專利名稱：丙戊酸在制備抗肺癌藥物多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丙戊酸在制備抗肺癌藥物多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)2008年四月國(guó)家衛(wèi)生部公布的《全國(guó)第三次死因調(diào)查》報(bào)告，肺癌已替代肝癌成為我國(guó)惡性腫瘤死亡原因第一位(占全部惡性腫瘤致死的22.7%)。肺癌早期多無明顯癥狀，尤其是占肺癌80%的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，65 80%的患者確診時(shí)已屬中晚期，有遠(yuǎn)處病灶轉(zhuǎn)移，常失去外科手術(shù)和放療機(jī)會(huì)；因此，在肺癌的治療上，藥物的作用就尤為重要。遺憾的是，目前對(duì)于肺癌的藥物治療，還缺乏持久有效的治療藥物，許多抗癌藥物，即便是新興的分子靶向治療藥物，盡管有特異性強(qiáng)、毒性作用小等優(yōu)勢(shì)，但因其針對(duì)性較局限，并不適合多數(shù)肺癌患者。國(guó)際癌癥組織推薦的以順鉬為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案，一直是非小細(xì)胞肺癌的一線標(biāo)準(zhǔn)化療方案。多項(xiàng)隨機(jī)臨床試驗(yàn)及薈萃分析顯示，不同的含鉬方案療效近似，而目前還沒有總體療效優(yōu)于含鉬治療方案。隨著鉬類藥物的廣泛應(yīng)用，不可避免地會(huì)引起腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，使化療效果明顯降低，這是當(dāng)前困擾肺癌治療的一大難題。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞對(duì)鉬類藥物耐藥的形成與多藥耐藥蛋白(MDR)無關(guān)，盡管諸如銅離子受體、ATP7B、谷胱甘肽以及DNA的修復(fù)蛋白等許多因素被認(rèn)為在鉬的耐藥形成中起一定作用，但至今并沒有一個(gè)明確的機(jī)制，也正因?yàn)槿绱?，目前并沒有合適的藥物用于逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)鉬的耐藥性。而癌細(xì)胞一旦對(duì)順鉬形成耐藥，會(huì)對(duì)阿霉素、長(zhǎng)春堿、氟尿嘧啶、VP-16、絲裂霉素等眾多一線化療藥形成多藥耐藥，所以其危害尤為嚴(yán)重。眾所周知，藥物治療是每一個(gè)腫瘤患者都要面對(duì)的，雖說現(xiàn)在已有數(shù)以百計(jì)的抗癌藥物應(yīng)用于臨床，可總體效果很不盡人意。究其原因，除了藥物的毒副作用外，更重要的一點(diǎn)是腫瘤產(chǎn)生的多藥耐藥性，這是困擾治療的一大難題。據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥協(xié)會(huì)發(fā)布的研究數(shù)據(jù)證實(shí)90%以上腫瘤患者化療失敗致死的原因都與耐藥有關(guān)。所以說，腫瘤對(duì)化療的耐藥性是影響治療的主要原因，尋找逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的藥物已成為當(dāng)前抗腫瘤的關(guān)鍵。這也是當(dāng)前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。然而，腫瘤耐藥的危害還不僅于此，早在20年前就有學(xué)者報(bào)道了頭頸部腫瘤的耐藥株存在侵襲轉(zhuǎn)移增強(qiáng)的現(xiàn)象，當(dāng)時(shí)這一研究并未引起人們的重視。隨著對(duì)腫瘤耐藥和侵襲轉(zhuǎn)移認(rèn)識(shí)的深入，人們逐漸對(duì)此有所關(guān)注。近來的研究表明人喉癌對(duì)紫杉醇形成耐藥后，過度表達(dá)的P-糖蛋白能與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)協(xié)同增強(qiáng)喉癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而耐阿霉素的乳腺癌細(xì)胞也通過P-糖蛋白誘導(dǎo)MMP-2和MMP-9過表達(dá)增強(qiáng)侵襲轉(zhuǎn)移性。我們及Anthony等研究發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞、大腸癌細(xì)胞對(duì)鉬類藥物形成耐藥后，細(xì)胞會(huì)發(fā)生上皮間充質(zhì)樣變(EMT)，遷移侵蝕能力較其親本株顯著增強(qiáng)，這種現(xiàn)象使腫瘤耐藥性的危害大大增加了。綜上所述，腫瘤多藥耐藥是導(dǎo)致臨床腫瘤治療失敗的主要原因，尋找逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的方法和藥物已成為當(dāng)前抗腫瘤的關(guān)鍵。
丙戍酸(Valproic acid, VPA)是一種含有8個(gè)碳原子的短鏈脂肪酸,具有抗癲癇作用，作為抗癲癇藥長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床，其臨床應(yīng)用效果可靠且安全。目前還沒有丙戊酸能有效地逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞的多藥耐藥性，從而提高藥物敏感性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供丙戊酸在制備抗肺癌藥物多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
