致密殼聚糖膜材料的組合物、制備及用途
【專利摘要】本發(fā)明描述了特別致密的殼聚糖的組合物及用于制備所述致密殼聚糖結構的新方法。所述新制備方法對中和的殼聚糖聚合物同時采用了壓縮和真空，從而產生特別致密的殼聚糖薄膜或膜材料。所述致密的殼聚糖薄膜或膜組合物具有多種物理和臨床上值得關注的品質，適用于在動物、哺乳動物或人體上或其體內的多種醫(yī)學應用。
【專利說明】致密殼聚糖膜材料的組合物、制備及用途
[0001] 公開領域
[0002] 本發(fā)明涉及致密的殼聚糖薄膜或膜材料及其制備方法。這些材料可用于醫(yī)學工 業(yè)、科技工業(yè)及其它工業(yè)中。
[0003] 背景
[0004] 功能性生物材料研究已經集中在開發(fā)用于創(chuàng)傷愈合和組織工程的改進的支架。已 經對許多生物可降解聚合物作為支架用于創(chuàng)傷愈合和組織工程應用進行了研究，并且包括 合成聚合物，如聚己內酯、聚（乳酸-共-乙醇酸）、聚（乙二醇）；及天然聚合物，如藻酸 鹽、明膠、膠原蛋白、淀粉及殼聚糖。其中，天然來源的聚合物特別值得關注，因為作為生物 結構的天然組分，其在生物和化學上類似于天然組織。在這一情形中，已經發(fā)現(xiàn)殼聚糖可作 為諸多應用中的引人注目的候選物，并且除抗細菌、抗真菌及止血特性外，還具有獨特的生 物特性，包括生物相容性、對于有害糖產物的生物降解性、無毒、生理學惰性、對于蛋白質的 顯著親和力。
[0005] 有記錄的殼聚糖應用應回溯到19世紀，Rouget在1859年論述殼聚糖的脫乙?；?形式時。幾丁質（殼聚糖的原材料）是含量最豐富的有機材料之一，每年通過生物合成產 生的量僅次于纖維素。它是動物，尤其是甲殼動物、軟體動物及昆蟲的外骨骼的一種重要成 分。它還是某些真菌細胞壁中的主要原纖維聚合物，并且可以由微藻產生。脫乙?；?幾丁質衍生物被稱為"殼聚糖"。當這兩個術語首次在19世紀（1800' s)使用時，據(jù)信幾丁 質和殼聚糖實際上常常是作為截然不同、充分確定的獨特并且無變化的化學物質存在，其 中幾丁質是完全乙酰基化的并且殼聚糖是完全脫乙?；慕M合物。然而，約一個世紀之 后，發(fā)現(xiàn)術語"幾丁質"和"殼聚糖"事實上是不明確的。這些術語實際上是指展現(xiàn)明顯不 同的物理和化學特性的化合物的家族，而非指充分確定的化合物。這些差異歸因于這些產 品的不同分子量和不同乙?；潭取?br> [0006] 殼聚糖是線性多糖，由通過β (1-4)糖苷鍵連接的葡糖胺和N-乙?；咸前穯?元構成，大體上呈糖單元線形式。取決于來源和制備程序，其分子量一般在10kDa到超過 lOOOkDa范圍內。殼聚糖聚合物的分子量通常是由粘度確定并且以厘泊（Centip〇ise，CPS) 或毫帕（mPas)為單位表示，并且可以在約5mPas到3000mPas范圍內。葡糖胺的含量被視為 脫乙?；某潭龋╠egree of deacetylation，DD)并且可以在30%到95%范圍內。呈結 晶形式的殼聚糖通常不可溶于超過PH7的水溶液中，然而，在稀酸（pH〈6.0)中，葡糖胺上的 質子化游離氨基促進該分子的溶解（Kim，Seo等，2008)。一般來說，殼聚糖具有三種類型的 反應性官能團，分別是在C(2)、C(3)及C(6)位置處的氨基以及伯羥基和仲羥基。這些基團 允許對殼聚糖進行修飾以用于特定應用，其可以制備適用于組織工程應用的各種支架。殼 聚糖的化學性質又為共價和離子修飾提供許多可能，從而允許廣泛調整機械和生物特性。 [0007] JL 丁質加工
[0008] 如以上所提到的，幾丁質存在于眾多分類組內。然而，市售的幾丁質通常是從海 洋甲殼動物（如褐奸（shrimp))分離的。甲殼動物的殼由30-40%蛋白質、30-50%碳酸 鈣及20-30%幾丁質組成，并且還含有脂質性質的顏料，如類胡蘿卜素（蝦青素、蝦黃素 (astathin)、角黃素、葉黃素及β-胡蘿卜素）。這些組分的比例隨物種和季節(jié)而變化。
[0009] 當通過酸處理溶解碳酸鈣，隨后堿提取使蛋白質變性并溶解，并且隨后進行脫色 步驟來提取幾丁質時，通過去除蝦青素主要獲得無色到灰白色產物。該制備方法是影響樣 品特征的一個因素。早期的研究已經清楚地證實，這些產物的具體特征（Mw、DD)取決于工 藝條件。然而，市售的幾丁質典型地通過第一步驟的脫蛋白質隨后第二步驟的脫礦質來制 備。在這些條件下，提取到"崩解的幾丁質"，其中幾丁質失去了天然結構。另一方面，當在 第一步驟中發(fā)生脫礦質時，提取到"壓縮的幾丁質"，其中天然鏈和纖維狀結構是完整并且 穩(wěn)定的。由任一殼聚糖提取方法制備的殼聚糖都適用于本發(fā)明。另外，本發(fā)明不限制來自 天然、半合成或合成來源的殼聚糖來源。
[0010] JL 丁質脫乙酰某化成為殼聚糖
[0011] 殼聚糖是通過水解幾丁質的乙酰胺基來制備。由于糖環(huán)中C2-C3取代基的 反式布置賦予的這些基團的抗性，這通常是通過苛性堿水解處理來進行的（Horton和 Linebackl965)。通常需要在強堿水溶液中對幾丁質進行熱處理來得到部分脫乙酰基化的 幾丁質（DD超過70%)，稱為殼聚糖。通常，在高溫（100°C)下使用濃度為30-50% (w/v) 的氫氧化鈉或氫氧化鉀。這種苛性氫氧化物/熱方法同時具有減少或去除潛在的細菌內毒 素的作用，這對于所得殼聚糖材料的生物醫(yī)學醫(yī)用的是有益的。
[0012] 取決于幾丁質的來源和殼聚糖的制備方法，殼聚糖DD可以在56% -99%范圍內 (Abou-Shoer2010)。影響脫乙酰基化程度的因素包括堿濃度、先前處理、幾丁質的粒度及密 度。實際上，在單次堿處理中可以實現(xiàn)的最大DD為約75-85% (Robertsl998)。一般來說， 在脫乙酰基化期間，條件必須是適于在合理時間內使幾丁質脫乙?；玫綒ぞ厶堑臈l 件，該殼聚糖（隨后）可溶于稀乙酸中。很明顯，有關殼聚糖精細結構的首要因素是DD值 的化學多分散性（R〇bert S1998)。在殼聚糖脫乙酰基化期間，發(fā)生聚合物鏈的降解。具有低 DD值（75-85%)的殼聚糖支架呈現(xiàn)較規(guī)則的結構，并且孔隙相當均勻并與多邊形橫截面平 行（Tigli和GumuSd ereli〇glu2008)。對于具有高脫乙?；潭龋?gt;85%)的支架，側向 孔隙連通性低得多。還進行了膨脹研究，但未發(fā)現(xiàn)DD與膨脹比之間的關系。針對殼聚糖支 架的機械測試顯示，在較高DD下，機械強度較高。支架的生物可降解性也取決于DD。
[0013] 殼聚糖的解聚
[0014] 在某些應用中使用殼聚糖的主要局限是其高粘度和在中性pH下的低溶解度。低 Mw殼聚糖和低聚物可以通過水解聚合物鏈來制備。對于某些特定應用，已經發(fā)現(xiàn)這些較小 的分子更有用。殼聚糖解聚可以化學方式、酶促方式或物理方式進行?；瘜W解聚主要是通 過使用HC1進行的酸水解或通過使用ΗΝ0 2和H202進行的氧化反應來執(zhí)行。已經發(fā)現(xiàn)，就 ΗΝ02攻擊脫乙?；咸前穯卧陌被?，隨后使相鄰糖苷鍵裂解來說，該方法是特異性的 (Prashanth和Tharanathan2007)。在酶促解聚的情況下，通過如幾丁質酶、殼聚糖酶、葡糖 酶及一些蛋白酶等若干種酶來制備具有高水溶性的低分子量殼聚糖。已知能夠使殼聚糖解 聚的多種非特異性酶，包括溶菌酶、纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶及果膠酶。以此方式，允許在 溫和條件下進行區(qū)位選擇性解聚（Aranaz, Mengibar等，2009)。
[0015] 殼聚糖的Mw與其膨脹行為之間不存在相關性（Roldo, Hornof等，2004 ; El_Kamel，Ashri 等，2007)。拉伸強度（tensile strength,TS)、斷裂伸長率百分比（EB%) 及彈性模量（elastic modulus，EM)是指示薄膜的強度和彈性的重要參數(shù)。已經建立了用 于評價薄膜或膜的物理參數(shù)的ASTM國際標準測試方法（ASTM2002 ;ASTM2006)。中等Mw的 殼聚糖薄膜具有最高的TS和EM值，隨后是高Mw和低Mw的殼聚糖薄膜（El-Kamel，Ashri 等，2007)。另一方面，低Mw的殼聚糖薄膜獲得最高的EB%，隨后是高Mw和中等Mw的殼聚 糖薄膜。
[0016] 孔隙奪化的影響
