抗tie2抗體及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供結(jié)合Tie2的抗體及使用所述抗體的方法。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，所述抗體是結(jié)合人Tie2并且阻斷Tie2與一個或多個Tie2配體諸如血管生成素1（Ang1）、血管生成素2（Ang2）、血管生成素3（Ang3）和/或血管生成素4（Ang4）之間的相互作用的完整人抗體。本發(fā)明的抗體尤其用于治療與一種或多種Tie2生物學(xué)活性（包括血管發(fā)生）相關(guān)的疾病或病癥。
【專利說明】抗TlE2抗體及其用途
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及抗體及其抗原結(jié)合片段，所述抗體對于人Tie2是特異性的。
[0002]背景
[0003]血管發(fā)生是由此形成新血管的生物學(xué)過程。異常的血管發(fā)生與嚴重的疾病包括例如增殖性視網(wǎng)膜病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和牛皮癬相關(guān)。此外，充分確定血管發(fā)生對于腫瘤生長和維持是關(guān)鍵性的。Tie2是單跨膜酪氨酸激酶受體，其已經(jīng)被定位于形成血管的內(nèi)皮細胞上并且已經(jīng)顯示出在血管發(fā)生中起作用。Tie2配體包括血管生成素(例如Angl、Ang2、Ang3和Ang4)。在有利于限制或阻斷血管發(fā)生的環(huán)境下，預(yù)期阻斷Tie2和其配體中的一種或多種之間的相互作用具有有益的治療作用。
[0004]針對Tie2的抗體例如在美國專利號6，365，154和6，376，653中提及。盡管如此，本領(lǐng)域中存在這樣的新分子的需要，所述新分子能夠結(jié)合Tie2，尤其所述新分子是能夠阻斷Tie2與一種或多種Tie2配體諸如Ang2的相互作用的抗Tie2抗體。此類分子將用于多種治療和診斷目的。
[0005]發(fā)明簡述
[0006]本發(fā)明提供結(jié)合人Tie2的抗體。本發(fā)明的抗體尤其用于抑制Tie2介導(dǎo)的信號傳遞并用于治療由Tie2活性和/或信號傳遞引起的或者與Tie2活性和/或信號傳遞相關(guān)的疾病和病癥。根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明的抗體阻斷Tie2和Tie2配體中的一種或多種諸如Angl、Ang2、Ang3和/或 Ang4之間的相互作用。
[0007]本發(fā)明的抗體可以是全長的(例如，IgGl或IgG4抗體)或者可以僅包含抗原結(jié)合部分(例如，F(xiàn)ab、F(ab’)2或scFv片段)，并且可以被修飾以影響功能性，例如以消除殘留的效應(yīng)子功能(Reddy 等，2000，J.1mmunol.164:1925-1933)。
[0008]本發(fā)明提供與如本文所述的任一示例性抗Tie2抗體具有基本上相同結(jié)合特征的抗Tie2抗體。本發(fā)明包括產(chǎn)生本文所述的抗Tie2抗體的細胞系。作為非限制性實例，產(chǎn)生示例性抗體H1M2055N和H2aM2760N的細胞系在2011年12月2日在按照布達佩斯條約的條款下保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，1080IUniversityBlvd.，Manassas, Va.20110-2209。已為保藏的細胞系指定以下保藏號:PTA-12295(H1M2055N)和 PTA-12296 (H2aM2760N)。
[0009]本發(fā)明提供編碼本文所述的示例性抗Tie2抗體的核酸分子。攜帶本發(fā)明的核酸的重組表達載體以及已引入此類載體的宿主細胞也包含在本發(fā)明中，所述載體和宿主細胞作為在允許產(chǎn)生抗體的條件下通過培養(yǎng)所述宿主細胞來產(chǎn)生抗體并且回收所產(chǎn)生的抗體的方法。
[0010]本發(fā)明包括抗體及其抗原結(jié)合片段，其包含在任何本文所述的示例性抗Tie2抗體(包括由保藏的細胞系PTA-12295和PTA-12296產(chǎn)生的抗體)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的重鏈和輕鏈⑶R氨基酸序列(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)。本發(fā)明還包括抗體及其抗原結(jié)合片段，其包含在本文所述的任意示例性抗Tie2抗體(包括由保藏的細胞系PTA-12295和PTA-12296產(chǎn)生的抗體)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的重鏈和輕鏈可變域氨基酸序列(HCVR和LCVR)。[0011]本發(fā)明包括本文所述的具有修飾的糖基化模式的任何示例性抗Tie2抗體。在一些應(yīng)用中，去除不需要的糖基化位點的修飾、或者抗體缺少寡糖鏈中存在的巖藻糖部分例如以增加抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)功能可以是有用的(見Shield等(2002)JBC277:26733)。在其他應(yīng)用中，可以進行半乳糖基化修飾以修飾依賴補體的細胞毒性(CDC)。
[0012]在另一方面，本發(fā)明提供包含如本文所述的抗Tie2抗體和可藥用的載體的藥物組合物。在相關(guān)方面，本發(fā)明描述了組合物，其包含抗Tie2抗體和第二治療劑的組合?？梢杂欣嘏c抗Tie2抗體組合的示例性試劑包括但不限于抑制抗Tie2活性的其他試劑(包括其他抗體或其他抗體的抗原結(jié)合片段、肽抑制劑、小分子拮抗劑等)和/或干擾Tie2上游或下游信號傳遞的試劑。
[0013]在另一方面，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的抗Tie2抗體或抗體的抗原結(jié)合部分來抑制Tie2活性的方法，其中治療方法包括施用治療有效量的包含本發(fā)明的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段的藥物組合物。所治療的病癥是通過去除、抑制或降低Tie2活性而好轉(zhuǎn)、減輕、抑制或預(yù)防的任何疾病或病癥。本發(fā)明的抗Tie2抗體或抗體片段可以行使阻斷Tie2和Tie2結(jié)合配偶體(例如，Angl、Ang2、Ang3和/或Ang4)之間的相互作用或另外行使抑制Tie2的信號傳遞活性的功能。
[0014]本發(fā)明還包括本發(fā)明的抗Tie2抗體或抗體的抗原結(jié)合部分在制造用于在患者中治療與Tie2活性相關(guān)或由Tie2活性引起的疾病或病癥的藥物中的用途。[0015]在下面詳細描述的綜述中，其他實施方案將變得顯而易見。
[0016]附圖簡述
[0017]圖1.全長人Tie2和用于定位本發(fā)明的抗Tie2抗體的表位的多種缺失構(gòu)建體的線性描述。構(gòu)建體上的數(shù)字表明與全長Tie2分子(SEQ ID NO:1)相關(guān)的構(gòu)建體的氨基酸邊界。
[0018]圖2.顯不血管生成素(hAngl、hAng2、mAng3 或 hAng4)與用抗 Tie2 抗體 H4H2055N或?qū)φ誌預(yù)處理的包被有hTie2的傳感器尖端結(jié)合的程度的柱狀圖。
[0019]圖3.顯示抗Tie2抗體(H4H2055N或?qū)φ誌)與用IOOnM的血管生成素(hAngl、hAng2、mAng3或hAng4)預(yù)處理的包被有hTie2的傳感器尖端結(jié)合的程度的柱狀圖。
[0020]圖4.圖A顯示施用抗Tie2抗體H2M2055N( )或Fe對照(.)后小鼠中的H29腫瘤生長曲線。向下箭頭指示處理起始日期。圖B顯示用抗Tie2抗體H2M2055N或Fe對照處理的小鼠中從處理起始時的腫瘤生長。星號(*)表示p〈0.05Mann Whitney非參數(shù)雙尾t_檢驗。
[0021]圖5.在實驗結(jié)束時在用抗Tie2抗體H2M2055N或Fe對照處理的小鼠中測量的H29腫瘤血管密度。星號(*)表示p〈0.05Mann Whitney非參數(shù)雙尾t_檢驗。
[0022]圖6.圖A顯示施用抗Tie2抗體Η2Μ2055Ν(.)或Fe對照(.)后小鼠中的Colo305腫瘤生長曲線。向下箭頭指示處理起始日期。圖B顯示用抗Tie2抗體H2M2055N或Fe對照處理的小鼠中從處理起始時的腫瘤生長。星號(*)表示p〈0.05Mann Whitney非參數(shù)雙尾t-檢驗。
[0023]圖7.在實驗結(jié)束時在用抗Tie2抗體H2M2055N或Fe對照處理的小鼠中測量的Colo205腫瘤血管密度。星號(*)表示p〈0.05Mann Whitney非參數(shù)雙尾t_檢驗。[0024]發(fā)明詳述
[0025]在描述本發(fā)明之前，應(yīng)該理解本發(fā)明并不限于所述的具體方法和實驗條件，這是由于此類方法和條件可以變化。還應(yīng)理解本文所用的術(shù)語僅用于描述具體實施方案的目的，并不用于限制，這是由于本發(fā)明的范圍僅由所附的權(quán)利要求來限定。
[0026]除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，當用于指具體描述的數(shù)值時，術(shù)語“約”表示該值與所述值的不同可以不超過1%。例如，如本文所用，表述“約100”包括99和101以及之間的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0027]盡管與本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本發(fā)明的實施或檢測中，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。
[0028]定義
