專利名稱：一種新型抗腫瘤納米藥物載體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米藥物載體技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種新型抗腫瘤納米藥物載體及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是人類生命健康的最大殺手，化學(xué)治療是癌癥治療最重要的手段，然而多數(shù)化學(xué)治療藥物缺少特定到達(dá)腫瘤組織的能力，對腫瘤細(xì)胞缺乏選擇殺傷作用，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也傷及正常細(xì)胞，特別是癌細(xì)胞因為給藥處理產(chǎn)生耐藥性，為了克服癌細(xì)胞的耐藥性需要給予更高的抗癌藥劑量，從而對正常細(xì)胞造成較大的副作用，甚至中斷治療；另一方面，多數(shù)抗腫瘤藥物的功效由于其自身性質(zhì)，如水溶性差、治療窗口窄等也限制了腫瘤治療的效果。從上世紀(jì)70年代開始，納米載體作為化療藥物傳遞系統(tǒng)用于癌癥治療引起了人們的極大關(guān)注。用于藥物傳遞系統(tǒng)的納米粒子其粒徑在10 lOOOnm，可以有多種材料構(gòu)成，包括聚合物、脂質(zhì)、病毒和有機(jī)金屬復(fù)合物等。近年來，聚合物納米制劑因為具有較好的理化性能而備受關(guān)注。聚合物膠束由雙親性的聚合物材料在水環(huán)境中自組裝形成，是具有均一納米級粒徑及球形的核殼結(jié)構(gòu)載體。其親水性外殼可以增強(qiáng)膠束在水性生物介質(zhì)的分散性和穩(wěn)定性，并與生物介質(zhì)相容，內(nèi)核可包埋難溶性藥物。特別是殼聚糖，由于其優(yōu)良的細(xì)胞相容性、生物可降解性、生物粘附性、無毒性、無免疫原性、抗菌活性等優(yōu)點，已被大量用于藥物載體，傳遞蛋白、基因、藥物等生物活性分子。因此，以殼聚糖為基礎(chǔ)材料，對其進(jìn)行疏水修飾，使其在水溶液中自組裝形成膠束的藥物載體被各國學(xué)者所研究。簡單疏水修飾的殼聚糖形成的膠束雖然具有可降解，無毒，載藥量高等優(yōu)點，但是作為抗腫瘤藥物載體，經(jīng)靜脈注射后，這樣的納米粒也很容易被體內(nèi)的吞噬細(xì)胞當(dāng)作外來異物識別而被吞噬，在人體內(nèi)循環(huán)的時間不是足夠的長，降低了生物利用率。另外，簡單疏水修飾的殼聚糖膠束也不具有很強(qiáng)的靶向性，不能夠與腫瘤細(xì)胞特異的結(jié)合，從而不能夠有效降低抗癌藥物對正常細(xì)胞的毒副作用。在本研究之前，雖然有研究者分別制備了具有靶向性和體內(nèi)長循環(huán)性的疏水殼聚糖膠束，但同時滿足以上要求的傳遞載體系卻很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種新型抗腫瘤納米藥物載體的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供由上述制備方法得到的新型抗腫瘤納米藥物載體。本發(fā)明的再一目的在于提供 所述的新型抗腫瘤納米藥物載體的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一種新型抗腫瘤納米藥物載體的制備方法，包括以下步驟:(I)殼聚糖疏水改性:
將殼聚糖(CS)和脫氧膽酸(DA)按摩爾比1:40 1:162于25 40°C反應(yīng)48 72h，純化后得到共聚物殼聚糖-脫氧膽酸(CS-DA)；(2)聚乙二醇(MPEG)修飾殼聚糖-脫氧膽酸:將步驟(I)制備的殼聚糖-脫氧膽酸和聚乙二醇溶于30 50ml 1%(ν/ν)醋酸溶液中，室溫攪拌15 30min后加入甲醛，室溫反應(yīng)I 6h，純化后得到殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇(CS-DA-MPEG)聚合物；其中聚乙二醇與殼聚糖-脫氧膽酸的質(zhì)量比為12:1 20:1，甲醛和殼聚糖-脫氧膽酸的質(zhì)量比為1:2 1:4;(3)接枝聚合物殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇的靶向修飾:將葉酸(FA)和步驟(2)制備的殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇按質(zhì)量比1:1 2:1于35 40°C水浴中避光反應(yīng)16 24h，純化后得到接枝共聚物載體殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇-葉酸(CS-DA-MPEG-FA)；(4)新型抗腫瘤納米藥物載體的制備:將步驟(3)制備的接枝共聚物殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇-葉酸溶于醋酸溶液中，得到混合液，每毫升醋酸溶解接枝共聚物殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇-葉酸I 2mg ；將混合液置于透析袋中透析后，將透析袋內(nèi)的溶液冷凍干燥，得到新型抗腫瘤納米藥物載體；步驟(I)中:所述的殼聚糖的分子量優(yōu)選為50000 ；所述反應(yīng)的條件優(yōu)選25°C磁力攪拌48 72h ；