丙戊酸在制備抗肺癌藥物多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述抗肺癌藥物為鉬類抗癌藥。優(yōu)選的，所述抗肺癌藥物為順鉬。丙戊酸在制備抗肺癌的化療藥物增敏劑中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述抗肺癌的化療藥物為鉬類抗癌藥。優(yōu)選的，所述抗肺癌的化療藥物為順鉬。丙戊酸在制備抗多藥耐藥性肺癌侵襲轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，丙戊酸與抗肺癌藥物聯(lián)用。本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)丙戊酸(VPA)具有顯著的抗人肺癌順鉬耐藥株(A549/DDP)的作用，VPA對(duì)A549/DDP細(xì)胞的增 殖有明顯抑制作用，其IC50為8mmol。VPA和順鉬聯(lián)合干預(yù)A549/DDP細(xì)胞結(jié)果顯示，采用沒有明顯細(xì)胞毒作用的低劑量VPA(2 mmol)即可顯著逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)順鉬的耐藥性，提高細(xì)胞對(duì)順鉬的敏感性，使10 μ mol順鉬的抑制細(xì)胞作用從11%升高到48%，顯示VPA有逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉬(Cisplatin，DDP)的耐藥作用。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，VPA聯(lián)合順鉬作用36h可見細(xì)胞周期受阻，G2/M期細(xì)胞比例明顯增加，48h時(shí)可見明顯的細(xì)胞凋亡。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)可知人肺癌耐藥株A549/DDP的遷移侵襲能力比親本株A549高出約5倍，表明肺癌耐順鉬后有著更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而通過基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)即便使用沒有明顯細(xì)胞毒作用的低劑量(0.5 2mmol)，VPA也對(duì)A549/DDP的侵襲能力有明顯的抑制作用。


圖1是不同劑量的VPA對(duì)A549/DDP細(xì)胞作用24h后的增殖抑制效果；
圖2是VPA (8 mmol)對(duì)A549/DDP細(xì)胞抑制作用的時(shí)效關(guān)系；
圖3是VPA (2 mmol)逆轉(zhuǎn)不同劑量DDP對(duì)A549/DDP細(xì)胞的作用；
圖4是VPA (10 μ mol)、DDP聯(lián)用對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖的影響；
圖5是VPA聯(lián)合DDP對(duì)A549/DDP細(xì)胞周期的影響；
圖6是不同劑量VPA抑制耐藥株A549/DDP的侵襲作用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。實(shí)驗(yàn)中所用的丙戊酸(VPA)、順鉬均購(gòu)自Sigma公司。
一、丙戊酸對(duì)人肺癌順鉬耐藥株的增殖抑制作用:
1.MTT法檢測(cè)不同劑量的VPA對(duì)A549/DDP作用24h后的增殖抑制作用:
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞人肺癌順鉬耐藥株(A549/DDP)(順鉬IC5(i=35 μ mol，耐藥倍數(shù)約6倍，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸科)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3X103個(gè)/孔，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入完全培養(yǎng)基(RPM1-1640+10%胎牛血清，下同)，37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，更換完全培養(yǎng)基每孔190 μ 1，每組加入按實(shí)驗(yàn)設(shè)定的不同劑量VPA (VPA劑量分別設(shè)為2mmol、4mmol、8mmol、16mmol、32 mmol),每組 8 個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng) 24h 后，每孔加入 20μ1 MTT 液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止反應(yīng)，將孔中的液體去除，加200 μ I 二甲基亞砜溶解結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔OD值(波長(zhǎng)570 nm)。實(shí)驗(yàn)設(shè)不加VAP僅添加完全培養(yǎng)基組為對(duì)照組。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-加藥組平均OD值/對(duì)照組平均OD 值)X 100 %。檢測(cè)結(jié)果見圖1，由圖1可知，VPA對(duì)A549/DDP細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，并存在劑量依賴性；其IC50為8mmol，16mmol劑量達(dá)到作用峰值。2.MTT法檢測(cè)VPA (8 mmol)對(duì)A549/DDP細(xì)胞抑制作用的時(shí)效關(guān)系: 參照“MTT法檢測(cè)不同劑量的VPA對(duì)A549/DDP作用24h后的增殖抑制作用”的MTT實(shí)驗(yàn)步驟，A549/DDP培養(yǎng)24h后，更換完全培養(yǎng)基每孔190 μ 1，并向完全培養(yǎng)基中各組均加入8 mmol VPA，設(shè)8個(gè)復(fù)孔，各組分別按以下時(shí)間培養(yǎng):12h、24h、36h、48h、60h，培養(yǎng)后每孔加入20μ1 MTT液(5 mg/ ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止反應(yīng)，將孔中的液體去除，加200 μ I 二甲基亞砜溶解結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔OD值(波長(zhǎng)570 nm),實(shí)驗(yàn)設(shè)不加VAP僅添加完全培養(yǎng)基組為對(duì)照組，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，由圖2可知，VPA的作用隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增大,在48小時(shí)達(dá)最大效應(yīng)。二、丙戊酸逆轉(zhuǎn)人肺癌細(xì)胞對(duì)順鉬的耐藥性
