本實用新型屬于醫(yī)療器械的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種全反式維甲酸藥物和納米金剛石的復(fù)合并聯(lián)合藍光LED照射治療白血病的裝置。

背景技術(shù)：

白血病是危害人類健康和生命的重大疾病，尚沒有完全治愈的藥物和技術(shù)。急性早幼粒細胞白血病(APL)屬于急性髓系白血病(AML)的一種，目前全反式維甲酸(ATRA)作為靶向治療APL的藥物并且獲得了較好的療效。但是ATRA長時間單一使用會產(chǎn)生維甲酸毒副作用以及復(fù)發(fā)性。將ATRA聯(lián)合砷化合物(ATO)治療APL是一種新的治療技術(shù)，可在較短時間獲得完全緩解率同時保證了較長的無病生存率，但是ATO的長期使用會對人體產(chǎn)生不良反應(yīng)或毒副作用。光動力學(xué)治療近年來也用于APL的治療的作用，如紅光作用光敏劑Purpurin-18可促進腫瘤細胞HL60的凋亡，但是光敏劑的使用存在細胞毒性以及細胞攝入量低的問題。還有用UV紫外燈光照核黃素抑制HL60細胞的生長，而紫外光照對人會產(chǎn)生皮膚致癌的作用，不宜于臨床應(yīng)用。利用光(特別是藍光)直接照射HL60細胞，可明顯地提高其抑制率，但沒有藥物的配合，該方法不具備靶向治療的特點，無法獲得更好的臨床治療效果。

和本實用新型接近的現(xiàn)有技術(shù)是申請?zhí)枮?3142238.1名稱為“一種可治愈急性早幼粒白血病的組合藥物”的發(fā)明專利，通過ATRA誘導(dǎo)未正常分化的細胞分化同時聯(lián)合砷劑As₂O₃共同誘導(dǎo)細胞凋亡，利用這兩種藥物聯(lián)合治療APL，雖然提高APL治愈率。但是，化療藥物的長時間使用會對人體產(chǎn)生毒性，研究表明As₂O₃對細胞毒性存在短期的副作用及長期的細胞毒性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本實用新型要解決的技術(shù)問題是，設(shè)計了一種ATRA/ND納米金剛石載藥復(fù)合物協(xié)同藍光治療裝置，利用無毒納米金剛石(ND)提高ATRA藥物作用效果的同時減少藥物的使用劑量，再協(xié)同溫和藍光作用，增強對人早幼粒白血病細胞的殺傷作用，從而達到更好的臨床治療效果。通過體外細胞增殖抑制、凋亡實驗及體內(nèi)動物抑瘤實驗，證明了三者協(xié)同增強抑制作用，可比單獨使用ATRA的效果大幅提高，同時可以減少藥物毒副作用。

將ATRA和ND按照摩爾質(zhì)量比5～10:1配制成納米金剛石載藥復(fù)合物藥物。

體內(nèi)動物實驗每天按照5mg/kg/d的接種量，腹腔注射，治療7天，同時給予0.25mW/cm²藍光體外照射8h/d，達到90％以上的抑瘤率。同時研究證明細胞凋亡主要是通過線粒體凋亡途徑實現(xiàn)的，其中ATRA是誘導(dǎo)分化促進細胞凋亡，納米金剛石作為一種載體具有富集、緩釋藥物的作用。藍光作為綠色光源替代As₂O₃促進細胞凋亡?；谝陨系难芯?，本實用新型公開一種新型的高效率、低毒副作用的APL聯(lián)合治療的裝置。

本實用新型設(shè)計的一種藍光照裝置，波長為400～500nm的商用藍光LED包覆于透明的血流管上，當(dāng)含有HL60細胞的血液流經(jīng)加藥口時，給予一定劑量的ATRA和ND(5～10:1的摩爾質(zhì)量比)制成的納米金剛石載藥復(fù)合物ATRA/ND，之后將含有藥物的血液流經(jīng)藍光照射裝置，最終獲得最大的抑制效果。具體的技術(shù)方案如下。

一種藍光-全反式維甲酸-納米金剛石協(xié)同治療白血病的裝置，其中的藥物成分有全反式維甲酸(ATRA)，其特征在于，在一條兩端分別是血液入口7和血液出口6的血循環(huán)管路8中間串接透明的血流管5，血流管5外部被藍光LED陣列1包覆；血循環(huán)管路8中間不同位置分別接裝有蠕動泵3、肝素囊4、藥物盒2；藥物盒2內(nèi)裝有以全反式維甲酸和納米金剛石粉為成分的納米金剛石載藥復(fù)合物。