[0029]除非指定為來自非人物種(例如，“小鼠Tie2”、“小鼠Tie2片段”、“猴Tie2”、“猴Tie2片段”等)，否則如本文所用的表述“Tie2”和“Tie2片段”指人Tie2蛋白或片段?！癟ie2片段”是比全長Tie2分子具有更少氨基酸的Tie2的任一部分，并且其能夠結(jié)合Tie2配體。人Tie2具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。來自非人物種(例如，小鼠、猴、兔、狗、豬等)的Tie2分子的氨基酸序列可獲自公共來源諸如GenBank (例如，GenBank保藏號ΝΡ_038718.2 (小鼠);NP_00IO992O7.1(大鼠)；等)。
[0030]如本文所用，術(shù)語“Tie2配體”表示與Tie2蛋白相互作用以在體內(nèi)傳遞生物學(xué)信號的蛋白質(zhì)。術(shù)語“Tie2配體”包括任何血管生成素,包括例如Angl、Ang2、Ang3和/或Ang4。如本文所用，術(shù)語“Angl”表示包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或者能夠與Tie2相互作用的所述蛋白質(zhì)的部分。如本文所用，術(shù)語“Ang2”表示包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或者能夠與Tie2相互作用的所述蛋白質(zhì)的部分。如本文所用，術(shù)語“Ang3”表示包含SEQ ID `NO: 17的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或者能夠與Tie2相互作用的部分。如本文所用，術(shù)語“Ang4”表示包含如SEQ ID NO: 18所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或者能夠與Tie2相互作用的所述蛋白質(zhì)的部分。
[0031]如本文所用，術(shù)語“抗體”意指包含四條多肽鏈，即由二硫鍵相互連接的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的免疫球蛋白分子，以及其多聚體(例如IgM)。每一重鏈包含重鏈可變區(qū)(本文縮寫為HCVR或Vh)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個結(jié)構(gòu)域(^、(^和^^。每一輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為LCVR或和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域(ClI)。V1^P \區(qū)可以進一步細分為稱為互補決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，其散布于更保守的稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域中。每個Vh和 '由三個CDR和四個FR構(gòu)成，從氨基端向羧基端按以下順序排列:FR1、CDRU FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發(fā)明的不同實施方案中，抗Tie2抗體(或其抗原結(jié)合部分)的FR可以與人種系序列相同，或者可以是經(jīng)天然或人工修飾的序列。氨基酸共有序列可以基于兩個或多個CDR的并行分析來確定。
[0032]如本文所用，術(shù)語“抗體”還包括完整抗體分子的抗原結(jié)合片段。如本文所用，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”、抗體的“抗原結(jié)合片段”等包括任何天然存在的、酶促獲得的、合成的、或基因工程多肽或糖蛋白，其特異地結(jié)合抗原以形成復(fù)合體。例如可以使用合適的標準技術(shù)諸如蛋白酶解消化或重組基因工程技術(shù)(涉及編碼抗體可變域及任選恒定域的DNA的操作和表達)從完整抗體分子中產(chǎn)生抗體的抗原結(jié)合片段。此類DNA是已知的和/或者容易地從例如商業(yè)來源、DNA文庫(包括例如，噬菌體抗體文庫)獲得，或者可以合成。DNA是可以測序的并使用化學(xué)方法來操作或者通過使用分子生物學(xué)技術(shù)例如，以將一個或多個可變域和/或恒定域排列成合適的構(gòu)型，或者引入密碼子、產(chǎn)生半胱氨酸殘基、修飾、增加或刪除氨基酸等。
[0033]抗原結(jié)合片段的非限制性實例包括:(i)Fab片段;(ii)F(ab’)2片段;(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(V)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由氨基酸殘基組成的最小識別單位，其模擬抗體的高變區(qū)(例如，分離的互補決定區(qū)(CDR)諸如CDR3肽)、或受限的FR3-CDR3-FR4肽。其他經(jīng)改造的分子諸如結(jié)構(gòu)域特異性抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、結(jié)構(gòu)域缺失的抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微體、納米抗體(nanobody)(例如單價納米抗體、二價納米抗體等)、小模塊免疫藥物(SMIPs)和鯊魚可變IgNAR結(jié)構(gòu)域，也包含于如本文所用的表述“抗原結(jié)合片段”中。
[0034]抗體的抗原結(jié)合片段將通常包含至少一個可變域?？勺冇蚩梢允侨我獯笮』蛘甙被峤M成，并且將通常包含至少一個⑶R，其與一個或多個構(gòu)架區(qū)序列相鄰或與其處在框內(nèi)。在具有結(jié)合'結(jié)構(gòu)域的Vh結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合片段中，V1^P'結(jié)構(gòu)域可以以任何合適的排列方式彼此排列。例如，可變區(qū)可以是二聚的并且含有vH-vH、vH-'或二聚體?；蛘?，抗體的抗原結(jié)合片段可以含有單體Vh或\結(jié)構(gòu)域。
[0035]在某些實施方案中，抗體的抗原結(jié)合片段可以含有與至少一個恒定域共價連接的至少一個可變域?？梢栽诒景l(fā)明的抗體的抗原結(jié)合片段內(nèi)發(fā)現(xiàn)的可變域和恒定域的非限制性、示例性構(gòu)型包括:⑴ Vh-Ch1 ； (ii) Vh-Ch2 ; (iii) VH-CH3; (iv) Vh-Ch1-CH2; (v)Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi)VH-CH2-CH3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-ChI ; (ix)VL-CH2; (x) VL-CH3 ; (xi)Vl-Ch1-Ch2; (xii)VL-CHl-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3;和(xiv)VfQ。在可變域和恒定域的任一構(gòu)型中，包括上文列出的任一示例性構(gòu)型中，可變域和恒定域可以彼此直接連接或者可以通過完整的或部分的鉸鏈區(qū)或接頭區(qū)來連接。鉸鏈區(qū)可以由至少2個(例如，5、10、15、20,40,60或更多個)氨基酸組成，所述氨基酸在單個多肽分子內(nèi)的鄰近的可變域和/或恒定域之間產(chǎn)生柔性的或半柔性的連接。此外，本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合片段可以包含上文列出的任一可變域和恒定域構(gòu)型的同型二聚體或異二聚體(或其他多聚體)，其中所述可變域和恒定域彼此之間非共價連接和/或與一個或多個單體Vh或\結(jié)構(gòu)域(例如通過一個或多個二硫鍵)非共價連接。
[0036]關(guān)于完整的抗體分子，抗原結(jié)合片段可以是單特異性的或多特異性的(例如，雙特異性的)?？贵w的多特異性抗原結(jié)合片段通常將包含至少兩個不同的可變域，其中每一可變域能夠特異地結(jié)合單獨的抗原或同一抗原上的不同表位?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中可用的常規(guī)技術(shù)，使任何多特異性抗體形式(包括本文所公開的示例性雙特異性抗體形式)適用于本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合片段的背景中。
[0037]本發(fā)明的抗體可以通過依賴補體的細胞毒性(CDC)或依賴抗體的細胞毒性(ADCC)行使功能?！耙蕾囇a體的細胞毒性”(CDC)指在補體存在的情況下，本發(fā)明的抗體裂解抗原表達細胞。“依賴抗體的細胞毒性”(ADCC)指細胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達Fe受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如，天然殺傷(NK)細胞、中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結(jié)合的抗體并由此導(dǎo)致靶細胞的裂解?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知并可用的測定法來測量 CDC 和 ADCC0 (參見例如，U.S.5，500，362 和 5，821，337，和 Clynes 等(1998) Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 95:652-656)。抗體的恒定區(qū)對抗體固定補體并介導(dǎo)依賴細胞的細胞毒性的能力是重要的。因此，可以基于抗體的同種型是否對于抗體介導(dǎo)細胞毒性是需要的來選擇所述同種型。