UVPA (2 mmol)逆轉(zhuǎn)不同劑量順鉬(DDP)對(duì)A549/DDP細(xì)胞的作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞人肺癌順鉬耐藥株(A549/DDP)(順鉬IC5(i=35 μ mol，耐藥倍數(shù)約6倍，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸科)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3X103個(gè)/孔，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入完全培養(yǎng)基(RPM1-1640+10%胎牛血清)，37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，更換完全培養(yǎng)基每孔190 μ 1，并向完全培養(yǎng)基中各組加入不同劑量的VPA，每組8個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，各組均按實(shí)驗(yàn)設(shè)定加入順鉬，培養(yǎng)48h后，每孔加入20μ I MTT液(5 mg/ ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止反應(yīng)，將孔中的液體去除，加200 μ I 二甲基亞砜溶解結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔OD值(波長(zhǎng)570 nm),計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。實(shí)驗(yàn)分三組:1)VPA組:VPA加入劑量為2mmol，DDP加入劑量為O mmol ;2)DDP組:VPA加入劑量均為Ommol，DDP加入劑量分別設(shè)為2.5 μ mol,5.0 ymolU0.0 μ mol,20.0μ mol ；3) VPA+ DDP組:VPA加入劑量均為2mmol，DDP加入劑量分別設(shè)為2.5 μ mol,5.0μ mol、10.0 μ mol、20.0 μ mol。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，由圖3可知，采用沒有明顯細(xì)胞毒作用的低劑量VPA(2mmol)即可顯著逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)順鉬的耐藥性，提高細(xì)胞對(duì)順鉬的敏感性。2、VPA、DDP聯(lián)用對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖的影響:
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞人肺癌順鉬耐藥株(A549/DDP)(順鉬IC5(i=35 μ mol，耐藥倍數(shù)約6倍，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸科)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3X103個(gè)/孔，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入完全培養(yǎng)基(RPM1-1640+10%胎牛血清)，37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，更換完全培養(yǎng)基每孔190 μ 1，并向完全培養(yǎng)基中各組加入不同劑量的VPA，每組8個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，各組均按實(shí)驗(yàn)設(shè)定加入順鉬，培養(yǎng)48h后，每孔加入20μ I MTT液(5 mg/ ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止反應(yīng)，將孔中的液體去除，加200μ I 二甲基亞砜溶解結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔OD值(波長(zhǎng)570 nm)，實(shí)驗(yàn)設(shè)不加VAP僅添加完全培養(yǎng)基組為對(duì)照組。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。實(shí)驗(yàn)分三組:1) DDP組:VPA加入劑量為Ommol，DDP加入劑量為10 μ mol ; 2) VPA組:VPA加入劑量分別設(shè)為0.5 mmolU.0 mmol,2.0 mmol,4.0 mmol，DDP加入劑量均為Ommol ；3)VPA+ DDP 組:VPA加入劑量分別設(shè)為 0.5 mmolU.0 mmol,2.0 mmol,4.0 mmol,DDP加入劑量均為10 μ mol。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，VPA和DDP聯(lián)合干預(yù)A549/DDP細(xì)胞結(jié)果(圖4)顯示，VPA能提高細(xì)胞對(duì)順鉬的敏感性，使 ο μ mol順鉬的抑制細(xì)胞率從11%升高到48%，顯示VPA有逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥作用。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)丙戊酸能有效地逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥株A549/DDP對(duì)順鉬的耐藥特性，提高細(xì)胞對(duì)順鉬的敏感性，也說明丙戊酸作為多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑能用于治療肺癌。三、VPA和DDP聯(lián)合處理后對(duì)A549/DDP細(xì)胞周期的影響