其中，全反式維甲酸和納米金剛石粉按摩爾質(zhì)量比5～10:1。

其中，所述的納米金剛石粉，平均粒徑為3～15nm；所述的金剛石粉，是經(jīng)過酸化回流處理的。

其中，藍光可以使用發(fā)光二極管LED光源，白光加藍光濾光片等，波長范圍為400～500nm。

本實用新型的ARTA/ND納米金剛石載藥復(fù)合物的用量按全反式維甲酸的量計，等于或低于現(xiàn)有的單獨使用全反式維甲酸的量。

本實用新型的納米金剛石載藥復(fù)合物是以納米金剛石粉作為載體，負載ATRA，納米金剛石粉在藥物中主要起富集和緩釋ATRA的作用，利用無毒、生物兼容性好的納米金剛石粉(ND)負載ATRA藥物，制成ATRA納米金剛石載藥復(fù)合物(ATRA/ND)，證明可以降低藥物給藥量；藍光-ATRA-ND的協(xié)同抑制細胞增殖效果分別高于任何單獨的組合，同時證明通過線粒體凋亡途徑實現(xiàn)細胞凋亡，可以大幅提高對HL60細胞的增殖抑制，體內(nèi)實驗證明能夠明顯抑制腫瘤的生長，獲得更好的臨床治療效果。

附圖說明

圖1是本實用新型的藍光-全反式維甲酸-納米金剛石協(xié)同治療白血病裝置示意圖。

圖2是實施例2的CCK8實驗檢測藍光-ATRA-ND協(xié)同增強細胞增殖抑制與對照組、ATRA-ND、藍光照組的對比圖。

圖3實施例2流式細胞儀檢測藍光-ATRA-ND協(xié)同誘導(dǎo)HL60細胞凋亡與對照組及分別使用藍光、ATRA-ND作用的對比圖。

圖4實施例3各種方式對小鼠的HL60腫瘤抑瘤曲線圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，對本實用新型做進一步說明。以下實施例僅用于說明本實用新型而非用于限制本實用新型的范圍。

實施例1、本實用新型的藍光-全反式維甲酸-納米金剛石協(xié)同治療白血病裝置的整體結(jié)構(gòu)。

如圖1所示，1為藍光LED陣列，2為藥物盒，3為蠕動泵，4為肝素囊，5為血流管，6為血液出口，7為血液入口，8為血循環(huán)管路。其中，血循環(huán)管路8兩端開有血液入口7和血液出口6，中間串通血流管5和接通蠕動泵3，血液入口7、蠕動泵3、血循環(huán)管路8、血流管5和血液出口6構(gòu)成血液的循環(huán)系統(tǒng)；血流管5外部放置藍光LED陣列1；血循環(huán)管路8中間分別接通藥物盒2和肝素囊4；藥物盒2內(nèi)裝有以全反式維甲酸和納米金剛石粉為成分的納米金剛石載藥復(fù)合物。

其中的納米金剛石粉，最好是經(jīng)過酸化回流處理，形成ND表面羥基化，有利于分散以及與全反式維甲酸藥物偶聯(lián)，形成納米金剛石載藥復(fù)合物。

將波長為400～500nm的商用藍光LED陣列1環(huán)置于透明的血流管5周圍，距離和光劑量可以優(yōu)化，使血流管5處于藍光照射下。血液經(jīng)過血液入口7進入血循環(huán)管路8，當(dāng)含有HL60細胞的血液流經(jīng)過肝素囊4與血循環(huán)管路8的通口處時，給予一定的肝素防止血液發(fā)生凝集，血液經(jīng)過蠕動泵3繼續(xù)循環(huán)，在藥物盒2內(nèi)的藥物輸入到血流管5，給予一定劑量的ATRA和ND(5～10:1的摩爾質(zhì)量比)制成的ATRA/ND納米金剛石載藥復(fù)合物，血液繼續(xù)流經(jīng)透明的血流管5，此時含有ATRA/ND納米金剛石載藥復(fù)合物的血液經(jīng)外層管壁上的藍光LED進行照射后，血液通過血循環(huán)管路8流至血液出口6重新回至人體。

所述的ATRA/ND納米金剛石載藥復(fù)合物，ATRA與ND的摩爾質(zhì)量比在5～10:1的范圍內(nèi)，對腫瘤細胞HL60的增殖抑制和凋亡效果基本相同。

