用于使用抗-整合素改善抗血管生成療法的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本文描述了用于治療腫瘤和轉(zhuǎn)移的方法和組合物，其改善了抗-血管生成療法。通過用抗-β1整合素組合物和抗-血管生成組合物組合抑制生物系統(tǒng)中的這些機(jī)制，腫瘤和轉(zhuǎn)移可以被剝奪充足的血液供給，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長停滯和可能的消退，包括腫瘤細(xì)胞死亡。在一種藥物組合物或多種藥物組合物中，本組合物包含抗-β1整合素劑與抗-VEGF劑的組合。還描述了治療方法和成像方法。
【專利說明】用于使用抗-整合素改善抗血管生成療法的方法和組合物
[0001]發(fā)明人:WarrenShawn Carbonell 和 Manish Aghi
[0002]相關(guān)申請的交叉引用
[0003]本申請要求2011年3月23日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/466，791的優(yōu)先權(quán)，其在此通過引用整體被并入。
[0004]政府支持的聲明
[0005]無
[0006]序列表、計(jì)算機(jī)程序或光盤的引用
[0007]本申請包含已通過EFS-Web以ASCII格式提交的序列表并在此通過引用整體被并入。所述ASCII拷貝，于2012年I月31日創(chuàng)建，被命名為“479-lOOSequence Listing,txt”且大小為5，287字節(jié)。
[0008]發(fā)明背景
發(fā)明領(lǐng)域
[0009]本發(fā)明涉及用于癌癥包括轉(zhuǎn)移癌的治療組合物和療法、特別是針對腫瘤血管化的療法的領(lǐng)域。
[0010]相關(guān)技術(shù)
[0011]下面呈現(xiàn)了關(guān)于本發(fā)明某些方面的背景信息，盡管它們可能涉及詳述中提及的技術(shù)特征，但不必然地被詳細(xì)描述。`即，本發(fā)明所使用的單獨(dú)的部分或方法可在下面所討論的材料中被更詳細(xì)地描述，這些材料可向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供用于制造或使用如所要求保護(hù)的本發(fā)明的某些方面的進(jìn)一步的指導(dǎo)。下面的討論不應(yīng)被解釋為承認(rèn)信息與本文任何權(quán)利要求的相關(guān)性或所描述的材料的現(xiàn)有技術(shù)效果。
[0012]已鑒定許多分子為具有血管生成的特征。然而，迄今為止被鑒定最有效的是血管內(nèi)皮生長因子-A (VEGF-A)o這是藥物貝伐單抗(又名，阿瓦斯汀? Genentech, SouthSan Francisco, CA)的祀標(biāo)，其已在患有包括結(jié)腸和直腸[Hurwitz等人，New EnglandJournal of Medicine350:2335-2342 (2004)]、乳腺[Miller 等人，New England Journalof Medicine357:2666-2676 (2007)]、肺[Sandler 等人，New England Journal ofMedicine355:2542-2550(2006)]、腎[Escudier 等人，The Lancet370:2103-2111 (2007)]和腦[Friedman 等人，Journal of Clinical Oncology,do1: 10.1200/JC0.2008.19.8721(2009)]的各種晚期-階段的癌癥的患者中顯示臨床前景。與VEGF-A本身不同，被設(shè)計(jì)抗VEGF-A受體的藥物也已在最近的臨床試驗(yàn)中顯示相似的前景。
[0013]雷珠單抗⑧(蘭尼單抗)也是重組的人源化抗-VEGF抗體。蘭尼單抗與多種VEGF-A亞型結(jié)合。作為抗體片段，蘭尼單抗被設(shè)計(jì)為具有48kD分子量的小分子。它被包裝用于玻璃體內(nèi)使用，而非靜脈內(nèi)或瘤內(nèi)使用。
[0014]VEGF-A是血管生長因子家族的最具特征的并可能是最有效的成員[Ferrara和Gerber, Acta Haematological06:148-156 (2002)]。目前，其他成員包括 VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和PIGF。這些因子通過至少三個(gè)已知的受體酪氨酸激酶:VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3傳遞信號。
[0015]不幸地，抗-血管生成假說的預(yù)測迄今為止還沒有在臨床中實(shí)現(xiàn)[Greenberg和Cheresh, Expert Opinion on Biological Therapy9:1347-1356 (2009)]。貝伐單抗治療和化療結(jié)合最多導(dǎo)致存活延長僅4.7個(gè)月的中值[Hurwitz等人，New England Journal ofMedicine350:2335-2342 (2004)]。患者最終死于持續(xù)的癌癥發(fā)展。該耐藥性機(jī)制是有爭議的并可反映血管生成假說的無效或腫瘤細(xì)胞獲取可替代的血管源的能力。
[0016]本領(lǐng)域的治療策略過分依賴于基于血管生成的腫瘤血管化的單一的概念。對抗-血管生成療法的臨床耐藥性很可能是由于腫瘤細(xì)胞利用用于獲得血管結(jié)構(gòu)的可替代的方法。已描述了多種類型的腫瘤血管化過程，包括血管擴(kuò)張、血管重塑、血管共選擇(co-option)、血管套疊(vascular intussusception)、腎小球樣血管形成、偽血管形成和循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞[在 Dome 等人,American Journal of Patho logy 170:1-15 (2007)中被綜述]。
[0017]本領(lǐng)域中一些策略已提出用于抑制腫瘤血管化的組合治療策略。然而，這些策略僅靶向腫瘤血管化的血管生成方面或提出新的腫瘤血管的靶向血管破裂。迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)中沒有提供通過向生物系統(tǒng)施用靶向血管生成生長信號傳導(dǎo)和基于粘附的共選擇信號傳導(dǎo)二者組合的化合物用于完全抑制腫瘤和/或轉(zhuǎn)移血管化的治療策略。
[0018]具體的專利和出版物
[0019]Park 等人(2009 年 11 月 17 日授權(quán)的美國 7，618，627，“Method of increasingradiation sensitivity by inhibition of beta-one integrin”)使用抗-β I 整合素抗體ΑΙΙΒ2與電離輻射聯(lián)合以促進(jìn)腫瘤細(xì) 胞凋亡。
[0020]Theodore Yednock[美國專利 6，O33，665 (2OOO) ] “Compositions and methodsfor modulating leukocyte adhesion to brain endothelial cells.，，這是已被FDA批準(zhǔn)用于臨床使用的導(dǎo)致抗-整合素治療藥物的首批專利之一(抗α 4-β I的Tysabri ?用于治療多發(fā)性硬化，Elan Pharmaceuticals, Inc.)。
[0021]Friess等人[美國專利申請0050385A1 (2008)]提出了用靶向血管生成相關(guān)的生長因子的抗-VEGF抗體和抗-HER2抗體二者的組合治療。
[0022]Senger等人[美國專利6，596，276 (2003)]提出了施用抗α I和/或α 2整合素亞基的抑制抗體以靶向VEGF介導(dǎo)的血管生成的這些下游效應(yīng)子。
[0023]Bissell 等人[美國專利 5，846，536 (1998)和美國專利 6，123，941 (2000)]公開了用于通過向需要此治療的組織的P1整合素受體施用有效量的^整合素功能-封閉抗體或整合素功能的肽抑制劑逆轉(zhuǎn)組織中的惡性表型的方法。
[0024]發(fā)明概述
[0025]以下的概述并不預(yù)期包含本發(fā)明的所有特征和方面，也不暗示本發(fā)明必須包含該概述中所討論的所有特征和方面。
[0026]本發(fā)明總體上包含用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物組合物，包括:為VEGF活性諸如VEGF信號傳導(dǎo)和/或與VEGF受體結(jié)合的抑制劑的第一劑；和阻斷β I整合素的第二劑。阻斷β I整合素能夠阻斷細(xì)胞附著、阻斷細(xì)胞附著后發(fā)生的β_整合素細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)或二者。所使用的劑是物質(zhì)，諸如肽或小分子的組合物。它們可以是抗體或抗體-樣分子。劑的組合具有協(xié)同效應(yīng)，即，比單獨(dú)的任一劑更有效。劑可以是單一組合物或匹配配對的組合物。
[0027]在某些方面，本發(fā)明包含用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法。通常，本方法包括用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法，包含向患有所述腫瘤的受試者施用以下物質(zhì)的步驟:為抗-血管生成劑的第一劑；和阻斷由β I整合素介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix)相互作用和β I整合素信號傳導(dǎo)的第二劑的組合，據(jù)此腫瘤細(xì)胞生長被抑制至比由單獨(dú)的第一劑或第二劑所引起的抑制更大的程度，即，協(xié)同地抑制。優(yōu)選的受試者是患有腫瘤的人受試者。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法包含施用抗- β I整合素抗體與拮抗性抗-VEGF受體、抗-VEGF(例如抗-VEGF-A)抗體聯(lián)合的劑量。下面進(jìn)一步詳細(xì)描述了多種抗-VEGF和抗-整合素劑。用于向患者遞送被組合的抗體的方法將是臨床腫瘤學(xué)領(lǐng)域中具有普通醫(yī)療、護(hù)理或類似醫(yī)療保健技能的人員眾所周知的?？赏ㄟ^任何臨床手段、特別是腸胃外或瘤內(nèi)注射施用本組合物。還可在手術(shù)切除之后將本組合物直接施加至機(jī)體內(nèi)的實(shí)際的或潛在腔，包括腫瘤床。也可以以臨床上適當(dāng)?shù)拈g隔施用提高血管通透性的劑。這些可增強(qiáng)某些器官諸如中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS )中治療物質(zhì) 的遞送。另外，可在包括放療和化療的治療之前、期間或之后給予輔助治療方案。可提供實(shí)施方案的重復(fù)施用以獲得期望的臨床效果。