所述的反應(yīng)優(yōu)選在催化劑1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)中進(jìn)行；所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺與脫氧膽酸的摩爾比優(yōu)選為2:1，所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比優(yōu)選為3:1 ；所述的純化優(yōu)選采用以下方法進(jìn)行:待反應(yīng)結(jié)束時，向反應(yīng)瓶中加入氨水，離心，棄去上清液，甲醇洗滌沉淀3 5次后透析7天，冷凍干燥，得到共聚物殼聚糖-脫氧膽酸；所述的冷凍干燥的條件為在-10°C冷凍過夜后置于凍干機(jī)中凍干24h ；優(yōu)選的，所述的殼聚糖疏水改性采用以下方法進(jìn)行:將殼聚糖溶于1%(ν/ν)醋酸水溶液中，得到殼聚糖醋酸溶液；將DA、EDC、NHS加入甲醇中活化半小時，得到混合液；然后將混合液滴加到殼聚糖醋酸溶液中，25°C磁力攪拌48 72h，純化后得到共聚物殼聚糖-脫氧膽酸；殼聚糖和脫氧膽酸的摩爾比為1:40 1:162 ;步驟(2)中:所述的聚乙二醇優(yōu)選為甲氧基聚乙二醇；所述的甲氧基聚乙二醇的分子量優(yōu)選為5000 ；所述的室溫反應(yīng)優(yōu)選在二甲基亞砜(DMSO)中進(jìn)行；所述的純化優(yōu)選采用以下方法進(jìn)行:向反應(yīng)瓶中加入50ml丙酮使反應(yīng)物沉淀下來，棄去上清液將沉淀透析7天，冷凍干燥，得到聚合物殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇；所述的冷凍干燥的條件為在-10°C冷凍過夜后置于凍干機(jī)中凍干24h ；步驟(3)中:
所述的避光反應(yīng)優(yōu)選在催化劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)中進(jìn)行；所述的葉酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺的質(zhì)量比優(yōu)選為1:1 ;所述的純化優(yōu)選采用以下方法進(jìn)行:用氫氧化鈉溶液將反應(yīng)液的pH調(diào)至9后離心，棄去上清液將沉淀透析，冷凍干燥，得到殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇-葉酸聚合物；所述的透析的條件為在pH為7.4的PBS溶液中透析7天后在雙蒸水中透析7天；所述的冷凍干燥的條件為在-10°C冷凍過夜后置于凍干機(jī)中凍干24h ；優(yōu)選的，所述的接枝聚合物殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇的靶向修飾采用以下方法進(jìn)行:將殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇溶于1%(ν/ν)醋酸溶液中，得到殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇醋酸溶液；將葉酸溶解于DMSO中，加入0.3g EDC后避光攪拌lh，得到混合液，將混合液在30分鐘內(nèi)滴加到殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇醋酸溶液中，于35 40°C水浴中避光攪拌反應(yīng)16 24h，純化后得到接枝共聚物載體殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇-葉酸；葉酸和殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇的質(zhì)量比為1:1 2:1 ;步驟(4)中:所述的醋酸溶液優(yōu)選為1%(ν/ν)醋酸水溶液；優(yōu)選的，每毫升醋酸溶解接枝共聚物殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇-葉酸Img ；所述的透析優(yōu)選為去離子水透析；所述的透析袋截留分子量為10000 ；所述的透析優(yōu)選按照以下方法進(jìn)行:先用生理鹽水透析24h，然后用雙蒸水透析24h，其中前3h每Ih換一次雙蒸水，以后每3h換一次雙蒸水；所述的冷凍干燥按照以下方法進(jìn)行:在-10 -20°C冷凍過夜后置于凍干機(jī)中凍干12 24h，優(yōu)選在-10°C冷凍過夜后置于凍干機(jī)中凍干24h ；—種新型抗腫瘤納米藥物載體，由上述制備方法得到；所述的新型抗腫瘤納米藥物載體可應(yīng)用于輸送多種治療腫瘤的化療藥物，如阿霉素、紫杉醇、喜樹堿等。本發(fā)明的發(fā)明機(jī)理如圖5所示。