實施例2、藍光照ATRA和ND協(xié)同促進細胞增殖抑制以及凋亡實驗。

1)細胞增殖抑制實驗

取對數(shù)期的HL60細胞計數(shù)，控制細胞密度10⁵個/ml。接種于96孔板中(10⁴個/孔)，實驗組1：50uM ATRA和50ug/LND形成的納米金剛石載藥復(fù)合物藥物；實驗組2：藍光照組；實驗組3：藍光照50uM ATRA和50ug/LND形成的納米金剛石載藥復(fù)合物；對照組:RPMI-1640培養(yǎng)基(含0.1％二甲基亞砜)，培養(yǎng)24h后，測試藍光照ATRA和ND對HL60細胞增殖抑制影響。加入10ul CCK8孵育4h，酶標儀450nm檢測吸光度。

2)細胞凋亡實驗

取對數(shù)期HL60細胞接種于100mm培養(yǎng)皿中，細胞密度為1.2×10⁶個，設(shè)置實驗組1：50uM ATRA和50ug/LND形成的納米金剛石載藥復(fù)合物藥物；實驗組2：藍光照組；實驗組3：藍光照50uM ATRA和50ug/LND形成的納米金剛石載藥復(fù)合物；對照組:RPMI-1640培養(yǎng)基(含0.1％二甲基亞砜)，每天光照12h，連續(xù)實驗3天，每天測試細胞凋亡情況。1000rpm 5min收集細胞，PBS清洗細胞一遍，將細胞重懸于50ul結(jié)合緩沖液中，分別加入2ul Annexin-V-FITC和2ul PI染料，4℃染色，過300目濾網(wǎng)，流式細胞儀1h小時內(nèi)完成測試。

實驗結(jié)果細胞增殖抑制如圖2(*P<0.05相對對照組具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異,#P<0.05相對ATRA/ND納米金剛石載藥復(fù)合物組具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異)，細胞凋亡如圖3。

圖2結(jié)果表明藍光照ATRA/ND納米金剛石載藥復(fù)合物，細胞增殖抑制率相比較空白組抑制率增加75％，比藍光或不加藍光ATRA/ND的抑制率都高。圖3結(jié)果表明，藍光照ATRA/ND的情況下，在24h的凋亡率54％，48h時凋亡率78％，72h的細胞凋亡率98％，隨著光劑量的增加細胞的凋亡率逐漸增加，都高于藍光、ATRA和ND單獨作用的凋亡率。

實施例3、體內(nèi)動物抑瘤實驗。

為了測試藍光治療APL的效果，建立HL-60細胞裸鼠皮下腫瘤模型。選擇BALB/c裸鼠(體重20-24g約5周齡)，小鼠皮下注射1×10⁷個細胞，觀察10天左右，出現(xiàn)明顯瘤體后。按照腫瘤大小隨機分組。分別設(shè)置空白組，ATRA組、ATRA和ND組、藍光照組：光照8小時/天，實驗7天。藍光ATRA組和藍光照ATRA和ND組：每天腹腔注射5mg/kg ATRA(含1％羥甲基纖維素鈉)，共作用7天。實驗過程中每天測量瘤體積和小鼠體重。瘤體積用數(shù)顯卡尺測量計算公式：瘤體積(mm³)V＝長*寬*寬/2，長：瘤長徑寬：瘤短徑。實驗結(jié)束后，處死小鼠取腫瘤，根據(jù)腫瘤抑制率％＝1－((給藥組平均瘤重(T)/對照組平均瘤重(C))×100％，計算抑瘤率。如圖4?？梢钥闯瞿[瘤生長受到抑制。藍光照ATRA和ND組相對空白組抑瘤率依次為95％。藍光照ATRA和ND可以最大程度地抑制腫瘤的生長。

實施例4、藍光/ATRA/ND協(xié)同機制。

通過線粒體凋亡通路的標志分子ROS，線粒體膜上的凋亡抑制蛋白Bcl-2mRNA的表達情況，以及凋亡效應(yīng)蛋白Caspase3蛋白活性進行細胞凋亡的機制的研究。實驗結(jié)果表明，藍光照ATRA和ND，活性氧增加，相應(yīng)的Bcl-2mRNA的表達量降低，Caspase3蛋白活性升高。可以推斷細胞通過線粒體通路走向凋亡。

綜上所述，本實用新型研制的一種安全、方便易制作的可見光-藍光協(xié)同最有效的治療藥物ATRA以及生物相容性較好的納米金剛石材料，制作一種新的裝置，通過協(xié)同作用用于白血病的臨床治療，提高治療效果，預(yù)期可取得重要的臨床應(yīng)用。