[0029]附圖簡述
[0030]圖1A、1B和IC分別是顯示響應(yīng)急性低氧損害的U87MG神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(1A)、MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞(IB)和SW1080結(jié)直腸癌細(xì)胞(I)的β I整合素(MFI)的增加的一系列的三張條形圖。
[0031]圖2Α和2Β是顯示具有(2Α)和不具有(2Β)貝伐單抗處理的處理下染色神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤異種移植物以確定整合素βI表達(dá)的一組照片。
[0032]圖3Α是顯示不同增殖條件的U87MG神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中整合素β I表達(dá)的條形圖；圖3Β是顯示整合素β I表達(dá)和增殖之間相關(guān)性的散點(diǎn)圖。
[0033]圖4Α和4Β是來自多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者樣本的一組照片，顯示經(jīng)染色以確定存在正常血管結(jié)構(gòu)(4Α)中和血管生成腎小球樣血管(4Β)處整合素β I表達(dá)的細(xì)胞。
[0034]圖5是在原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和抗血管生成逃避(evasive)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的情況下繪制整合素β I表達(dá)的條形圖。
[0035]圖6是顯示由不同劑量的ΑΙΙΒ2對原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的細(xì)胞生長抑制和當(dāng)ΑΙΙΒ2與低氧(1%氧氣持續(xù)48小時(shí))組合時(shí)對其的協(xié)同生長抑制的條形圖。
[0036]圖7Α和7Β是顯示三種不同的敲低細(xì)胞系的整合素β I表達(dá)(7Α)和增殖(7Β)的一組條形圖，其中整合素βI敲低顯示大體上較低的表達(dá)和增殖。
[0037]圖8是顯示處于不同濃度的ΑΙΙΒ2時(shí)，抗血管生成耐受性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中月旲聯(lián)蛋白和Ki67調(diào)亡標(biāo)志物的表達(dá)的條形圖。
[0038]圖9是顯示不同濃度的AIIB2抗體下原代GBM細(xì)胞系的細(xì)胞生長的條形圖。
[0039]圖10是顯示不同的抗體處理下小鼠腫瘤模型中腫瘤體積變化的圖。標(biāo)記“組合(combo)”的圖是AIIB2和貝伐單抗的組合。箭頭顯示處理的開始。
[0040]圖11是顯示用不同濃度的AIIB2處理超過2天的生長期和匯合培養(yǎng)(生長停滯)中GBM細(xì)胞的細(xì)胞生長隨時(shí)間推移的條形圖。IgG被用作對照。
[0041]圖12是顯示經(jīng)受持續(xù)2天的低氧、隨后在常氧下生長的GBM細(xì)胞的細(xì)胞生長隨時(shí)間推移的條形圖。給予細(xì)胞IgG (對照)和不同濃度的AIIB2。
[0042]圖13是顯示兩周一次測量對照IgG (10mg/kg)(菱形)、貝伐單抗(10mg/kg)(正方形)或貝伐單抗(lmg/kg)和AIIB2 (lmg/kg)的低劑量交替的組合療法(圓形)情況下的U87MG神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤的腫瘤生長隨時(shí)間推移的線性圖。
[0043]優(yōu)選實(shí)施方案的詳述
[0044]定義
[0045]除非另外定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員所普遍理解的相同的含義。盡管與本文所描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可被用于本發(fā)明的實(shí)施或檢測，描述了優(yōu)選的方法和材料。通常，使用與細(xì)胞和分子生物學(xué)和化學(xué)相關(guān)的術(shù)語及細(xì)胞和分子生物學(xué)和化學(xué)的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的和普遍使用的術(shù)語和技術(shù)。沒有具體定義的某些實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通常根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法和如貫穿本說明書被引用和被討論的多種一般的和更具體的參考文獻(xiàn)中描述的被實(shí)施。為了清楚的目的，下面定義了以下的術(shù)語。
[0046]“VEGF”指的是血管內(nèi)皮生長因子，還稱為血管內(nèi)皮生長因子(vasoendothelialgrowth factor),在Genbank登錄號AAA35789中具有示例性的氨基酸序列，在Leung等人“Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen, ”Science246(4935), 1306-1309(1989)中被進(jìn)一步描述。VEGF是與血小板衍生生長因子(“TOGF”)有關(guān)的二聚的、二硫鍵連接的46-kDa的糖蛋白。它由正常的細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生；是內(nèi)皮細(xì)胞選擇性有絲分裂原；在體內(nèi)檢測體系(例如，兔角膜)中顯示血管生成活性；是內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化的；并在內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)纖溶酶原激活物，其參與毛細(xì)血管形成過程中的細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解的降解中。一些VEGF的亞型是已知的，盡管它們顯示可比的生物活性，但其在分泌它們的細(xì)胞類型和它們的肝素結(jié)`合能力方面存在不同。VEGF的細(xì)胞受體(VEGFR)是跨膜受體酪氨酸激酶。它們通過具有7個(gè)免疫球蛋白-樣的結(jié)構(gòu)域和I個(gè)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的胞外域被表征。已表征了不同類型的VEGF受體，包括VEGFR-1 (還稱為flt-1)、VEGFR-2 (還稱為KDR3)和VEGFR-3。大量的人類腫瘤，特別是神經(jīng)膠質(zhì)瘤和癌，表達(dá)高水平的VEGF和VEGFR。這已導(dǎo)致了以下假說:由腫瘤細(xì)胞釋放的VEGF以旁分泌的方式刺激毛細(xì)血管的生長和腫瘤內(nèi)皮的增殖并通過改善的血液供給加快腫瘤生長。
[0047]術(shù)語“VEGF抑制劑”指的是減弱通過VEGF-VEGFR通路的信號傳導(dǎo)的物質(zhì)或方法。VEGF抑制劑可以是，例如，小分子，肽，多肽，蛋白、更具體地包括抗體、包括抗-VEGF抗體、抗-VEGFR抗體、胞內(nèi)抗體、大抗體(maxibody)、微抗體(minibody)、雙體，F(xiàn)e融合蛋白諸如肽抗體、受體抗體(receptibody)、可溶性VEGF受體蛋白和片段和多種其他的。目前優(yōu)選的VEGF抑制劑是肽，諸如基于抗體的抑制劑。許多VEGF抑制劑通過與VEGF或與VEGF受體結(jié)合起作用。其他的則通過與結(jié)合至VEGF或結(jié)合至VEGF受體的因子或與VEGF信號傳導(dǎo)通路中的其他組成部分結(jié)合較為間接地起作用。又其他的VEGF抑制劑通過改變調(diào)節(jié)VEGF通路信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)性翻譯后修飾起作用。根據(jù)本發(fā)明的VEGF抑制劑還可通過較為間接的機(jī)制起作用。無論參與什么機(jī)制，如本文所用的，相對于在不存在抑制劑時(shí)處于相同環(huán)境中的VEGF信號傳導(dǎo)通路的有效活性，VEGF抑制劑減弱了給定環(huán)境中的VEGF信號傳導(dǎo)通路的有效活性。另一種VEGF抑制劑是基于核酸的，使用RNAi的抑制劑，如下面所描述的。
[0048]術(shù)語“人源化”指的是為包含源自非-人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗體的非-人(例如，嚙齒動物)抗體的形式。大多數(shù)情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)，其中，來自受者高變區(qū)的殘基被來自非-人物種諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的具有期望的特異性、親和性和能力的高變區(qū)(供體抗體)的殘基所代替。在一些情況下，人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非-人殘基所代替。此外，人源化的抗體可包含受者抗體或供體抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。做出這些修飾以進(jìn)一步完善抗體性能。通常，人源化的抗體將包括至少一個(gè)且通常兩個(gè)可變域的基本上所有，其中所有或基本上所有的高變環(huán)對應(yīng)于非-人免疫球蛋白的高變環(huán)且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化的抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。關(guān)于進(jìn)一步的詳細(xì)信息，見Jones等人，Nature321:522-525 (1986) ;Riechmann等人，Nature332:323-329(1988);和 Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992)。
