抗-il-6受體抗體及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了抗IL-6R單克隆抗體及相關(guān)的組合物，其可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其他疾病的多種治療方法中的任何一種。
【專利說(shuō)明】抗-1L-6受體抗體及其使用方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年3月3日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1 / 449，005的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本申請(qǐng)。
[0003]關(guān)于序列表的聲明
[0004]與本申請(qǐng)附帶的序列表以文本格式替代紙質(zhì)副本，并通過(guò)引用并入說(shuō)明書。包含序列表的文本文件的名稱為APEX_012_01W0_ST25.txt。該文本文件于2012年2月28日創(chuàng)建，大小為53KB，通過(guò)EFS-WEB以電子形式提交。
[0005]背景
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0006]本發(fā)明主要涉及抗IL-6受體(IL-6R)抗體，及其組合物和使用方法。更特別地，本發(fā)明涉及抗IL-6R抗體及其制備方法和用途。這些抗體可用于，例如，治療多種炎性和癌癥疾病的方法。
[0007]相關(guān)技術(shù)的描述
[0008]白細(xì)胞介素-6(IL_6)是一種多功能細(xì)胞因子，其在宿主的防御機(jī)制中起著核心作用。Heinrich 等，Biochem.J.(1990) 26.5:621 ；Van Snick, J.Annu.Rev.Tmmunol.(1990)8:253 ;以及 Himno 等，Immunol.Today (1990) 11:443。然而，在多種人類炎癥、自身免疫、腫瘤疾病中，可觀察到IL-6產(chǎn)生異常，并且這已被認(rèn)為在這些疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。Hirano 等，同上；Sehgal, P.B.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(1990) 195: 183 ；Grau, G.E., Eur.Cytokine Net (1990) 1:203 ；Bauer 等，Ann.Hemato 1.(1991)62:203 ； Campbe 11等，J，Clin，Invest (1991) 7:739 ;和 Roodman 等，J.Clin.1nvest.(1992)89:46。因此，IL-6的生物活性抑制劑可能有助于研究IL-6在疾病中的作用，并可能具有廣泛的治療應(yīng)用。
[0009]IL-6是由T細(xì)胞，B細(xì)胞，單核細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，系膜細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。通過(guò)增強(qiáng)IL-2受體的表達(dá)和IL-2的產(chǎn)生，IL-6誘導(dǎo)T細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞分化。IL-6與IL-3協(xié)同作用，以支持造血作用中多向母細(xì)胞集落的形成，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，巨核細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化。在急性期反應(yīng)中，IL-6刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生急性期蛋白，如C-反應(yīng)蛋白(CRP)，纖維蛋白原，α 1-抗胰蛋白酶和血清淀粉樣蛋白A。體內(nèi)給藥時(shí)，IL-6也會(huì)引起白細(xì)胞增多和發(fā)熱，并可作為腎小球系膜細(xì)胞、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，以及，例如，漿細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤，和腎細(xì)胞癌中不同類型的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)因子。
[0010]膿毒癥也涉及IL-6 的過(guò)度產(chǎn)生(Starnes, Jr.，H.F.等，J.1mmunol.(1990) 145:4185)，并且在多發(fā)性骨髓瘤，或漿細(xì)胞白血病(Klein, B.Blood (1991) 78:1198)也涉及IL-6過(guò)度產(chǎn)生。其他疾病包括骨吸收(骨質(zhì)疏松癥)(Roodman，G.D.等，J.，Clin，Invest.(1992)89:46 Jilka, R.L 等，Science (1992) 257:88-91)、惡病質(zhì)(Strassman, G.等，J.Clin.1nvest.(1992)89:1681)、牛皮癬、全身型青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系膜增生性腎小球腎炎、腎細(xì)胞癌、卡波濟(jì)氏肉瘤、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Eur.J.1mmunol.18，1797-1801,1988 ；Arthritis Rheum.31,784-788, 1988 ；Ann.Rheum.Dis.52, 232-234，1993)、高 Y 球蛋白血癥(Grau，G.E.et al.,J.Exp.Meal.(1990) 172:1505)、卡斯特萊曼病(Castleman’s disease)、IgM丙種球蛋白病、心臟粘液瘤和自身免疫性胰島素依賴型糖尿病(Campbell, 1.L et al., J,Clin, Invest.，(1991)87:739)。大鼠抗小鼠 IL-6R抗體阻止DBA / IJ小鼠中膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)的發(fā)展，并且在猴CIA模型中，抗人IL-6抗體對(duì)預(yù)防和治療均有效。這些證據(jù)表明IL-6在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，并支持這些動(dòng)物模型可用于關(guān)節(jié)炎，以及抗IL-6或IL-6R治療效果的研究(Arthritis Rheum.41,2117-2121，1998 ;Clin Immunol.2001Mar ；98(3):319-26 ;Biol Pharm Bull.2008Jun ；31(6):1159-63)。