[0017] 基于殼聚糖的支架的機械特性取決于孔隙大小和孔隙取向。通過將殼聚糖溶液冷 凍并凍干，或通過如"內部鼓泡法（internal bubbling process, IBP)"等方法可以形成呈 互連多孔結構的殼聚糖，在IBP方法中，將CaC03添加到殼聚糖溶液中，通過使用適合模具 產生特定形狀的殼聚糖-CaC0 3凝膠（Chow和Khor2000)。針對水合樣品的拉伸測試顯示， 與無孔殼聚糖膜（5_7MPa)相比較，多孔殼聚糖膜具有大幅減小的彈性模量（0. 1-0. 5MPa， 其中兆帕單位=N/mm2)。多孔膜的可伸長性（最大應變）隨孔隙大小和孔隙取向而在類 似于無孔殼聚糖的值（約30% )到超過100%之間變化。多孔膜展現(xiàn)出復合材料所特有 的應力-應變曲線，具有兩個截然不同區(qū)域：在低應變下的低模量區(qū)和在高應變下轉變到 高2-3倍的模量。據(jù)報道，這些多孔結構的拉伸強度在30_60kPa范圍內（Madihally和 Matthewl999)。
[0018] Chen和Hwa報道了所用殼聚糖的分子量和其結晶度對于殼聚糖膜機械特性的影 響（Chen和Hwal996)。也就是說，由于可能存在纏結差異，所用殼聚糖的分子量越低，則所 制備的殼聚糖膜的拉伸強度越低。換句話說，使用較低分子量的殼聚糖產生較少纏結。殼聚 糖的結晶度差異可能歸因于另一因素。所用殼聚糖的分子量越低，則所得膜的焓越小。這 些表明，該膜的較低拉伸強度是由低分子量殼聚糖制備的殼聚糖膜中的結晶度較低引起。
[0019] 牛物可降解件
[0020] 殼聚糖不存在于哺乳動物中，但可以在體內被若干酶降解，最值得注意的是 溶菌酶、幾丁 質酶和 NAG 酶（Dalian, da Luz Moreira 等，2007 ;Kim, Seo 等，2008) (Aranaz, Mengibar等，2009) (Niekraszewicz2005)。生物降解導致釋放出不同長度的無毒 寡糖，這些寡糖隨后可以結合到糖胺聚糖和糖蛋白中、進入代謝路徑或被排泄掉。溶菌酶， 存在于哺乳動物組織中并且涉及到先天免疫性的非特異性糖苷水解酶，似乎對幾丁質和殼 聚糖的降解起到重要作用。降解動力學似乎與結晶程度呈逆相關，而結晶程度主要受DD控 制。另外，乙?；姆植家灿绊懮锝到庑?，因為乙?；淮嬖诨蚱渚鶆蚍植迹o規(guī)而非嵌 段分布）引起極低的酶降解速率。
[0021] 最后，若干研究報道，鏈長度（Mw)也影響降解速率。有關基于殼聚糖的材料和醫(yī) 療裝置的降解速率的了解和控制是特別值得關注的，因為降解在許多小分子和大分子釋放 應用中及功能組織再生應用中是必不可少的。在某些應用中，支架降解的速率應當反映新 組織形成的速率或適合于生物活性分子（例如天然化合物、藥物、生物制品、核酸、疫苗及 免疫效應物）的控制釋放。因此，了解并控制每種材料降解的機制和速率是很重要的。
[0022] 降解速率還影響生物相容性，因為極快的降解速率將釋放（并且潛在地累積）氨 基糖，這些糖可能引起輕度的炎性反應。具有低DD的殼聚糖樣品會誘發(fā)急性程度較高的 炎性反應，而具有高DD的殼聚糖樣品因降解速率低而誘發(fā)極少反應。經顯示，降解可隨DD 降低而增加。換句話說，一般而言，通過增加乙?；稍鲞M降解（Lim，Song等，2008)。 Kofuji等通過觀察在溶菌酶存在下殼聚糖溶液粘度的變化，研究了各種殼聚糖的酶促行為 (Kofuji, Qian等，2005)。他們發(fā)現(xiàn)，具有低DD的殼聚糖傾向于更迅速地降解。然而，其 他作者報道，降解的差異是由殼聚糖分子中乙酰胺基的分布不同引起。這是由脫乙?；?條件的差異所致，這些條件的差異通過改變分子間或分子內排斥力來影響殼聚糖溶液的粘 度。因此，可以得出結論，僅從DD無法估算出降解速率。
[0023] 牛物相容件
[0024] 殼聚糖顯示出極佳的生物相容性，但這一特性取決于樣品的特征（例如，天然來 源、制備方法、Mw及DD)。盡管消化（口腔/胃腸）酶可以部分地降解殼聚糖，但當口服施 用時，它不被吸收。出于這一原因，認為殼聚糖無法通過口服途徑供生物利用。殼聚糖在小 鼠中的LD50為約16g/kg，具有極高劑量并且伴有可忽略的急性毒性。據(jù)報道，殼聚糖的毒 性取決于DD。Schipper等報道，DD高于35%的殼聚糖顯示低毒性，而DD低于35% (即， 幾丁質）引起劑量依賴性毒性（Schipper, Varum等，1996)。另一方面，殼聚糖的Mw不影響 毒性（Schipper, Varum 等，1996)。
[0025] 已經在體外用心肌細胞、內皮細胞和上皮細胞、成纖維細胞、肝細胞、軟骨細胞及 角質形成細胞來證明殼聚糖的細胞相容性（Aranaz, Mengibar等，2009)。這一特性似乎與 樣品的DD相關。當該聚合物的正電荷增加時，由于游離氨基的存在，殼聚糖與細胞之間的 相互作用也增加。角質形成細胞和成纖維細胞在具有不同DD的若干殼聚糖薄膜上的粘附 性和增殖取決于兩個因素：DD和細胞類型。在兩種細胞中，細胞粘附百分比明顯取決于DD， 隨這一參數(shù)而增加。細胞類型也是影響粘附的一個因素，成纖維細胞更有利，這些細胞展現(xiàn) 的負電荷表面比角質形成細胞多。另一方面，通過增加 DD，增殖明顯減少。因此，在創(chuàng)傷愈 合和生物應用中細胞粘附與細胞增殖的平衡需要適當?shù)腄D。
[0026] 含有不同Mw殼聚糖的殼聚糖薄膜具有不同的粘附力，但統(tǒng)計學分析揭露，薄膜之 間的生物粘附力無顯著差異。相反，Roldo等顯示，中等Mw殼聚糖的最大脫附力比低Mw殼 聚糖和高Mw殼聚糖要高（Roldo, Hornof等，2004)。
[0027] 含殘留蛋白質的不純幾丁質和殼聚糖會在一些個體內引起過敏反應，如過敏癥。 樣品中蛋白質的含量取決于樣品的來源并且尤其是制備方法。當如以上所描述（例如，酸 隨后強堿加上熱處理）來制備時，純化的殼聚糖是非致敏性的。盡管〇. 2-0. 3%的人群表現(xiàn) 出對海洋甲殼動物過敏（Osterballe, Hansen 等，2005 ;0sterballe，Mortz 等，2009)，但尊 敬的作者Riccardo Muzzarelli博士針對殼聚糖得出以下結論：
[0028] 目前將幾丁質解釋為致敏性物質是不明智的，需要進行更多的臨床研究和遺傳研 究。螃蟹、褐奸、對奸（prawn)和龍奸（lobster)幾丁質，以及所有等級的殼聚糖一旦經過純 化，就不應被視為"甲殼動物衍生物"，因為分離程序已經在一定程度上去除了蛋白質、脂肪 和其它污染物，由此容許將其分類為化學品，不管其起源如何。[(Muzzarelli2010)第305 頁]
[0029] 已經鑒別出主要的褐蝦過敏原為肌肉蛋白質原肌球蛋白……褐蝦來源的葡糖胺 是安全的，即使個體對原肌球蛋白過敏。Villacis等指出，由各種制造商制造的葡糖胺補充 品不應含臨床上相關水平的過敏原[76]。Gray等清楚地指出，"貝蝦類過敏是由針對貝蝦 類肉中而不是殼中的抗原的IgE抗體引起；因此，服用葡糖胺補充品對于貝蝦類過敏的患 者應當是安全的" [77]。[ (Muzzarelli2010)第300頁]
[0030] 另外，就純化的殼聚糖作為"創(chuàng)傷敷料"產品內的材料來說，Muzzarelli博士指 出：
[0031 ] "在實驗和臨床前手術試驗中，使用幾丁質/殼聚糖和其衍生物從未導致過敏或其 它疾病。" [(Muzzarelli2010)第 304 頁]
[0032] |卜血的考虎
[0033] 殼聚糖的Mw還影響紅細胞的結合或凝集（Mi, Shyu等，2001 ;Ishihara, Obara 等，2006 ;Pang, Chen 等，2007 ;Aranaz, Mengibar 等，2009 ;Zhang, Xia 等，2010)。在近 期的論文中，對于固態(tài)殼聚糖與殼聚糖乙酸生理鹽水溶液進行了比較性研究（Jian, Feng 等，2008)。測試了 Mw為2000到400kDa并且DD為90 %到70 %的若干殼聚糖樣品。發(fā)現(xiàn) 固態(tài)殼聚糖和"殼聚糖乙酸生理鹽水溶液"遵循不同的止血機制。當將血液與殼聚糖乙酸 生理鹽水溶液混合時，紅細胞凝集并且這些細胞變形。與在100-1，OOOkDa之間范圍內的Mw 的影響相比較，殼聚糖乙酸生理鹽水中的DD，尤其是高DD，對于紅細胞的異常凝集和變形 具有顯著影響。然而，這一現(xiàn)象在固態(tài)殼聚糖中未觀察到。具有高DD的固態(tài)殼聚糖結合更 多的血小板并且止血作用更強。
[0034] 市售的含有殼聚糖和其鹽形式的眾多醫(yī)療裝置產品都可用于控制出血（例如，酸 性的凍干殼聚糖海綿）。這些裝置典型地作為創(chuàng)傷敷料或"繃帶"而用于創(chuàng)傷的外表面（參 見以下參考文獻：FDA批準的裝置）。
[0035] 粘臘粘附