[0049] 術(shù)語“對流曾弓黽的遞.送(convection enhanced delivery)，，豐旨的是.用于通.1寸克服血腦屏障將藥物遞送至腦的方法。對流增強(qiáng)的遞送由R.Hunt Bobo等人在Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1994 年 3 月，第 91 卷，第 2076-2080 頁；uConvection-enhanced deliveryof macromolecules in the brain”)中首次描述。對流增強(qiáng)的遞送包括通過頡骨鉆孔將一些導(dǎo)管立體定向地放置入腦實(shí)質(zhì)及后續(xù)治療劑通過微量注射泵的注入。通過靜脈內(nèi)注射并穿過血腦屏障或通過腦室內(nèi)注射的大部分藥物的局部遞送進(jìn)入腦的標(biāo)準(zhǔn)方法依賴于擴(kuò)散，其導(dǎo)致大部分劑的非均勻的分布。靜脈內(nèi)施用藥物至腦被血腦屏障所阻礙，其阻止了大分子的通過。腦血屏障由血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接所表征，其阻止或阻礙多種天然存在和合成的物質(zhì)(包括抗癌藥物)進(jìn)入腦。不同于依賴于擴(kuò)散的技術(shù)，對流增強(qiáng)的遞送使用在注入導(dǎo)管的尖端所建立的壓力梯度將藥物推進(jìn)細(xì)胞外間隙。目的是比通過單獨(dú)的擴(kuò)散施用時(shí)更均勻地、以更高濃度地并經(jīng)更大區(qū)域地分布藥物。治療劑的對流增強(qiáng)的遞送可在使用腫瘤切除的開顱術(shù)之后進(jìn)行。藥物的對流增強(qiáng)的遞送由Yael Mardor等人在Cancer Research (2005 年 8 月，第 65 卷，第 6858-6863 頁；〃Convection_enhanced drugdelivery:1ncreased efficacy and magnetic resonance image monitoring")中詳細(xì)描述。
[0050]術(shù)語“人單克隆抗體”指的是基本上沒有非-人(例如，小鼠)序列的抗體。它可以是完全人的或如本領(lǐng)域已知的通過去除除了抗體結(jié)合區(qū)之外的小鼠序列，F(xiàn)v部分或CDR區(qū)而人源化的。
[0051]術(shù)語“ 抗體”還包括多種形式的經(jīng)修飾的或經(jīng)改變的抗體，諸如多種片段諸如Fv片段、僅包含輕鏈和重鏈可變區(qū)的Fv片段、由二硫鍵連接的Fv片段(Brinkmann等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:547-551 (1993))、包含可變區(qū)和部分恒定區(qū)的 Fab或(Fab)’2片段、單鏈抗體和類似的抗體(Bird等人，Science242:424-426 (1988)；Huston 等人，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA85:5879-5883 (1988))?？贵w最初可以是動物的(特別是小鼠或大鼠)或人源的或可以是嵌合的(Morrison等人，Proc Nat.Acad.Sc1.USA81:6851-6855 (1984)) ο 它可如 Jones 等人，Nature321:522-525 (1986)和公布的 UK 專利申請#8707252中所描述的被人源化。
[0052]術(shù)語“細(xì)胞外基底物質(zhì)(extracellular substrate)”指的是用于細(xì)胞結(jié)合的物質(zhì)，并可包含所定義的組織諸如血管結(jié)構(gòu)(血管內(nèi)皮細(xì)胞)或細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，即，除了執(zhí)行多種其他重要功能之外通常向動物細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐的動物組織的細(xì)胞外部分；它由纖維蛋白和糖胺聚糖的交錯(cuò)的網(wǎng)構(gòu)成。
[0053]術(shù)語“shRNA”指的是短發(fā)夾RNA。
[0054]術(shù)語“RNAi”指的是RNA干擾。RNAi是轉(zhuǎn)錄后、靶向基因沉默的技術(shù)，其使用雙鏈RNA (dsRNA)以降解包含與dsRNA相同序列的信使RNA (mRNA) (Sharp, P.A.和Zamore, P.D.287，2431-2432 (2000) ；Zamore, P.D.等人，CelllOl, 25-33 (2000).Tuschl, T.等人，Genes Dev.13，3191-3197 (1999) ； Cottrell T R 和 Doering T L.2003.TrendsMicrobiol.11:37-43 ；Bushman F.2003.Mol Therapy.7:9-10 ；McManus M T 和 Sharp PA.2002.Nat Rev Genet.3:737-47)。當(dāng)內(nèi)源的核糖核酸酶將較長的dsRNA裂解為較短，例如，21-核苷酸或22-核苷酸-長的RNA，稱為小干擾RNA或siRNA時(shí)，發(fā)生該過程。隨后，較小的RNA區(qū)段介導(dǎo)祀mRNA的降解。用于合成RNAi的試劑盒是例如從New England Biolabs或Ambion市售可得。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所描述的用于反義RNA的一種或多種化學(xué)品可在介導(dǎo)RNAi的分子中被采用。
[0055]術(shù)語“藥物組合物”指的是包含以指定量與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、穩(wěn)定劑、賦形劑等組合的所列舉的治療劑的產(chǎn)品或一組產(chǎn)品。術(shù)語“藥學(xué)上可接受”指的是具有足夠的純度和質(zhì)量用于制備本發(fā)明的藥物組合物、藥品或藥劑，并當(dāng)適當(dāng)?shù)厥┯弥羷游锘蛉藭r(shí)不會產(chǎn)生不利的、過敏的或其他不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。由于人類使用和獸醫(yī)使用二者同樣被包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，藥學(xué)上可接受的制劑將包括用于人或獸醫(yī)使用的藥物組合物、藥品或藥劑。
[0056]在本發(fā)明涉及方法、藥物組合物的某些方面，可包含單一的劑，但根據(jù)本方法，在療程中與其他劑一起被施用。
[0057]一般方法和材料
`[0058]本文描述了用于治療腫瘤和轉(zhuǎn)移的改進(jìn)的方法和組合物，其通過I)血管的新生或重塑(B卩，血管生成)與2)通過直接的粘附互作(B卩，共選擇(co-option))利用現(xiàn)有血管的組合識別腫瘤血管化的雙重機(jī)制。通過抑制生物系統(tǒng)中兩種機(jī)制的組合，腫瘤和轉(zhuǎn)移可被剝奪足夠的血液供給，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長停滯和可能的消退，包括腫瘤細(xì)胞死亡。本方法在科學(xué)研究和醫(yī)療保健中具有多種用途，其中血管化是疾病過程特別是癌癥中的促進(jìn)因素。在另外的實(shí)施方案中，可通過同時(shí)或順序地加強(qiáng)血管生成和粘附血管共選擇二者實(shí)現(xiàn)用于組織修復(fù)或代替的血管化的增強(qiáng)。
[0059]目前靶向VEGF通路的抗血管生成療法是由Genentech的阿瓦斯汀? (貝伐單抗)帶領(lǐng)下的具有2009年銷售總額61億美元的快速增長的市場。然而，阿瓦斯汀⑧僅顯示中度的臨床成功。其在結(jié)腸癌中最多增加4.7個(gè)月的總存活期且在腦癌(多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，GBM)中最多增加4.2個(gè)月的無進(jìn)展存活期。甚至更令人沮喪的是，如已在UK發(fā)生的，F(xiàn)DA正考慮推翻他們關(guān)于在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中使用阿瓦斯汀?的批準(zhǔn)。
[0060]阿瓦斯汀?被認(rèn)為通過阻止新血管形成(血管生成)發(fā)揮作用，因此使腫瘤細(xì)胞經(jīng)受葡萄糖和氧的饑餓。尤其，β I整合素在腫瘤細(xì)胞中的氧缺乏(又名，低氧)過程中被上調(diào)。在取自具有失敗的阿瓦斯汀?治療的患者的GBM細(xì)胞中，與未處理的原代GBM細(xì)胞相比，該靶標(biāo)被上調(diào)了 50χ至200χ。有趣的是，它在腫瘤細(xì)胞增殖過程中和Y輻照之后也被上調(diào)，表明了在有絲分裂和細(xì)胞存活中的雙重角色。抑制該靶標(biāo)還可在ECM支架(例如，間質(zhì)和血管基底膜)上阻止腫瘤細(xì)胞的依賴整合素的入侵。[0061]本發(fā)明的一個(gè)方面包括在具有用抗-VEGF抗體諸如阿瓦斯汀? (貝伐單抗)治療失敗的患者中使用抑制β I整合素的劑。如下面描述的，這已被體外和體內(nèi)證明。短語“失敗的抗VEGF抗體治療”此處以其臨床意義使用。貝伐單抗失敗的臨床定義為:1)從開始就無響應(yīng)(通常70%的患者)和2)初始響應(yīng)之后面對治療時(shí)疾病進(jìn)展。對于進(jìn)展存在多種客觀的臨床標(biāo)準(zhǔn)，但最常用的(并特別在貝伐單抗臨床試驗(yàn)中所使用的)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是McDonald標(biāo)準(zhǔn)。通常讓任一組中的患者服用貝伐單抗并隨后被再次手術(shù)(28天之后，由于貝伐單抗使得你容易出血)并被服從于可能的三線治療或臨終關(guān)懷。因此，人們認(rèn)為抗_β I組合物能夠作為用于具有失敗的貝伐單抗的3L GBM的單一療法。
[0062]血管共詵擇
[0063]Holash 等人(1999; Science284:1994-1998 “vessel co-option, regression andgrowth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF”)在小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中說明了最初通過共選擇現(xiàn)有宿主血管而生長的一種亞類腫瘤。該共選擇的宿主血管結(jié)構(gòu)及時(shí)地顯示了上調(diào)的VEGF和血管生成。本發(fā)明人的關(guān)于腦轉(zhuǎn)移的研究已顯示，已存在的血管的血管共選擇或利用是在早期實(shí)驗(yàn)?zāi)X轉(zhuǎn)移建立過程中和在反映疾病的早期階段的人臨床樣本中由腫瘤細(xì)胞使用的血管的主要形式。該發(fā)現(xiàn)排除了在小集落形成之前對從頭血管生成的要求。CNS實(shí)質(zhì)很大程度上缺少對于上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞粘附和存活必需的非-血管間質(zhì)基底膜成分。血管共選擇，因此，為非神經(jīng)癌細(xì)胞的惡性生長供給基底物質(zhì)，其在神經(jīng)纖維網(wǎng)中不是以其他方式廣泛可得的。當(dāng)粘附至基底膜基質(zhì)時(shí)，高度加強(qiáng)了轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞的增殖并通過體外抑制MEK被減弱。與組織培養(yǎng)中的實(shí)驗(yàn)一致，在體內(nèi)集落形成的早期階段，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)微轉(zhuǎn)移與現(xiàn)有腦血管的VBM直接接觸且這些細(xì)胞中的許多是增殖的。因此，血管基底膜(VBM)被表明是用于腦中腫瘤細(xì)胞生長的活性物質(zhì)。VBM促進(jìn)惡性細(xì)胞的粘附和入侵并在任何明顯的血管生成之前足夠用于腫瘤生長。