[0011]IL-6通過(guò)與IE細(xì)胞表面至少兩個(gè)特異性受體的相互作用而發(fā)揮作用。Taga等，J.Exp.Med.(1987) 166:967 ;和 Coulie 等，Eur.J.1mmunol, (1987) 17:1435。這兩種受體鏈的cDNA已被克隆，它們編碼兩個(gè)跨膜糖蛋白:80kDa的IL-6受體“IL-6R”和130kDa的糖蛋白 “gpl30，，。Yamasaki 等，Science (1988) 241:825 ;和 Hibi 等，Cell (1990)63:1149。IL-6通過(guò)獨(dú)特的機(jī)制與這些糖蛋白相互作用。首先，IL-6R與IL-6以低親和力(Kd值=約
InM)結(jié)合，并且不觸發(fā)信號(hào)。Taga等，Cell (1989) 58:573。隨后，IL-6 / IL-6R復(fù)合體與gpl30結(jié)合，這將傳導(dǎo)信號(hào)。Hibi等，同上；和Taga等，同上。在溶液中，gpl30本身與IL-6沒(méi)有親和力，但它能在膜上穩(wěn)定IL-6 / IL-6R復(fù)合體，從而產(chǎn)生高親和力的IL-6結(jié)合(Kd值=約IOpM)。Hibi等，同上。最近發(fā)現(xiàn)gpl30也是制瘤素M的低親和力受體，以及LIF受體的親和力轉(zhuǎn)換物(Gearing, D.P.等，Science (1992) 255:1434)。
[0012]中和IL-6活性的一種方法是利用特異性結(jié)合IL-6的抗體。根據(jù)對(duì)IL_6分子上兩個(gè)不同表位的識(shí)別，針對(duì)IL-6的中和單克隆抗體(Mab)可被分為兩組，所述不同表位被指定為位點(diǎn)I和位點(diǎn)II。位點(diǎn)I是構(gòu)象表位，其由IL-6分子的氨基末端和羧基末端組成:氨基末端部分包括氨基酸Ile3crAsp35 ;而羧基末端部分包括關(guān)鍵氨基酸Arg183-Met18515位點(diǎn)
II包括關(guān)鍵氨基酸 Ala154_Thr163。Brakenhoff 等(1990, J.1mmunol.145:561-568)。
[0013]中和IL-6的活性的另一種方法是通過(guò)結(jié)合并阻斷IL-6R，抑制配體-受體相互作用。本發(fā)明提供了如本申請(qǐng)中進(jìn)一步描述的所述及其它優(yōu)點(diǎn)。
[0014]發(fā)明概述
[0015]本申請(qǐng)一方面提供了一種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，包括(i)重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括與SEQ ID NO:3的氨基酸殘基相同的VHCDRl區(qū)、與SEQ ID NO:4的氨基酸殘基相同的VHCDR2區(qū)、和與SEQ ID NO:5的氨基酸殘基相同的VHCDR3區(qū)；以及(ii)輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括與SEQ ID NO:6的氨基酸殘基相同的VLCDRl區(qū)、與SEQ ID NO:7的氨基酸殘基相同的VLCDR2區(qū)、和與SEQ ID NO:8的氨基酸殘基相同的VLCDR3區(qū)；或者所述抗體的變體，或其抗原結(jié)合片段，其包括與(i)和(ii)所述重鏈和輕鏈可變區(qū)相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)，但是在所述CDR區(qū)有至多8個(gè)氨基酸替換。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在本申請(qǐng)?jiān)摲矫娴牧硪粋€(gè)實(shí)施方式中，所述輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0016]本申請(qǐng)另一方面提供了一種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，包括重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體包括輕鏈可變區(qū)，其包括與SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體包括輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0017]本申請(qǐng)的另一個(gè)方面提供了一種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，包括輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在該方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體包括重鏈可變區(qū)，其包括與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
[0018]本申請(qǐng)的另一個(gè)方面提供了一種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，包括(i)重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括與SEQ ID NO:13的氨基酸殘基相同的VHCDRl區(qū)、與SEQ ID NO:14的氨基酸殘基相同的VHCDR2區(qū)、和與SEQ ID NO:15的氨基酸殘基相同的VHCDR3區(qū)；以及(ii)輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括與SEQ ID NO:16的氨基酸殘基相同的VLCDRl區(qū)、與SEQ ID NO: 17的氨基酸殘基相同的VLCDR2區(qū)、和與SEQ IDNO:18的氨基酸殘基相同的VLCDR3區(qū)；或者所述抗體的變體，或其抗原結(jié)合片段，其包括與