[0036] 若干因素會影響殼聚糖的粘膜粘附，如生理學變量和殼聚糖的物理化學特性。粘 膜是由稱為粘蛋白的糖蛋白構成的，由于具有水楊酸殘基而富含負電荷。在胃部，殼聚糖由 于酸性環(huán)境而帶正電荷，并因此，它可以通過靜電力與粘蛋白相互作用。這一聯(lián)合的程度取 決于粘蛋白中存在的水楊酸的量以及殼聚糖的Mw和DD。已經發(fā)現(xiàn)，當殼聚糖的Mw增加時， 粘蛋白層中的滲透性也增加，并由此使粘膜粘附增強（Lehr, Bouwstra等，1992)。另一方 面，較高的DD導致分子電荷密度增加，并且粘附特性變得更相關（He，Davis等，1998)。
[0037] 抗微牛物活件
[0038] 殼聚糖的一個固有特性是，它賦予針對廣譜細菌的顯著抗細菌活性（No, Park 等，2002;Jou，Yuan 等，2007)。Aimin 等（Aimin，Chunlin 等，1999)已顯不，殼聚糖可以 降低兔中由金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)實驗性誘發(fā)的骨髓炎的感染率。這 與由氨基賦予殼聚糖的陽離子性和細菌細胞壁上的陰離子有關。帶正電的殼聚糖與帶負電 的微生物細胞壁之間的相互作用導致細胞內成分的漏出。殼聚糖與DNA的結合以及mRNA 合成的抑制是經由殼聚糖滲透到微生物細胞溶質中并且干擾mRNA和蛋白質的合成而發(fā)生 (Liu, Guan 等，2001)。
[0039] 還提出了其它機制。殼聚糖可以通過充當螯合劑，使金屬、微量元素或必要養(yǎng)分無 法用于供生物體以正常速率生長來抑制微生物生長。殼聚糖還能夠與絮凝蛋白質相互作 用，但這一作用具有高的pH依賴性。
[0040] 此外，殼聚糖還具有抗真菌特性。若干作者已經提出，殼聚糖針對絲狀真菌的抗微 生物作用可以通過比較直接地擾亂膜功能來解釋。然而，尚不了解殼聚糖的抗微生物活性 是由生長抑制作用（抑真菌作用）還是細胞死亡（殺真菌作用）引起。
[0041] 抗氣化活件
[0042] 殼聚糖已經顯示出針對不同自由基物質的顯著清除能力，其結果與 用市售的抗氧化劑所獲得的結果相當?；谇宄?，1-二苯基-2-苦肼基 (1，l-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、輕基、過氧化物及燒基自由基的能力，對由螃蟹 殼幾丁質制備的DD為90%、75%和50%的樣品進行評價。結果揭露，具有較高DD的殼聚 糖展現(xiàn)出最高的清除活性（Park，Je等，2004)。另一方面，針對超氧化物和羥基自由基來分 析不同大小的殼聚糖以及其硫酸鹽衍生物。發(fā)現(xiàn)殼聚糖的Mw與活性之間呈負相關。殼聚 糖硫酸化衍生物對于過氧化物自由基呈現(xiàn)較強的清除效應，但Mw最低的殼聚糖顯示出比 其它殼聚糖顯著的亞鐵離子螯合效力。金屬離子的螯合作用是殼聚糖能夠被視為潛在天然 抗氧化劑的原因之一。殼聚糖可以通過螯合系統(tǒng)中存在的亞鐵離子，由此消除其促氧化活 性或其向鐵離子的轉化來延遲脂質氧化（Pengl998)。
[0043] 殼聚糖的當前應用
[0044] 殼聚糖（天然的陽離子多糖）和其鹽形式（例如，乙酸鹽、乳酸鹽、氯化物、磷酸鹽 等）作為用于多種應用，尤其是食品、醫(yī)療裝置、化妝品及護發(fā)產品和藥物中的無毒并且生 物可降解的生物聚合物，已經引起了相當大的關注（Johnson和Nichols2000)。
[0045] 就食品來說，近年來，殼聚糖由于能夠結合脂肪而被用于非處方藥，如多種營養(yǎng)補 充產品中的膳食補充品或降膽固醇劑。已經鑒別出殼聚糖為天然來源的通用生物聚合物， 由于其針對食物變質微生物的抗微生物作用及抗氧化特性而用于食品防腐。pH依賴性溶解 度使其能夠使用水處理而成形為各種形狀（例如珠粒、薄膜和膜）。已經描述，珠粒和顆粒 適用于樹脂、填料、吸收劑、吸附劑及絕緣材料（Smithl994) (Unger和Rohrbachl996)。已有 大量文獻證明，使用殼聚糖涂層作為保護屏障可延長許多水果和蔬菜的儲存性。
[0046] 殼聚糖結構的當前醫(yī)學應用
[0047] 殼聚糖因其生物特性而被用于創(chuàng)傷愈合管理（例如，創(chuàng)傷敷料和"繃帶"）、可植入 裝置系統(tǒng)（如整形外科和牙周復合物、供組織再生用的支架）及藥物遞送系統(tǒng)和DNA遞送 系統(tǒng)中的研究和/或商業(yè)產品中。
[0048] 多年來，殼聚糖作為生物可降解的天然生物聚合物，已經被用作生物相容性創(chuàng)傷 敷料?；跉ぞ厶堑牟牧暇哂懈叨壬锵嗳菪裕瑹o毒并且僅存在早期、輕度、巨噬細胞占優(yōu) 勢的炎性反應。一般來說，殼聚糖的獨特化學和生物特性、生物降解特征及生物相容性使其 在生物醫(yī)學應用中引起注意。含殼聚糖的產品當前可用于醫(yī)藥市場上，典型地如用于促進 創(chuàng)傷愈合的US FDA的I類醫(yī)療裝置創(chuàng)傷敷料或"繃帶"?；跉ぞ厶堑漠a品在國際上的應 用甚至可能比美國更廣泛。
[0049] 鈍化的殼聚糖在人體中的安全件
[0050] 純化的殼聚糖在人體中的安全性已經廣泛報道（Illuml998 ;Baldrick2010)。已 經在各種情形中證實在人體中的安全性：
[0051] 1.FDA枇準的裝置：鈍化的殼聚糖是眾多US FDA批準的I類醫(yī)療和牙科裝置的組 分，并且在大多數(shù)情況下是作為主要組分。它是以各種成品形式使用，如顆粒、繃帶和紗布 中的薄膜組分，及凍干的"海綿"。FDA510(k)售前通知列出的I類產品的實例包括HemCon 繃帶、HemCon牙科敷料、HemoHalt止血貼創(chuàng)傷敷料、Aquanova超強吸收敷料、CEL0X可溶袋 中的局部止血顆粒及ChitoGauze。
[0052] 2. GRAS會品添加劑:殼聚糖以各種殼聚糖制造商（例如Primex) "自確定的"水平 作為食品添加劑被視為一般認為安全的（Generally Accepted as Safe,GRAS)。據(jù)我們所 知，遵循完整FDA評述，在"未加評論"的更高水平下的GRAS名稱尚未出現(xiàn)過。殼聚糖被科 學界認為可安全用于食品中，不過有一點需注意：攝取的殼聚糖對膳食脂質具有親和力并 且可以減少胃腸道的脂質吸收。
[0053] 3.化妝品與消費者皮膚護理產品:殼聚糖被列于化妝品原料國際命名 (International Nomenclature of Cosmetic Ingredients，INCI)中。殼聚糖和其各種鹽 形式（例如乳酸鹽、乙醇酸鹽、抗壞血酸鹽、甲酸鹽及水楊酸鹽）及其它有機衍生物被列為 用于化妝品和消費者皮膚護理產品中的成分并且被眾多供應商使用。然而，殼聚糖尚未通 過化妝品原料評估（Cosmetics Ingredients Review,CIR)進行評價。為安全起見，這一行 業(yè)專家小組評價了數(shù)量極其有限的化妝品原料的安全性。據(jù)我們所知，殼聚糖未被專家組 考慮在內，并且科學界認為它用于消費者皮膚護理產品和化妝品是安全的。
[0054] 鉬織工稈
[0055] 組織工程是多學科的科學，包括材料工程和分子/細胞生物學中嘗試開發(fā)衰竭組 織和器官的生物替代品的基本原理。在最全面意義上，組織工程試圖制造身體的活體代用 部分。Langer和Vacanti (Langer和Vacantil993)報道，用于工程化生物替代品的最常用 方法是基于活細胞、信號分子和聚合物支架。細胞合成新組織的基質并且代替患病或受損 組織起作用，而支架為細胞能夠有效實現(xiàn)其任務（如粘附、增殖和分化）提供適合的環(huán)境。 信號分子的功能是幫助并促進細胞再生新組織。支架不僅提供了形成所設計的組織的臨時 三維構架，而且還提供空間填充和生物活性信號分子的控制釋放。為了在組織工程中執(zhí)行 這些不同的功能，支架應當滿足以下要求：（1)與組織的生物相容性和促進細胞粘附的環(huán) 境；（2)以對應于新組織形成速率的最佳速率進行生物降解；（3)無毒并且無免疫原性；(4) 最佳的機械特性；及（5)適于在支架內以及在支架與局部環(huán)境之間運輸氣體、代謝物、養(yǎng)分 及信號分子的足夠孔隙率和形態(tài)。
[0056] 殼聚糖是組織工程中最有前景的生物材料之一，因為它提供了一組截然不同的有 益物理化學和生物特性，使其適用于各種類別的器官（如皮膚、骨骼、軟骨、肝、神經及血 管）的組織再生。近期進行的再生組織工程研究提出了使用支架來支撐并組織受損的組 織，因為三維基質為細胞行為提供了更有利的周圍環(huán)境。由于具有低免疫原活性、受控制的 生物降解性及多孔結構，殼聚糖骨架成為設計組織工程系統(tǒng)的頗具前景的材料。