[0064]血管共選擇中β I整合素的作用
[0065]發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞粘附至血管的血管基底膜是由β I整合素介導(dǎo)的。腫瘤細(xì)胞中β?整合素亞基的阻斷或丟失阻止了與血管基底膜的粘附并減弱了轉(zhuǎn)移形成和體內(nèi)生長。腦中的轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移期間對粘附和入侵中的血管結(jié)構(gòu)需求可能更類似于在胰島的形成期間對VBM的需求。胰島細(xì)胞使用β I整合素與VBM相互作用且該互作對于增殖和內(nèi)分泌功能是必需的。Nikolova等人把該基底膜微環(huán)境叫作“血管微生態(tài)”(Nikolova等Α,2006;Dev CelllO:397-405;^The vascular basement membrane:a niche for insulingene expression and beta cell proliferation”)。相似地，血管壁細(xì)胞需要 β I 整合素亞基用于與血管適當(dāng)?shù)恼掣讲⒂糜诰S持血管穩(wěn)定。隨后，以類似的方式，在腦轉(zhuǎn)移過程中癌細(xì)胞表現(xiàn)為劫持腦VBM用于必需的功能。有趣地，在有限的、行之有效的CNS黑色素瘤轉(zhuǎn)移中抑制血管生成引起血管共選擇生長的逆轉(zhuǎn)。這表明腫瘤細(xì)胞的連續(xù)的血管利用，其可代表用于治療研究的可行的靶標(biāo)。
[0066]腫瘤細(xì)胞和血管之間的互作依賴于β I整合素-介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞與血管的血管基底膜的粘附。該互作足夠促進(jìn)腦中腫瘤系的直接增殖和微轉(zhuǎn)移形成。該親血管性機(jī)制對CNS中的癌(貼壁依賴型細(xì)胞)和淋巴瘤(貼壁非必需型細(xì)胞,anchorage-dispensible cell) 二者是通用的。βI整合素在正常細(xì)胞生物學(xué)的許多方面發(fā)揮主導(dǎo)作用并涉及癌發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。存在有至少10種β I整合素異二聚體，其作為不同的配體諸如膠原和層粘連蛋白的可變的雜性粘附受體。但是，我們的數(shù)據(jù)表明單獨(dú)的βI整合素亞基的拮抗作用在用于腦轉(zhuǎn)移的治療策略中可能是有用的。事實(shí)上，Park等人發(fā)現(xiàn)抑制性抗-β I整合素亞基抗體在三維培養(yǎng)中生長的乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，但沒有在單層培養(yǎng)中生長的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(Park 等人 2006; “ β lintegrin inhibitory antibody induces apoptosis of breastcancer cells,inhibits growth, and distinguishes malignant from normal phenotypein three dimensional cultures and in vivo，，Cancer Res.66:1526-1535)。用相同抗體處理具有來自那些細(xì)胞系的乳腺癌異種移植物的小鼠導(dǎo)致減小的腫瘤體積。除了所描述的體外凋亡機(jī)制，抑制血管共選擇也可減弱生長。在評價(jià)β I整合素的作用的可選的策略中，在乳腺癌的MMTV/PyMT轉(zhuǎn)基因模型中分析腫瘤。誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生之后，β I整合素的條件缺失導(dǎo)致FAK磷酸化作用和增殖的損害，與對用于腫瘤生長的貼壁依賴型信號傳導(dǎo)的依賴—致。
[0067]本方法可適用于治療具有β I整合素受體的任何類型的上皮或非上皮哺乳動物腫瘤，特別是，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、間變性星形細(xì)胞瘤、乳腺(breast) /乳腺(ma_ary)癌、肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸和直腸癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、腎癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲狀腺癌。
[0068]因此，本方面的優(yōu)勢是靶向腫瘤血管化的兩種機(jī)制包括血管生成和粘附血管共選擇。如下面描述的，抑制β I整合素的優(yōu)勢是不僅阻斷由腫瘤使用的血管的共選擇，而且直接抑制腫瘤增殖并阻止由低氧激活的存活信號通路。這避免了僅依賴于單獨(dú)的抗-血管生成的現(xiàn)有技術(shù)策略中所確定的治療耐藥性。用于評價(jià)治療療效包括腫瘤休眠和消退的手段將是具有普通醫(yī)療技能的人員所眾所周知的。這些將包括使用醫(yī)療成像技術(shù)諸如MR1、CT、PET和SPECT及物理尺寸測量和患者的臨床狀態(tài)。這兩種形式的抗血管生成劑和整合素-阻斷劑一起具有協(xié)同作用。
[0069]在實(shí)行本方法中有用的針對整合素的抗體，且，特別是針對β I整合素的抗體是本領(lǐng)域已知的。見Bissell等人美國專利號6，123，941關(guān)于通過應(yīng)用抗-β I整合素抗體ΑΙΙΒ2逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞中惡性表型的描述。針對⑶-29表位的抗-β I整合素從ResearchDiagnostics, Inc., Flanders, N.J.可得。另一種抗_ β I 整合素抗體為 CSAT,從Universityof 1wa Hybridoma Bank可得。另外的`商業(yè)可得的抗-β I整合素抗體為4B7R,是從AncellImmunology Research Products 可得的鼠 IgGl κ 抗體。
[0070]ΑΙΙΒ2是最初從人絨毛膜癌雜交瘤中被分離的大鼠單克隆IgGl，并被鑒定為與β I整合素胞外域的所有異二聚體非特異性結(jié)合的抗-β I整合素抗體。使用經(jīng)酶消化的ΑΙΙΒ2的F(ab)’片段的實(shí)驗(yàn)顯示抗體的表位結(jié)合部分是有活性的，并導(dǎo)致β I整合素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)和下游信號傳導(dǎo)中間物的下調(diào)。關(guān)于βI整合素生物學(xué)的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)因?yàn)?種已知的剪接變體而變得更加復(fù)雜，其主要區(qū)別是關(guān)于胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，下面聯(lián)合用于免疫制備抗β I整合素抗體的多肽進(jìn)一步描述。已發(fā)現(xiàn)ΑΙΙΒ2通過胞外域識別所有的變體。Park 等人(2009 年 11 月 17 日授權(quán)的美國 7，618，627,“Method of increasing radiationsensitivity by inhibition of beta-one integrin”)使用 AIIB2 抗體與電離福射聯(lián)合起來以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。
[0071]如在 Hall 等人，“The alphal/betaland alpha6/beta-lIntegrinHeterodimers Mediate Cell Attachment to Distinct Sites on Laminin” J.CellBiol.110:2175-2184(1990)所報(bào)道的，抗-整合素抗體AIIB2根據(jù)以下被制備:以2周的間隔，給予Lewis大鼠與Ribi佐劑1:1混合的107EDTA-收獲的JAR絨毛膜癌細(xì)胞的兩次腹腔內(nèi)注射。2周后，在不存在佐劑時(shí)，以2周的間隔，給予兩次另外的脾內(nèi)注射。給予Balb/c小鼠四次、每兩月一次的5xl06早期-妊娠的人細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的腹腔內(nèi)注射。最后的注射后4d，根據(jù)Kennett等人的方法(1980)，如Wheelock等人所改良的(1987)將每一個(gè)脾與Sp2/0小鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞融合。使用以上描述的附著分析，篩選雜交瘤上清液關(guān)于它們抑制JAR人絨毛膜癌細(xì)胞附著至FN、LN或Col IV的能力。發(fā)現(xiàn)兩種大鼠雜交瘤上清液僅抑制與FN的附著(BIE5和BIIG2)，而兩種其他大鼠抑制與LN、FN和Col IV的附著(AIIB2和BIE11)。一種小鼠的雜交瘤上清液僅抑制JAR細(xì)胞與Col IV的附著(S2G3)。通過有限的稀釋克隆了這些雜交瘤。使用山羊抗-大鼠瓊脂糖通過親和色譜法從培養(yǎng)上清液中純化大鼠抗體。于4°C通過50%飽和的硫酸銨沉淀將小鼠上清液S2G3，一種IgM，濃縮10倍。在進(jìn)一步使用之前，再次檢測這些抗體對FN、LN和Col IV涂覆的物質(zhì)的附著抑制活性。
