硫酸化糖胺聚糖與透明質(zhì)酸酶組合用于改善因子viii的生物利用度的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含因子VIII、硫酸化的糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶的用于在出血障礙的治療性和預(yù)防性治療中非靜脈內(nèi)施用的藥物制劑。本發(fā)明還涉及因子VIII、硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶組合用于治療或預(yù)防出血障礙的用途，以及用于在通過共施用硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶進(jìn)行因子VIII的非靜脈內(nèi)施用后增加生物利用度的方法。
【專利說明】硫酸化糖胺聚糖與透明質(zhì)酸酶組合用于改善因子Vl I I的生物利用度
[0001]本發(fā)明涉及包含至少一種因子VII1、至少一種硫酸化糖胺聚糖和至少一種透明質(zhì)酸酶藥物制劑，其用于出血障礙的治療性和預(yù)防性治療中的非靜脈內(nèi)施用。本發(fā)明還涉及因子VII1、硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶組合用于治療和預(yù)防出血障礙的用途，以及用于在通過共施用硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶進(jìn)行因子VIII的非靜脈內(nèi)施用后增加生物利用度的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]因子VIII (FVIII)
[0004]FVIII是哺乳動(dòng)物肝臟中產(chǎn)生的分子量約280kDa的血漿糖蛋白。其為導(dǎo)致血液凝固的凝血反應(yīng)級(jí)聯(lián)的至關(guān)重要的組分。該級(jí)聯(lián)中有一個(gè)其中因子IXa(FIXa)與活化的因子VlII(FVIIIa) 一起將因子X(FX)轉(zhuǎn)化成活化形式FXa的步驟。FVIIIa在該步驟中充當(dāng)輔因子，其與鈣離子和磷脂一起是使FIXa的活性最大化所需要的。最常見的血友病障礙是由被稱為血友病A的功能性FVIII缺乏而引起的。
[0005]血友病A的治療中的一項(xiàng)重要進(jìn)展是分離到編碼人FVIII的完整2，351個(gè)氨基酸的序列的cDNA克隆(美國專利N0.4，757，006)以及提供了人FVIII基因DNA序列和其重
組生產(chǎn)方法。
[0006]從克隆的cDNA確定的人FVIII的推導(dǎo)一級(jí)氨基酸序列的分析表明，其為從更大的前體多肽加工而成的異二聚體。該異二聚體由約80kDa的C末端輕鏈以及以金屬離子依賴性方式相締合的約200kDa N末端重鏈組成。(參見Kaufman, Transfusion Med.Revs.6:235(1992)的綜述)。該異二聚體的生理活化通過凝血酶對其蛋白質(zhì)鏈的蛋白水解切割發(fā)生。凝血酶將重鏈切割成90kDa的蛋白質(zhì)，隨后將其切割成54kDa和44kDa的片段。凝血酶還將80kDa的輕鏈切割成72k`Da的蛋白質(zhì)。正是后一種蛋白質(zhì)和通過鈣離子保持在一起的兩個(gè)重鏈片段(上述54kDa和44kDa)構(gòu)成了活性FVIII。當(dāng)44kDa A2重鏈片段從該分子上解離下來時(shí)或當(dāng)72kDa和54kDa結(jié)構(gòu)域被凝血酶、活化的蛋白C或FXa進(jìn)一步切割時(shí)，發(fā)生失活。在血漿中，F(xiàn)VIII通過與50倍摩爾濃度過量的Von Willebrand因子蛋白(〃VWF〃)締合而得以穩(wěn)定，所述因子蛋白似乎抑制上述FVIII的蛋白水解破壞。
[0007]FVIII的氨基酸序列被組織成3個(gè)結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域:三重330個(gè)氨基酸的A結(jié)構(gòu)域、單個(gè)980個(gè)氨基酸的B結(jié)構(gòu)域和二重150個(gè)氨基酸的C結(jié)構(gòu)域。B結(jié)構(gòu)域與其它蛋白質(zhì)不具有同源性，并且提供該蛋白質(zhì)的25個(gè)潛在天冬酰胺(N)-連接糖基化位點(diǎn)中的18個(gè)。B結(jié)構(gòu)域似乎在凝血中不具有功能，并且可被缺失，該B結(jié)構(gòu)域被缺失的FVIII分子仍然具有促凝血活性。
