微泡復(fù)合物及使用方法本發(fā)明總體涉及利用白蛋白親和配體對(duì)治療劑的附著的所述治療劑與白蛋白微泡藥物的新型結(jié)合。這種結(jié)合提供將治療劑在體外或體內(nèi)在微泡輔助下遞送至感興趣的靶細(xì)胞或組織的方法。業(yè)已發(fā)現(xiàn)對(duì)攜帶藥物的微泡的超聲介導(dǎo)破壞可用作非侵入性藥物遞送系統(tǒng)?？蓪⑺幬锘蚱渌委焺┮远喾N不同的方式摻入微泡內(nèi)，包括使藥物與微泡殼結(jié)合和配體的附著。例如，全氟化碳填充的微泡充分穩(wěn)定地作為血池劑在血管中循環(huán)；它們充當(dāng)這些劑的攜帶者直至到達(dá)感興趣的部位。然后可在皮膚表面上應(yīng)用超聲使該部位的微泡破裂，導(dǎo)致藥物或治療劑在部位特異性位置局部釋放。更具體來(lái)講，通過(guò)位點(diǎn)定向聲學(xué)超聲已將白蛋白微泡使用和遞送至具體器官靶標(biāo)。白蛋白是血液中的主要蛋白質(zhì)，它的天然生理學(xué)作用是結(jié)合和攜帶廣泛多種親脂/弱溶性配體至機(jī)體各處。這些配體，可對(duì)白蛋白具有親和力，包括脂肪酸及其它性質(zhì)上疏水的生物合成和分解代謝產(chǎn)物。因此白蛋白微泡已被用于攜帶多種基于蛋白質(zhì)及其它生物制劑的治療劑，包括寡核苷酸(ODN)和多核苷酸比如反義ODN，其具有與特異性靶定的信使RNA(mRNA)序列互補(bǔ)的序列。這些微泡-核酸復(fù)合物可自在微泡殼形成期間與白蛋白或脂質(zhì)組分混合的未修飾ODN產(chǎn)生，或者可通過(guò)將預(yù)成型微泡與感興趣的ODN混合進(jìn)行復(fù)合物形成。在兩種情況下，ODN在基因翻譯過(guò)程或更早的加工事件中充當(dāng)機(jī)械干預(yù)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可能有基因特異性作用，這應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)為相對(duì)低的劑量和最小的非靶向副作用。但是，已知將ODN的有效生物學(xué)轉(zhuǎn)化為藥物的關(guān)鍵障礙是有效和安全的藥物遞送水平。例如，用化學(xué)制劑、病毒載體和微粒遞送進(jìn)行的ODN遞送在可獲得治療效應(yīng)之前已受到化學(xué)安全相關(guān)問(wèn)題的阻礙。此外，白蛋白微泡作為ODN比如siRNA載體的用途受限，這是因?yàn)镺DN與白蛋白微泡的有限結(jié)合以及白蛋白-ODN復(fù)合物的穩(wěn)定性。因?yàn)榘椎鞍椎呢?fù)的殼表面電位，荷負(fù)電的較短核酸不與微泡非常良好地結(jié)合，用這些復(fù)合物的基因轉(zhuǎn)染效率一般為亞最佳的。因此需要改善治療劑與微泡的結(jié)合以及改善微泡復(fù)合物的穩(wěn)定性和功效。此外需要減小選擇性遞送高細(xì)胞毒性藥物時(shí)的毒性。非靶向遞送這些藥物可引起全身毒性，已阻止許多這些藥物以對(duì)良好功效所需的全都一起或較高劑量應(yīng)用。雖然在許多情況下將這些藥物作為前藥遞送的嘗試已減小這個(gè)問(wèn)題，但是在靶定組織中并不總是容易實(shí)現(xiàn)選擇性吸收，因?yàn)樵诓∽兘M織中大部分吸收機(jī)制也存在于正常組織。因此通過(guò)如本文公開(kāi)的非天然機(jī)制提高這些藥物在選擇性組織的吸收，可具有重大價(jià)值。本文提供利用配體-治療組合物對(duì)白蛋白殼的親和力增加治療性藥物與微泡結(jié)合的新的組合物和方法。通過(guò)超聲成像可輕易地顯現(xiàn)攜帶治療組合物的微泡的全身循環(huán)。用對(duì)治療部位具有特異性的高能量脈沖超聲的觸發(fā)器從微泡釋放治療劑。微泡的空穴化導(dǎo)致臨近細(xì)胞/組織的聲孔效應(yīng)(sonoporation)。在一個(gè)實(shí)施方案中，公開(kāi)微泡復(fù)合物，它包含微泡(其具有包含天然和變性白蛋白混合物的外殼和包封全氟化碳?xì)怏w的中空芯)、治療劑(其選自小分子化療劑、肽、碳水化合物或寡核苷酸)和雙功能接頭(所述接頭一端連接治療劑且另一端通過(guò)配體上的反應(yīng)基團(tuán)的反應(yīng)連接配體)。所述配體通過(guò)疏水相互作用與微泡的外殼結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中公開(kāi)將上述微泡復(fù)合物遞送至組織靶標(biāo)的方法。該方法包含提供微泡復(fù)合物、將微泡復(fù)合物給予受試者(其中該受試者是組織靶標(biāo)的來(lái)源)和將超聲能量給予受試者(其中該超聲能量足以導(dǎo)致微泡復(fù)合物在組織靶標(biāo)中空穴化)的步驟。當(dāng)參考附圖閱讀以下詳細(xì)描述時(shí)將更好地理解本發(fā)明的這些及其它特征、方面和優(yōu)點(diǎn)，其中：圖1表示siRNA-配體與白蛋白微泡的非共價(jià)結(jié)合。圖2是膽固醇綴合的siRNA(2皮摩爾)和不同量的Optison(i、ii、iii和iv分別是0、9、22和46皮摩爾)的混合物的凝膠移動(dòng)測(cè)定的代表性顯微照片。圖3是與不同濃度Optison或天然HSA(其在凝膠測(cè)定中無(wú)移動(dòng))混合的Cy3-siRNA(4皮摩爾)的凝膠移動(dòng)測(cè)定的代表性顯微照片。圖4是與不同濃度Optison、天然HSA或變性HSA混合的Cy3-膽固醇-siRNA(2皮摩爾)的凝膠測(cè)定的代表性顯微照片。圖5是膽固醇-siRNA與Optison和天然has的結(jié)合特性的代表圖；(A)自凝膠移動(dòng)測(cè)定測(cè)量膽固醇-siRNA條帶的相對(duì)熒光(B)自相對(duì)熒光計(jì)算并針對(duì)白蛋白濃度作圖的siRNA的結(jié)合分?jǐn)?shù)。