[0072]可通過與Werb, Z.、Tremble, P.、Berensten, 0.、Crowley, E.和 Damsky, C.H.(1989)中描述的方法類似的方法制備適于與本方法和組合物一起使用的抗-整合素抗體。通過纖連蛋白受體的信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)膠原酶表達(dá)。J.Cell Biol.109,877-890 ;和Damsky, C.H., Fitzgerald, Μ.和Fisher, S.J.(1992)。這提供了用于潛在抗體的篩選檢測。所使用的免疫原為完全人JAR絨毛膜癌細(xì)胞?？贵w阻斷細(xì)胞附著至Fn、Col-1、IV和LN，并因此可以以這些方式被進(jìn)一步表征。
[0073]用大鼠單克隆抗體AIIB2抑制β I整合素聯(lián)合低氧協(xié)同地減弱了 GBM細(xì)胞的體外生長。ΑΙΙΒ2還直接減弱阿瓦斯汀?逃避GBM細(xì)胞的體外生長。此組合物還可被用于體內(nèi)腫瘤成像或作為細(xì)胞增殖的生物標(biāo)志物或?qū)?xì)胞損害(例如，低氧或電離輻射)的響應(yīng)。還觀察到未經(jīng)處理的GBM的血管生成的血管中β I整合素的顯著的上調(diào)。因此,其對于直接抑制和/或成像體內(nèi)血管生成過程也是有用的。
[0074]如上所述，多種VEGF抑制劑可被用于本方法和組合物。如在Oliner等人2009 年 12 月 10 日公布的、題為 “ANG2AND VEGF INHIBITOR COMBINATIONS” 的美國2009/0304694A1中所描述的，適合用于本方法的VEGF抑制劑包括以下:(a)4TBPPAPC,如在美國2003/0125339或美國專利號6，995，162中所描述的，其通過引用以其整體、特別是以其公開4TBPPAPC的部分并入本文；(b)AMG706，如在美國2003/0125339或美國專利號6，995，162或美國專利號6，878，714中所描述的，其通過引用以其整體特別是以其公開AMG706的部分并入本文；(c)阿瓦斯汀? ;(d)多吉美?，如在W000/42012、W000/41698、美國 2005/0038080A1、美國 2003/0125359A1、美國 2002/0165394A1、美國 2001/003447A1、美國2001/0016659A1和美國2002/013774A1中所描述的，其通過引用以其整體、特別以其公開多吉美?的部分并入本文；(e)PTK/ZK ;(f)索坦?，和(g)如美國2006/0241115中所描述的式IV的VEGF抑制劑。在這方面，目前優(yōu)選的VEGF抑制劑是AMG706。
[0075]可根據(jù)一些方法制備人源化的抗-VEGF或抗-整合素抗體。Sliwkowski等人的2005 年 9 月 27 日授權(quán)的、題為 “Humanized ant1-ErbB2antibodies and treatment withant1-ErbB2antibodies”的美國6，949, 245描述了用于人源化抗體的方法，其根據(jù)本教導(dǎo)可以是適合的。本文的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與源自另外的物種或?qū)儆诹硗獾目贵w種類或亞類的抗體、及此類抗體的片段的相應(yīng)序列相同或同源，只要它們呈現(xiàn)期望的生物活性(美國專利號4，816，567 ;和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 81:6851-6855 (1984))。本文的感興趣的嵌合抗體包括包含源自非-人靈長類動物(例如，舊大陸猴、猿等)的可變域抗原-結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列的“靈長類源化”抗體。
[0076]如以上引用的美國6，949，245中進(jìn)一步描述的，人源化的抗體具有非-人來源的被引入其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非-人氨基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，其典型取自“輸入”可變域?？勺裱璚inter和合作者的方法(Jones等人，Nature, 321:522-525 (1986) ；Riechmann 等人，Nature, 332:323-327 (1988) ；Verhoeyen等人，Science, 239:1534-1536 (1988))，通過用人抗體的相應(yīng)序列取代高變區(qū)序列基本上執(zhí)行人源化。因此，此“人源化”抗體為嵌合抗體(美國專利號4，816，567)，其中基本上小于完整的人可變域已被來自非-人物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)踐中，人源化的抗體通常是一些高變區(qū)殘基和可能的一些FR殘基被來自嚙齒動物抗體中類似位點(diǎn)的殘基所取代的人抗體。
[0077]還可使用單鏈重組抗體,如例如Williams等人、題為“Methods and compositionscomprising single chain recombinant antibodies” 的美國專利號 5，840，300 中所描述的，此處為了描述用于制備此組合物的方法的目的通過引用被并入。簡要地，分別擴(kuò)增K、重和λ免疫球蛋白鏈并隨后使用重組PCR組合為單鏈，即，通過重疊延伸(SOE)PCR方法的剪接，其中，單鏈包含重鏈加κ鏈或重鏈加λ鏈。在引物中使用了柔性線性接頭肽，其因此包含被用于連接\與Vh以形成包含包括輕鏈和重鏈二者作為單鏈的整合素結(jié)合可變區(qū)的新的重組Fv片段的接頭。Fv片段可被開發(fā)為針對β I整合素亞基的Fv片段的庫。
[0078]還可在經(jīng)遺傳改造旨在表達(dá)人抗體的小鼠中制備適合的抗體?？捎冒甩?I整合素片段的抗原免疫小鼠并將包含活性B細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞與合適的骨髓瘤系融合。具有人Ig所有組成成分的小鼠市售可得。見Hemachandra等人，“Human MonoclonalAntibodies against Ps`eudomonas aeruginosa Lipopolysaccharide Derived fromTransgenic Mice Containing Megabase Human Immunoglobulin Loci Are Opsonic andProtective against Fatal Pseudomonas Sepsis”，INFECTION AND IMMUNITY，2001 年 4月，第2223-2229頁，第69卷，第4期。
[0079]用于制備本抗體的另外的技術(shù)，噬菌體展示組合庫技術(shù)，提供了產(chǎn)生可被篩選抗-整合素活性的人Mab的大庫的有用的方法。從淋巴細(xì)胞mRNA制備的庫可由直至IO8個(gè)單克隆Fab所有組成成分的重組體組成。通過在絲狀噬菌體表面展示庫并針對模式表位(如下面描述的β I整合素片段)的淘選(panning)，可選擇單克隆Fab抗體并分析它們的免疫特征和生物活性(整合素抑制)。Fab用于治療和診斷方法二者是理想的，由于它們能夠大量廉價(jià)地被制備且它們是天然的非免疫原性的。見Witzum等人的美國專利號6，716，410關(guān)于該技術(shù)的描述，此處通過引用被并入。
[0080]如Marks等人所描述的，結(jié)合β I抗原的人單鏈Fv (scFv)可從非免疫曬菌體庫中被分離。所選擇的抗體的輕鏈(V(L))和重鏈(V(H))可變區(qū)的CDR3隨后可順序地被突變，突變的scFv展示在噬菌體上，并選擇與抗原具有較高親和力的突變株。見Schier等人,“Isolation of picomolar affinity ant1-c-erbB-2 single-chain Fv by molecularevolution of the complementarity determining regions in the center of theantibody binding site，，J Mol Biol.1996Nov.8; 263 (4): 551-67。
[0081]還可采用與其他抗原交聯(lián)的雙特異性抗體(例如，雙體)。不像其他的雙特異性形式(format),可以以功能形式從細(xì)菌(大腸桿菌(E.coli))或酵母(巴斯德畢赤酵母(P.Pastoris))分泌產(chǎn)生雙體。詳細(xì)的操作說明可見于:Tomlinson 1.和Holliger P.(2000)Methods for generating multivalent and bispecific antibodyfragments, Methods Enzymol, 326, 461-479 ；和 Holliger，P.(2001)Expression ofantibody fragments in Pichia pastoris.Meth.Mol.Biol.?？梢砸远喾N已知方式產(chǎn)生二聚抗體片段或微抗體。這些產(chǎn)生非共價(jià)或共價(jià)的二聚體(sc (FV) 2)。可用已知的穩(wěn)定劑和賦形劑將本抗體組合物制備為呈無菌粉末或液體形式的純化的藥物組合物用于靜脈內(nèi)施用，如本領(lǐng)域已知的和在美國專利號6，165，467中描述冷凍干燥單克隆抗體中所示例的，在此通過引用被并入。
[0082]本文所使用的術(shù)語“協(xié)同的”以其傳統(tǒng)意義，指的是組分的組合，其中組合的活性大于該組合的每一個(gè)組分的單`獨(dú)的活性之和。
[0083]可將VEGF活性的其他抑制劑用于本方法和組合物。例如，阿柏西普(VEGF-Trap，AVE-0005)是完全人的重組融合蛋白，由被融合至人IgGl的Fe區(qū)的血管內(nèi)皮生長因子受體I (VEGFRl)的第二 Ig結(jié)構(gòu)域和血管內(nèi)皮生長因子受體2 (VEGFR2)的第三Ig結(jié)構(gòu)域組成。阿柏西普與所有的VEGF-A亞型及胎盤生長因子(PIGF)結(jié)合，從而阻止這些因子刺激血管生成。與化療聯(lián)合，每兩周一次以4mg/kg通過靜脈注入施用阿柏西普。
[0084]命名為KDR-bp (KDR-結(jié)合蛋白)的VEGF受體結(jié)合蛋白，來自東部棉口蛇(Eastern Cottonmouth)(食魚峻，Agkistrodonpiscivoruspiscivorus)的毒液，是無催化活性的PLA2同源物，Lys49PLA2,其具有有效的肌毒性并被發(fā)現(xiàn)是拮抗VEGF受體的外源分子，如在 Fujisawa 等 AuCatalytically inactive phospholipase A2homologuebinds to vascular endothelial growth factor receptor~2via a C—terminal loopregion, ”Biochem.J.(2008)411，515-522 中所描述的。