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:本發(fā)明通過殼聚糖和脫氧膽酸進(jìn)行酰胺化反應(yīng)形成共聚物殼聚糖-脫氧膽酸，殼聚糖-脫氧膽酸和甲醛形成希夫堿中間體后與聚乙二醇反應(yīng)，得到的殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇與葉酸發(fā)生酰胺化反應(yīng)而制備新型抗腫瘤納米藥物載體。制備得到的新型抗腫瘤納米藥物載體對藥物的包載為非化學(xué)鍵結(jié)合，通過脫氧膽酸的疏水作用形成疏水微區(qū)，殼聚糖親水骨架盤繞在疏水微區(qū)的外面形成親水性外殼，使其在水溶液中具有最低的表面能，此外，在緊密的殼聚糖骨架間存在分子間和分子內(nèi)氫鍵，進(jìn)一步促進(jìn)膠束的形成，這種獨特的超分子結(jié)構(gòu)很適合捕獲疏水藥物，從而增加小分子疏水藥物的溶解，而連接到殼聚糖外殼上的聚乙二醇和葉酸分別起到了隱形和主動靶向的作用。親水性強(qiáng)的聚乙二醇能夠在納米粒表面形成一層或者 多層保護(hù)性的親水衣膜，可阻礙調(diào)理作用，聚乙二醇自身的高分子鏈可以自由擺動，具有較高的柔韌性，對普通納米粒能夠起到更強(qiáng)的立體保護(hù)作用，避免被吞噬細(xì)胞快速吞噬，從而使該納米粒子具備更長的血漿半衰期；葉酸體積小，被認(rèn)為無免疫原性，并且穩(wěn)定性高。利用腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體高表達(dá)而正常組織很少有葉酸受體過分表達(dá)的特點，接有葉酸分子的新型抗腫瘤納米藥物載體與腫瘤細(xì)胞有更強(qiáng)的親和力，使得新型抗腫瘤納米藥物載體同時又具備了主動靶向的特性，克服了普通納米粒功能比較單一的缺點。該新型抗腫瘤納米藥物載體能夠很好的避開吞噬細(xì)胞的吞噬，有利于在體內(nèi)長期循環(huán)而不被清除，主動靶向修飾能夠更好的與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，減少了藥物對人體正常細(xì)胞的損害。


圖1是實施例1中不同接枝聚合物的紅外譜圖，其中:a為CS-DA-MPEG-FA的紅外譜圖，b為CS-DA-MPEG紅外譜圖，c為CS-DA紅外譜圖，d為CS紅外譜圖。圖2是實施例1中不同接枝聚合物的核磁氫譜圖，其中:a為CS_DA_MPEG_FA的核磁氫譜圖，b為CS-DA-MPEG的核磁氫譜圖，c為CS-DA的核磁氫譜圖，d為CS的核磁氫譜圖，e為MPEG的核磁氫普圖，f為FA的核磁氫普圖。圖3是實施例1的殼聚糖-脫氧膽酸-乙二醇-葉酸納米粒的透射電鏡掃描圖。圖4是效果實施例的殼聚糖-脫氧膽酸-乙二醇-葉酸納米粒載阿霉素的體外累積釋放曲線圖，其中:a為載阿霉素納米粒子在pH5.7的醋酸鈉緩沖溶液中的體外累積釋放曲線；b為載阿霉素納米粒子在pH7.4的PBS緩沖溶液中的體外累積釋放曲線。圖5是本發(fā)明的反應(yīng)機(jī)理圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1(I)殼聚糖疏水改性:稱取1.0g殼聚糖于反應(yīng)瓶中，加入IOOml的1%(ν/ν)醋酸水溶液將其溶解，得到殼聚糖醋酸溶液；將0.3180g DA (殼聚糖(CS)和脫氧膽酸(DA)摩爾比為l:40)、0.6211gEDC、0.1243g NHS加入到另一燒杯中，加入200ml甲醇活化半小時，得到混合液；然后將混合液滴加到殼聚糖醋酸溶液中，磁力攪拌，25°C反應(yīng)48h，待反應(yīng)結(jié)束時，向反應(yīng)瓶中加入60ml氨水,將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至離心管中離心10分鐘(轉(zhuǎn)速5000r/min),棄去上清液,40ml甲醇洗滌沉淀3次，然后將沉淀轉(zhuǎn)移到透析袋(透析袋截留分子量為10000，下同。)中透析7天，冷凍干燥(在-10°C冷凍過夜后置于凍干機(jī)中凍干24h)，得到殼聚糖-脫氧膽酸，其反應(yīng)方程式為:
權(quán)利要求
1.一種新型抗腫瘤納米藥物載體的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)殼聚糖疏水改性:將殼聚糖和脫氧膽酸按摩爾比1:40 1:162于25 40°C反應(yīng)48 72h，純化后得到共聚物殼聚糖-脫氧膽酸； (2)聚乙二醇修飾殼聚糖-脫氧膽酸:將步驟(I)制備的殼聚糖-脫氧膽酸和聚乙二醇溶于30 50ml 1%醋酸溶液中，室溫攪拌15 30min后加入甲醛，室溫反應(yīng)I 6h，純化后得到殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇聚合物；聚乙二醇與殼聚糖-脫氧膽酸的質(zhì)量比為12:1 20:1，甲醛和殼聚糖-脫氧膽酸的質(zhì)量比為1:2 1:4 ; (3)接枝聚合物殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇的靶向修飾:將葉酸和步驟(2)制備的殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇按質(zhì)量比1:1 2:1于35 40°C水浴中避光反應(yīng)16 