[0038]如本文所用，術(shù)語“人抗體”意在包括具有源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括例如在CDR中尤其在CDR3中且不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機誘變或定點誘變或通過體內(nèi)體細胞突變引入突變)。然而，如本文所用，術(shù)語“人抗體”并不意在包括這樣的抗體，其中來源于另一哺乳動物物種諸如小鼠的種系的CDR序列已經(jīng)移植至人構(gòu)架序列上。
[0039]如本文所用，術(shù)語“重組人抗體”意在包括通過重組方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的所有的人抗體，諸如使用轉(zhuǎn)染入宿主細胞內(nèi)的重組表達載體表達的抗體(下文進一步描述)，從重組、組合的人抗體文庫分離的抗體(下文進一步描述)，從用人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因的動物(例如，小鼠)分離的抗體(例如參見Tay I or等(I 992) Nuc 1.Ac i dsRes.20:6287-6295)或通過涉及將人免疫球蛋白基因序列剪切為其他DNA序列的任何其他方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。此類重組人抗體具有源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。在某些實施方案中，然而，將此類重組人抗體進行體外誘變(或者，當使用了用人Ig序列進行轉(zhuǎn)基因的動物時，為體內(nèi)體細胞誘變)，因此該重組抗體的V1^P \區(qū)域的氨基酸序列是這樣的序列，盡管來源于人種系Vh和\序列或與人種系Vh和\序列相關(guān)，但所述氨基酸序列并不天然存在于體內(nèi)人抗體種系所有組成成分中。
[0040]人抗體可以以與鉸鏈異質(zhì)性(hinge heterogeneity)相關(guān)的兩種形式存在。在一種形式中，免疫球蛋白分子包含大約150-160kDa的穩(wěn)定的四鏈構(gòu)建體，其中二聚體通過鏈間重鏈二硫鍵結(jié)合在一起。在第二種形式中，二聚體并不經(jīng)鏈間的二硫鍵連接，而是形成由共價偶聯(lián)的輕鏈和重鏈構(gòu)成的約75-80kDa的分子(半抗體)。這些形式即使在親和純化后仍極難進行分離。
[0041]在多種完整IgG同種型中出現(xiàn)第二種形式的概率是由于但不限于與抗體的鉸鏈區(qū)同種型相關(guān)的結(jié)構(gòu)差異。在人IgG4鉸鏈的鉸鏈區(qū)內(nèi)的單個氨基酸取代能夠?qū)⒌诙N形式的出現(xiàn)(Angal等(1993)Molecular Immunology30:105)顯著減少至使用人IgGl鉸鏈通常觀察到的水平。本發(fā)明包括在鉸鏈區(qū)、Ch2或Ch3區(qū)內(nèi)具有一個或多個突變的抗體，所述突變可以是所希望的，例如在生產(chǎn)中用于提高想要的抗體形式的產(chǎn)量。
[0042]如本文所用，“分離的抗體”表示已經(jīng)從它的天然環(huán)境的至少一種組分中鑒定并分離和/或回收的抗體。例如，已經(jīng)與生物的至少一種組分分離或?qū)⑸锏闹辽僖环N組分除去的抗體、或者從抗體天然存在或天然產(chǎn)生的組織或細胞中分離或除去的抗體是用于本發(fā)明的目的的“分離的抗體”。分離的抗體還包括在重組細胞內(nèi)的原位抗體。分離的抗體是已經(jīng)進行至少一個純化或分離步驟的抗體。根據(jù)某些實施方案，分離的抗體可以基本上不含其他細胞物質(zhì)和/或化學(xué)品。
[0043]術(shù)語“特異地結(jié)合”等表示抗體或其抗原結(jié)合片段與抗原形成在生理條件下相對穩(wěn)定的復(fù)合體。用于確定抗體是否特異地結(jié)合抗原的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括例如平衡透析、表面等離振子共振等等。例如，如在本發(fā)明的上下文中所用，“特異地結(jié)合”人Tie2的抗體包括以如在表面等離振子共振測定中測量的以以下Kd結(jié)合人Tie2或其部分的抗體:少于約ΙΟΟΟηΜ、少于約500nM、少于約300nM、少于約200nM、少于約ΙΟΟηΜ、少于約90nM、少于約80nM、少于約70nM、少于約60nM、少于約50nM、少于約40nM、少于約30nM、少于約20nM、少于約ΙΟηΜ、少于約5nM、少于約4nM、少于約3nM、少于約2nM、少于約InM或少于約0.5nM。(參見，例如實施例2，本文)。然而，特異地結(jié)合人Tie2的分離的抗體可以與其他抗原諸如來自其他(非人)物種的Tie2分子具有交叉反應(yīng)性。
[0044]如本文所用，“中和性”或“抑制性”抗體意指這樣的抗體，其與Tie2的結(jié)合:⑴干擾Tie2或Tie2片段和Tie2配體(例如，血管生成素)之間的相互作用，和/或(ii)導(dǎo)致抑制Tie2的至少一種生物學(xué)功能。由Tie2中和性抗體或抑制性抗體引起的抑制并不需要是完全的，只要它使用合適的測定法能檢測到即可。在本文描述了用于檢測TIE2抑制的示例性測定。
[0045]與抗體來源的所對應(yīng)的種系序列相比，本文公開的抗Tie2抗體可以包含在重鏈和輕鏈可變域的構(gòu)架區(qū)和/或CDR區(qū)中的一個或多個氨基酸取代、插入和/或缺失。通過比較本文公開的氨基酸序列與例如從自公共抗體序列數(shù)據(jù)庫中獲得的種系序列可以容易地確定此類突變。本發(fā)明包括抗體及所述抗體的抗原結(jié)合片段，其來源于本文公開的任一氨基酸序列，其中將一個或多個構(gòu)架區(qū)和/或CDR區(qū)內(nèi)的一個或多個氨基酸突變至抗體來源的種系序列的對應(yīng)殘基、或者突變至另一人種系序列的對應(yīng)殘基、或者突變至對應(yīng)種系殘基的保守氨基酸取代物(此類序列改變在本文中共同稱為“種系突變”)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員從本文公開的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列開始，能夠容易地產(chǎn)生包含一個或多個單個種系突變或其組合的大量抗體和抗原結(jié)合片段。在某些實施方案中，將在Vh和/或\結(jié)構(gòu)域內(nèi)的所有構(gòu)架和/或CDR殘基突變回在抗體來源的原始種系序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。在其他實施方案中，僅將某些殘基突變回原始種系序列，例如，僅突變在FRl的前8個氨基酸內(nèi)或在FR4的最后8個氨基酸內(nèi)發(fā)現(xiàn)的突變殘基，或者僅突變在CDR1、CDR2或CDR3內(nèi)發(fā)現(xiàn)的突變殘基。在其他實施方案中，將一個或多個構(gòu)架和/或CDR殘基突變?yōu)椴煌N系序列(即，與抗體原始來源的種系序列不同的種系序列)所對應(yīng)的殘基。此外，本發(fā)明的抗體可以含有在構(gòu)架區(qū)和/或CDR區(qū)內(nèi)的兩個或多個種系突變的任意組合，例如，其中將某些單獨的殘基突變?yōu)樘囟ǚN系序列的對應(yīng)殘基，而將與原始種系序列不同的某些其他殘基保持或突變?yōu)椴煌N系序列的對應(yīng)殘基。一旦`獲得后，由于一種或多種想要的特性，諸如，提高的結(jié)合特異性、增加的結(jié)合親和力、提高的或增強的拮抗或?qū)股飳W(xué)特性(由于可能是該情況)、降低的免疫原性等，就能夠容易地檢測含有一個或多個種系突變的抗體和抗原結(jié)合片段。以這種一般方式獲得的抗體和抗原結(jié)合片段包含于本發(fā)明中。
[0046]本發(fā)明還包括這樣的抗Tie2抗體，相比于本文公開的示例性抗Tie2抗體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，所述抗Tie2抗體包含具有一個或多個保守性取代的變體。例如,本發(fā)明包括這樣的抗Tie2抗體，相對于本文公開的抗Tie2抗體的任一 HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，所述抗Tie2抗體具有例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少等保守氨基酸取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列。
[0047]如本文所用，術(shù)語“表面等離振子共振”指通過例如使用BI Acor e?系統(tǒng)(GEHealthcare的Biacore Life Sciences部門，Piscataway, NJ)來檢測生物傳感器基質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度改變從而允許分析實時相互作用的光學(xué)現(xiàn)象。
[0048]如本文所用，術(shù)語“KD”意指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數(shù)。
[0049]術(shù)語“表位”指與抗體分子可變區(qū)內(nèi)的特定抗原結(jié)合位點(稱為互補位)相互作用的抗原決定簇。單一抗原可以具有多于一個表位。因此，不同抗體可以結(jié)合抗原上的不同區(qū)域并且可以具有不同的生物效應(yīng)。表位可以是構(gòu)象性的或線性的。構(gòu)象表位由來自線性多肽鏈不同區(qū)段的且在空間上并列的氨基酸產(chǎn)生。線性表位是由多肽鏈中相鄰的氨基酸殘基產(chǎn)生的表位。在某些情況下，表位可以包括抗原上的糖、磷?；蚧酋；糠?。