[0085]在某些方面，本發(fā)明包括用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法，包含向患有所述腫瘤的受試者施用為抗血管生成劑的低劑量第一劑；與阻斷由βI整合素介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞結(jié)合的第二劑的組合的步驟，據(jù)此腫瘤細(xì)胞生長被抑制與由較高臨床劑量的第一劑所引起的等同的量。低劑量的第一劑可以是例如VEGF抑制劑，其以如產(chǎn)品標(biāo)簽或印刷品上所顯示的最小劑量被施用。根據(jù)本發(fā)明，腫瘤生長將被抑制至與如同VEGF抑制劑以最高批準(zhǔn)劑量被給予至少相同的程度。例如，當(dāng)治療結(jié)腸癌或直腸癌時(shí)，貝伐單抗的建議劑量為每14天通過IV給予每kg5mg或IOmg (每磅約2.3mg至4.5mg)。所建議的劑量將基于所給予的化療的類型而不同(每kg5mg或IOmg)。
[0086]為VEGF抑制劑的劑和阻斷β -整合素的劑的治療組合
[0087]可以一起施用或在規(guī)定的時(shí)間間隔之后順序地施用調(diào)節(jié)粘附血管共選擇和血管生成的劑。當(dāng)一起施用時(shí)，可通過可接受的生物相容的遞送平臺遞送它們。這可以是納米綴合物或聚合物。可選地，可將劑與彼此直接融合。另外，可同時(shí)或順序地施用多種血管生成和/或粘附血管共選擇調(diào)節(jié)劑。最終，可將任何實(shí)施方案與輔助治療諸如放療、化療和/或增加血管通透性的劑組合。[0088]可使用用于抑制血管生成信號傳導(dǎo)方面的實(shí)施方案，其在信號傳導(dǎo)的下游或與其細(xì)胞外受體(VEGFR-1/Flt-l、VEGFR-2/Flk-l)結(jié)合的能力中對VEGF-A具有抑制作用。也可靶向血管生成的其他介導(dǎo)物，包括其他VEGF家族成員(VEGF-B、VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E和 PIGF)和它們的受體(VEGFR-l/Flt-1、VEGFR2/Flk_l、VEGFR_3/Flt_4)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-1和FGF-2)和它們的受體(FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR4)、表皮生長因子成員(EGF和HB-EGF)和它們的受體(EGFR)、CEACAM_l/CD_66a、孤兒受體HER-2、血管生成素(Angl、Ang2、Ang3和Ang4)和它們的受體(Tie-1和Tie2)、血小板衍化生長因子(PDGF)和它們的受體(PDGFRa型 和TOGFRP型)、轉(zhuǎn)化生長因子-β家族成員(TGF-β 1、TGFβ 2、TGF-β 3)和它們的受體(TGFBR2)、δ -樣配體4和其受體(Notch)和先已存在的結(jié)構(gòu)蛋白的天然存在的抗血管生成片段，諸如血管抑素和腫瘤抑素。
[0089]可使用用于靶向粘附血管共選擇信號傳導(dǎo)方面的實(shí)施方案，其在信號傳導(dǎo)的下游或與其細(xì)胞外受體結(jié)合的能力中對βI整合素具有抑制作用。這些可包括去整合素、細(xì)胞外基質(zhì)的組分/片段、粘著斑激酶(FAK)、FAK-相關(guān)非激酶和細(xì)胞外信號相關(guān)激酶(ERK/MAPK)ο
[0090]抗-血管生成組合物可包含人單克隆抗體或抗體片段、人源化抗體或抗體片段、抑制肽、激酶抑制劑、內(nèi)源抑制劑、小分子抑制劑、納米抗體、RNA1、適體、反義物(antisense)、或任何這些劑與藥學(xué)上可接受的載體或運(yùn)載體(carrier)的組合。
[0091]抗-基于粘附的血管共選擇組合物可包含人單克隆抗體或抗體片段、人源化抗體或抗體片段、抑制肽、激酶抑制劑、內(nèi)源抑制劑、小分子抑制劑、納米抗體、RNA1、適體、反義物、或任何這些劑與藥學(xué)上可接受的載體或運(yùn)載體的組合。
[0092]在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有復(fù)發(fā)性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)的患者將經(jīng)受瘤內(nèi)放置在切除腔內(nèi)的或硬膜下放置的一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)管的植入?；颊邔⒁耘R床上合適的劑量和間隔被施用標(biāo)準(zhǔn)的貝伐單抗療法1.V.。貝伐單抗注射后至少24小時(shí)或理想48小時(shí)至120小時(shí)，將以臨床相關(guān)劑量和頻率通過對流增強(qiáng)的遞送(CED)裝置通過所述導(dǎo)管施用抑制性抗- β I整合素組合物。
[0093]在另一個(gè)實(shí)施方案中，以上方案將與另外的輔助療法諸如電離輻射和/或化療組合。在另外的實(shí)施方案中，上述方案將被施用至新的經(jīng)診斷GBM。在另外的實(shí)施方案中，將通過CED施用抗血管生成組合物和抑制性抗_β I整合素組合物二者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將腸胃外施用抗血管生成組合物和抑制性抗-β I整合素組合物二者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將在惰性運(yùn)載體諸如可溶解的生物相容的聚合物中將一種或兩種組合物直接施用至腫瘤床。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將同時(shí)施用兩種組合物作為二價(jià)抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將單獨(dú)施用抑制性抗-β I整合素組合物至具有先前抗血管生成療法失敗的患者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將單獨(dú)施用抑制性抗-β I整合素組合物至未經(jīng)歷抗血管生成療法的患者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗_β I整合素組合物還可包含附著至其的放射性同位素，特別是β _放射兀素。
[0094]除了抗-血管生成療法之外，用于引起低氧的可選的劑是使用用于血管栓塞的血管內(nèi)技術(shù)(超選擇栓塞/靶向栓塞)。該方法是已知用于高度血管腦損傷諸如腦膜瘤和AVM，以減少損傷因此為手術(shù)切除提供更好的環(huán)境。
[0095]抑制該靶標(biāo)對于除GBM以外表達(dá)β I整合素的一些癌癥可以是有效的，包括大部分上皮腫瘤和非上皮腫瘤諸如乳腺癌、肺癌、肝癌、腎癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤和淋巴瘤?？? β 1組合物可具有用于非腫瘤疾病諸如年齡相關(guān)性濕性黃斑變性中抑制血管生成的另外的用途。最終，抗-β 1組合物可具有用于抗炎適應(yīng)癥的用途，由于β 1整合素信號傳導(dǎo)對于一些免疫細(xì)胞功能包括粘附和增殖是重要的。
[0096]可選的實(shí)施方案涉及生物系統(tǒng)中增強(qiáng)血管化如再生醫(yī)療策略中。在此實(shí)施方案中，選擇性調(diào)節(jié)血管生成和粘附血管共選擇二者可導(dǎo)致改善的組織修復(fù)或再生。
[0097]本發(fā)明的另外的實(shí)施方案包含使用shRNA (短發(fā)夾RNA)以敲低腫瘤細(xì)胞中β I整合素基因表達(dá)。這在下面的實(shí)施例中被實(shí)施，其中在對抗-VEGF抗體有耐受性的細(xì)胞系中顯示腫瘤細(xì)胞生長的顯著減弱。在示例性的研究中，ShRNA是短干擾RNA (siRNA)的前體，短干擾RNA是RNA干擾(RNAi)的強(qiáng)大的介導(dǎo)物。在RNAi中，序列與siRNA同源的基因在轉(zhuǎn)錄后狀態(tài)被沉默。存在可以引起有效的siRNA的多種不同的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。慢病毒，諸如人類免疫缺陷病毒(HIV)能夠感染非分裂細(xì)胞，包括腦的分化神經(jīng)元?？蓮穆《局斜磉_(dá)短發(fā)夾RNA，允許多種細(xì)胞類型的高效轉(zhuǎn)染?？苫诖怀聊幕虻男蛄性O(shè)計(jì)有效的RNA發(fā)夾構(gòu)建體。整合素β I是人中由ITGBl基因編碼的蛋白。關(guān)于整合素β I亞基的全部人mRNA在Genbank基因座X07979和登錄號BC020057中被闡明。該序列的3656個(gè)核苷酸(SEQ ID NO:1)，還在 J.Cell Biol.105 (3)，1183-1190 (1987)中被給出，為了簡潔起見此處沒有復(fù)述，但特別通過引用并入本文。該已知序列可被用于設(shè)計(jì)干擾核酸構(gòu)建體諸如示例性的shRNA。
[0098]盡管不是每一個(gè)發(fā)夾構(gòu)建體都將產(chǎn)生有效的RNAi響應(yīng)，已形成了關(guān)于富集成功的構(gòu)建體的規(guī)則。這些規(guī)則是基于大量的有效構(gòu)建體的檢查和微RNA和有效的siRNA的熱力學(xué)分析。規(guī)則在例如Ambion technical bulletin#506中發(fā)布,在線可得。
[0099]從DNA載體中制備復(fù)制病毒包括將構(gòu)建體包裝進(jìn)入細(xì)胞系。包裝RNAi慢病毒本質(zhì)上與包裝攜帶cDNA的慢病毒相同。本質(zhì)上，將DNA載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入包裝細(xì)胞系-諸如人293細(xì)胞,且在2-3天之后,上清液中將包含病毒。
[0100]在大多數(shù)情況下，慢病毒載體制備體系基于“斷裂(split)”體系，其中天然病毒基因組被斷裂為單獨(dú)的輔助質(zhì)粒構(gòu)建體。將不同病毒元件斷裂為三個(gè)或四個(gè)單獨(dú)的載體降低了通過慢病毒基因組的偶然重組產(chǎn)生能夠復(fù)制的病毒的風(fēng)險(xiǎn)。
[0101]當(dāng)選擇用于制備根據(jù)本發(fā)明的β整合素敲低的慢病毒制備體系時(shí)，技術(shù)人員可制備具有被限制的宿主范圍(即，僅可感染嚙齒動物的病毒)對廣譜宿主范圍(可感染小鼠、禽、人等的病毒)的病毒。在大多數(shù)情況下，病毒表面外殼蛋白決定了物種特異性。由于慢病毒制備體系是斷裂的，通過使用例如水皰性口炎病毒(VSV/G)糖蛋白(其展示寬宿主范圍取向)對嗜麥芽糖結(jié)合表面糖蛋白(其展示有限的特異性)可轉(zhuǎn)換外殼蛋白。