24h，純化后得到接枝共聚物載體殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇-葉酸； (4)新型抗腫瘤納米藥物載體的制備:將步驟(3)制備的接枝共聚物殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇-葉酸溶于醋酸溶液中，得到混合液，每毫升醋酸溶解接枝共聚物殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇-葉酸I 2mg ;將混合液置于透析袋中透析后，將透析袋內(nèi)的溶液冷凍干燥，得到新型抗腫瘤納米藥物載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型抗腫瘤納米藥物載體的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述反應(yīng)的條件為25°C磁力攪拌48 72h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的 新型抗腫瘤納米藥物載體的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的殼聚糖的分子量為50000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型抗腫瘤納米藥物載體的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的反應(yīng)在催化劑1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺中進(jìn)行；所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺與脫氧膽酸的摩爾比為2:1，所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為3:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型抗腫瘤納米藥物載體的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述的聚乙二醇為甲氧基聚乙二醇；所述的室溫反應(yīng)在二甲基亞砜中進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型抗腫瘤納米藥物載體的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述的避光反應(yīng)在催化劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺中進(jìn)行；所述的葉酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺的質(zhì)量比為1:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型抗腫瘤納米藥物載體的制備方法，其特征在于:步驟(4)中所述的透析按照以下方法進(jìn)行:先用生理鹽水透析24h，然后用雙蒸水透析24h，其中前3h每Ih換一次雙蒸水，以后每3h換一次雙蒸水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型抗腫瘤納米藥物載體的制備方法，其特征在于:步驟(4)中所述的冷凍干燥按照以下方法進(jìn)行:在-10 _20°C冷凍過夜后置于凍干機(jī)中凍干12 24h。
9.一種新型抗腫瘤納米藥物載體，由權(quán)利要求1 8任一項所述的制備方法得到。
10.權(quán)利要求9所述的新型抗腫瘤納米藥物載體應(yīng)用于輸送治療腫瘤的化療藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型抗腫瘤納米藥物載體及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明通過殼聚糖和脫氧膽酸進(jìn)行酰胺化反應(yīng)形成共聚物殼聚糖-脫氧膽酸，殼聚糖-脫氧膽酸和甲醛形成希夫堿中間體后與聚乙二醇反應(yīng)，得到的殼聚糖-脫氧膽酸-聚乙二醇與葉酸發(fā)生酰胺化反應(yīng)而制備新型抗腫瘤納米藥物載體，利用腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體高表達(dá)而正常組織很少有葉酸受體過分表達(dá)的特點，接有葉酸分子的新型抗腫瘤納米藥物載體與腫瘤細(xì)胞有更強(qiáng)的親和力，克服了普通納米粒功能較單一的缺點。制備的新型抗腫瘤納米藥物載體能夠很好的避開吞噬細(xì)胞的吞噬，有利于在體內(nèi)長期循環(huán)而不被清除，主動靶向修飾能夠更好的與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，減少了藥物對人體正常細(xì)胞的損害。
文檔編號A61P35/00GK103083673SQ20131001366
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月14日
發(fā)明者郭瑞, 張淵明, 師忠根, 唐渝 申請人:暨南大學(xué)