[0008]Von Willebrand 因子(VWF)
[0009]VWF是存在于哺乳動(dòng)物血漿中的多聚粘著糖蛋白，其具有多個(gè)生理功能。在主要的止血過程中，VWF充當(dāng)血小板表面上的特異性受體與細(xì)胞外基質(zhì)的組分例如膠原之間的介質(zhì)。此外，VWF還充當(dāng)促凝血因子FVIII的載體和穩(wěn)定化蛋白。VWF在內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞中被合成為2813個(gè)氨基酸的前體分子。前體多肽(前VWF原)由22個(gè)殘基的信號(hào)肽、741個(gè)殘基的前肽和在成熟血漿VWF中發(fā)現(xiàn)的2050個(gè)殘基的多肽組成(Fischer等人，F(xiàn)EBSLett.351:345-348, 1994)。在分泌進(jìn)入血漿后，VWF以具有不同分子大小的不同種類的形式循環(huán)。這些VWF分子由具有2050個(gè)氨基酸殘基的成熟亞基的寡聚體和多聚體組成。VWF通常可作為一個(gè)二聚體至由50 - 100個(gè)二聚體組成的多聚體形式發(fā)現(xiàn)于血漿中(Ruggeri等人，Thromb.Haemost.82:576-584，1999)。在人循環(huán)中人VWF的體內(nèi)半衰期約為12小時(shí)。
[0010]人中最常見的遺傳性出血障礙是維勒布蘭德病(VWD)。取決于出血癥狀的嚴(yán)重度，VWD可通過利用含VWF (通常地來源于人血漿，但重組VWF也在開發(fā)中)的濃縮物的替代療法來治療?？蓮娜搜獫{制備VWF，如例如EP0503991中描述的。在專利EP0784632中描述了分離重組VWF的方法。
[0011]已知VWF體內(nèi)穩(wěn)定FVIII，從而起著調(diào)節(jié)FVIII的血漿水平的關(guān)鍵作用，因此是控制原發(fā)性和繼發(fā)性止血的中心因子。還已知在于VWD患者中靜脈內(nèi)施用含VWF的藥物制劑后，可觀察到在24小時(shí)內(nèi)內(nèi)源性FVIII = C達(dá)到I至3個(gè)單位/ml的增加，這表明VWF對FVIII的體內(nèi)穩(wěn)定作用。[0012]患者總的來說受益于活性成分的特定作用模式，但目前所有商購可得的因子VIII制劑是通過靜脈內(nèi)施用來給藥的，這牽涉注射部位感染的風(fēng)險(xiǎn)并且通常是患者希望避免的過程，尤其是在治療凝血系統(tǒng)中具有缺陷的兒童中。
[0013]直至今天，血友病A和VWD的標(biāo)準(zhǔn)治療包括FVIII和VWF濃縮物的制劑的頻繁靜脈內(nèi)輸注。
[0014]這些替代療法通常是有效的，然而，例如在經(jīng)歷預(yù)防性治療的嚴(yán)重血友病A患者中，因因子VIII約12小時(shí)的短暫血漿半衰期的原因，必須每周約3次地靜脈內(nèi)(1.V.)施用因子VIII。通過使FVIII水平高于正常人血漿1% (對應(yīng)于FVIII水平升高0.01U/ml)，已經(jīng)將嚴(yán)重的血友病A轉(zhuǎn)變成中度血友病A。在預(yù)防性治療中，給藥方案被設(shè)計(jì)成使FVIII活性的谷底水平不降至非血友病患者中FVIII活性的2-3%以下的水平。
[0015]通過靜脈內(nèi)施用進(jìn)行的因子VIII給藥是非常麻煩的，其伴隨著疼痛并且具有造成感染的風(fēng)險(xiǎn)，特別是這主要是患者自己或由診斷為血友病A的兒童的父母在家治療中進(jìn)行這一操作。此外,頻繁的靜脈內(nèi)注射不可避免地導(dǎo)致瘢痕形成,干擾將來的輸注。由于嚴(yán)重血友病的預(yù)防性治療始于生命的早期，兒童通常在2歲以前開始，因此甚至難以將FVIII每周3次地注射進(jìn)入這樣小的患者的靜脈。在有限的時(shí)期內(nèi)，端口系統(tǒng)的植入可提供另一選擇。然而，在這些情況下，重復(fù)感染可能會(huì)發(fā)生，并且端口可在體育運(yùn)動(dòng)中引起不便。
[0016]因此，存在對避免靜脈內(nèi)輸注因子VIII的巨大醫(yī)學(xué)需要。
[0017]皮下施用在例如W095/01804A1和W095/026750中已被建議用于因子VIII。然而，必須施用極高劑量的因子VIII才能獲得可接受的生物利用度。
[0018]提高非靜脈內(nèi)施用的生物利用度的另一個(gè)方法是使用白蛋白融合的因子VIII(W02011/020866A2)。
[0019]W02010/077297A1和W02010/077297A1教導(dǎo)了將透明質(zhì)酸酶用作擴(kuò)散或分散劑來