[0102]使用 Gene link siRNA explorer(http colon slash slash www dot genelink.com/sirna/shrna1.asp),鑒定483條shRNA序列為人β I整合素mRNA的抑制劑,包括,例如，序列 TTCTGGATTGGACTGATCAGTTC(SEQ ID NO:2)。
[0103]優(yōu)選以適于人施用的藥物組合物的形式向患有此處所描述的腫瘤的有相應(yīng)需要的患者遞送此處提及的劑。組合物將包含劑，例如呈被分離和大體上純的形式的抗體或核酸，與如本領(lǐng)域已知的穩(wěn)定劑、緩沖液、賦形劑等混合，且無外源因子(adventitiousagent)。[0104]下面的實(shí)施例說明此處描述的某些發(fā)明概念。實(shí)施例
[0105]實(shí)施例1:與高β I整合素表達(dá)相關(guān)的低氧
[0106]此處顯示，在快速生長的癌情況下并在抗血管生成療法之后另一個(gè)常見的細(xì)胞應(yīng)激，低氧，與患者多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)樣本中高β I表達(dá)相關(guān)。為了直接確證該機(jī)制，我們將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)受6h至48h的1%氧以刺激微環(huán)境低氧。我們觀察到體外神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中β I整合素表達(dá)的顯著增加(圖1)。這是快速且可逆的細(xì)胞響應(yīng)并在乳腺癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞中也被證明。為了驗(yàn)證抗-血管生成療法能夠強(qiáng)烈地增加體內(nèi)生長腫瘤中β I的表達(dá)，我們?nèi)旧嗽谧詈蟮呢惙慰固幚淼膸滋靸?nèi)取自小鼠的神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤。與對照相比，我們在被處理的腫瘤中、特別是在低氧的腫瘤中心觀察到β I的顯著增加(圖2)。
[0107]實(shí)施例2:在腫瘤細(xì)胞增殖過程中觀察到增加的β I整合素表達(dá)
[0108]在腫瘤細(xì)胞本身增殖期間觀察到體外腫瘤細(xì)胞中β I表達(dá)的進(jìn)一步增加。在U87MG神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，體外細(xì)胞匯合和β I水平之間具有負(fù)相關(guān)(圖3)。另外，如FACS所顯示的，U87MG神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中增殖標(biāo)志物K1-67的表達(dá)與β I表達(dá)正相關(guān)。這與其他人在乳腺癌細(xì)胞中所觀察到的一致。最后，我們直觀地觀察到來自原代GBM的人手術(shù)樣本中血管生成血管中β I整合素表達(dá)的顯著增加(圖4)。該增加的β I整合素表達(dá)被認(rèn)為與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中所觀察到的β I與細(xì)胞增殖的關(guān)聯(lián)相關(guān)，如以上所討論的。因此，除了入侵和在血管上生長，β I整合素呈現(xiàn)密切參與腫瘤細(xì)胞增殖、低氧和IR后的存活信號傳導(dǎo)、及血管生成過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞。這多個(gè)特征使得βI整合素是潛在地直接抑制腫瘤生長和作為減弱抗-血管生成耐受性的形成的與抗-血管生成的結(jié)合療法(conjunctivetherapy)的極具吸引力的祀標(biāo)。
[0109]實(shí)施例3: β I整合素參與腫瘤細(xì)胞中抗-VEGF抗體耐受性
[0110]為了檢驗(yàn)β I整合素可能參與貝伐單抗耐受性的假說，我們對在貝伐單抗治療之前和在獲得性貝伐單抗耐受性形成之后取得的GBM的成對的患者樣本中的β I整合素使用免疫熒光組織化學(xué)。與未處理的樣本相比，在12對中的9對中觀察到貝伐單抗后GBM組織中清楚的增加(75%，圖5)。
[0111]為了直接驗(yàn)證獲得性貝伐單抗耐受性之后腫瘤細(xì)胞中β I整合素表達(dá)的增加，我們分析了源自原代GBM (第一次手術(shù))和源自抗血管生成療法耐受性形成后至少30天所分離的組織的細(xì)胞系。事實(shí)上，與前一組相比，來自后一組的細(xì)胞中β I整合素表達(dá)是平均13倍高(圖6)。
[0112]為了驗(yàn)證所觀察到的β I整合素的上調(diào)是有功能的，我們?nèi)旧R近的患者腫瘤切片關(guān)于被激活的粘附斑激酶(磷酸化-FAKtyri97)。與治療之前取得的樣品相比，獲得性貝伐單抗耐受性之后取得的患者樣品中的磷酸化-FAKti"397染色顯著較高(圖7)。
[0113]因此，在獲得性貝伐單抗耐受性形成之后取得的臨床患者樣品中β I整合素被功能性上調(diào)。
[0114]實(shí)施例4:抑制β I整合素之后抗-VEGF抗體耐受性細(xì)胞系中減少的攻擊性
[0115]慢病毒顆粒中整合素PlshRNAUSanta Cruz Biotechnology, Inc.,目錄#sc-35675購得。提供了四種不同的shRNA序列的混合物。將該物質(zhì)用于轉(zhuǎn)化源自貝伐單抗失敗的患者的細(xì)胞系SF8106-Axl和SF7796-Ax3 (還分別稱為BRG3和BRG2)。我們使用慢病毒載體創(chuàng)建了 β?和β 3整合素的穩(wěn)定的敲低系。我們驗(yàn)證了與GFP載體對照細(xì)胞或β 3敲低細(xì)胞相比，BRG3細(xì)胞中β I的70%的敲低和對應(yīng)的I周后細(xì)胞生長的60%的減少(圖8)。為了更詳細(xì)地研究這些細(xì)胞，我們分離了具有超過90%敲低的β I的BRG3敲低克隆并評價(jià)了指示增加的腫瘤細(xì)胞攻擊性的功能，包括粘附、細(xì)胞擴(kuò)散、細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖。與載體對照細(xì)胞相比，這些敲低克隆的所有四種功能都被顯著損害(圖9)。
[0116]為了體內(nèi)驗(yàn)證以上的發(fā)現(xiàn)，我們在裸鼠中皮下植入以上的BRG30 I整合素敲低克隆中的三種并持續(xù)6個(gè)月追蹤腫瘤生長。載體對照腫瘤細(xì)胞正常生長，而我們在整個(gè)研究階段沒有觀察到任何敲低克隆的生長(圖10)。事實(shí)上，15個(gè)敲低腫瘤中的13個(gè)(87%)被完全消退。為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)是β I敲低的直接結(jié)果，我們皮下植入來自BRG2和BRG3的多克隆敲低系并相似地監(jiān)測體內(nèi)生長。這些系顯示平均70%的β?敲低。如預(yù)測的，這些系比載體對照系生長慢。然而，與90%敲低克隆相比之下，幾周之后，兩種系都展示了潛在的體內(nèi)生長，表明增殖和β I整合素水平的劑量-響應(yīng)關(guān)系(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0117]因此，貝伐單抗耐受性的神經(jīng)膠質(zhì)瘤系中βI的90%或更大的敲低減弱了體外攻擊表型并完全阻止了異種移植模型中的體內(nèi)生長。
[0118]實(shí)施例5:抗-VEGF抗體耐受性細(xì)胞系的抗β I整合素抗體處理
[0119]為了驗(yàn)證以上結(jié)果具有β I抑制的臨床相關(guān)模式，我們在體外抑制實(shí)驗(yàn)中使用充分表征的ΑΙΙΒ2抑制性大鼠單克隆抗-β I整合素抗體。同種型匹配的IgG被用作對照。貝伐單抗耐受性神經(jīng)膠質(zhì)瘤系顯示與β I敲低相似的功能抑制，包括減少的粘附(數(shù)據(jù)未顯示)和以10yg/ml的遷移(動態(tài)影片分析，未顯示)。用免疫熒光染色關(guān)于凋亡/細(xì)胞死亡(膜聯(lián)蛋白V)或增殖(K1-67抗原)顯示對細(xì)胞生長的影響。染色之后，通過流式細(xì)胞術(shù)/熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)分選細(xì)胞。該分析顯示用AIIB2處理的GBM細(xì)胞中Ki_67染色的顯著減少，但是對膜聯(lián)蛋白V免疫反應(yīng)性沒有影響，與抑制細(xì)胞效應(yīng)一致(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0120]用原代GBM系體外重復(fù)了用AIIB2的該處理，以觀察細(xì)胞生長是否將被增殖狀態(tài)影響。分匯合培養(yǎng)(生長期)中的細(xì)胞，而不是匯合培養(yǎng)(生長停滯)中的細(xì)胞，被持續(xù)2天的AIIB2處理顯著地抑制了生長(圖11)。
[0121]最后,用直至5mg/kg劑量的AIIB2、每周2次體內(nèi)處理顯著抑制了皮下異種移植模型中BRG3貝伐單抗耐受性系的生長(數(shù)據(jù)未顯示)。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(Terminal deoxynucleotidyItransferasedUTP nick end labeling,TUNEL)揭示了 BRG3系中AIIB2處理的腫瘤中增加的凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0122]因此，與β I敲低類似，用功能阻斷抗體諸如ΑΙΙΒ2的β I整合素抑制體外減弱了攻擊表型。此外，ΑΙΙΒ2的腸胃外施用對于抑制典型的和貝伐單抗耐受性的神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植物的腫瘤體內(nèi)生長是有效的。
[0123]實(shí)施例6: β I的抑制逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和干細(xì)胞_樣表型
[0124]培養(yǎng)中的球狀腫瘤細(xì)胞生長是干細(xì)胞-樣表型的替代并能夠被應(yīng)激因素諸如低氧和酸性PH促進(jìn)/ 富集。在典型的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87MG)和BRG3貝伐單抗耐受性細(xì)胞系二者中敲低β I顯著損害了球狀體形成(數(shù)據(jù)未顯示)。ΑΙΙΒ2還抑制了由48小時(shí)低氧引起的U87MG神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的球狀生長(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0125]除了損害球狀生長，β I整合素的抑制促進(jìn)了如腫瘤細(xì)胞區(qū)域的顯著增加所顯示的EMT的逆轉(zhuǎn)和間質(zhì)細(xì)胞受體c-met50%的減少(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0126]實(shí)施例7:用β I整合素抑制增強(qiáng)抗血管生成療法