[0050]當指核酸或其片段時，術(shù)語“基本同一性”或“基本上相同的”表示當與另一核酸(或它的互補鏈)最優(yōu)比對適合的核苷酸插入或缺失時，如通過下文所討論的任一眾所周知的序列同一性算法諸如FASTA、BLAST或Gap所測量的，在至少約95%、并且更優(yōu)選至少約96%、97%、98%或99%的核苷酸堿基中存在核苷酸序列同一性。在某些情況下，與參考核酸分子具有基本上相同的核酸分子可以編碼與由參考核酸分子編碼的多肽具有相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。
[0051]當應(yīng)用于多肽時，術(shù)語“基本相似性”或“基本上相似的”表示當通過諸如程序GAP或BESTFIT使用默認空位權(quán)重進行最優(yōu)比對時，兩條肽序列具有至少95%的序列同一性，甚至更優(yōu)選至少98 %或99 %的序列同一性。優(yōu)選地，不相同的殘基位置通過保守氨基酸取代而不同?！氨Ｊ匕被崛〈笔沁@樣的取代，其中一個氨基酸殘基由具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的側(cè)鏈(R基團)的另一個氨基酸殘基所取代。一般而言，保守氨基酸取代將基本上不會改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在兩條或多條氨基酸序列由于保守取代而彼此不同的情況下，百分比序列同一性或相似度可以向上調(diào)整以校正取代的保守性質(zhì)。進行這種調(diào)整的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。參見例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。具有相似化學(xué)性質(zhì)的氨基酸組的實例包括(I)脂肪族側(cè)鏈:甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；(2)脂肪族-羥基側(cè)鏈:絲氨酸和蘇氨酸；(3)含酰胺的側(cè)鏈:天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族側(cè)鏈:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)堿性側(cè)鏈:賴氨酸、精氨酸和組氨酸；(6)酸性側(cè)鏈:天冬氨酸和谷氨酸以及(7)含硫的側(cè)鏈:半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組為:纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。備選地，保守替換是在Gonnet等(1992) Science256:1443-1445中公開的PAM2501og可能性矩陣中具有正值的任何改變?！斑m度`保守的”替換是在PAM2501og可能性矩陣中具有非負值的任何改變。
[0052]多肽的序列相似性，也稱為序列同一性,一般使用序列分析軟件來測量。蛋白質(zhì)分析軟件使用分配至多種取代、缺失和其他修飾(包括保守氨基酸取代)的相似性測量匹配相似的序列。例如，GCG軟件含有程序諸如Gap和Bestfit，其可以使用默認參數(shù)來確定緊密相關(guān)的多肽諸如來自不同生物物種的同源多肽之間或者野生型蛋白質(zhì)與其突變蛋白質(zhì)之間的序列同源性或序列同一性。例如，參見GCG版本6.1。還可以使用FASTA (GCG版本6.1中的程序)并使用默認或推薦參數(shù)比較多肽序列。FASTA (例如，F(xiàn)ASTA2和FASTA3)提供了在查詢和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對和百分比序列同一性(Pearson (2000)，上文)。當比較本發(fā)明的序列與含有來自不同生物的大量序列的數(shù)據(jù)庫時，另一個優(yōu)選算法是計算機程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，同時使用默認參數(shù)。參見，例如Altschul等(1990) J.Mol.Biol.215:403-410 和 Altschul 等(1997) Nucleic Acids Res.25: 3389-402。
[0053]抗體的生物學(xué)特征
[0054]本發(fā)明包括阻斷Tie2和Tie2配體之間的相互作用的抗體。如本文所用，表述“阻斷Tie2和Tie2配體之間的相互作用”表示在可以檢測和/或定量Tie2和Tie2配體之間的物理相互作用的測定中，加入本發(fā)明的抗體使Tie2和Tie2配體(例如，Angl、Ang2、Ang3和/或Ang4)之間的相互作用減弱了至少50%。在本文實施例5中說明了可以用于確定抗體是否阻斷人Tie2和Tie2配體之間的相互作用的非限制性、示例性測定。在該測定形式的一個示例性實施方案中，將抗體與Tie2蛋白混合，并隨后將抗體/Tie2混合物應(yīng)用到包被有Tie2配體(在這種情況下為Ang2蛋白)的表面上。洗去未結(jié)合的分子后，測量結(jié)合到包被有Ang2的表面上的Tie2的量。通過在該測定形式中使用不同量的抗體，可以計算出阻斷50%的Tie2與Ang2結(jié)合所需的抗體量并且將其表示為IC5tl值。該測定形式可以反過來，以便將Tie2包被到表面上，將抗體加入到包被有Tie2的表面上，洗去未結(jié)合的抗體,隨后將Tie2配體加入到經(jīng)抗體處理的Tie2表面上。本發(fā)明包括這樣的抗Tie2抗體，當在如實施例5中所示的Tie2/Tie2配體結(jié)合測定中或基本上相似的測定中測試時，所述抗Tie2抗體顯示出低于約IOOnM的IC5(I。例如，本發(fā)明包括這樣的抗Tie2抗體，當在如實施例5中所示的Tie2/Tie2配體結(jié)合測定中或基本上相似的測定中測試時,所述抗Tie2抗體顯示出低于約 100、90、80、70、60、50、40、30、20、19、18、17、16、15、14、12、10、9、8、7、6、5、
4、3、2、1、0.5,0.4,0.3 或 0.2nM 的 IC5。。
[0055]在本文實施例6中說明了可以用于確定抗體是否阻斷人Tie2和Tie2配體之間的相互作用的另一測定形式。在該測定形式中，使用這樣的細胞系，其被改造以在其表面上表達人Tie2，并且所述細胞系還包括報道基因構(gòu)建體，當Tie2與Tie2配體相互作用時所述報道基因構(gòu)建體產(chǎn)生待表達的可檢測信號。用抗Tie2抗體并用Tie2配體處理被改造的細胞，并且測量報道基因信號。在該測定形式中通過使用不同量的抗體，可以計算出抑制50%的報道基因信號(在不存在抗體的情況下觀察到的)所需的抗體量并且表示為IC5tl值。本發(fā)明包括這樣的抗Tie2抗體，當在如實施例6中所示的Tie2/Tie2配體結(jié)合測定中或基本上相似的測定中測試時，所述抗Tie2抗體顯示出低于約20nM的IC5(I。例如，本發(fā)明包括這樣的抗Tie2抗體，當在如實施例6中所示的Tie2/Tie2配體結(jié)合測定中或基本上相似的測定中測試時，所述抗 Tie2 抗體顯示出低于約 20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、
5、4、3、2、1、0.5,0.4,0.3,0.2 或 0.1nM 的 IC50。
[0056]表位定位和相關(guān)技術(shù)
[0057]人Tie2蛋白含有以下結(jié)構(gòu)域:Igl結(jié)構(gòu)域、Ig2結(jié)構(gòu)域、EGF重復(fù)結(jié)構(gòu)域、Ig3結(jié)構(gòu)域、纖連蛋白重復(fù)(FN)結(jié)構(gòu)域(包括FN1、FN2和FN3)。這些結(jié)構(gòu)域圖示地顯示于圖1中。本發(fā)明包括特異地結(jié)合一個或多個以下區(qū)域內(nèi)的表位的抗Tie2抗體:(a) Igl-1g2-EGF結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 7) ; (b) Ig2-EGF 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:8) ; (c)EGF 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:9) ; (d)Ig3-FN結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 10);和/或(e)FN結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 11)。(參見實施例3和4)。
[0058]根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明提供與Tie2的Igl和/或Ig2結(jié)構(gòu)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一個或多個氨基酸相互作用的抗Tie2抗體。表位可以由一條或多條3個或更多個(例如，3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個)氨基酸的連續(xù)序列組成，所述氨基酸位于Tie2的Igl和/或Ig2結(jié)構(gòu)域內(nèi)。備選地，表位可以由位于Tie2的Igl和/或Ig2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的多個非連續(xù)氨基酸(或氨基酸序列)組成。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，提供與位于一個或多個氨基酸區(qū)段內(nèi)的一個或多個氨基酸相互作用的抗Tie2抗體，所述氨基酸區(qū)段選自:SEQ ID NO: 7的氨基酸96-106，SEQ ID NO: 7的氨基酸139-152以及SEQ IDNO:7的氨基酸166-175。例如，本發(fā)明包括與前述區(qū)段的每一個(即，在SEQ ID NO:7的氨基酸96-106、139-152和166-175內(nèi)的每一個)內(nèi)的至少一個氨基酸相互作用的抗Tie2抗體。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，與SEQ ID NO:7的氨基酸139-152和/或166-175相互作用的抗體能夠阻斷Tie2和一個或多個Tie2配體諸如例如Ang2之間的相互作用(參見實施例4-6，本文)。