促進(jìn)、增強(qiáng)或增加大量試劑、藥物和蛋白質(zhì)的分散和遞送，從而改善共施用藥劑、藥物或蛋白質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效特征。
[0020]高度期望改善非靜脈內(nèi)施用后因子VIII的生物利用度。本申請的發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，如果將因子VIII與硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶一起組合施用，則可顯著增加因子VIII的生物利用度。
[0021]發(fā)明概述
[0022]在第一方面，本發(fā)明涉及包含至少一種因子VII1、至少一種硫酸化糖胺聚糖和至少一種透明質(zhì)酸酶的藥物制劑。
[0023]在本發(fā)明第一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物制劑包含因子VII1、至少一種硫酸化糖胺聚糖(例如肝素)和至少一種透明質(zhì)酸酶。更優(yōu)選地，所述藥物制劑包含人因子VII1、未分級(jí)分離的肝素和人透明質(zhì)酸酶?？梢詫⒒蚩梢圆粚⒁蜃覸III與VWF復(fù)合。
[0024]在第二方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防出血障礙的因子VIII，其中所述治療或預(yù)防包括施用至少一種硫酸化糖胺聚糖和至少一種透明質(zhì)酸酶。在第二方面的一種變型中，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防出血障礙的因子VII1、硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶。
[0025]本發(fā)明第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是用于治療或預(yù)防出血障礙的因子VIII，其中所述治療或預(yù)防包括施用至少一種硫酸化糖胺聚糖和至少一種透明質(zhì)酸酶。更優(yōu)選地，治療或預(yù)防包括施用因子VII1、肝素(例如未分級(jí)分離的肝素)和人透明質(zhì)酸酶。可以將或可以不將因子VIII與VWF復(fù)合。
[0026]進(jìn)一步優(yōu)選所述出血障礙是血友病A，并且治療或預(yù)防包括藥劑的非靜脈內(nèi)施用，最優(yōu)選通過皮下、肌內(nèi)或皮內(nèi)注射。
[0027]本發(fā)明的第三方面是至少一種硫酸化糖胺聚糖與至少一種透明質(zhì)酸酶組合用于提高一種或多種因子VIII的生物利用度。第三方面的一些優(yōu)選實(shí)施方案對應(yīng)于在細(xì)節(jié)上做必要修正的第一和第二方面的優(yōu)選實(shí)施方案。
[0028]本發(fā)明的第四方面是通過給有此需要的受試者施用治療有效量的至少一種因子VII1、至少一種硫酸化糖胺聚糖和至少一種透明質(zhì)酸酶來治療出血障礙的方法?？梢岳缤ㄟ^混合在單一組合物中來同時(shí)施用因子VII1、硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶?；蛘撸煞珠_地施用一個(gè)組分，同時(shí)將另外兩種組分同時(shí)施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以例如以時(shí)間上錯(cuò)開的方式分開地施用全部三種組分。
[0029]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包括至少一種因子VII1、至少一種硫酸化糖胺聚糖和至少一種透明質(zhì)酸酶的藥物試劑盒。
[0030]在本發(fā)明的所有方面，因子VIII優(yōu)選是人因子VIII。優(yōu)選硫酸化糖胺聚糖是肝素，最優(yōu)選未分級(jí)分離的肝素。
[0031]附圖概述
[0032]圖1描述了實(shí)施例1的結(jié)果。如將硫酸化糖胺聚糖與透明質(zhì)酸酶共施用，則可增加FVIII的生物利用度。組合施用對因子VIII的生物利用度的作用是協(xié)同性的。
[0033]詳述
[0034]本發(fā)明涉及出血障礙的治療和預(yù)防。
[0035]如本文中所用，術(shù)語“出血障礙”包括家族性和獲得性血友病A。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了包含至少一種因子VII1、至少一種硫酸化糖胺聚糖和至少一種透明質(zhì)酸酶的藥物制劑。