(i)和(ii)所述重鏈和輕鏈可變區(qū)相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)，但是在所述CDR區(qū)有至多8個(gè)氨基酸替換。在本申請(qǐng)?jiān)摲矫娴囊粋€(gè)實(shí)施方式中，所述重鏈可變區(qū)包括SEQ ID N0:11所示的氨基酸序列。在本申請(qǐng)這方面的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
[0019]本申請(qǐng)的另一個(gè)方面提供了一種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，包括重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體包括輕鏈可變區(qū)，其包括與SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體包括輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID N0:12所示的氨基酸序列。
[0020]本申請(qǐng)的另一個(gè)方面 提供了一種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，包括輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段包括重鏈可變區(qū)，其包括與SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
[0021]在本申請(qǐng)的另一個(gè)方面，本申請(qǐng)所述分離的抗體是人源化的。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述人源化的抗體包括VH區(qū)，其包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，以及VL區(qū)，其包括如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述的人源化的抗體包括VH區(qū)，其包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，以及VL區(qū)，其包括如SEQID NO:20所示的氨基酸序列。
[0022]在本申請(qǐng)的某些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述的分離的抗體選自單鏈抗體，ScFv，缺乏鉸鏈區(qū)的單價(jià)抗體，和微抗體(minibody)。在某些實(shí)施方式中，所述抗體是Fab,Fab’片段，F(xiàn)(ab’)2片段或完整的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述抗體包括人IgG恒定結(jié)構(gòu)域，并且在某些特定的實(shí)施方式中，所述IgG恒定結(jié)構(gòu)域包括IgGlCHl結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述IgG恒定結(jié)構(gòu)域包括IgGlFc區(qū)。
[0023]本申請(qǐng)的另一方面提供了分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與本申請(qǐng)所述抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人IL-6R。
[0024]本申請(qǐng)的一個(gè)方面提供了分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與IL-6R結(jié)合，結(jié)合的KD值為1.3nM或更低。
[0025]本申請(qǐng)的另一方面提供了分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與IL-6R結(jié)合，結(jié)合的Kd值為0.5nM或更低。
[0026]在本申請(qǐng)所述的分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段阻斷IL-6與IL-6R結(jié)合，抑制IL-6R信號(hào)，抑制IL6或IL-6R介導(dǎo)的一種或多種生物學(xué)功能或抑制STAT3磷酸化，或前述一項(xiàng)或多項(xiàng)的組合。在本申請(qǐng)所述任意抗體的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述IL6或IL-6R介導(dǎo)的一種或多種生物學(xué)功能包括，但不限于，IL-6誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、IL-6誘導(dǎo)細(xì)胞分化，以及IL-6誘導(dǎo)產(chǎn)生CRP、纖維蛋白原或血清淀粉樣蛋白A。
[0027]本申請(qǐng)的另一個(gè)方面提供了一種分離的多核苷酸，其編碼如本申請(qǐng)所述的分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段。
[0028]本申請(qǐng)的另一個(gè)方面提供了一種組合物，其包含生理學(xué)上可接受的載體，和治療有效量的如本申請(qǐng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0029]本申請(qǐng)的另一個(gè)方面提供了治療炎性疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括向患有所述炎性疾病的患者給予如本申請(qǐng)所述的組合物，從而治療患有所述炎性疾病的所述患者，所述組合物包含生理學(xué)上可接受的載體，和治療有效量的如本申請(qǐng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述炎性疾病是青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎。