[0057] 已知如孔隙大小、形狀和分布等微觀結構對于細胞侵入、增殖及在組織工程中的 功能具有顯著影響。在支架上進行的細胞附著研究顯示，較高的DD有利于細胞粘附（Seda Tigli，Karakecili等，2007)。然而，本公開涵蓋56%到99%的殼聚糖DD。
[0058] 支架的降解性在組織工程化細胞/材料構建體的長期性能方面起到關鍵作用，因 為它影響到許多細胞過程，包括細胞生長、組織再生及宿主反應。如果將支架用于骨骼系統(tǒng) 的組織工程，那么支架生物材料的降解應當相對較慢，因為它需要維持機械強度直到組織 再生完成或接近完成。降解速率也隨時間而固有地影響機械特性和溶解特性。
[0059] 近來，關注點集中在通過靜電紡絲法來制備聚合納米纖維，這是一項獨特技術，因 為取決于聚合物和加工條件，該技術能夠制造出直徑在數(shù)微米到數(shù)十納米范圍內的殼聚糖 納米纖維。靜電紡絲向聚合物溶液或熔體的毛細液滴施加高電壓以克服液體表面張力， 并由此能夠形成比常規(guī)纖維紡絲方法更精細的纖維。這些納米纖維模擬天然細胞外基質 (extracellular matrix, ECM)的結構和功能，并且在組織工程中作為支架材料來恢復、維 持或改善人體組織的功能而引起極大關注，因為這些材料具有若干有用的特性，如高比表 面積和高孔隙率。近期已經嘗試通過靜電紡絲來制備基于殼聚糖的納米纖維結構，并取得 了不同程度的成功。Min等（Min, Lee等，2004)制造出平均直徑為llOnm并且直徑在40nm 至Ij 640nm范圍內（通過SEM圖像分析測量）的幾丁質和殼聚糖納米纖維。Bhattarai等 (Bhattarai, Edmondson等，2005)進一步推斷，這些基于殼聚糖的納米纖維促進軟骨細胞 和成骨細胞粘附并且維持特征性細胞形態(tài)。
[0060] 創(chuàng)傷愈合
[0061] 幾丁質和殼聚糖使免疫細胞和炎性細胞（例如，PMN和巨噬細胞）、成纖維細胞及 血管內皮細胞活化。這些效應與樣品的DD相關，幾丁質呈現(xiàn)的作用比殼聚糖弱。Okamoto 和同事報道，殼聚糖在實驗動物模型中影響創(chuàng)傷修復的所有階段（Okamoto, Shibazaki 等，1995)。在發(fā)炎階段，殼聚糖具有獨立于正常凝血級聯(lián)的獨特止血特性。在體內，這些 聚合物還可以刺激成纖維細胞增殖并且調節(jié)嗜中性粒細胞和巨噬細胞的遷移行為，從而改 良后續(xù)修復過程，如纖維素增生和再上皮化（Okamoto, Shibazaki等，1995 ;Kosaka, Kaneko 等，1996)。Kosaka等報道，殼聚糖的細胞結合和細胞活化特性在其潛在作用方面起到關鍵 作用。這些研究進一步證實了殼聚糖適合作為創(chuàng)傷愈合材料，其中將細胞接種到基于殼聚 糖的支架上將提供生物相容并且有活力的組織工程化植入物。
[0062] 殼聚糖低聚物還展現(xiàn)出創(chuàng)傷愈合特性（Minagawa, Okamura等，2007)。已經提出， 其創(chuàng)傷愈合特性是歸因于其能夠通過影響成纖維細胞生長因子來刺激成纖維細胞產生。隨 后的膠原蛋白產生進一步促進了結締組織的形成（Howling, Dettmar等，2001)。
[0063] 已經對幾丁質寡糖在創(chuàng)傷愈合中的潛在作用以及其針對慢性腸病的能力進行研 究（Deters, Petereit等，2008)。殼聚糖低聚物和單體的創(chuàng)傷愈合作用特別值得關注，因為 在體內溶菌酶將殼聚糖聚合物降解成這些較小的分子。
[0064] 已經發(fā)現(xiàn)，基于殼聚糖的植入物引起最少的外來物反應，具有極少或無纖維包覆。 典型的愈合過程伴隨正常肉芽組織的形成，通常伴隨血管生成加速。殼聚糖具有促進真皮 快速再生及加速創(chuàng)傷愈合的有利特性，適合于從簡單的創(chuàng)傷敷料到復雜的人工皮膚基質的 多種應用。在巨噬細胞樣細胞降解殼聚糖植入物的過程中，已經報道殼聚糖可刺激抗炎性 細胞因子級聯(lián)（Chellat, Grandjean-Laquerriere 等，2005)。
[0065] 理想的皮膚敷料應控制創(chuàng)傷中蒸發(fā)的水以最佳速率損失。正常皮膚的經皮水分損 失（transepidermal water loss, TEWL)速率為每天204g/m2,而角質層和表皮損傷的受損 皮膚的TEWL速率可以在每天279g/m2 (對于"一度"燒傷）到每天5138g/m2 (對于缺乏表皮 的肉芽狀創(chuàng)傷）范圍內。創(chuàng)傷敷料的水蒸氣滲透性應當防止過度脫水以及滲出物的積累。 推薦的每天2500g/m 2的速率（在受損皮膚損失率的中間范圍內）將提供適當水平的水分， 同時無創(chuàng)傷脫水的風險。取決于膜燒注之前滲透蒸發(fā)（per-evaporation)的時間,所制造 的不對稱殼聚糖膜的水分損失數(shù)據(jù)在每天2109到2792g/m 2范圍內（Mi, Shyu等，2001)。海 綿樣底層的高孔隙率使水蒸氣的吸附增加，并且致密皮膚層的厚度減小使得水分子的擴散 增加，由此引起水蒸氣傳遞速率的增加。
[0066] 藥物遞送系統(tǒng)
[0067] 殼聚糖在工業(yè)中的一項重要應用是開發(fā)藥物遞送系統(tǒng)，如納米粒子、水凝膠、微球 體、薄膜及片劑。由于具有陽離子性，殼聚糖能夠與多陰離子反應，得到聚合電解質絡合物。 藥物應用包括經鼻、眼、口、陰道、腸胃外及透皮藥物遞送。需考慮的殼聚糖的三個主要特征 為：Mw、DD及純度。當殼聚糖鏈變短（低Mw殼聚糖）時，這些鏈可以直接溶解于水中，這特 別適用于特定生物醫(yī)學應用，當pH保持在約7.0,或略低（約5. 5-6. 5)時特別適用于皮膚 病學或消費者皮膚護理應用。
[0068] 在藥物遞送中，選擇具有某些特征的理想殼聚糖類型可用于開發(fā)持續(xù)藥物遞送系 統(tǒng)，延長藥物活性持續(xù)時間，改善治療效率并減少副作用。殼聚糖的物理化學特征對于選擇 適當殼聚糖作為藥物遞送媒介物的材料特別重要。
[0069] 由于控制殼聚糖基質的裝載和釋放特征的疏水相互作用的變化，故DD控制殼聚 糖中的結晶度和疏水性（Dragetl996)。Zhang等還報道，已顯示高殼聚糖DD和窄聚合物Mw 分布對于控制粒度分布至關重要（Zhang, Oh等，2004)。
[0070] Desai和Park觀察到，當用于制備微球體的殼聚糖Mw增加時，維生素 C的釋放 速率變低（Desai和Park2006)。他們研究了釋放動力學并且發(fā)現(xiàn)它遵循菲克擴散定律 (Fick' s law of diffusion)〇
[0071 ] 就體外釋放研究來說，含有低Mw和中等Mw殼聚糖的薄膜所釋放的藥物量類似，但 用高Mw殼聚糖制備的薄膜則較低。考慮到殼聚糖的摩爾質量與其溶液的粘度之間的直接 關系，這一特性是可預測的。通過增加聚合物的粘度，使得藥物穿過所形成的凝膠層向釋放 介質中的擴散延遲（El-Kamel, Ashri等，2007)。
[0072] 某閔遞送
[0073] 由于帶有正電荷，殼聚糖能夠與帶負電荷的分子（如DNA)相互作用。這一特性在 1995年首次被用于制備基因遞送系統(tǒng)的非病毒載體（MacLaughlin, Mumper等，1998)。與 病毒載體相比較，使用殼聚糖作為基因遞送的非病毒載體提供了若干益處。主要的是，殼聚 糖不產生內源重組、致癌作用并且僅引起輕度的免疫反應。另外，殼聚糖/質粒DNA復合物 可以容易地以低成本制備。
[0074] 殼聚糖的Mw是殼聚糖/DNA復合物制備中的一個關鍵參數(shù)，因為轉染效率與殼聚 糖Mw明顯相關。高分子量殼聚糖產生極為穩(wěn)定的復合物，但轉染效率極低。為了改善轉染 效率，近期的研究檢查了低Mw殼聚糖和低聚物在基因遞送載體中的應用。為了獲得高水 平轉染，似乎必須實現(xiàn)細胞外DNA保護（在高Mw下較佳）與有效細胞內解包裝（在低Mw 下較佳）之間的精細平衡。Lavertu等研究了若干個殼聚糖Mw與DD的組合，發(fā)現(xiàn)使用具 有10kDa分別與92% DD和80% DD的兩個殼聚糖組合具有高轉染效率（Lavertu，Methot 等，2006)。
[0075] Kiang等研究了在殼聚糖-DNA納米粒子中殼聚糖脫乙酰基化程度對基因轉染效 率的影響（Kiang，Wen等，2004)。高度脫乙?；臍ぞ厶牵ǔ^80% )釋放DNA極慢。 他們提出，使用DD低于80 %的殼聚糖可以促進DNA的釋放，因為該殼聚糖降低了電荷密度， 可以增加與DNA形成的復合物的位阻，并且已知其可加速降解速率。他們報道，當DD從90% 降低到70%時，熒光素酶報道基因表達增加。62%和70%脫乙?；呐渲莆镆鸬臒晒?素酶轉基因表達比90%脫乙?；臍ぞ厶歉邇蓚€數(shù)量級。