圖6是通過(guò)測(cè)量細(xì)胞cy3-熒光定量的在opticell中被U-87腫瘤細(xì)胞吸收的siRNA的代表圖。圖7包括顯示脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(RNAifect)與Optison之間的siRNA轉(zhuǎn)染比較的熒光圖像的顯微照片。圖8是脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(RNAifect)與Optison之間siRNA轉(zhuǎn)染的平均細(xì)胞熒光值和標(biāo)準(zhǔn)誤差的代表圖。圖9是用各向異性值計(jì)算的熒光素-肉豆蔻酸酯與Optison和天然HSA的結(jié)合分?jǐn)?shù)的代表圖。圖10A和B是與Optison(i、ii、iii和iv分別為0、8、40和200皮摩爾)結(jié)合的熒光素，熒光素-肉豆蔻酸酯(63皮摩爾)和熒光素-硬脂酸酯(180皮摩爾)在凝膠上分別顯現(xiàn)為黑帶。以下詳細(xì)描述為示例性，并非旨在限制本申請(qǐng)的發(fā)明和本發(fā)明的應(yīng)用。此外，并非旨在受本發(fā)明的前述背景或附圖描述中提出的任何理論的限制。本發(fā)明總體涉及在體外或體內(nèi)將治療劑在微泡輔助下遞送至感興趣的細(xì)胞或組織。在某些實(shí)施方案中治療劑可包含小分子化療劑、肽、碳水化合物或寡核苷酸；和一端連接治療劑且另一端通過(guò)配體上反應(yīng)基團(tuán)的反應(yīng)連接配體的雙功能接頭，其中配體與微泡的外殼結(jié)合。在某些實(shí)施方案中治療劑可以是寡核苷酸(ODN)。寡核苷酸指核酸聚合物，其通過(guò)較長(zhǎng)核酸的鍵斷裂形成，或者用天然或化學(xué)修飾核苷或者在少數(shù)情況下非核苷化合物的經(jīng)保護(hù)的亞磷酰胺這一構(gòu)造單元合成。寡核苷酸的長(zhǎng)度可從50或更少堿基對(duì)的短核酸聚合物至大于200個(gè)堿基對(duì)變化。如用于本文，ODN還指具有大于200個(gè)堿基對(duì)的多核苷酸。還包括反義ODN，其指與所選序列互補(bǔ)的DNA或RNA單鏈。在反義RNA的情況下，反義RNA通過(guò)與某些信使RNA鏈結(jié)合防止這些信使RNA鏈的蛋白質(zhì)翻譯。反義DNA可用于靶向特定的互補(bǔ)(編碼或非編碼)RNA。還包括小干擾RNA(siRNA)，有時(shí)稱為短干擾RNA或沉默RNA，其是一類雙鏈RNA分子，通常為20-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)，在生物學(xué)，(包括RNA干擾(RNAi)途徑，其中它干擾特定基因的表達(dá))中發(fā)揮多種作用，用作抗病毒機(jī)制，或者在基因組染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的成形中發(fā)揮作用。在某些實(shí)施方案中，治療劑可以是細(xì)胞毒素。如用于本文,細(xì)胞毒素指對(duì)細(xì)胞具有毒性作用的物質(zhì)。例如細(xì)胞毒素可導(dǎo)致發(fā)生壞死，其中它們喪失膜完整性，并因細(xì)胞裂解而死亡。在其它實(shí)例中細(xì)胞毒素可伴隨抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，其中將細(xì)胞用抗體標(biāo)記，通過(guò)某些淋巴細(xì)胞發(fā)揮作作用。細(xì)胞毒性劑的實(shí)例在Goodman和Gilman的"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics(治療的藥理學(xué)基礎(chǔ)),"第10版,McGraw-Hill,NewYork,2001列出。這些包括紫杉醇；氮芥類，比如氮芥、環(huán)磷酰胺、美法侖、尿嘧啶氮芥和苯丁酸氮芥；乙烯亞胺衍生物，比如塞替派；烷基磺酸酯，比如白消安；亞硝基脲，比如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀和鏈佐星；三氮烯，比如達(dá)卡巴嗪；葉酸類似物，比如甲氨蝶呤；嘧啶類似物，比如氟尿嘧啶、阿糖胞苷和阿扎立平；嘌呤類似物，比如巰嘌呤和硫鳥嘌呤；長(zhǎng)春花生物堿，比如長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿；抗生素，比如更生霉素、柔紅霉素、多柔比星、博來(lái)霉素、光輝霉素和絲裂霉素；酶，比如L-天冬酰胺酶；鉑配位絡(luò)合物，比如順鉑；取代的脲，比如羥基脲；甲肼衍生物，比如丙卡巴肼；腎上腺皮質(zhì)抑制劑，比如米托坦；激素和拮抗劑，比如腎上腺皮質(zhì)類固醇(潑尼松)、黃體酮(己酸羥孕酮、乙酸甲羥孕酮和乙酸甲地孕酮)、雌激素(己烯雌酚和炔雌醇)、雌激素對(duì)抗劑(他莫昔芬)，和雄激素(丙酸睪酮和氟甲睪酮)。干擾細(xì)胞內(nèi)蛋白合成的藥物、蛋白合成抑制劑，也可與配體偶聯(lián)；此類藥物為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，包括嘌呤霉素、環(huán)己酰亞胺和核糖核酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療劑充當(dāng)其抑制劑的蛋白質(zhì)包括但不限于單獨(dú)或其組合的酶、可溶性和血清蛋白質(zhì)、在細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)、非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和水溶性或可使其溶于水的蛋白質(zhì)的區(qū)段以及蛋白質(zhì)的任何衍生物。