[0037]因子VIII可以是野生型因子VIII或可包含突變。取決于選擇的宿主細(xì)胞和宿主細(xì)胞環(huán)境的性質(zhì)，糖基化或其它翻譯后修飾的程度和位置可變化。當(dāng)提及特定氨基酸序列時(shí)，這樣的序列的翻譯后修飾包括在本申請中。[0038]術(shù)語〃血液凝固因子VIII"、〃因子VIir和〃FVIII〃在本文中可互換使用?！耙蜃覸III”包括野生型因子VIII以及具有野生型因子VIII的促凝活性的野生型因子VIII衍生物。衍生物相較于野生型因子VIII的氨基酸序列而言可具有缺失、插入和/或添加。術(shù)語因子VIII包括因子VIII的蛋白水解加工的形式，例如包含重鏈和輕鏈的活化前形式。
[0039]術(shù)語〃因子VIII"包括具有野生型因子VIII的生物活性的至少10%，優(yōu)選至少25%，更優(yōu)選至少50%，最優(yōu)選至少75%的任何因子VIII變體或突變體。測定因子VIII的生物活性的適當(dāng)測試是一階段或兩階段凝血測定(Rizza等人1982.Coagulation assay ofFVII1:C and FIXa in Bloom ed.The Hemophilias.NY Churchchill Livingston 1992)或生色底物 FVII1:活性測定(S.Rosen, 1984.Scand J Haemato133:139-145，suppl.)。將這些參考資料的內(nèi)容通過引用并入本文。
[0040]作為非限定性實(shí)例，因子VIII分子包括防止或減少APC切割的因子VIII突變體(Amanol998.Thromb.Haemost.79:557-563)、白蛋白融合的 FVIII 分子(W02011/020866A2)、FVII1-Fc 融合分子(W004/101740A)、進(jìn)一步穩(wěn)定 A2 結(jié)構(gòu)域的因子VIII突變體(W097/40145)、導(dǎo)致表達(dá)增加的FVIII突變體(Swaroop等人1997.JBC272:24121-24124)、免疫原性降低的因子 VIII 突變體(LolIar 1999.Thromb.Haemost.82:505-508)、從不同地表達(dá)的重鏈和輕鏈重建的FVIII (Oh等人1999.Exp.Mol.Med.31:95-100)、減少對受體的結(jié)合(從而導(dǎo)致FVIII樣HSPG (硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)和/或LRP(低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白)的分解代謝)的FVIII突變體(Ananyeva 等人 2001.TCM, 11:251-257)、二硫鍵穩(wěn)定化的 FVIII 變體(Gale 等人，2006.J.Thromb.Hemost.4:1315-1322)、具有改善的分泌性質(zhì)的FVIII突變體(Miao等人，2004.Bloodl03:3412-3419)、輔因子比活性增加的 FVIII 突變體(Wakabayashi 等人，2005.Biochemistry44:10298-304)、具有改善的生物合成和分泌、降低的ER伴侶蛋白相互作用、改善的ER-Golgi轉(zhuǎn)運(yùn)、活化增強(qiáng)或?qū)κЩ畹目剐栽鰪?qiáng)和半衰期改善的FVIII突變體(由Pipe2004.Sem.Thromb.Hemost.30:227-237概述的)，以及具有B結(jié)構(gòu)域全部或部分的缺失的 FVIII 突變體(參見例如 W02004/067566A1、W002/102850A2、W000/24759A1 和美國專利N0.4，868，112)。特別優(yōu)選作為“單鏈”FVIII分子的FVIII分子。單鏈FVIII具有B結(jié)構(gòu)域全部或部分的缺失以及酸性a3區(qū)域全部或部分的缺失，從而缺失了 Argl648處的切割位點(diǎn)(其通常在分泌過程中被切割)。單鏈FVIII分子公開于例如W02004/067566A1 ；US2002/132306A1 ；Krishnan` 等人(1991)European Journal of Biochemistry 第 195卷,n0.3,第 637-644 頁;Herlitschka 等人(1998)Journal of Biotechnology,第 61卷,n0.3,第 165-173 頁;Donath 等人(1995) Biochem.J.,第 312 卷，第 49-55 卷中。