[0076] 殼聚糖臘
[0077] 殼聚糖膜或薄膜的潛在和實際應用是作為阻隔膜用于在手術期間分離組織層。 典型地使用了三種方法來制備具有低密度到高密度的膜狀或薄膜狀殼聚糖結構。這些制 備方法是溶劑燒注、相分離及浸沒-沉淀相轉化（Madihally和Matthewl999 ;Hong, Wei 等，2007)。對于全部三種方法，通過將適量的殼聚糖粉末（例如，75-90 % DD/400-500mPas) 溶解于1% (v/v)乙酸溶液中來制備不同濃度（例如，2-4% w/v)的殼聚糖溶液。接下來， 將殼聚糖溶液澆注到定制的硅酮模具腔中。就這一點來說，這三種不同的方法（如下文所 描述）彼此不同。
[0078] 在相分離方法中，澆注的酸性殼聚糖溶液在_20°C下冷凍過夜，然后在10 ΧΚΓ3毫 巴下于-40°C下冷凍干燥48小時。然后，使冷凍干燥的殼聚糖材料脫模并且用IN NaOH處 理4小時以使殼聚糖聚合物網絡穩(wěn)定，用蒸餾水反復洗滌，然后放入50°C烘箱中干燥。相分 離方法產生相對較低密度的多孔"海綿"，并且孔隙大小可以加以控制（Mi，Shyu等，2001) (No 等，2002)。
[0079] 冷凍殼聚糖溶液產生兩個或更多個截然不同的相-典型地將水冷凍成冰，并且殼 聚糖生物材料移位到單獨的固相中。需要另一個步驟來去除冷凍的溶劑（典型地為冰），并 且由此制得低密度多孔海綿，這是創(chuàng)傷敷料的常用形式。此法不會因冷凍干燥（即，凍干） 和/或冷凍替代步驟而破壞纖維狀結構。
[0080] 對于溶劑澆注法，簡單地在50°C烘箱中對澆注的酸性殼聚糖溶液進行干燥以去除 溶劑，從而留下殼聚糖膜。在干燥之后，用INNaOH處理殼聚糖膜4小時，用蒸餾水反復洗滌 以去除任何微量的反應劑，然后放入50°C烘箱中干燥。在以此方法澆注溶液之后，當溶劑開 始汽化時，聚合物溶液表面上的溶劑比內部的溶劑汽化快，使得聚合物濃度迅速增加，從而 借助于膠狀粒子而形成層狀。在形成表面層之后，溶劑的汽化減慢。殼聚糖的溶解度不足 以使系統(tǒng)維持均勻溶液形式，并且引起相分離。從該均勻溶液分離的溶劑形成缺少聚合物 的相，被富含聚合物的相包圍。酸性溶劑與中和性堿的交換使聚合物網絡穩(wěn)定。
[0081] 在第三種方法，即，浸沒-沉淀相轉化（immersion-precipitation phase inversion，IPPI)方法中，在50°C烘箱中使?jié)沧⒌乃嵝詺ぞ厶侨芤海ú糠值兀┟撍?小時 以形成不對稱膜，隨后通過將其浸入〇. 2MNa0H溶液中24小時來使呈膜形式的殼聚糖聚合 物穩(wěn)定。然后用脫離子水反復洗滌所得膜，并且接著冷凍干燥48小時。IPPI方法產生具有 三層的不對稱多孔膜：致密的外層、不太致密的中間過渡層，然后是海綿狀多孔層，全部都 是可以控制的（Hong, Wei等，2007)。
[0082] 有關殼聚糖和其用途的評述已經公開（Kato, Onishi等，2003 ; Niekraszewicz2005 ;Boateng，Matthews 等，2008 ;Aranaz，Mengibar 等，2009 ;Zhang，Xia 等，2010)。
[0083] 殼聚糖海綿的制備和用途描述于現(xiàn)有技術中：
[0084] (1)有關未壓縮的凍干的中性海綿（Zhang, Cheng等，2006 ; SedaTigli, Karakecili 等，2007 ;Blan 和 Birla2008);及
[0085] (2)有關未壓縮的凍干的非中性海綿（Tully-Dartez, Cardenas等，2010 ; McAdams, Block 等，2011)。
[0086] 還描述了若干其它增加殼聚糖材料的密度的方法，包括：
[0087] (1)將凍干的酸性海綿壓縮到未指定的密度（McCarthy, Gregory等，2008 ; Gregory 和 McCarthy2009);
[0088] (2)將凍干的酸性海綿壓縮到小于或等于0. 8g/cm3的指定密度 (McCarthy, Gregory 等，2008 ;Gregory 和 McCarthy2010;McAdams, Block 等，2011 ; McCarthy, Gregory 等，2011);
[0089] (3)不對稱空氣干燥（Ma, Wang 等，2001 ;Thein_Han 和 Stevens2004 ;Kuo2005 ; Kuo，Chang 等，2006 ;Dallan，da Luz Moreira 等，2007 ;Duan，Park 等，2007 ;Hong，Wei 等，2007 ;Pang, Chen 等，2007 ;Kuo2008) (Ma 等，2001) (Duan 等，2007);及
[0090] (4)靜電紡絲隨后乳制（Yeo, Jeon 等，2〇〇5 ;Li 和 Hsieh2〇〇6 ;Park, Kang 等，2006)。靜電紡絲制造出較薄的中性殼聚糖纖維，這些纖維可以摻混在一起成為分層網 狀產品。靜電紡絲技術不適用于本文所描述的本發(fā)明。
[0091] 可以通過在需要或不需要光活化的情況下進行化學交聯(lián)來加強殼聚糖結構 (Masuoka, Ishihara等，2005 ;0bara, Ishihara等，2005)。然而，這些交聯(lián)方法都不能將殼 聚糖的密度增加到本文所描述的本發(fā)明的高密度范圍。
[0092] 不對稱空氣干燥通過使酸性溶劑從殼聚糖溶液暴露的表面蒸發(fā)來增加殼聚糖溶 液的密度。當去除溶劑時，暴露的表面上殼聚糖的密度增加。這種增加殼聚糖密度的方法 可以產生致密的膜狀殼聚糖裝置。利用這種方法存在的一個特殊問題是在模具內溶液的表 面蒸發(fā)的不均勻性，以及在不壓縮情況下可能達到的密度有限。僅僅使用空氣干燥來制造 致密殼聚糖膜結構的另一個問題在于，干燥的膜在潤濕時過度膨脹，并且對于打算作為致 密的阻隔薄膜的材料在臨床上有問題。因此，不同于現(xiàn)有技術，本發(fā)明描述了制造高密度膜 狀殼聚糖材料的新方法，這些方法解決了當前的問題。
[0093] 概述
[0094] 截至目前，在手術和創(chuàng)傷愈合應用中使用純化的殼聚糖作為阻隔膜受到了殼聚糖 物理特性的限制。如現(xiàn)有技術中所描述來制備的殼聚糖可以產生薄膜、膜或海綿，其具有不 足以用于醫(yī)學應用的密度或其它物理特性。當根據(jù)醫(yī)學應用典型地需要的，潤濕達到易彎 曲程度時，所制備的密度〈〇. 6mg/cm3的殼聚糖具有的強度不足以可靠地支持手術安置期間 的穩(wěn)固縫合和操作。因此，已經開發(fā)出制造密度>〇. 6mg/cm3同時具有其它有益特性的殼聚 糖膜的新方法。這一高密度殼聚糖薄膜或膜提供了可靠地應用于臨床的必要強度和操作性 能。具體地說，本發(fā)明的高密度殼聚糖薄膜或膜具有適用于醫(yī)學領域的優(yōu)良拉伸強度、縫合 保留（即，對抽出式縫合的抗性）、彈性、適合厚度及形狀記憶（即，適應性），并且當再水合 時仍存在有限的膨脹。
[0095] 在已知用于增加殼聚糖密度的若干方法中，最常用方法包括凍干的殼聚糖海綿的 壓縮。盡管可以使用足夠的壓力將凍干的殼聚糖支架壓縮成高密度，但這一常用程序的缺 點在于，壓縮的凍干支架在再潤濕后保持形狀記憶，并且過度重繞成在臨床上作為膜不可 接受的厚度。通過這一壓縮凍干海綿的方法不可能限制潤濕之后重繞的厚度及在膜狀結構 中維持足夠的密度，并因此不適于制備強度足以用于臨床操作和縫合的致密膜。因此，本發(fā) 明描述了制備約〇. 6-1. 6g/cm3并且厚度小于2mm的致密殼聚糖膜的新方法，并且本發(fā)明除 去了在壓縮之前制造海綿的常用步驟。
[0096] 本發(fā)明的本質是膜狀殼聚糖材料的制備和用途，該材料比凍干的殼聚糖海綿致 密，并且具有另外的特性，如適當?shù)睦鞆姸取⒖p合保留（即，對抽出式縫合的抗性）、彈性 及足夠的形狀記憶（即，適應性），并且當再水合時仍存在有限的膨脹，這與先前描述的殼 聚糖材料明顯不同。本發(fā)明不限制來自天然、半合成或合成來源的幾丁質或殼聚糖來源。
[0097] 產生本發(fā)明的關鍵步驟是：