在具體實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包括比如但不限于單獨(dú)或其組合的半胱氨酸蛋白酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、環(huán)氧化物水解酶(EH)、硫解酶、NAD/NADP-依賴性氧化還原酶、烯酰輔酶A水合酶、醛脫氫酶、羥基丙酮酸還原酶、組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)、亞胺甲基轉(zhuǎn)移酶環(huán)化脫氨酶(FTCD)、氨基戊酮酸脫水酶(ADD)、肌氨酸激酶、羧酸酯酶(LCE)、單酰基甘油(MAG)脂肪酶、金屬蛋白酶(MP)、磷酸酶(蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，PTP)、蛋白體、FK506結(jié)合蛋白(FKBP12)、雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶標(biāo)(mTOR;或稱為FKBP-雷帕霉素結(jié)合域(FRB))、絲氨酸水解酶(超家族)、遍在蛋白結(jié)合蛋白、-半乳糖苷酶、核苷酸結(jié)合酶、蛋白激酶、GTP-結(jié)合蛋白、角質(zhì)酶(cutinase)、腺嘌呤琥珀酸合酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、谷氨酸脫氫酶、二氫葉酸還原酶、脂肪酸合酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、乙酰膽堿酯酶、HMG膽酸鹽還原酶和環(huán)加氧酶(COX-1和COX-2)。還包括任何蛋白質(zhì)的任何衍生物。在另一個(gè)實(shí)例中，蛋白質(zhì)基本不含輔因子?！盎静缓o因子”包括不需要任何附加的輔因子、化學(xué)劑、化學(xué)修飾或物理修飾以便在生理?xiàng)l件和室溫以及在溶液中的壓力下或作為固體都天然穩(wěn)定，并可在體內(nèi)與其對(duì)應(yīng)配體結(jié)合的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白微泡可用于在全身遞藥時(shí)攜帶治療劑。然后組織靶向超聲聲能可用于穴化白蛋白微泡并將治療劑遞送至細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中。例如可將微泡復(fù)合物靜脈內(nèi)給予待靶向其細(xì)胞或組織的受試者或給予所述受試者的腹膜(腹膜內(nèi))。一旦通過(guò)受試者將微泡復(fù)合物攜帶至靶細(xì)胞，則遞送超聲聲能。在某些實(shí)施方案中，可在遞送超聲之前顯現(xiàn)靶細(xì)胞，而在又另外的實(shí)施方案中可實(shí)時(shí)進(jìn)行顯現(xiàn)和監(jiān)測(cè)空穴化。在某些實(shí)施方案中，微泡的白蛋白外殼包含主要通過(guò)半胱氨酸-半胱氨酸鍵維持一起的天然和變性白蛋白兩者。在某些實(shí)施方案中，白蛋白殼的主要組成大部分采用天然形式，其中變性部分允許增加半胱氨酸鍵連接。在某些實(shí)施方案中變性白蛋白與天然白蛋白的相對(duì)量約為0.5-30wt%。在其它實(shí)施方案中相對(duì)量約為1%-15wt%。天然和變性白蛋白的混合物提供空穴化所需殼彈性的平衡，微泡表面上的反應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)增加。微泡可在預(yù)熱白蛋白溶液的存在下通過(guò)全氟化碳?xì)怏w的聲處理形成，或者用高剪切力通過(guò)混合氣體和預(yù)熱白蛋白形成。小部分白蛋白分子在聲處理預(yù)熱白蛋白溶液期間重排，通過(guò)白蛋白分子之間的二硫鍵發(fā)生交聯(lián)。這些白蛋白分子據(jù)信在結(jié)構(gòu)上類似于白蛋白的F形式，其具有更多的暴露的疏水殘基。這允許增加疏水相互作用的結(jié)合位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，微泡可充滿不溶性全氟化碳?xì)怏w，比如但不限于全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷或其組合。在某些實(shí)施方案中，微泡直徑為約1-約5微米，優(yōu)化該大小以允許通過(guò)血流循環(huán)。在某些實(shí)施方案中，治療劑-微泡復(fù)合物包含用具有反應(yīng)基團(tuán)的接頭修飾的治療劑，該反應(yīng)基團(tuán)能夠與具有針對(duì)白蛋白的親和力的配體結(jié)合。因此，所述治療劑可通過(guò)所述配體與白蛋白偶聯(lián)。接頭包括通過(guò)第一部分將配體連接至治療劑的任何連接部分。接頭可以短至一個(gè)碳或?yàn)殚L(zhǎng)的聚合物比如聚乙二醇、四乙二醇(TEG)、聚賴氨酸或其它在制藥工業(yè)中常用于調(diào)節(jié)治療劑的藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布特征的聚合物。其它不同長(zhǎng)度的接頭包括具有一個(gè)或更多個(gè)選自O(shè)、S、N、P的雜原子并被鹵素原子任選取代的C1-C250長(zhǎng)。