[0041]將所有這些因子VIII突變體和變體通過引用整體并入本文。
[0042]人因子VIII的成熟野生型形式的氨基酸序列示于SEQ ID N0:2中。提及特定序列的氨基酸位置時(shí)意指所述氨基酸在FVIII野生型蛋白中的位置，并且不排除在所提及的序列中其它位置處突變例如缺失、插入和/或取代的存在。例如，提及SEQ ID N0:2的〃Glu2004〃處的突變時(shí)，不排除在被修飾的同源物中，SEQ ID N0:2的位置I至2332處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸不存在。編碼SEQ ID NO:2的DNA序列示于SEQ ID NO:1中。
[0043]術(shù)語“糖胺聚糖”，如本文中所用，是指特別地包含氨基己糖單位的低聚糖或多糖。硫酸化糖胺聚糖包括但不限于硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、肝素和硫酸乙酰肝素。優(yōu)選地，硫酸化糖胺聚糖是肝素，最優(yōu)選硫酸化糖胺聚糖選自未分級(jí)分離的肝素、低分子量肝素和硫酸軟骨素。
[0044]術(shù)語“肝素”包括未分級(jí)分離的肝素和具有更低分子量的肝素。在一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明使用的肝素是“未分級(jí)分離的肝素”，其可具有約SkDa至約30kDa，優(yōu)選約IOkDa至約20kDa，最優(yōu)選約12kDa至約16kDa，例如約15kDa的平均分子量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明使用的肝素是低分子量肝素(LMWH)。LMWH是平均分子量小于SOOODa的肝素或肝素鹽，其中至少60%的所有鏈具有小于SOOODa的平均分子量。優(yōu)選地，按照本發(fā)明使用的LMWH的分子量為約2kDa至約8kDa，更優(yōu)選約3kDa至約6kDa，更優(yōu)選約4kDa至約5kDa，例如約4.5kDa。LMWH可通過多聚肝素的分級(jí)分離或解聚合的各種方法來獲得。LMWH的實(shí)例包括但不限于阿地肝素鈉(Normiflo)、舍托肝素(Sandoparin)、依諾肝素(Lovenox和克賽)、帕肝素(Fluxum)、亭扎肝素(Innohep和洛集帕林)、達(dá)肝素(法安明)、瑞肝素(諾易平)和納屈肝素(Fraxiparin)。
[0045]術(shù)語“肝素”還包括通過裂解和分離而衍生自天然肝素或通過合成途徑產(chǎn)生的肝素分子的小分子量片段。已有例如合成地制造的、并且其結(jié)構(gòu)來源于肝素的商購可得的硫酸化戊糖。其可以磺達(dá)肝素鈉獲得。
[0046]硫酸軟骨素包括例如硫酸軟骨素A(軟骨素-4-硫酸)、硫酸軟骨素C(軟骨素-6-硫酸)、硫酸軟骨素D (軟骨素-2，6-硫酸)和硫酸軟骨素E (軟骨素-4，6-硫酸)。
[0047]硫酸皮膚素(先前稱為硫酸軟骨素B)是商購可得的另一種硫酸化糖胺聚糖。
[0048]硫酸角質(zhì)素是另一種硫酸化的糖胺聚糖。硫酸角質(zhì)素的結(jié)構(gòu)描述于例如Funderburgh (2000)Glycobiology 第 10 卷 n0.10 第 951-958 頁。
[0049]硫酸乙 酰肝素是與肝素不同的N-硫酸化多糖(參見，例如，Gallagher, J.T., Lyon, Μ.(2000)."Molecular structure of Heparan Sulfate and interactions withgrowth factors and morphogens〃.1n 1zzo, Μ, V..Proteoglycans: structure, biologyand molecular interactions.Marcel Dekker Inc.New York, New York.第 27 - 59 頁；和Gallagher, J.T.Walker, A.(1985)."Molecular distinctions between Heparan Sulphateand Heparin:Analysis of sulphation patterns indicates Heparan Sulphate and 月干素are separate families of N-sulphated polysaccharides^.Biochem.J.230(3):665 -74)。