[0098] 1)將酸性殼聚糖溶液浸泡在強堿中，直到該材料中的所有酸都被中和，并且所得 凝固的殼聚糖凝膠具有堿性pH。本發(fā)明不排除在中和之前進行空氣干燥。為了維持每單位 面積所希望的殼聚糖濃度，優(yōu)選地約〇. 3-0. 5g殼聚糖溶液/cm2,在所述中和過程期間，使用 模具或模型來保留殼聚糖溶液是優(yōu)選的。在所述中和之前，優(yōu)選在模具中冷凍殼聚糖溶液 以使在中和過程期間每單位面積殼聚糖的濃度穩(wěn)定并且促進在中和之前排除聚合物。在殼 聚糖從表面損失并且改變均勻殼聚糖結構之前，優(yōu)選使用化學領域的技術人員慣用的強堿 (優(yōu)選為1-2摩爾濃度的氫氧化鈉）使冷凍的殼聚糖懸浮物從冷凍殼聚糖懸浮物的外部向 內部聚合。
[0099] 2)去除固體殼聚糖凝膠中的水或液體，同時壓縮殼聚糖。脫水優(yōu)選是在凝固的殼 聚糖凝膠內的強堿與緩沖水溶液或水交換之后進行。脫水優(yōu)選是在真空中在熱存在下進 行。脫水優(yōu)選是在真空下在熱存在下時，通過半透膜（例如，賽璐玢（Cellophane)或類似 的纖維材料）減少溶劑相（例如，水、緩沖水溶液）來進行。壓縮優(yōu)選是用均勻地分散于殼 聚糖凝膠上的25英寸Hg的最低線性壓力進行。
[0100] 本發(fā)明的一個重要的獨特方面是將壓縮與脫水過程組合，由此使凝膠在壓縮期間 發(fā)生脫水。本發(fā)明的另一獨特方面是在脫水期間凝膠的pH呈中性或堿性。
[0101] 從以下【具體實施方式】的評述并且通過參照所附權利要求，可以更清楚地了解并理 解本發(fā)明的這些和其它目的、特征及益處。
[0102] 詳述
[0103] 基于前述發(fā)現(xiàn)，本文提供了密度大于0. 6g/cm3的新殼聚糖結構、制備組合物的方 法及使用該組合物用于在本文獻背景下所描述的醫(yī)學應用的方法。制備殼聚糖結構的方法 可通過以下三個連續(xù)步驟來表征：
[0104] a)提供水和殼聚糖的酸性溶液；
[0105] b)中和所述溶液以形成聚合殼聚糖的凝膠；
[0106] c)對該聚合殼聚糖凝膠同時進行脫水和壓縮。
[0107] 在一個優(yōu)選實施方案中，所得高密度殼聚糖薄膜或膜組合物的密度大于〇.6g/ cm3,并且更優(yōu)選大于0. 8g/cm3。
[0108] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，酸性溶液中所使用的殼聚糖起始物質為約 70-95% DD。然而，本發(fā)明也允許56% -99%的DD。
[0109] 在一個優(yōu)選實施方案中，殼聚糖是以殼聚糖堿形式存在。然而，該殼聚糖也可以呈 鹽形式，如殼聚糖乙酸鹽、殼聚糖琥珀酸鹽、殼聚糖己二酸鹽、殼聚糖氯化物、殼聚糖谷氨酸 鹽、殼聚糖乳酸鹽、殼聚糖天冬氨酸鹽、殼聚糖丙酮酸鹽、殼聚糖磷酸鹽、殼聚糖乙醇酸鹽、 殼聚糖抗壞血酸鹽、殼聚糖水楊酸鹽、殼聚糖甲酸鹽或殼聚糖蘋果酸鹽。
[0110] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，殼聚糖起始物質具有約400-500厘泊（CPS)或 毫帕（mPas)的平均粘度。然而，本發(fā)明涵蓋約5到3000mPas的殼聚糖起始物質粘度。 [0111] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，殼聚糖溶解于1%乙酸中。然而，本發(fā)明也考慮 除乙酸外的酸性溶劑并且溶劑百分比在0. 1% -10%范圍內。舉例來說，pH低于5.0的適 當有機酸，如甲酸、乙醇酸、檸檬酸或乳酸，也是適合的。其它適合的酸包括鹽酸、谷氨酸、天 冬氨酸、抗壞血酸、丙酮酸、蘋果酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、葡糖醛酸、山梨酸及葉酸。
[0112] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該溶液中殼聚糖的濃度為2%-4%。然而，本發(fā) 明涵蓋0. 1 %到25%的殼聚糖濃度。
[0113] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，在形成中性殼聚糖凝膠之前，將殼聚糖溶解于 酸性溶劑中，保持7天（在中和之前存在或不存在冷凍步驟）。然而，本發(fā)明也考慮在即將 形成中性殼聚糖凝膠之前或長達2年里所制備的殼聚糖溶液（在中和之前存在或不存在冷 凍步驟）。
[0114] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，將一定量殼聚糖溶液倒入一個模型或模具中， 達到每平方厘米該模型或模具的面積約0. 3-0. 5g殼聚糖溶液的厚度。然而，本發(fā)明涵蓋在 冷凍之前模具或模型內低至0. Ig/cm2或高達10g/cm2的殼聚糖溶液量。
[0115] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，通過該模具或模型對該溶液施加振動來使殼聚 糖溶液脫氣。振動時間優(yōu)選為10分鐘。然而，本發(fā)明涵蓋1秒到10天的振動時間。在替 代性實施方案中，本發(fā)明涵蓋通過施加真空來使殼聚糖溶液脫氣。
[0116] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在模具或模型中冷凍殼聚糖溶液以使其變?yōu)槟?固的殼聚糖懸浮物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在約_80°C下冷凍殼聚糖溶液1小 時。在替代性實施方案中，在約-20°C下冷凍殼聚糖溶液16小時。然而，本發(fā)明涵蓋在0°C 到-276°C范圍內的溫度下冷凍殼聚糖溶液，持續(xù)從1分鐘到365天的足以使殼聚糖溶液冷 凍的時間。本發(fā)明還涵蓋在該方法的這一階段中不冷凍殼聚糖溶液的可能。
[0117] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，使凝固的（如果冷凍的話）殼聚糖懸浮物以固 體形式脫模（從模具移出），隨后以固體形式浸入堿（如1-2M氫氧化鈉）中，保持24小時 以完全中和凝固的殼聚糖懸浮物內的酸性溶劑，從而產生聚合凝膠。然而，完全中和凝固的 殼聚糖凝膠內的酸性溶劑所需的堿的濃度和體積，以及浸沒的持續(xù)時間，可以根據(jù)凝固的 殼聚糖懸浮物的大小和酸度而變化。本發(fā)明涵蓋化學領域技術人員已知的若干種堿中的任 一種，如氫氧化鈉或氫氧化鉀，濃度在〇. 1M到10M范圍內，并且浸沒時間在1分鐘到3個月 范圍內。可以使用替代性氫氧化物，并且其包括氫氧化鈣和氫氧化鎂。
[0118] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在脫離子水或蒸餾水或者緩沖水溶液中洗滌具 有堿性pH的中性殼聚糖凝膠24小時以使堿性溶液變?yōu)橹行曰蚧旧铣手行缘膒H(例如， pH5-ll、5-9或5. 5-7. 5)。然而，本發(fā)明涵蓋從1分鐘到3個月的洗滌時間。本發(fā)明還涵蓋 在這一沖洗步驟期間使用連續(xù)流動的脫離子水或蒸餾水或者緩沖水溶液。本發(fā)明還涵蓋根 本不洗滌中性殼聚糖凝膠。
[0119] 在本發(fā)明的一個關鍵方面中，從中性殼聚糖凝膠去除液體，同時壓縮該殼聚糖。脫 水優(yōu)選是利用真空和熱進行的。壓縮優(yōu)選是用25英寸Hg的最低線性壓力進行的并且優(yōu)選 均勻地分散于殼聚糖凝膠上以獲得均勻膜。然而，涵蓋使用5-500英寸、10到100英寸或20 到50英寸Hg的最低線性壓力進行的壓縮。脫水和壓縮優(yōu)選是在80°C溫度下進行的。然 而，本發(fā)明涵蓋在2 °C到150°C、40°C到120°C或50°C到100°C范圍內的溫度下對殼聚糖凝膠 進行脫水和壓縮。
[0120] 當然，應了解，在稱為除氣的過程中，脫水和物理壓縮可以在真空下自行發(fā)生或通 過加熱發(fā)生。施加的真空優(yōu)選低于大氣壓力，并且低至0. 6、0. 4或0. 2個大氣壓。
[0121] 脫水和壓縮優(yōu)選進行4小時的時間。然而，本發(fā)明涵蓋進行脫水和壓縮在1分鐘 到3個月范圍內的時間。
[0122] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在施加真空進行脫水之前，將中性殼聚糖凝膠 放在半透膜之上或內部。該半透膜隨后促進水蒸氣在真空下散失，同時保持正在脫水和已 經脫水的聚合殼聚糖的完整性。半透膜可選擇性滲透水，同時在半透膜的邊緣或邊界內保 留模制的殼聚糖凝膠，并且可以是賽璐玢或其它纖維膜或另一材料。脫水的高密度殼聚糖 薄膜或膜隨后可以從脫水過程期間使用的半透膜移出。