在具體實(shí)施方案中，接頭包含以下中的至少一種：?jiǎn)为?dú)或其組合的由天然或合成單體構(gòu)成的寡聚物或聚合物、選自藥理學(xué)上可接受的寡聚物或聚合物成分的低聚或聚合部分、寡-或聚-氨基酸、肽、糖、核苷酸和具有1-250個(gè)碳原子的有機(jī)部分。具有1-250個(gè)碳原子的有機(jī)部分可含有一個(gè)或更多個(gè)雜原子比如O、S、N或P且在一個(gè)或更多個(gè)位置被鹵素原子任選取代。第一部分可以只是接頭的延伸，其通過(guò)接頭上的反應(yīng)物與治療劑上的反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)形成。反應(yīng)物和反應(yīng)基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于活性酯(比如N-羥基琥珀酰亞胺酯、五氟苯基酯)、亞磷酰胺、異氰酸酯、異硫氰酸酯、醛、?；取⒒酋Ｂ?、馬來(lái)酰亞胺、烷基鹵、胺、膦、磷酸酯、醇或硫醇，前提是反應(yīng)物和反應(yīng)基團(tuán)匹配以發(fā)生得到共價(jià)連接的綴合物的反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)基團(tuán)可以是伯胺官能團(tuán)，因此胺修飾的治療劑可通過(guò)配體羧基部分的反應(yīng)與親和配體綴合。在某些其它實(shí)施方案中反應(yīng)基團(tuán)可以是通過(guò)磷酸基與配體連接的醇。配體，在本文也稱為親和配體，包括脂肪酸、類固醇、小的芳族化合物或其組合。白蛋白結(jié)合分子的實(shí)例可見(jiàn)于2010年7月8日公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2010/0172844。例如在某些實(shí)施方案中親和配體是脂肪酸，包括但不限于肉豆蔻?；⑹懰?油烯基(lithocolic-oleyl)、二十二烷基、月桂?；?、硬脂?；?steoroyl)、棕櫚?；⒂王；騺喡轷；?。在其它實(shí)施方案中，親和配體是親脂分子比如類固醇或修飾的類固醇，包括膽固醇、膽酸、石膽酸或鵝去氧膽酸。在其它實(shí)施方案中，親和配體是選自4-對(duì)碘苯基-丁酸及其類似物或衍生物的高親和力分子。在還有其它實(shí)施方案中，治療劑包含siRNA，接頭包含四乙二醇，配體包含膽固醇。在某些實(shí)施方案中，治療劑-白蛋白復(fù)合物可通過(guò)在全氟化碳的存在下聲處理配體修飾的治療劑與白蛋白或脂質(zhì)制備，或者通過(guò)混合預(yù)成型微泡與配體修飾的治療劑制備。在某些實(shí)施方案中，這些分子可在治療劑合成期間附著于感興趣的治療劑。例如膽固醇的亞磷酰胺可用于在核酸合成儀上的DNA或RNA合成期間摻入膽固醇，或者通過(guò)摻入反應(yīng)部分在合成后摻入膽固醇。在某些實(shí)施方案中，治療劑是修飾的ODN，可將其通過(guò)用修飾的三磷酸核苷酶促制備；用配體本身或用反應(yīng)官能團(tuán)修飾用于與配體的合成后修飾。根據(jù)ODN用途，配體連接可在一端或兩端，在核酸序列內(nèi)或在多個(gè)位置。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)siRNA是ODN時(shí)，可通過(guò)3’OH位連接。在某些實(shí)施方案中，除了配體以外，可以選擇性修飾治療劑(包括當(dāng)治療劑是ODN時(shí))以防御核酸酶。在某些實(shí)施方案中，穩(wěn)定修飾可包括硫代磷酸酯修飾或2'-OMe修飾。在某些實(shí)施方案中，可將微泡復(fù)合物與感興趣的細(xì)胞或組織孵育或者注入體內(nèi)(優(yōu)選靜脈內(nèi))，然后在預(yù)定時(shí)間或現(xiàn)場(chǎng)成像期間在期望的部位用超聲能量穴化。在某些實(shí)施方案中，可在正常超聲診斷成像下在血液循環(huán)中全身游行期間觀察微泡復(fù)合物。當(dāng)氣泡到達(dá)組織靶標(biāo)(在此情況下為腫瘤)，將一系列脈沖聲能波送至腫瘤。這在微泡上產(chǎn)生慣性空穴化，其使微泡萎陷。當(dāng)最大地定位聲能時(shí)發(fā)生微泡的空穴化。通過(guò)與機(jī)械指數(shù)力、最佳超聲聲學(xué)距離和超聲聲學(xué)掃描尺寸有關(guān)的參數(shù)在超聲探頭上完成這種定向。產(chǎn)生的力然后有可能在細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)形成微孔。通常給予頻率約0.5-約5MHz的脈沖能。這些微孔，與在慣性空穴化下產(chǎn)生的微噴射力一起，可促進(jìn)ODN進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)環(huán)境。例如當(dāng)ODN是siRNA時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的siRNA將利用宿主機(jī)構(gòu)使mRNA和稍后的蛋白質(zhì)合成沉默。類似地，當(dāng)mRNA信息充當(dāng)血管生成促進(jìn)蛋白(包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF))時(shí)，腫瘤中的VEGF表達(dá)減少可停止或減慢腫瘤生長(zhǎng)。在微泡空穴化后微泡中心的密集氣體從機(jī)體呼出，白蛋白殼被代謝，經(jīng)由肝清除途徑排泄。在例示性實(shí)施方案中，可根據(jù)先前的治療性研究將微泡復(fù)合物推注混合至最佳比率。一旦建立復(fù)合物的混合物，則通過(guò)靜脈途徑全身注射推注藥物。例如在使用siRNA-微泡推注時(shí)，可在首過(guò)血液動(dòng)力學(xué)中監(jiān)測(cè)推注。