[0059]可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種技術(shù)來確定抗體是否與多肽或蛋白質(zhì)內(nèi)的“一個或多個氨基酸相互作用”。示例性技術(shù)包括例如常規(guī)交叉阻斷測定諸如Antibodies, Harlow 和 Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)描述的，丙氨酸掃描突變分析，妝印記分析(Reineke, 2004, Methods Mol Biol248:443-463)和肽切割分析。此外，可以使用方法諸如表位切除、表位提取和抗原的化學(xué)修飾(Tomer, 2000, Protein Science9:487-496)?？捎糜阼b定與抗體相互作用的多肽內(nèi)的氨基酸的另一種方法是由質(zhì)譜分析法檢測氫/氘交換。(參見，例如實施例4，本文)。在一般術(shù)語中，氫/氘交換方法涉及用氘標記目標蛋白，隨后使抗體結(jié)合到氘標記的蛋白質(zhì)上。隨后，將蛋白質(zhì)/抗體復(fù)合體轉(zhuǎn)移到水中，以允許除由抗體保護的殘基(其保持為氘標記的)之外的所有殘基上發(fā)生氫-氘交換?？贵w解離后，對目標蛋白進行蛋白酶切割和質(zhì)譜分析，由此揭示氘標記的殘基，其對應(yīng)于與抗體相互作用的特異性氨基酸。參見，例如,Ehring (1999)Analytical Biochemistry267 (2):252-259;Engen 和 Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
[0060]本發(fā)明包括與本文所述的任何特異示例性抗體(例如，抗體H1M2055N和H2aM2760N，分別從保藏的細胞系PTA-12295和PTA-12296中產(chǎn)生)結(jié)合相同表位的抗Tie2抗體。同樣，本發(fā)明還包括與本文所述的任何特異示例性抗體(例如，抗體H1M2055N和H2aM2760N,分別從保藏的細胞系PTA-12295和PTA-12296中產(chǎn)生)競爭結(jié)合Tie2或Tie2片段的抗Tie2抗體。
[0061]技術(shù)人員可以通過使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法容易地確定抗體結(jié)合的表位是否與參考抗Tie2抗體結(jié)合的表位相同或與參考抗Tie2抗體結(jié)合的表位競爭結(jié)合。例如，為了確定檢測抗體結(jié)合的表位是否與參考抗Tie2抗體結(jié)合的表位相同，允許參考抗體在飽和條件下結(jié)合Tie2蛋白或肽。隨后，評估檢測抗體結(jié)合Tie2分子的能力。如果在參考抗Tie2抗體飽和結(jié)合Tie2后，檢測抗體能夠結(jié)合Tie2，則可以推定該檢測抗體結(jié)合的表位不同與參考抗Tie2抗體結(jié)合的表位。另一方面，如果在參考抗Tie2抗體飽和結(jié)合Tie2后，檢測抗體不能夠結(jié)合Tie2分子，那么有可能該檢測抗體結(jié)合的表位與本發(fā)明的參考抗Tie2抗體所結(jié)合的表位相同。隨后可以進行額外的常規(guī)實驗法(例如肽突變和結(jié)合分析)來證實沒有觀察到檢測抗體的結(jié)合是否實際上是由于所述檢測抗體與參考抗體結(jié)合相同表位，或者是否是由于空間位阻(steric blocking)(或另一現(xiàn)象)導(dǎo)致沒有觀察到結(jié)合。這類實驗可以使用ELISA、RIA、Biacore、流式細胞術(shù)或本領(lǐng)域中可用的任何其他定量或定性抗體結(jié)合測定法來進行。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，如在競爭性結(jié)合測定中測量到的，如果例如
1、5、10、20、或100倍過量的一種抗體抑制了另一種抗體的至少50%，但優(yōu)選75%、90%或甚至99%的結(jié)合,則兩種抗體結(jié)合相同(或重疊)的表位(參見,例如，Junghans等，CancerRes.1990:50:1495-1502)。備選地，如果抗原中降低或消除一種抗體的結(jié)合的基本上所有氨基酸突變降低或消除了另一種抗體的結(jié)合，則認為兩種抗體結(jié)合相同的表位。如果僅僅降低或消除一種抗體的結(jié)合的一組氨基酸突變降低或消除了另一種抗體的結(jié)合，則認為兩種抗體具有“重疊的表位”。
[0062]為了確定抗體是否與參考抗Tie2抗體競爭結(jié)合，在兩個方向上進行上述的結(jié)合方法:在第一方向上，允許參考抗體在飽和條件下結(jié)合Tie2分子，隨后評估檢測抗體與Tie2分子的結(jié)合。在第二方向上，允許檢測抗體在飽和條件下結(jié)合Tie2分子，隨后評估參考抗體與Tie2分子的結(jié)合。如果在兩個方向上僅有第一(飽和)抗體能夠結(jié)合Tie2分子，那么推定檢測抗體和參考抗體競爭結(jié)合Tie2。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的，與參考抗體競爭結(jié)合的抗體可以不必結(jié)合與參考抗體相同的表位，但可以通過結(jié)合重疊的表位或鄰近的表位而在空間上阻斷參考抗體的結(jié)合。
[0063]人抗體的制備
[0064]用于產(chǎn)生單克隆抗體包括完全人單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。任何此類已知方法可以用于本發(fā)明的上下文中，以產(chǎn)生特異地結(jié)合人Tie2的人抗體。[0065]使用VEL0CIMMUNE?技術(shù)或用于產(chǎn)生單克隆抗體的任何其他已知方法，最初分離具有人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的高親和力抗Tie2嵌合抗體。如同在下文的實驗部分中，表征抗體并選擇所需的特征，包括親和力、選擇性、表位等。用想要的人恒定區(qū)替換小鼠恒定區(qū)，以產(chǎn)生本發(fā)明的完全人抗體，例如野生型或經(jīng)修飾的IgGl或IgG4。盡管選擇的恒定區(qū)可以根據(jù)特定的用途而變化，但高親和力抗原結(jié)合及靶特異性特征存在于可變區(qū)中。
[0066]生物等效性本發(fā)明的抗Tie2抗體和抗體片段包括具有這樣的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列與所描述的抗體的氨基酸序列不同但保留結(jié)合人Tie2能力。當與親本序列比較時，此類變異抗體和抗體片段包含一個或多個氨基酸的添加、缺失或取代，但顯示出與所述抗體的生物學(xué)活性基本上等同的生物學(xué)活性。同樣，本發(fā)明的編碼抗Tie2抗體的DNA序列包括這樣的序列，當與公開的序列比較時，所述序列包含一個或多個核苷酸的添加、缺失或取代，但編碼與本發(fā)明的抗Tie2抗體或抗體片段基本上生物等效的抗Tie2抗體或抗體片段。
[0067]如果例如兩種抗原結(jié)合蛋白或抗體是藥物等同物或者藥物替代品，當在相似實驗條件(單一劑量或多次劑量)下以相同摩爾劑量施用時，所述兩種結(jié)合抗原蛋白質(zhì)或抗體的吸收率和程度沒有顯示出顯著差異，認為它們具有生物等效性。如果一些抗體在吸收程度而非吸收率上等同，那么它們將被認為是等同物或者藥物替代品，并且仍可以認為是生物等效的，這是由于在吸收率中的此類差異是有意為之的并且反映在標簽中，所述差異對于例如在長期使用上達到有效機體藥物濃度并不是必需的，并且認為在醫(yī)學(xué)上對所研究的特定藥品并不重要。
[0068]在一個實施方案中，如果兩種抗原結(jié)合蛋白在其安全性、純度和潛能中沒有臨床上有意義的差異，那么它們具有生物等效性。
[0069]在一個實施方案中，如果患者可以在參考制品和生物制品之間轉(zhuǎn)換一次或多次，與不進行此類轉(zhuǎn)換的持續(xù)治療相比，所述轉(zhuǎn)換不存在副作用(包括免疫原性中的臨床上顯著變化或降低的有效性)風(fēng)險的預(yù)期增加，那么所述參考制品和生物制品具有生物等效性。
[0070]在一個實施方案中，如果兩種抗原結(jié)合蛋白均在條件或使用條件下通過共同的機制或作用機制起作用至此類機制已知的程度，那么它們具有生物等效性。[0071]生物等效性可以通過體內(nèi)和體外方法來證明。生物等效性測量包括例如(a)人或其他哺乳動物中的體內(nèi)檢測，其中將血液、血漿、血清或其他生物流體中的抗體或其代謝物的濃度測量為時間函數(shù)；(b)體外檢測，其已經(jīng)與人體內(nèi)生物利用率數(shù)據(jù)相關(guān)并且合理地預(yù)測人體內(nèi)生物利用率數(shù)據(jù)；(C)人或其他哺乳動物中的體內(nèi)檢測，其中將抗體(或其靶標)的合適的急性藥理作用測量為時間函數(shù)；和((1)在完全受控的臨床試驗中，所述臨床試驗建立抗體的安全性、效力、生物利用率或生物等效性。
[0072]本發(fā)明的抗Tie2抗體的生物等效變體可以通過例如進行殘基或序列的多種取代或者缺失對于生物學(xué)活性非必需的末端或內(nèi)部殘基或序列來構(gòu)建。例如，對于生物學(xué)活性非必需的半胱氨酸殘基可以被缺失或用其他氨基酸替換，來防止在復(fù)性后形成非必要的或不正確的分子內(nèi)二硫鍵。在其他上下文中，生物等效抗體可以包括這樣的抗Tie2抗體變體，其包含修飾了抗體的糖基化特征的氨基酸改變，例如消除或去除糖基化的突變。