[0123] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，將中性的聚合殼聚糖凝膠浸入甘油溶液中，保 持在1秒到10天范圍內的時間，然后將其放到半透膜之上或內部進行真空脫水。另外，該 甘油溶液優(yōu)選在水中或緩沖水溶液中含有約5%到20%或10%的甘油。然而，本發(fā)明在這 一過程期間也可以使用在1%到50%范圍內的甘油濃度。
[0124] 所得殼聚糖結構優(yōu)選呈厚度小于10mm、5mm、2mm、1mm或甚至0. 5mm的薄膜或膜的 形式。如先前所述，該結構的密度優(yōu)選超過〇. 6g/cm3,并且可以高達1.6g/cm3。在另一優(yōu)選 實施方案中，該結構的密度超過〇. 8g/cm3,并且可以高達1. 6g/cm3。該薄膜或膜也可以通過 其pH來表征，該pH優(yōu)選在5. 0到9. 5的范圍內。該薄膜或膜可以被切開或研磨并且以微 粒形式使用，但由于其優(yōu)良的物理特性（例如拉伸強度、彈性及對抽出式縫合的抗性），優(yōu) 選以薄膜或膜形式使用。
[0125] 在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的殼聚糖薄膜或膜不需要化學或光誘導交聯(lián)步 驟，并且仍獲得>0. 6g/cm3并且更優(yōu)選>0. 8g/cm3的脫水密度。然而，對于一些應用，包括化 學或光誘導交聯(lián)步驟可能提供一些益處，如降低生物降解可能性。
[0126] 在另一實施方案中，所得本發(fā)明的致密殼聚糖結構具有的物理特性有益于用于動 物、哺乳動物或人的生物醫(yī)學程序中，如手術植入的薄膜或膜。當評估拉伸強度、彈性和/ 或對抽出式縫合的抗性時，致密的殼聚糖材料呈現(xiàn)優(yōu)良的物理特征。已經建立了用于評價 薄膜或膜的這些物理參數(shù)的ASTM國際標準方法（ASTM2002 ;ASTM2006)。這些具有微小修 改的標準方法（例如，對于拉伸測試，根據(jù)ASTM標準方法D1708-06a，條帶為半圓形而非半 橢圓形模板圖案，并且最小寬度為約2. 5mm(ASTM2006);對于抽出式縫合，條帶的寬度為約 5_)已經被用于表征所得本發(fā)明的致密殼聚糖結構。
[0127] 本發(fā)明公開了組合物，該組合物包含密度大于0. 6g/cm3并且更優(yōu)選地大于0. 8g/ cm3的呈薄膜或膜形式的殼聚糖。在另一優(yōu)選實施方案中，該殼聚糖組合物的pH為5. 0到 9. 5。在另一優(yōu)選實施方案中，該殼聚糖組合物包括甘油。
[0128] 最后，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的結構進行治療的方法，并且因此可以定義為治 療方法，該方法包括：提供密度大于〇. 6g/cm3的殼聚糖組合物；及將所述組合物放置于動 物體上或其體內。在優(yōu)選實施方案中，該動物是哺乳動物或人，并且在另一優(yōu)選實施方案 中，使用前，該結構在水或緩沖水溶液中并且在存在或不存在一種或多種選自藥物、生物 齊U、核酸、疫苗、免疫效應物或其鹽的化合物的情況下發(fā)生水合作用。在另一優(yōu)選實施方案 中，該殼聚糖組合物用作物理阻隔薄膜或阻隔膜以分開動物體內的各個組織層。在另一優(yōu) 選實施方案中，在該動物、哺乳動物或人體上或其體內的薄膜或膜隨時間而再吸收，并且其 速率部分取決于該材料的DD和厚度。在另一優(yōu)選實施方案中，該殼聚糖組合物在動物體上 或其體內用作抗感染物理阻隔薄膜或阻隔膜。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，該殼聚糖 薄膜或膜可滲透水或水溶液中的小分子。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，多種物理特性 (例如，拉伸強度、彈性和對抽出式縫合的抗性）單獨或與臨床操作特征（例如，可潤濕性、 對于手術植入部位的適應性及可縫合性）的組合促進了所得致密殼聚糖薄膜或膜在動物、 哺乳動物或人的臨床環(huán)境中的優(yōu)良易用性。 實施例
[0129] 在中和之前冷凍殼聚糖溶液的優(yōu)選方法中，在_80°C下，在模具中將約0. 3-0. 5g/ cm2的殼聚糖溶液超低溫冷凍一小時最終引起殼聚糖在暴露的頂部表面上聚合，當通過顯 微鏡或掃描電子顯微鏡檢查時，在該表面處具有編織的纖維狀多孔結構。所得脫水薄膜或 膜的總密度>〇. 6g/cm3并且更優(yōu)選>0. 8g/cm3,并且略有些不對稱，在相對的底側具有更光 滑、不太像原纖維的表面。
[0130] 在中和之前冷凍殼聚糖溶液的優(yōu)選方法中，在_80°C下超低溫冷凍明顯超過一小 時（例如，兩小時）可以引起冷凍的殼聚糖凝膠以及最終膜結構的物理碎裂。
[0131] 在存在冷凍的優(yōu)選方法中，在中和之前，在模具內于_20°C下冷凍殼聚糖溶液使最 終膜結構中編織結構的范圍減小。不管冷凍溫度如何，所得膜的密度>〇. 6g/cm3。
[0132] 在中和前不冷凍殼聚糖溶液的情況下，所得經過壓縮和脫水的膜不具有可見的編 織原纖維結構。不管存在或不存在冷凍，所得膜的密度>〇. 6g/cm3。
[0133] 在中和酸之前冷凍酸性殼聚糖溶液與脫水加壓縮的關聯(lián)將通過在利用和不利用 冷凍過程情況下所產生的材料的機械特性進一步舉例說明。在使用Instron試驗機測 量對抽出式縫合的抗性時，在不利用冷凍過程情況下制備的殼聚糖膜具有每毫米膜厚度 2. 0N±0. 3N的較差抽出力，而在中和之前于-80°C冷凍溫度下保持1小時所制備的具有相 同組成的膜具有每毫米膜厚度4. 5N±0. 1N的優(yōu)良的對抽出式縫合的抗性。
[0134] 為了舉例說明在脫水和壓縮之前用堿將冷凍的殼聚糖懸浮物中和成半固體凝膠 的重要性，有關在壓縮酸性殼聚糖溶液的同時進行蒸發(fā)的嘗試失敗了。脫水加壓縮需要半 透膜（例如賽璐玢）來保留溶質（殼聚糖聚合物），同時允許溶劑通過，其中在干燥的同時， 殼聚糖的密度逐漸增加。無法通過半透膜對酸性殼聚糖溶液進行脫水的可能的原因是，粘 滯的未聚合殼聚糖最后累積在膜表面處并且阻止了溶劑的通過。結果是無法對該溶液進 行脫水，即使是在熱存在下。出于相同原因，在冷凍酸性殼聚糖溶液之后也無法立即進行脫 水和壓縮。出于相同原因，也無法對潮濕的酸性殼聚糖海綿（通過將酸性殼聚糖懸浮物凍 干來制備）進行脫水加壓縮，從而無法通過真空脫水進行干燥。出于相同原因，也無法對潮 濕、空氣干燥的酸性殼聚糖結構進行脫水加壓縮。在真空壓縮之前，通過以堿中和來使殼聚 糖懸浮物聚合是必要的。
[0135] 為了舉例說明蒸發(fā)和壓縮中性殼聚糖凝膠的重要性，在壓縮干燥的凍干酸性海綿 方面的嘗試引起殼聚糖膜結構碎裂。潤濕干燥的壓縮膜導致不可接受的重繞膨脹及未聚合 膜結構的損失。
[0136] 當將中性殼聚糖凝膠放入pH2. 9的酸性溶液中20小時的時候引起殼聚糖凝膠結 構瓦解，使得殼聚糖結構損失，舉例說明了當殼聚糖溶液在強堿中聚合成凝膠之后維持pH 高于5. 0的重要性。
[0137] 在pH4或更低的酸性環(huán)境中24小時之后致密殼聚糖薄膜或膜結構完全損失，舉例 說明了在中性殼聚糖凝膠脫水之后維持高于PH5. 0的pH環(huán)境的重要性。
[0138] 為了舉例說明使中性殼聚糖凝膠而非凍干的海綿脫水和壓縮的重要性，對潤濕的 中性凍干殼聚糖海綿進行壓縮產生0. 38g/cm3的不足殼聚糖密度。對干燥的中性凍干殼聚 糖海綿進行壓縮引起不足的殼聚糖密度（0. 〇65g/cm3)。
[0139] 為了舉例說明同時進行脫水和壓縮的重要性，在壓縮期間在不進行適當脫水的情 況下提供壓縮的實驗產生開裂并且不令人滿意的殼聚糖最終結構。
[0140] 在中和之前振動對酸性殼聚糖溶液的影響對最終膜結構無影響。
[0141] 為了舉例說明具有高密度的殼聚糖薄膜或膜的生物關聯(lián)性，這些膜展現(xiàn)對小分子 的滲透性。舉例來說，使用Franz池技術，由4%殼聚糖溶液制備的高密度殼聚糖薄膜或膜 可滲透磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate buffered saline，PBS)溶液中的亞甲基藍和結晶 紫（分別為Mw285和373)。這證實了這些薄膜或膜對所選小分子的滲透性。對于動物、哺 乳動物或人體上或其體內的養(yǎng)分的滲透性可能具有生理學益處。