可利用低診斷水平的聲能用超聲探頭監(jiān)測(cè)微泡共振和由此增強(qiáng)的超聲對(duì)比。在循環(huán)期間推注到達(dá)器官靶標(biāo)。心血管組織灌注可幫助將推注遞送至具有小管腔直徑的深部微血管內(nèi)。通過(guò)供應(yīng)脈沖聲能，可將充分的能量提供給微泡進(jìn)行慣性空穴化。一旦微泡空穴化完成，可將siRNA內(nèi)容物跨質(zhì)膜遞送入病變細(xì)胞內(nèi)。而在細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中siRNA可具有治療作用。在微泡空穴化期間siRNA可通過(guò)各種機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。例如siRNA可通過(guò)a：來(lái)自萎陷微泡的微噴射力進(jìn)入細(xì)胞，所述微噴射力可將siRNA推進(jìn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)?；蛘咚鰴C(jī)制可包括微噴射能或聲致發(fā)光能，其在質(zhì)膜內(nèi)產(chǎn)生臨時(shí)微孔以允許siRNA被動(dòng)擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi)，或者在微泡共振期間在實(shí)際空穴化之前撞擊質(zhì)膜的微泡可將siRNA推入細(xì)胞內(nèi)。因此，微泡遞送機(jī)制在治療廣泛多種疾病中具有潛在應(yīng)用，所述疾病可包括癌性、炎性、傳染性、心血管性、代謝性、自身免疫和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。許多這些疾病目前都不能有效地治療，因?yàn)槌Ｒ?guī)小分子藥物和單克隆抗體不能獲得靶向分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1微泡-siRNA復(fù)合物圖1是siRNA與白蛋白包封的微泡結(jié)合以形成微泡-siRNA復(fù)合物的代表圖示。用于VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)沉默的靶siRNA通過(guò)IDTDNA技術(shù)合成。IDTDNA提供脂質(zhì)修飾比如在siRNA上的膽固醇基TEG(Chol-siRNA)以及染料綴合。有正鏈：5'-Cy3/GCAUUUGUUUGUCCAAGAUmUmU/3'-脂質(zhì)(SEQIDNO:1)反義鏈：5'/mAmArArUrCrUrUrGrGrArCrArArArCrArArArUrGrC/3'(SEQIDNO:2)在siRNA上的花青染料Cy3具有550nm的激發(fā)波長(zhǎng)和580nm的峰發(fā)射。已將siRNA用cy3染料標(biāo)記用于在結(jié)合測(cè)定及其它表征技術(shù)期間容易顯現(xiàn)siRNA。將OptisonTM(GEHealthcare,ChalfontSt.Giles,UnitedKingdom,10mg/ml白蛋白)離心；棄去上層，將底部的過(guò)量白蛋白溶液用于結(jié)合研究。使凍干的人血清白蛋白(HSA)粉末(SigmaAldrich,St.LouisMO)溶于1×磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中以制備10mg/mL儲(chǔ)液。用1×PBS制備Optison和天然白蛋白溶液稀釋液兩者。通過(guò)將天然HSA溶液加熱至80℃持續(xù)20分鐘制備變性HSA溶液。結(jié)合反應(yīng)：在無(wú)RNA酶水中制備cy3-siRNA和cy3-siRNA-膽固醇,20μM的儲(chǔ)液并貯存于-20℃。將4皮摩爾cy3-siRNA和2皮摩爾膽固醇-siRNA溶液與0-50皮摩爾的不同量Optison溶液、天然HSA和變性HSA溶液混合。反應(yīng)緩沖液是1×PBS,pH7.4。將反應(yīng)混合物在黑暗中25℃孵育45分鐘。孵育后，將10μLsiRNA混合物與2μLNovex?Hi-DensityTBESampleBuffer(5X)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)混合。凝膠電泳：將所有反應(yīng)物都上樣在預(yù)制的6%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)上。使凝膠在100V在0.5×NovexTBE電泳緩沖液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中跑45分鐘。用臺(tái)風(fēng)掃描儀(TyphoonTM9410,GEHealthcare)將含有DNA、蛋白質(zhì)或兩者的凝膠針對(duì)cy3熒光成像。結(jié)果：連接siRNA的Cy3熒光在凝膠上可看到不同的siRNA條帶。當(dāng)siRNA和白蛋白溶液的混合物在凝膠上跑時(shí)，白蛋白結(jié)合的siRNA的遷移率低于無(wú)siRNA的，在凝膠上產(chǎn)生兩條帶。在初步試驗(yàn)中，用來(lái)自EMSA試劑盒(MolecularProbes,Eugene,OR,USA)的sypro紅寶石染色觀察凝膠中的白蛋白條帶。實(shí)施例顯示于圖2，其是膽固醇綴合的siRNA(2皮摩爾)與不同量Optison(i、ii、iii和iv分別為0、9、22和46皮摩爾)的混合物的凝膠移動(dòng)測(cè)定。凝膠的熒光成像顯示不同的siRNA(下帶區(qū))和白蛋白(上帶區(qū))條帶。Cy3-siRNA當(dāng)cy3-siRNA和天然HSA/Optison的混合物在凝膠上跑時(shí)，增加白蛋白濃度也看不到結(jié)合的siRNA。