[0050]術(shù)語“透明質(zhì)酸酶”是指具有透明質(zhì)酸葡糖醛酸酶活性、透明質(zhì)酸葡糖胺酶活性或透明質(zhì)酸裂解酶活性的任何多肽。優(yōu)選地，透明質(zhì)酸酶能夠至少部分地降解乙酰透明質(zhì)酸(透明質(zhì)酸)。
[0051]存在三類透明質(zhì)酸酶:
[0052](I)哺乳動(dòng)物透明質(zhì)酸酶(EC3.2.1.35)，其為是內(nèi)切-β-N-乙酰己糖胺酶，以四糖和己糖作為主要終產(chǎn)物。它們具有水解和轉(zhuǎn)糖苷酶活性，并且可降解乙酰透明質(zhì)酸和軟骨素硫酸鹽類(CS)，特別地C4-S和C6-S。
[0053](2)細(xì)菌透明質(zhì)酸酶(EC4.2.2.1)，其是通過β -消除反應(yīng)起作用的內(nèi)切-β -N-乙酰己糖胺酶，其主要產(chǎn)生二糖終產(chǎn)物。
[0054](3)來自水蛭、其它寄生蟲和甲殼類動(dòng)物的透明質(zhì)酸酶(EC3.2.1.36)，其是通過β 1-3鍵的水解產(chǎn)生四糖和己糖終產(chǎn)物的內(nèi)切-β -葡糖醛酸糖苷酶。[0055]哺乳動(dòng)物透明質(zhì)酸酶根據(jù)本發(fā)明是優(yōu)選的，并且還可細(xì)分成2類:中性活性酶和酸性活性酶。中性活性透明質(zhì)酸酶是優(yōu)選的。本發(fā)明的透明質(zhì)酸酶可來源于任何物種。然而，更優(yōu)選透明質(zhì)酸酶是人透明質(zhì)酸酶。仍更優(yōu)選分別由人基因HYALl (Uniprot/Swissprot登錄號(hào) Q12794)、HYAL2 (Uniprot/Swissprot 登錄號(hào) Q12891)、HYAL4 (Uniprot/Swissprot登錄號(hào)Q2M3T9)和PH20/SPAM1 (Uniprot/Swissprot登錄號(hào)P38567)編碼的透明質(zhì)酸酶用作本發(fā)明的透明質(zhì)酸酶。最優(yōu)選地，透明質(zhì)酸酶是人PH20 (Uniprot/Swissprot登錄號(hào)P38567)。特別優(yōu)選的還有W02010/077294A1中描述的可溶性PH20多肽和擴(kuò)展的可溶性PH20多肽(具體參見W02010/077294A1的圖1中描述的人PH20的氨基酸序列)。將這些多肽通過引用并入本文。
[0056]還包括的是上述透明質(zhì)酸酶的任何變體和突變體，只要它們?nèi)匀痪哂兄辽倌撤N透明質(zhì)酸酶活性即可。
[0057]如本文中所用，透明質(zhì)酸酶活性是指酶促催化透明質(zhì)酸的切割的能力。透明質(zhì)酸酶的美國藥典(USP)XXII測定通過測量在使酶與HA在37°C反應(yīng)30分鐘后剩余的更高分子量透明質(zhì)酸或乙酰透明質(zhì)酸(HA)底物的量來間接地測定透明質(zhì)酸酶活性(USP XXI1-NFXVII(1990)644-645United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD)? 參照標(biāo)準(zhǔn)溶液可在測定中用于確定以單位表示的任何透明質(zhì)酸酶的相對活性。測定透明質(zhì)酸酶的透明質(zhì)酸酶活性的體外測定在本領(lǐng)域中是已知的。示例性測定包括微濁度測定(microturbidity assay),其通過檢測當(dāng)未切割的透明質(zhì)酸與血清白蛋白結(jié)合時(shí)形成的不溶性沉淀物來間接地測量透明質(zhì)酸酶對透明質(zhì)酸的切割(參見例如Hynes，ff.L.，J.J.Ferretti (1994).Assays for hyaluronidase activity.Meth Enzymol235:606-616).可使用參照標(biāo)準(zhǔn)以便例如產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定以被測試的透明質(zhì)酸酶單位表示的活性。在另一個(gè)實(shí)例中，透明質(zhì)酸酶活性可使用其中在與透明質(zhì)酸酶溫育后測量殘留生物素化透明質(zhì)酸的微量滴定測定來測量(參見，例如，F(xiàn)rost和Stern(1997)Anal.Biochem.251:263-269，美國專利公布N0.2005/0260186)。測量透明質(zhì)酸酶活性的其它測定在本領(lǐng)域也是已知的，并且也可以使用(參見Deipech等人，(1995)Anal.Biochem.229:35-41; Takahashi 等人,(2003) Anal.Biochem.322:257-263)。