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞人肺癌順鉬耐藥株(A549/DDP)接入培養(yǎng)皿中，37°C 5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后換液，加入VPA (2mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24h后，再加入DDP (ΙΟμπιοΙ/L)。分別加入DDP后12h、24h、36h、48h收集細(xì)胞 并用70%的冷乙醇固定過夜；800g離心lOmin，去上清，加10ml PBS洗去殘留的乙醇；800g離心lOmin，去上清，加入已配好的PI溶液(25 μ g/ml ΡΙ、20 μ g/ml RnaseA、0.l%Triton-x_100),4°C避光染色 30min。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，由圖5可知VPA聯(lián)合順鉬作用36h可見細(xì)胞周期受阻，G2/M期細(xì)胞比例明顯增加，48h時(shí)可見明顯的細(xì)胞凋亡，其凋亡數(shù)約為對(duì)照組的5倍。四、丙戊酸抑制人肺癌順鉬耐藥株的遷移侵蝕作用
細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)=Transwell小室(BD公司)濾膜上方加12 μ I Matrigel膠(BD公司)在37°C預(yù)處理，隨后于Transwell上層小室分別加入A549/DDP (不加VAP僅添加完全培養(yǎng)基組為對(duì)照組)及VPA預(yù)處理(劑量分別為0.5mmol, 1.0mmol, 2.0mmol, 4.0mmol)24h的A549/DDP細(xì)胞按3 X IO4個(gè)/室均勻的加入Transwell小室中，上層加含1%血清的RPM1-1640培養(yǎng)液300 μ 1，下層加含10%血清的RPM1-1640培養(yǎng)液800 μ 1，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，各小室用濕棉棒擦去膜上層細(xì)胞和Matrigel膠，底膜用結(jié)晶紫染色固定，高倍鏡(10X20 )下隨機(jī)選擇5個(gè)無重疊區(qū)，計(jì)數(shù)穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞，重復(fù)3次取均值，比較各組細(xì)胞數(shù)的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，圖5中左邊的方框圖為VAP劑量與入侵細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系圖，右邊的五幅圖是細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的各組細(xì)胞圖，由圖5可知，VPA具有顯著的抑制肺癌順鉬耐藥株A549/DDP的侵襲轉(zhuǎn)移作用，即使使用沒有明顯細(xì)胞毒作用的低劑量(0.5 2mmol)，VPA也對(duì)A549/DDP的侵襲能力有明顯的抑制作用。
權(quán)利要求
1.丙戊酸在制備抗肺癌藥物多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于:抗肺癌藥物為鉬類抗癌藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于:抗肺癌藥物為順鉬。
4.丙戊酸在制備抗肺癌的化療藥物增敏劑中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于:所述抗肺癌的化療藥物為鉬類抗癌藥。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用，其特征在于:所述抗肺癌的化療藥物為順鉬。
7.丙戊酸在制備抗多藥耐藥性肺癌侵襲轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的應(yīng)用 ，其特征在于:丙戊酸與抗肺癌藥物聯(lián)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了丙戊酸在制備抗肺癌藥物多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用，還公開了丙戊酸在制備抗肺癌的化療藥物增敏劑中及抗多藥耐藥性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)丙戊酸具有顯著的抗人肺癌順鉑耐藥株的作用，并證實(shí)丙戊酸可顯著逆轉(zhuǎn)人肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，提高人肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，以及丙戊酸對(duì)肺癌順鉑耐藥株的侵襲能力有明顯的抑制作用。
文檔編號(hào)A61P11/00GK103142646SQ20131000969
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者饒進(jìn)軍, 陳云燕, 王新波, 吳少瑜, 呂琳, 王文雅, 楊迎暴 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)