cy3-siRNA與天然HSA或Optison溶液都沒(méi)有明顯結(jié)合。這顯示于圖3，其是與不同濃度Optison或天然HSA混合的Cy3-siRNA(4皮摩爾)凝膠的熒光圖像，顯示在凝膠測(cè)定中沒(méi)有移動(dòng)。凝膠上的黑帶是siRNA上的cy3-熒光。cy3-siRNA與Optison和天然HSA兩者都沒(méi)有明顯結(jié)合。Chol-siRNA圖4顯示chol-siRNA與Optison、天然HSA和變性HSA結(jié)合的凝膠圖像。Chol-siRNA與天然HSA和Optison溶液兩者都結(jié)合，而結(jié)合對(duì)于等量的變性HSA而言則明顯下降。通過(guò)在條帶的周圍畫框人工估計(jì)每條泳道中siRNA的熒光強(qiáng)度。用每條siRNA帶的強(qiáng)度值減去背景(等于凝膠的平均強(qiáng)度值)。計(jì)算大范圍白蛋白濃度內(nèi)結(jié)合siRNA的熒光強(qiáng)度。將相對(duì)熒光R計(jì)算為：R=(F結(jié)合-F游離)/F游離　(1)F結(jié)合是結(jié)合siRNA條帶的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)游離是游離siRNA條帶的熒光強(qiáng)度。將相對(duì)熒光對(duì)白蛋白濃度作圖。這顯示于圖5，其是如下所述的膽固醇-siRNA與Optison和天然HSA的結(jié)合性質(zhì)的圖解比較。在0-15μM范圍的低白蛋白濃度，看到結(jié)合熒光對(duì)白蛋白濃度的線性相關(guān)。圖5曲線圖A顯示在該濃度范圍，與Optison溶液結(jié)合的chol-siRNA量高于與天然HAS的結(jié)合。為了估計(jì)結(jié)合常數(shù)，用更高濃度的白蛋白以讓與白蛋白結(jié)合的siRNA量飽和。將結(jié)合分?jǐn)?shù)x如下確定：x=(F結(jié)合-F游離)/(F飽和-F游離)　(2)F飽和是在飽和條件下最大結(jié)合的siRNA的熒光強(qiáng)度。如圖5曲線圖B所示，將結(jié)合分?jǐn)?shù)對(duì)增加的白蛋白濃度作圖，將數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合至以下平衡方程式：x=n*[白蛋白]/(kd+[白蛋白])　(3)kd是解離常數(shù)，n是結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目，[白蛋白]是各樣品的總白蛋白濃度。用非線性擬合解答方程式3以確定chol-siRNA與Optison和天然HSA兩者結(jié)合的kd和n(表1)。用微軟Excel解答工具進(jìn)行這種非線性擬合，發(fā)現(xiàn)Optison和天然HSA的誤差平方和(SSE)分別是0.07和0.06。chol-siRNA的結(jié)合常數(shù)類似于Optison和天然HSA兩者。實(shí)施例2將siRNA遞送至腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)：將MATBIII大鼠乳腺癌和U-87人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞分別培養(yǎng)在McCoy's5AMedium(改良的)(1×)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)和Eagle最低必需培養(yǎng)基(EMEM)(ATCC,Manassas,VA)中。兩種培養(yǎng)基溶液都補(bǔ)充有10%熱滅活胎牛血清(FBS)(FisherScientific,Springfield,NJ)和1%青霉素-鏈霉素(SigmaAldrich,StLouis,MO)。將細(xì)胞保持在37℃在含5%CO2的濕潤(rùn)氣氛中。底物連接的細(xì)胞的聲處理：使MATB-III和U-87細(xì)胞在10mL容量Opticell單元(NalgeNuncInternational,Rochester,NY)中生長(zhǎng)至90%匯合。將OptiCell中的培養(yǎng)基用含有40皮摩爾cy3-siRNA或膽固醇-siRNA的10mL新鮮培養(yǎng)基更換。將opticell在37℃培養(yǎng)箱中靜置24小時(shí)。單獨(dú)地，將細(xì)胞用與Optison微泡(300μL)或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(90μL)(RNAifect,Qiagen,Valencia,CA)混合的siRNA溶液處理。對(duì)于siRNA/Optison混合物，用具有心區(qū)探頭(cardiacsectorprobe)(3S)的Vividi成像器使微泡破裂并自微泡遞送siRNA藥物。將opticell固定在水浴中，超聲探頭連接跨越opticell全長(zhǎng)的移動(dòng)臂。探頭的尖端浸在水中，探頭與opticell表面之間的距離是3cm，這允許opticell整個(gè)寬度的聲處理。將opticell中的微泡用機(jī)械指數(shù)MI>1.3連續(xù)聲處理處理。探頭在opticell全長(zhǎng)內(nèi)以1m/s的速度移動(dòng)。在聲處理后，將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。類似地，將用RNAifect處理的細(xì)胞也在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，用熒光顯微鏡(ZeissAxioImager.Z1,CarlZeiss)使細(xì)胞成像。