[0058]在一個(gè)實(shí)施方案中，將因子VII1、硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶包含在相同制劑中?？赏ㄟ^單次注射等給患者施用包含所述3種組分的制劑。
[0059]在另一個(gè)實(shí)施方案中，因子VII1、硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶不存在于相同組合物中。例如，可以以分開的劑型將3種組分中的每一種在所述藥物制劑中提供?；蛘?，3種組分中的兩種可存在于相同組合物中，然而第三組分以分開的劑型提供。在另一種變型中，將3種組分中的每一種以分開的劑型提供于所述藥物制劑中。概括而言，本發(fā)明包括下列實(shí)施方案。
[0060]表1
[0061]
【權(quán)利要求】
1.一種藥物制劑，其中包含因子VII1、硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶。
2.權(quán)利要求1的藥物制劑，其中因子VII1、硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶被包含在相同組合物中。
3.權(quán)利要求1的藥物制劑，其中以分開的劑型在所述藥物制劑中提供因子VII1、硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶中的每一種。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物制劑，其中所述透明質(zhì)酸酶是人透明質(zhì)酸酶。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物制劑，其中所述硫酸化糖胺聚糖是肝素。
6.權(quán)利要求5的藥物制劑，其中所述肝素是未分級(jí)分離的肝素。
7.用于治療或預(yù)防出血障礙的因子VIII，其中所述治療或預(yù)防包括施用硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶。
8.按照權(quán)利要求7使用的因子VIII，其中所述因子VIII是人因子VIII。
9.按照權(quán)利要求7至8中任一項(xiàng)使用的因子VIII，其中所述透明質(zhì)酸酶是人透明質(zhì)酸酶。
10.按照權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)使用的因子VIII，其中所述硫酸化糖胺聚糖是肝素。
11.按照權(quán)利要求7至10中任一項(xiàng)使用的因子VIII，其中所述出血障礙是血友病A。
12.按照權(quán)利要求7至11中任一項(xiàng)使用的因子VIII，其中同時(shí)施用所述因子VII1、硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶。`
13.按照權(quán)利要求7至12中任一項(xiàng)使用的因子VIII，其中分開地施用因子VII1、硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶。
14.按照權(quán)利要求7至13中任一項(xiàng)使用的因子VIII，其中治療或預(yù)防包括所述因子VII1、硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶的非靜脈內(nèi)施用。
15.根據(jù)權(quán)利要求14使用的因子VIII，其中所述非靜脈內(nèi)施用是皮下注射、肌內(nèi)注射或皮內(nèi)注射。
16.用于改善因子VIII的生物利用度的硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶。
17.權(quán)利要求16的硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶，其用于治療性或預(yù)防性治療出血障礙。
18.權(quán)利要求16和17的硫酸化糖胺聚糖和透明質(zhì)酸酶，其中所述出血障礙選自家族性和獲得性血友病A、家族性或獲得性維勒布蘭德病。
19.一種用于治療或預(yù)防出血障礙的藥物試劑盒，其包含因子VII1、透明質(zhì)酸酶和硫酸化糖胺聚糖。
【文檔編號(hào)】A61K47/36GK103889446SQ201280051590
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月18日
【發(fā)明者】S·祖內(nèi)爾, H·梅特斯內(nèi)爾 申請人:德國杰特貝林生物制品有限公司