[0142] 為進一步舉例說明具有高密度的殼聚糖薄膜或膜的生物關聯(lián)性，將活哺乳動物細 胞接種于這些膜上并在培養(yǎng)物中維持至少3天。觀察該膜兩側上的細胞結合和細胞相容 性。還證實了增殖和細胞遷移的證據(jù)。如通過顯微鏡圖像分析所測量，相對于較為多孔的 表面（即，當在模具中時的頂部），角質形成細胞遷移在較光滑的表面（即，當在模具中時的 底部）上最明顯。這些結果提供了體外生物相容性的證據(jù)。
[0143] 為了進一步舉例說明具有高密度的殼聚糖薄膜或膜的生物關聯(lián)性，當通過手術將 這些膜放到大鼠口腔上顎中完整厚度手術誘發(fā)的潰瘍的底部處時，觀察到哺乳動物模型中 創(chuàng)傷愈合。愈合與上皮下基質中膠原蛋白的再發(fā)育和潰瘍的再上皮化相關。在膜植入1到 12周之后進行的組織學分析也指示，高密度殼聚糖是生物可相容的，同時也是生物可降解 或可再吸收的。在動物、哺乳動物或人體上或其體內產生隨時間再吸收的物理屏障具有臨 床效用。舉例來說，不同組織（例如，骨骼對比軟組織）之間的物理屏障可以促進在該薄膜 或膜的相對側上的差異愈合速率。另外，就體外酶降解速率來說，類似地預期體內再吸收速 率（參見下文）取決于致密殼聚糖薄膜或膜的DD百分比和/或厚度。換句話說，降解速率 可以至少部分通過改變DD百分比和/或厚度進行"控制"。
[0144] 為了舉例說明密度與臨床功能和效用的關聯(lián)，干燥殼聚糖薄膜或膜的密度與其它 物理特性（如拉伸強度）之間存在強相關性。用具有微小修改的ASTM標準方法（例如，對 于拉伸測試，根據(jù)ASTM標準方法D1708-06a，條帶為半圓形而非半橢圓形模板圖案，并且最 小寬度為約2. 5mm(ASTM2006);對于抽出式縫合，條帶的寬度為約5mm)已經被用于表征所 得致密殼聚糖薄膜或膜。由本文要求保護的方法制備的致密殼聚糖薄膜或膜顯示出膜密度 與拉伸強度之間的直接相關性。一般來說，本發(fā)明的致密殼聚糖薄膜或膜當在一系列隨制 造批料變化的實驗變量（例如，起始殼聚糖溶液的量、小于1_并且典型地為〇. 2到0. 6_ 的干膜厚度、70%到95%的DD百分比、來自不同供應商的原材料，干燥后處理（如果有的 話）等等）下進行測試時，在使用Instron試驗機的測試中得到以下的典型物理特性范圍： (a)約2到14N的最大拉伸載荷（約2. 5mm最小寬度）；(b)約20到140MPa的最大拉伸應 力（約2. 5mm最小寬度）；及（c)約0· 5到4· 5N的抽出式縫合最大載荷（約5mm寬度）。
[0145] 另外，舉例說明本發(fā)明的致密殼聚糖薄膜或膜的物理特征與臨床效用的相關性的 是密度、拉伸強度、彈性及對抽出式縫合的抗性的組合，其中有一些或全部都是可縫合的可 植入手術膜所希望的特征。
[0146] 為了關于本文所公開并且要求保護的方法舉例說明殼聚糖脫乙?；年P聯(lián)，在 37°C下于pH6. 5的濃緩沖溶菌酶溶液中的降解對于70% DD膜在8天內完成，對于75% DD 膜在11天內完成，對于80%和85% DD膜在18天內部分完成，并且在90%和95%膜中在 這些條件下3周后仍不明顯。這些結果指示，起始聚合材料（S卩，DD百分比不同的殼聚糖 粉末）對于體外酶促降解的固有敏感性未被本發(fā)明的方法破壞，同時制造出致密殼聚糖薄 膜或膜。另外，本發(fā)明的致密殼聚糖薄膜或膜當放入乙酸溶液或PH4或更低的緩沖溶液中 時在無酶促降解作用情況下，保持對酸解聚（及增溶作用）的不穩(wěn)定性。
[0147] 為了舉例說明在脫水步驟之前，用甘油溶液（例如10%或50%甘油水溶液）處理 中性聚合殼聚糖凝膠的關聯(lián)，所得薄膜或膜具有與在沒有這一甘油溶液步驟情況下制造的 薄膜或膜類似的高密度，并且具有有益的高拉伸強度、對抽出式縫合的抗性，及操作特征， 如柔性和易于切割性。這一屬性組合（即，物理特性和臨床操作特征）提供了適用于動物、 哺乳動物或人體上或其體內的具有極大效用的薄膜或膜材料。
[0148] 在本申請通篇，提到了各種出版物。這些出版物的公開內容皆據(jù)此通過引用并入， 以便更充分地描述本發(fā)明所屬領域的現(xiàn)有技術水平。對于本領域技術人員將顯而易見的 是，在不背離本發(fā)明的范圍或精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和變更。通過考慮 本文所公開的本發(fā)明的說明和實踐，本發(fā)明的其它實施方案對于本領域技術人員將顯而易 見。預期這些說明和實施例僅被視為示例性的，而本發(fā)明的真實范圍和精神是由所附權利 要求書所指示。
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【權利要求】
1. 一種制備密度大于0. 6g/cm3的殼聚糖組合物的方法，其依序包括： a) 提供水和殼聚糖的酸性溶液； b) 中和所述溶液以形成聚合凝膠；及 c) 對所述凝膠同時進行脫水和壓縮。
2. 如權利要求1所述的方法，其另外包括在步驟（c)之后，使所述凝膠在水或緩沖水 溶液中在一種或多種化合物存在下再水合，所述化合物選自交聯(lián)劑、藥物、生物劑、核酸、疫 苗、免疫效應物或其鹽。
3. 如權利要求1所述的方法，其中所述組合物包含厚度小于2mm的薄膜或膜。
4. 如權利要求1所述的方法，其中所述溶液包含水、乙酸及殼聚糖。
5. 如權利要求1所述的方法，其中所述殼聚糖是呈殼聚糖堿形式或呈鹽形式，所述鹽 選自殼聚糖乙酸鹽、殼聚糖琥珀酸鹽、殼聚糖己二酸鹽、殼聚糖氯化物、殼聚糖谷氨酸鹽、殼 聚糖乳酸鹽、殼聚糖天冬氨酸鹽、殼聚糖丙酮酸鹽、殼聚糖磷酸鹽、殼聚糖乙醇酸鹽、殼聚糖 抗壞血酸鹽、殼聚糖水楊酸鹽、殼聚糖甲酸鹽及殼聚糖蘋果酸鹽。
6. 如權利要求1所述的方法，其中所述酸溶液包含選自以下的酸：甲酸、乙酸、乙醇酸、 檸檬酸、乳酸、鹽酸、谷氨酸、天冬氨酸、抗壞血酸、丙酮酸、蘋果酸、順丁烯二酸、反丁烯二 酸、葡糖醛酸、山梨酸、葉酸及其混合物。
7. 如權利要求1所述的方法，其中所述中和步驟（b)包括使所述溶液與氫氧化物鹽接 觸，所述氫氧化物鹽選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣及氫氧化鎂。
8. 如權利要求1所述的方法，其另外包括在中和步驟（b)之前，對所述酸性溶液進行冷 凍。
9. 如權利要求1所述的方法，其另外包括在脫水步驟（c)之前，在水或緩沖水溶液中對 所述凝膠進行洗滌。
10. 如權利要求1所述的方法，其另外包括在脫水步驟（c)之前，在水或緩沖水溶液中 將所述凝膠洗滌達到5. 5到7. 5的pH。
11. 如權利要求1所述的方法，其另外包括在脫水步驟（c)之前，將所述凝膠浸入1% 到50%的甘油溶液中。
12. 如權利要求1所述的方法，其中所述脫水包括在壓縮期間對所述凝膠施加真空。
13. 如權利要求1所述的方法，其另外包括在所述脫水步驟（c)之前，使所述殼聚糖凝 膠與選擇性滲透水溶液的膜接觸。
14. 如權利要求1所述的方法，其中在2°C到150°C的溫度下，在熱存在下使所述殼聚糖 凝膠脫水。
15. 如權利要求1所述的方法，其中所述壓縮步驟（c)包括在所述殼聚糖凝膠上施加 25英寸Hg的最低線性壓力。
16. 如權利要求1所述的方法，其中所述殼聚糖薄膜或膜具有5. 5到7. 5的pH。
17. -種治療方法，其包括： a) 提供密度大于0. 6g/cm3的殼聚糖組合物；及 b) 將所述組合物放置于動物體上或其體內。
18. 如權利要求17所述的方法，其中所述殼聚糖組合物具有大于0. 8g/cm3的密度。
19. 如權利要求17所述的方法，其中在所述放置步驟（b)之前，使所述組合物在水或緩 沖水溶液中水合。
20. 如權利要求17所述的方法，其中所述動物選自哺乳動物和人。
21. 如權利要求17所述的方法，其中在所述放置步驟（b)之前，使所述組合物在水或緩 沖水溶液中，在一種或多種化合物存在下水合，所述化合物選自藥物、生物劑、核酸、疫苗、 免疫效應物或其鹽。
22. -種組合物，其包含密度大于0. 6g/cm3的呈薄膜或膜形式的殼聚糖。
23. 如權利要求22所述的組合物，其具有0. 6g/cm3到1. 6g/cm3的密度。
24. 如權利要求22所述的組合物，其具有0. 8g/cm3到1. 6g/cm3的密度。
25. 如權利要求22所述的組合物，其具有5. 0到9. 5的pH。
26. 如權利要求22所述的組合物，其含有甘油。
【文檔編號】A61K31/722GK104144692SQ201280069003
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2012年12月19日 優(yōu)先權日:2011年12月22日
【發(fā)明者】A·A·德卡羅, A·埃利斯, T·P·杜利, M·貝羅索瓦 申請人:阿金塔生物技術公司