用于cy3的濾器是DsRed/Cy3(546ex/620em)。在熒光圖像中的感興趣區(qū)(ROI)，測(cè)量細(xì)胞熒光，計(jì)算細(xì)胞熒光的平均值。用ImageJ處理圖像并計(jì)算熒光強(qiáng)度。將數(shù)據(jù)報(bào)告為平均值+1.0標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)，N=4。用雙樣本t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，用Minitab?12(MinitabInc,StateCollege,PAUSA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：遞送系統(tǒng)對(duì)與cy3-siRNA或chol-siRNA孵育的U-87細(xì)胞的作用在圖6顯示。將siRNA向腫瘤細(xì)胞內(nèi)的遞送用平均細(xì)胞cy3-熒光表示。報(bào)告每組的平均熒光值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。細(xì)胞聲處理實(shí)質(zhì)上增強(qiáng)cy3-siRNA滲透入細(xì)胞內(nèi)。因聲孔效應(yīng)的作用所致，Optison/超聲處理細(xì)胞的平均細(xì)胞熒光比未處理細(xì)胞多39%。對(duì)于膽固醇-siRNA，在用Optison/超聲處理后平均細(xì)胞熒光增加53%。用雙樣本t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)組間的顯著性差異(cy3-siRNA的p=0.032，膽固醇-siRNA的p=0.059)。類似地對(duì)于MATBIII細(xì)胞，將Optison/超聲處理的作用與市售可獲得的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑比較。將細(xì)胞用Cy3-siRNA或chol-siRNA聯(lián)合RNAifect或Optison/超聲遞送劑處理，結(jié)果顯示于圖7和8。圖7顯示處理后細(xì)胞的代表性圖像。圖8報(bào)告所有組的平均細(xì)胞熒光，將標(biāo)準(zhǔn)誤差表示為誤差條。對(duì)于cy3-siRNA，Optison/超聲處理的平均細(xì)胞熒光更高(雙樣本t檢驗(yàn),p=0.007)。這主要因?yàn)樵谖⑴莸拇嬖谙录?xì)胞的聲孔效應(yīng)。將chol-siRNA遞送入細(xì)胞內(nèi)的RNAifect與Optison/超聲遞送之間沒(méi)有顯著性差異。雖然平均細(xì)胞熒光相似，但發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑對(duì)腫瘤細(xì)胞具有毒性，如由圖7中細(xì)胞的不規(guī)則形狀所證明。應(yīng)當(dāng)注意的是，等量的轉(zhuǎn)染試劑和siRNA用于未修飾和膽固醇-siRNA兩者中。雖然在兩種情況下轉(zhuǎn)染試劑都具有毒性，但chol-siRNA的毒性更高。實(shí)施例3用熒光素脂肪酸綴合物評(píng)價(jià)治療性脂肪酸綴合物對(duì)微泡的初步結(jié)合研究。綴合方法：將脂肪酸NHS酯(2當(dāng)量,5.37mg肉豆蔻酸NHS酯或6.38mg硬脂酸NHS酯)溶解在DMSO和二氯甲烷的50:50混合物(100ul)中，與熒光素尸胺溶液(FL-尸胺,5mg,1當(dāng)量,在50ulDMSO中)混合。向其加入二異丙基乙胺(3.8當(dāng)量)，使混合物渦旋以得到透明溶液。將樣品在室溫下保持在黑暗中。4.5小時(shí)后，通過(guò)HPLC檢查反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)完成。正如預(yù)期，兩種綴合物都觀察到保留時(shí)間的大變化(保留時(shí)間FL-尸胺4.7min,FL-尸胺硬脂酸酯12.1分鐘和FL-尸胺肉豆蔻酸酯9.9min,柱X-BridgeShieldRP18,4.6×50mm柱,粒度5um,梯度方法在15分鐘內(nèi)0-100%B，在100%B持續(xù)5分鐘,溶劑A0.1MTEAA,pH7.0和溶劑B100%乙腈,流速1ml/min)。將粗產(chǎn)物用DMSO稀釋至~2ml，在AKTA純化器上使用XterraMSC18,19×100mm柱純化，梯度為在18.75個(gè)柱體積中的0-100%B，流速為10ml/min。溶劑A和B如上文關(guān)于分析方法的描述。收集多個(gè)流分中產(chǎn)物，通過(guò)分析型HPLC分析各流分。僅將各情形中的最純的流分(~90%純度)用于結(jié)合研究(原料本身是~86%純,其余可能是具有相同光譜性質(zhì)的位置異構(gòu)體(regioisomer))。將該流分在室溫濃縮至干。使殘留物懸浮于水(~2ml)中，用二氯甲烷(3×2ml)提取。將有機(jī)提取物合并，用無(wú)水硫酸鈉干燥并濃縮至干。熒光偏振測(cè)定在1×PBS中制備熒光素-肉豆蔻酸酯儲(chǔ)液。保持126nM的低濃度的熒光素用于熒光偏振測(cè)定。將0-15μM白蛋白濃度的不同濃度的Optison或HSA溶液加至熒光素肉豆蔻酸酯溶液。反應(yīng)緩沖液是1×PBS,pH7.4。將反應(yīng)混合物在黑暗中25℃孵育15分鐘。在孵育后，用微板讀數(shù)器(SpectraMax5,MolecularDevices,Sunnyvale,CA)測(cè)量熒光素原始各向異性值的改變。在Corning96孔板(具有透明底的黑板)(SigmaAldrich,StLouis,MO)中測(cè)量樣品。