[0127]作為抗血管生成療法的效應(yīng)的體外模型，我們將生長期的原代GBM細(xì)胞經(jīng)受持續(xù)2天的低氧，隨后在常氧中持續(xù)2天繼續(xù)生長。低氧被用作抗-血管生成療法諸如貝伐單抗的體外替代。如與單獨(dú)的低氧或ΑΙΙΒ2處理相比，持續(xù)2天的恢復(fù)階段添加ΑΙΙΒ2抗體導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長進(jìn)一步的減少(圖12)。因此，β I整合素抑制和抗血管生成的組合預(yù)測加強(qiáng)了治療療效。[0128]為了驗(yàn)證以上的體外結(jié)果,我們用對照IgG (10mg/kg)、貝伐單抗(10mg/kg)或貝伐單抗(lmg/kg)和AIIB2 (lmg/kg)的低劑量交替組合療法,兩周一次地處理具有皮下生長U87MG神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤的小鼠。幾周處理之后，低劑量交替的組合療法抑制腫瘤生長被證明與單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)劑量的貝伐單抗同樣有效(圖13)。因此，用AIIB2抑制β?整合素允許貝伐單抗劑量的20倍的降低。
[0129]因此，概括地說，顯示β I整合素的抑制可通過I)阻止血管共選擇和血管周的入侵(或在任何典型的ECM基底物質(zhì)上的入侵)，2)在諸如IR和低氧損害之后可能通過促進(jìn)凋亡減少腫瘤細(xì)胞的活性，3)直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，4)通過靶向增殖和遷移的內(nèi)皮細(xì)胞直接抑制血管生成和5)逆轉(zhuǎn)攻擊性的干細(xì)胞-樣的表型包括上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(ΕΜΤ)，抑制腫瘤的生長。重要地，通過慢病毒敲低或用ΑΙΙΒ2拮抗β I受體可顯著減弱貝伐單抗-耐受性神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植物的體內(nèi)生長。此外，ΑΙΙΒ2處理可減少神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植模型中貝伐單抗的必需劑量達(dá)至少20χ。
[0130]結(jié)論
[0131]以上的具體描述意在例證并闡述本發(fā)明且不應(yīng)被視為限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求的字面上的及等同的范圍所界定。本說明書中提及的任何專利或出版物意在傳達(dá)實(shí)施本發(fā)明某些方面中有用的方法和材料的詳細(xì)信息，其可能沒有被明確陳述但其將被本領(lǐng)域工作人員所理解。此類專利或出版物在此與如同每一個(gè)被特定地并單獨(dú)地通過引用被并入相同的程度通過引用被并入并被本文所包含，如描述和使得被提及的方法或材料可行的目的所需的。
【權(quán)利要求】
1.一種藥物組合物，所述藥物組合物用于抑制腫瘤細(xì)胞生長，所述藥物組合物包含 為血管內(nèi)皮生長因子(“VEGF”)的抑制劑的第一劑；和 阻斷β_1整合素結(jié)合的第二劑的組合，據(jù)此所述組合抑制腫瘤細(xì)胞生長至比單獨(dú)的所述第一劑或所述第二劑更大的程度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述VEGF的抑制劑是結(jié)合VEGF的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述抗體是人源化的小鼠抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的組合物，其中所述第二劑是與β-l整合素結(jié)合的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述多肽與締合任何α亞基的β-l整合素結(jié)合并抑制腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基底物質(zhì)的結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述多肽是β-l整合素特異性抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述β-l整合素特異性抗體是嵌合、單鏈或人源化抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述抗體是ΑΙΙΒ2、ΒΙΕ11或源自ΑΙΙΒ2或BIEll的人源化抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一劑和所述第二劑由具有識別VEGF的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和識別βI整合素的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的二價(jià)抗體提供。
10.一種用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法，所述方法包括向患有所述腫瘤的受試者施用以下物質(zhì)的步驟:` 為抗血管生成劑的第一劑；和 阻斷由β-l整合素介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞結(jié)合的第二劑的組合，據(jù)此腫瘤細(xì)胞生長被抑制至比單獨(dú)的所述第一劑或所述第二劑引起的抑制更大的程度。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述抗血管生成劑是結(jié)合VEGF的抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述抗血管生成劑選自由以下組成的組:人源化的小鼠單克隆抗體和完全人抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述第二劑是與β-1整合素結(jié)合的多肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述多肽與締合任何α亞基的β-1整合素結(jié)八口 ο
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述多肽是分離的β-1整合素特異性抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述抗體是嵌合、單鏈或人源化抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述抗體是ΑΙΙΒ2、ΒΙΕ11或其人源化的衍生物。
18.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述腫瘤選自由以下組成的組:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、腎癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤和淋巴瘤。
19.一種治療神經(jīng)上皮組織的腫瘤的方法，所述方法包括將所述腫瘤與β-1整合素結(jié)合抑制劑接觸的步驟。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述抑制劑是與締合任何α亞基的β-l整合素結(jié)合的抗體。
21.一種用于成像腫瘤的方法，所述方法包括: 向患有所述腫瘤的受試者施用與VEGF結(jié)合的第一劑；和阻斷由β -1整合素介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞結(jié)合的第二劑的組合，其中所述第一劑和所述第二劑的一種或兩種被標(biāo)記。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述第二劑是與β-1整合素結(jié)合的嵌合、單鏈或人源化抗體。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述腫瘤選自由以下組成的組:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌、肺癌、腎癌、肝癌、卵巢癌和乳腺癌。
24.一種用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法，所述方法包括向所述細(xì)胞遞送干擾編碼β_1整合素的基因的表達(dá)的核酸構(gòu)建體的步驟。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述構(gòu)建體是編碼與β-1整合素mRNA結(jié)合以沉默β I整合素基因表達(dá)的shRNA的慢病毒載體。
26.—種治療患有腫瘤的患者的方法,所述患者具有失敗的抗-VEGF抗體治療,所述方法包括向所述患者施用抗-整合素劑的步驟。
27.一種用于治療患有復(fù)發(fā)性多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)的患者的藥盒，所述藥盒包含: (a)用于瘤內(nèi)放置在切除的腔內(nèi)或硬膜下放置的導(dǎo)管；和 (b)抑制性抗-β I整合素組合物，所述組合物被配制用于通過對流增強(qiáng)的遞送(CED)裝置以臨床相關(guān)的劑量和頻率通過所述導(dǎo)管施用。
28.一種用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法，所述方法包括向患有所述腫瘤的受試者施用以下物質(zhì)的步驟: 為抗血管生成劑的低劑量第一劑；和 阻斷由β_1整合素介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞結(jié)合的第二劑的組合，據(jù)此腫瘤細(xì)胞生長被抑制至與由所述第一劑以更高的臨床劑量引起的等同的量。
【文檔編號】A61K38/18GK103561761SQ201280024596
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月23日
【發(fā)明者】沃倫·肖恩·卡伯尼爾, 馬尼什·庫馬爾·阿吉 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會