[0073]物種選擇性和物種交叉反應(yīng)性
[0074]根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，抗Tie2抗體結(jié)合人Tie2但不結(jié)合來自其他物種的Tie2。本發(fā)明還包括結(jié)合人Tie2和來自一種或多種非人物種的Tie2的抗Tie2抗體。例如，本發(fā)明的抗Tie2抗體可以特異地結(jié)合人Tie2以及結(jié)合嚙齒動物Tie2(例如，來自小鼠或大鼠的Tie2)。可以用于確定抗體是否特異地結(jié)合小鼠Tie2的示例性構(gòu)建體是具有SEQID NO:6的氨基酸序列的構(gòu)建體；可以用于確定抗體是否特異地結(jié)合大鼠Tie2的示例性構(gòu)建體是具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的構(gòu)建體。使用這些構(gòu)建體來評估抗Tie2抗體的結(jié)合顯示于本文實施例2中。
[0075]免疫連接物
[0076]本發(fā)明包括 綴合有治療部分(“免疫連接物”)諸如細胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素的抗Tie2單克隆抗體。細胞毒性劑包括對細胞有害的任何試劑。用于形成免疫連接物的合適的細胞毒性劑和化學(xué)治療劑的實例是本領(lǐng)域已知的(例如參見W005/103081)。
[0077]多特異性抗體
[0078]本發(fā)明的抗體可以是單特異性的、雙特異性的或多特異性的。多特異性抗體可以對一種目標多肽的不同表位是特異的，或者可以含有對多于一種目標多肽特異的抗原結(jié)合域。參見，例如，Tutt 等,1991, J.1mmunol.147:60-69;Kufer 等,2004, TrendsBiotechnol.22:238-244。本發(fā)明的抗Tie2抗體可以與另一種功能分子,例如另一種肽或蛋白質(zhì)連接或共表達。例如，抗體或其片段可以與一種或多種其他分子實體，諸如另一種抗體或抗體片段功能性連接(例如，通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價連接或其他方式)，以產(chǎn)生具有第二結(jié)合特異性的雙特異性或多特異性抗體。例如，本發(fā)明包括雙特異性抗體，其中免疫球蛋白的一條臂對于人Tie2或其片段是特異性的，并且該免疫球蛋白的另一條臂對于第二治療靶標是特異性的或者連接到治療部分諸如胰蛋白酶抑制劑上。
[0079]可以用于本發(fā)明的上下文中的示例性雙特異性抗體形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3結(jié)構(gòu)域和第二 Ig G3結(jié)構(gòu)域，其中第一和第二 IgCH3結(jié)構(gòu)域由于至少一個氨基酸而彼此不同，并且其中與缺少氨基酸差異的雙特異性抗體相比，至少一個氨基酸差異減弱了雙特異性抗體與蛋白A的結(jié)合。在一個實施方案中，第一 Ig CH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白A，并且第二 IgCH3結(jié)構(gòu)域含有減弱或消除蛋白A結(jié)合的突變，諸如H95R修飾(由MGT外顯子編號；由EU編號為H435R)。第二 CH3可以進一步包含Y96F修飾(由MGT外顯子編號；由EU編號為Y436F)?？梢栽诘诙?Ch3中發(fā)現(xiàn)的其他修飾包括:在IgGl抗體的情況下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M 和 V82I (由 IMGT 外顯子編號;由 EU 編號為 D356E、L358M、N384S、K392N、V397M 和 V422I);在 IgG2 抗體的情況下，N44S、K52N 和 V82I(IMGT;由 EU 編號為N384S、K392N 和 V422I);并且在 IgG4 抗體的情況下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和 V82I (由 IMGT 外顯子編號;由 EU 編號為 Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q 和V422I)。考慮上文描述的雙特異性抗體形式中的變異在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0080]治療制劑和施用
[0081]本發(fā)明提供包含本發(fā)明的抗Tie2抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物。將本發(fā)明的藥物組合物與合適的載體、賦形劑及提供改善的轉(zhuǎn)移、遞送、耐受等的其他試劑一起配制。多種適合的制劑可以在所有藥劑師已知的處方中發(fā)現(xiàn):Remington’s PharmaceuticalSciences, Mack Publishing Company, Easton, PA。這些制劑包括例如粉劑、糊劑、軟膏、凝膠劑、蠟、油、脂質(zhì)、含有小泡(諸如LIP0FECTIN?)的脂質(zhì)(陽離子的或陰離子的)、DNA綴合物、無水吸收糊劑、水包油和油包水乳劑、乳劑碳蠟(多種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠、和含有碳臘的半固體混合物。還參見Powell等〃Compendium of excipients forparenteral formulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol52:238-31I。
[0082]向患者施用的抗體劑量可以根據(jù)患者的年齡和尺寸、目標疾病、狀況、施用途徑等而變化。通常根據(jù)體重或體表面積計算優(yōu)選的劑量。當將本發(fā)明的抗體用于在成年患者中治療與Tie2活性相關(guān)的病癥或疾病時，以下可能是有利的:一般以約0.01至約20mg/kg體重，更優(yōu)選約0.02至約7mg/kg,約0.03至約5mg/kg或約0.05至約3mg/kg體重的單次劑量靜脈內(nèi)施用本發(fā)明的抗體。根據(jù)病癥的嚴重性，可以調(diào)整治療的頻率和持續(xù)時間。施用Tie2抗體的有效劑量和時間表可以根據(jù)經(jīng)驗來確定；例如，可以通過定期評估監(jiān)測患者病程，并相應(yīng)地調(diào)整劑量。此外，可以使用本領(lǐng)域中眾所周知的方法進行劑量的種間類推(例如,Mordenti 等,1991, Pharmaceut.Res.8:1351)。
`[0083]多種遞送系統(tǒng)是已知的并且可用于施用本發(fā)明的藥物組合物，例如，脂質(zhì)體中封裝、微粒、微膠囊、能夠表達突變病毒的重組細胞、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(參見，例如，Wu等，1987，J.Biol.Chem.262:4429-4432)。導(dǎo)入的方法包括但不限于真皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服途徑。組合物可以通過任何常規(guī)途徑施用，例如通過輸注或團注、通過上皮或皮膚粘膜(例如，口腔粘膜、直腸粘膜和腸粘膜等)施用，并可以與其他生物學(xué)上有活性的試劑一同施用。施用可以是全身性的或局部的。
[0084]本發(fā)明的藥物組合物可以用標準針和注射器經(jīng)皮下或靜脈內(nèi)遞送。此外，在皮下遞送方面，筆式遞送(pen delivery)設(shè)備容易地應(yīng)用于遞送本發(fā)明的藥物組合物。此類筆式遞送設(shè)備可以是重復(fù)使用的或一次性的。重復(fù)使用的筆式遞送設(shè)備一般利用含有藥物組合物的可更換藥筒。一旦藥筒內(nèi)的所有藥物組合物已施用并且藥筒排空，則可以將空藥筒容易地丟棄并替換為含有藥物組合物的新藥筒。隨后筆式遞送設(shè)備可以再次使用。在一次性筆式遞送設(shè)備中，不存在可替換的藥筒。相反，一次性筆式遞送設(shè)備預(yù)先裝填有保存在設(shè)備內(nèi)的儲存器中的藥物組合物。一旦儲存器排空藥物組合物，則將整個設(shè)備丟棄。
[0085]大量的重復(fù)使用的筆式遞送設(shè)備和自動注射器遞送設(shè)備應(yīng)用于本發(fā)明的藥物組合物的皮下遞送中。這樣的實例包括但不限于AUT0PENTM(0wenMumford, Inc., Woodstock,UK)、DISETRONIC? 筆(Disetronic MedicalSystems, Bergdorf, Switzerland)、HUMALOG MIX75/25? 筆、HUMALOGtm 筆、HUMALIN70/30? 筆(Eli Lilly and C0.，Indianapolis, IN)、NOVOPENtm1、II 和 III (NovoNordisk, Copenhagen, Denmark)、N0V0PEN JUNIOR?(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark)、BD? 筆(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)、OPTIPEN?、OPTIPEN PRO?、OPTIPENSTARLET? 和 OPTICLIK?(sanof1-aventis, Frankfurt, Germany)，僅舉幾例。應(yīng)用于本發(fā)明的藥物組合物的皮下遞送的一次性筆式遞送設(shè)備的實例包括但不限于S0L0STAR?筆(sanof1-aventis)、FLEXPEN?(Novo Nordisk)、KWIKPEN?(Eli Lilly)、SURECLICK?Autoinjector(Amgen, Thousand Oaks, CA)、PENLET?(HaseImeier, Stuttgart,Germany)、EPIPEN (Dey, L.P.)和 HUM I RA? Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL)，僅舉幾例。