熒光素在470nm激發(fā)，在540nm測(cè)量發(fā)射。用與之前相同的方程式(方程式2)計(jì)算結(jié)合分?jǐn)?shù)(x)，但用各向異性值代替熒光值。然后將計(jì)算的結(jié)合分?jǐn)?shù)對(duì)白蛋白濃度作圖，如圖9顯示。將數(shù)據(jù)報(bào)告為平均值+1.0標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)，N=3。方程式3用于確定與Optison和天然HSA兩者結(jié)合的熒光素-肉豆蔻酸酯的kd和n(表2)。這也在圖10表示，該圖顯示與Optison(i、ii、iii和iv分別是0、8、40和200皮摩爾)結(jié)合的熒光素，其在凝膠上顯現(xiàn)為熒光素-肉豆蔻酸酯(圖10A)(63皮摩爾)和熒光素-硬脂酸酯(圖10B)(180皮摩爾)的黑帶。當(dāng)測(cè)試不含肉豆蔻酸酯綴合的熒光素與白蛋白的結(jié)合性質(zhì)時(shí)，觀察到各向異性無(wú)顯著改變。眾所周知脂肪酸比膽固醇具有更強(qiáng)的結(jié)合性質(zhì)，并且在這里也得到證實(shí)，對(duì)熒光素-肉豆蔻酸酯綴合物所觀察到的解離常數(shù)kd較低(表1和表2)。表1：膽固醇-siRNA與Optison和天然HSA結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和解離常數(shù)表2：熒光素-肉豆蔻酸酯與Optison和天然HSA結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和解離常數(shù)因此，使脂肪酸比如肉豆蔻酸酯與治療化合物綴合可增加此類治療化合物與白蛋白殼微泡的結(jié)合。熒光素-肉豆蔻酸酯與Optison結(jié)合的解離常數(shù)低于與天然HSA結(jié)合的解離常數(shù)。這提示具有天然和部分變性白蛋白兩者的微泡殼的疏水結(jié)合性質(zhì)較好。實(shí)施例4siRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性：治療化合物比如siRNA一旦注入體內(nèi)其穩(wěn)定性非常低。研究了皮下和尾靜脈注射白蛋白微泡和天然siRNA(無(wú)綴合物)的混合物之間的比較。11-14周(體重~30g)齡nu/nu小鼠從CharlesRiverLaboratories(Wilmington,MA)獲得。根據(jù)被國(guó)立衛(wèi)生研究院采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南圈養(yǎng)動(dòng)物。將Lewis肺癌細(xì)胞(LLC)皮下接種至麻醉小鼠的右側(cè)腹部(3.5×106個(gè)細(xì)胞/100μl/小鼠)。在接種后第4天，將小鼠用抗-VEGFsiRNA(SigmaLifeSciences,St.Louis,MO)-微泡混合物治療，皮下注射的siRNA劑量為1.0mg/kg，尾靜脈注射劑量為2.0mg/kg。注射混合物在無(wú)RNA酶水中含有100μL微泡溶液和100μLsiRNA。在注射后，用具有心區(qū)探頭(3S)的Vividi成像器聲處理腫瘤。遞送脈沖形式的能量，峰MI為1.3。對(duì)照組不接受任何治療。治療當(dāng)天24小時(shí)后，使小鼠安樂(lè)死，提取腫瘤。將腫瘤立即冷凍并貯存于-20℃。在VEGF測(cè)量當(dāng)天在室溫將腫瘤解凍。然后將腫瘤用裂解基質(zhì)管(裂解基質(zhì)管A,RPBiomedical)在RIPA緩沖液(加入蛋白酶抑制劑)中裂解腫瘤。然后將從樣品收集的裂解物稀釋，用蛋白質(zhì)試劑盒(PierceBCA試劑蛋白測(cè)定試劑盒)測(cè)量總蛋白質(zhì)，用ELISA試劑盒(小鼠VEGFELISA試劑盒,RayBiotech,Norcross,GA)測(cè)量VEGF。結(jié)果在表3中報(bào)告為對(duì)照和不同治療組的平均pgVEGF/mg蛋白質(zhì)。與對(duì)照組相比，皮下注射1.0mg/kgsiRNA-微泡混合物導(dǎo)致VEGF下降約39%(雙樣本t檢驗(yàn);p=0.0096)。盡管對(duì)照組與2.0mg/kg尾靜脈注射siRNA-微泡混合物之間只有較小差異，但是這可能因?yàn)槲葱揎梥iRNA對(duì)微泡缺乏有效結(jié)合或有效結(jié)合較少。表3：siRNA遞送至腫瘤的作用；平均pgVEGF/mg總蛋白。本發(fā)明可在不背離其精神或本質(zhì)特征的情況下以其它特定形式具體化。因此前述實(shí)施方案在所有方面都應(yīng)視為說(shuō)明性的，而非限制本文描述的發(fā)明。因此本發(fā)明的范圍由附屬權(quán)利要求而非由前述描述表明，因此落入在權(quán)利要求等同含義和范圍內(nèi)的所有改變旨在包括在其中。序列表<110>MOHAN,PRAVEENALIM,HAEWONLOWERY,LISABURCZAK,JOHNDONALDROTHMAN,JAMESEDWARDSOOD,ANUP<120>微泡復(fù)合物及使用方法<130>250944-1<140>13/235,890<141>2011-09-19<160>2<170>PatentIn版本3.5<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成寡核苷酸<400>1gcauuuguuuguccaagauuu　　　　　21<210>2<211>21<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成寡核苷酸<400>2aaaucuuggacaaacaaaugc　　　　　　21