[0086]在某些情況下，藥物組合物可以在控釋系統(tǒng)中遞送。在一個實施方案中，可以使用泵(參見 Langer,上文;Sefton, 1987, CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一個實施方案中，可以使用聚合材料；參見Medical Applications of Controlled Release, Langer和 Wise (eds.)，1974，CRC Pres., Boca Raton, Florida。在另一個實施方案中，可以將控釋系統(tǒng)置于組合物祀標的附近，因而僅需要全身劑量的一部分(參見，例如，Goodson, 1984，inMedical Applications of Controlled Release,上文，vol.2，pp.115-138)。其他控釋系統(tǒng)在 Langer, 1990, Science249:1527-1533 的綜述中進行了討論。
[0087]注射劑可以包括用于靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和肌內(nèi)注射、滴注等的劑量形式。這些注射劑可以通過公眾已知的方法來制備。例如，注射劑可以這樣制備:例如，通過上文描述的抗體或其鹽在常規(guī)用于注射的無菌水介質(zhì)或油介質(zhì)中溶解、懸浮或乳化。作為注射用的水介質(zhì)，例如，包含生理鹽水、含有葡萄糖和其他助劑的等滲溶液等，所述水介質(zhì)可以與適合的增溶劑諸如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非離子型表面活性劑[例如，聚山梨酯80，HC0-50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等組合使用。作為油介質(zhì)，可以使用例如芝麻油、大豆油等，所述油介質(zhì)可以與增溶劑諸如苯甲酸芐酯、苯甲醇等組合使用。如此制備的注射`劑優(yōu)選裝入適合的安瓿中。
[0088]有利地，將上述用于口服或腸胃外使用的藥物組合物制備為在適合于滿足活性成分的劑量的單位劑量中的劑量形式。在單位劑量中的此類劑量形式包括例如片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑(安瓿)、栓劑等。所含有的上述抗體的量一般在單位劑量中為約5至約500mg/劑量形式；尤其在注射劑形式時，優(yōu)選含有約5至約IOOmg的上述抗體，并且對于其他劑量形式含有約10至約250mg的上述抗體。
[0089]抗體的治療用途
[0090]本發(fā)明的抗體尤其用于治療、預(yù)防和/或減輕任何與Tie2活性相關(guān)的疾病或病癥，包括與血管發(fā)生有關(guān)的疾病或病癥。本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段可以用于治療例如在腦和腦膜、口咽、肺和支氣管樹、胃腸道、雄性及雌性生殖道、肌肉、骨骼、皮膚及附屬物、結(jié)締組織、脾、免疫系統(tǒng)、造血細胞和骨髓、肝和泌尿道、和特定的感覺器官諸如眼中產(chǎn)生的原發(fā)性腫瘤和/或轉(zhuǎn)移瘤。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段用于治療一種或多種以下癌:腎細胞癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、惡性膠質(zhì)瘤(malignant gliomas)、骨肉瘤、結(jié)直腸癌、惡性間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌、或黑素瘤。[0091]組合療法
[0092]本發(fā)明包括治療施用方案，其包括施用與至少一種額外的治療活性成分組合的本發(fā)明的抗Tie2抗體。此類額外的治療活性成分的非限制性實例包括，例如另一種Tie2拮抗劑(例如，抗Tie2抗體)、表皮生長因子受體(EGFR)的拮抗劑(例如，抗EGFR抗體[例如，西妥昔單抗或帕尼單抗]或EGFR活性的小分子抑制劑[例如，吉非替尼或埃羅替尼])、另一個EGFR家族成員諸如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4的拮抗劑(例如，抗ErbB2抗體、抗ErbB3抗體或抗ErbB4抗體或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制劑)、EGFRvIII的拮抗劑(例如，特異地結(jié)合EGFRvIII的抗體)、cMET拮抗劑(例如，抗cMET抗體)、IGFlR拮抗劑(例如，抗IGFlR抗體)、B-raf抑制劑(例如，威羅菲尼(vemurafenib )、索拉非尼、⑶C-0879、PLX-4720 )、PDGFR-α 抑制劑(例如，抗 TOGFR-α 抗體)、TOGFR-β 抑制劑(例如，抗 I3DGFR-β抗體)、VEGF拮抗劑(例如，VEGF-Trap,參見例如，US7, 087，411 (本文中也稱為〃抑制VEGF的融合蛋白")、抗VEGF抗體(例如，貝伐單抗)、VEGF受體的小分子激酶抑制劑(例如，舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼(pazopanib)))、DLL4拮抗劑(例如，US2009/0142354中公開的抗DLL4抗體諸如REGN421)、Ang2拮抗劑(例如，US2011/0027286中公開的抗Ang2抗體，諸如H1H685P)等。可以與本發(fā)明的抗Tie2抗體有利地組合施用的其他試劑包括細胞因子抑制劑，其包括小分子細胞因子抑制劑和結(jié)合細胞因子諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL_4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-1U IL-12、IL-13、IL-17、IL-18 或結(jié)合它們各自受體的抗體。
[0093]本發(fā)明還包括治療組合，其包含本文提及的任意抗Tie2抗體和VEGF、Ang2、DLL4、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvII1、cMet、IGF1R、B-raf, PDGFR- a、PDGFR- β 中的一種或多種或任何前述細胞因子的抑制劑，其中所述抑制劑是適體、反義分子、核酶、SiRNA、肽體(peptibody)、納米抗體或抗體片段(例如,Fab片段；F(ab’ )2片段；Fd片段；Fv片段；scFv ；dAb片段；或其他改 造的分子，諸如雙抗體、三抗體、四抗體、微體和最小識別單元)。本發(fā)明的抗Tie2抗體還與抗病毒劑、抗生素、鎮(zhèn)痛藥、糖皮質(zhì)激素和/或NSAID組合施用。本發(fā)明的抗Tie2抗體還可以作為治療方案的部分來施用，所述治療方案還包括輻射治療和/或常規(guī)化學(xué)療法。
[0094]額外的治療活性成分可以在施用本發(fā)明的抗Tie2抗體之前、同時或者之后不久進行施用(對于本公開的目的，認為此類施用方案為抗Tie2抗體與額外的治療活性成分的“組合”施用)。本發(fā)明包括這樣的藥物組合物，其中將本發(fā)明的抗Tie2抗體與如本文別處描述的一種或多種額外的治療活性成分共同配制。
[0095]抗體的診斷用途
[0096]本發(fā)明的抗Tie2抗體還可以例如為了診斷目的而用于檢測和/或測量樣品中的Tie2。例如，可以使用抗Tie2抗體或其片段來診斷表征為Tie2的異常表達(例如，過表達、過低表達、不表達等)的病癥或疾病。用于Tie2的示例性診斷測定可以包括例如使獲自患者的樣品接觸本發(fā)明的抗Tie2抗體，其中用可檢測標記或報道基因分子標記抗Tie2抗體。備選地，未標記的抗Tie2抗體可以與二級抗體(自身被可檢測地標記)組合用于診斷應(yīng)用中?？蓹z測標記或報道基因分子可以是放射性同位素，諸如3H、14C、32P、35S或125I ;熒光或化學(xué)發(fā)光部分諸如異硫氰酸熒光素或羅丹明；或者酶諸如堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶或螢光素酶。可以用于檢測或測量樣品中的Tie2的特定的示例性測定法包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測S(RIA)和熒光激活細胞分選術(shù)(FACS )。[0097]可以用于根據(jù)本發(fā)明的Tie2診斷測定中的樣品包括在正?；虿±項l件下可從患者中獲得的任何組織或液體樣品，其含有可檢測量的Tie2蛋白或其片段。一般地，將測量從健康患者(例如，未患有與異常Tie2水平或活性相關(guān)的疾病或病癥的患者)獲得的特定樣品中的Tie2水平，以開始確立Tie2的基線或標準水平。隨后，可以將Tie2的基線水平與從懷疑患有Tie2相關(guān)疾病或病癥的個體獲得的樣品中測量的Tie2水平相比較。
實施例
[0098]提出以下實施例，以向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供關(guān)于如何進行并使用本發(fā)明的方法和組合物的完整公開及描述，且并不意在限制發(fā)明人所認為的本發(fā)明的范圍。已經(jīng)進行了努力以確保所用數(shù)字(例如，量、溫度等)的準確性，但應(yīng)說明有一些試驗誤差和偏差。除非另有說明，否則份均為以重量計的份，分子量均為平均分子量，溫度均為攝氏度，并且壓力均為處于或接近大氣壓。
[0099]用于以下實施例中的對照構(gòu)建體
[0100]為了比較目的，將示例性對照構(gòu)建體(抗Tie2抗體)包括在下文描述的幾個實驗中。稱為對照I的抗體是具有小鼠重鏈和輕鏈可變域的嵌合抗Tie2抗體，其具有如美國專利6，376，653中所述的“12H8”的對應(yīng)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。該抗體的恒定域是人IgG4。
[0101]實施例1.針對人Tie2的人抗體的產(chǎn)生
[0102]根據(jù)標準方法 通過用人Tie2抗原免疫VELOCIMMUNE?小鼠來產(chǎn)生幾種人抗Tie2抗體(參見，例如美國專利號6，596，541)。使用該技術(shù)，獲得了幾種抗Tie2抗體；以該方式產(chǎn)生的示例性抗體及其對應(yīng)的生物學(xué)特征在以下實施例中詳細描述，并且所述示例性抗體包括命名為 H2aM2760N、H2aM2761N、H1M2055N、H1H2304B、H1H2317B、H1H2322B、H1H2324B、H1H2331B、H1H2332B、H1H2333S、H1H2337B、H1H2338B、H1H2339B、H1H2340B 和H4H2055N的抗體。本文所用的抗體命名中的HIM、H2M、HlH等前綴表明抗體的特定Fe區(qū)。例如，“H2M”抗體具有小鼠IgG2Fc，然而“H1H”抗體具有人IgGlFc。如同本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所將理解的，抗體的Fe區(qū)可以被修飾或用不同的Fe區(qū)替換，但可變域(包括CDR)將保持不變。
[0103]在2011年12月2日在按照布達佩斯條約的條款下將產(chǎn)生抗Tie2抗體H1M2055N和H2aM2760N的雜交瘤保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBlvd.，Manassas,Va.20110-2209，保藏號為 PTA-12295(H1M2055N)和PTA-12296(H2aM2760N)。
[0104]實施例2.表面等離振子共振衍生的人單克隆抗Tie2抗體的結(jié)合親和力和動力學(xué)常數(shù)
[0105]在25°C和37°C下通過表面等離振子共振測定人單克隆抗Tie2抗體的結(jié)合親和力和動力學(xué)常數(shù)(表1-4)。在Biacore2000或T200儀器上進行測量。
[0106]對于具有小鼠恒定區(qū)(命名為HlM或H2M)的抗體,將抗體固定于抗小鼠Fe傳感器表面上，并將不同濃度的人、小鼠或大鼠Tie2構(gòu)建體(hTie2-His、mTie2-hFc和rTie2_hFc)注射到捕獲有抗體的表面上。對于人IgG形式(命名為HlH或H4H)的抗體，根據(jù)應(yīng)用至捕獲有抗體的表面上的Tie2構(gòu)建體來使用抗人Fe感受器表面(hTie2-His和hTie2-mFc)或抗人Fab傳感器表面(mTie2-hFc和rTie2_hFc)。用于該實施例中的構(gòu)建體的氨基酸序列如下:hTie2-His(SEQ ID NO: 2) ; hTie2_hFc (SEQ ID NO: 3) ; hTie2_mFc (SEQ IDNO:4) ;rTie2-hFc(SEQ ID NO:5)以及 mTie2_hFc (SEQ ID NO: 6) ?
[0107]通過使用Scrubbed.0曲線擬合軟件將實時結(jié)合傳感圖擬合成具有質(zhì)量傳輸限制(mass transport limitation)的1:1結(jié)合模型來測定動力學(xué)速率常數(shù)一結(jié)合速率(ka)和解離速率(kd)。從動力學(xué)速率常數(shù)計算的平衡解離常數(shù)(Kd)和解離半壽期(T1/2)如下:KD(M)=kd/ka、T1/2 (分鐘)= (ln2/ (60*kd))。如表1_2中所示,幾種抗體證明了在兩種檢測溫度下對hTie2的高親和力結(jié)合。此外，H1M2055N、H1H2332B、H1H2337B、H1H2340B和H4H2055N顯示出對小鼠和大鼠Tie2的明顯結(jié)合(表3_4)。
[0108]表1:25°C下人mAb對hTie2的Biacore結(jié)合親和力
[0109]
【權(quán)利要求】
1.分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異地結(jié)合人Tie2并阻斷Tie2與Tie2配體之間的相互作用。
2.權(quán)利要求1的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述Tie2配體選自Angl、Ang2、Ang3 和 Ang4。
3.權(quán)利要求1的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段阻斷Tie2與Angl、Ang2、Ang3和Ang4中的全部四種之間的相互作用。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段特異地結(jié)合由人Tie2的Igl-1g2-EGF結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:7)組成的多肽或由人Tie2的Ig2-EGF結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:8)組成的多肽。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段與位于一個或多個氨基酸區(qū)段內(nèi)的一個或多個氨基酸相互作用，所述氨基酸區(qū)段選自SEQ IDN0:7 的氨基酸 96-106、SEQ ID NO: 7 的氨基酸 139-152 和 SEQ ID NO: 7 的氨基酸 166-175。
6.權(quán)利要求5的抗體或抗原結(jié)合片段，其中如由氫/氘交換所測定的，所述抗體或抗原結(jié)合片段與SEQ ID NO:7的氨基酸96-106、SEQ ID NO:7的氨基酸139-152以及SEQ IDNO:7的氨基酸166-175相互作用。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段特異地結(jié)合嚙齒動物Tie2和人Tie2。
8.權(quán)利要求7的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述嚙齒動物Tie2為小鼠Tie2或大鼠Tie2。
9.權(quán)利要求1-6中任一項的`分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段特異地結(jié)合人Tie2、小鼠Tie2和大鼠Tie2。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段產(chǎn)生于細胞系，所述細胞系以保藏號PTA-12295或PTA-12296保藏于美國典型培養(yǎng)物保減中心。
11.分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其與產(chǎn)生于以保藏號PTA-12295或PTA-12296保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的細胞系的抗體結(jié)合人Tie2上相同的表位。
12.分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其與產(chǎn)生于以保藏號PTA-12295或PTA-12296保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的細胞系的抗體競爭結(jié)合人Tie2。
13.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-12中任一項的抗體或抗原結(jié)合片段以及可藥用的載體或稀釋劑。
14.藥物組合物，其用于抑制患者中腫瘤的生長，所述藥物組合物包含特異地結(jié)合人Tie2并且阻斷Tie2與Tie2配體之間的相互作用的抗體或其抗原結(jié)合片段。
15.權(quán)利要求14的藥物組合物,其中所述Tie2配體選自Angl、Ang2、Ang3和Ang4。
16.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段阻斷Tie2與Angl、Ang2、Ang3和Ang4中全部四種之間的相互作用。
17.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段產(chǎn)生于細胞系，所述細胞系以保藏號PTA-12295或PTA-12296保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。
18.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與產(chǎn)生于以保藏號PTA-12295或PTA-12296保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的細胞系的抗體結(jié)合人Tie2上相同的表位。
19.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與產(chǎn)生于以保藏號PTA-12295或PTA-12296保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的細胞系的抗體競爭結(jié)合人Tie2。
20.用于抑制患者中腫瘤生長的方法，所述方法包括向所述患者施用藥物組合物，所述藥物組合物包含特異地結(jié)合人Tie2并且阻斷Tie2與Tie2配體之間的相互作用的抗體或其抗原結(jié)合片段。`
【文檔編號】A61P35/00GK103874709SQ201280040426
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月19日
【發(fā)明者】G·瑟斯頓 申請人:瑞澤恩制藥公司