[0030]本申請(qǐng)的另一個(gè)方面提供了治療卡斯特萊曼病(Castleman’s disease)的方法，所述方法包括向患有卡斯特萊曼病的患者給予組合物，從而治療所述卡斯特萊曼病，所述組合物包含生理學(xué)上可接受的載體，和治療有效量的如本申請(qǐng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0031]本申請(qǐng)的另一個(gè)方面 提供了治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的方法，所述方法包括向患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者給予組合物，從而治療所述系統(tǒng)性紅斑狼瘡，所述組合物包含生理學(xué)上可接受的載體，和治療有效量的如本申請(qǐng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0032]本申請(qǐng)的另一個(gè)方面提供了治療與IL-6表達(dá)異常相關(guān)的癌癥的方法，所述方法包括向患有此種癌癥的患者給予組合物，從而治療所述與IL-6表達(dá)異常相關(guān)的癌癥，所述組合物包含生理學(xué)上可接受的載體，和治療有效量的如本申請(qǐng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。
[0033]本申請(qǐng)的另一個(gè)方面提供了治療與癌癥相關(guān)的疲勞或惡病質(zhì)的方法，所述方法包括向患有與癌癥相關(guān)的疲勞或惡病質(zhì)的患者給予組合物，從而治療與癌癥相關(guān)的疲勞或惡病質(zhì)，所述組合物包含生理學(xué)上可接受的載體，和治療有效量的如本申請(qǐng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0034]附圖若干視圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0035]圖1A-圖1D:人源化的前導(dǎo)抗IL-6R候選抗體保留了其家兔相應(yīng)部分的大多數(shù)活性。A部分:抗IL-6R抗體的直接ELISA ；B部分:FACS檢測(cè)到抗IL-6R抗體與人骨髓瘤細(xì)胞U266B1上的IL-6R結(jié)合；C部分:抗IL-6R抗體阻斷IL-6與IL-6R結(jié)合的能力；D部分:人源化抗IL-6R抗體抑制IL-6介導(dǎo)的TF-1細(xì)胞增殖。
[0036]圖2A和圖2B顯示10個(gè)抗-1L6R家兔抗體VH(2A)和VL(2B)區(qū)的氨基酸比對(duì)，所述抗體的鑒定如實(shí)施例1中所述，并總結(jié)在表1中。VH和VL區(qū)的氨基酸序列分別如SEQ IDNO:25-34和35-44所示。下劃線顯示的是CDR。所有克隆的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:45-74所示。所有克隆的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的氨基酸序列如 SEQ ID NO:75-104 所示。[0037]序列簡(jiǎn)述
[0038]SEQ ID NO:1是克隆36家兔抗IL-6R抗體VH區(qū)的氨基酸序列。
[0039]SEQ ID NO:2是克隆36家兔抗IL-6R抗體VL區(qū)的氨基酸序列。
[0040]SEQ ID NO:3是克隆36家兔抗IL-6R抗體VHCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0041]SEQ ID NO:4是克隆36家兔抗IL-6R抗體VHCDR2區(qū)的氨基酸序列域。
[0042]SEQ ID NO:5是克隆36家兔抗IL-6R抗體VHCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0043]SEQ ID NO:6是克隆36家兔抗IL-6R抗體VLCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0044]SEQ ID NO:7是克隆36家兔抗IL-6R抗體VLCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0045]SEQ ID NO:8是克隆36家兔抗IL-6R抗體VLCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0046]SEQ ID NO:9是克隆36家兔抗IL-6R抗體VH區(qū)人源化序列的氨基酸序列。
[0047]SEQ ID NO:10是克隆36家兔抗IL-6R抗體VL區(qū)人源化序列的氨基酸序列。
[0048]SEQ ID NO:11是克隆51家兔抗IL-6R抗體VH區(qū)的氨基酸序列。
[0049]SEQ ID NO:12是克隆51家兔抗IL-6R抗體VL區(qū)的氨基酸序列。
[0050]SEQ ID NO:13是克隆51家兔抗IL-6R抗體VHCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0051]SEQ ID NO:14是克隆51家兔抗IL-6R抗體VHCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0052]SEQ ID NO:15是克隆51家兔抗IL-6R抗體VHCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0053]SEQ ID NO:16是克隆51家兔抗IL-6R抗體VLCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0054]SEQ ID NO:17是克隆51家兔抗IL-6R抗體VLCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0055]SEQ ID NO:18是克隆51家兔抗IL-6R抗體VLCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0056]SEQ ID NO:19是克隆51家兔抗IL-6R抗體VH區(qū)的人源化序列的氨基酸序列。
[0057]SEQ ID NO:20是克隆51家兔抗IL-6R抗體VL區(qū)的人源化序列的氨基酸序列。
[0058]SEQ ID NO:21:是包括CH1，鉸鏈，CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的人IgGl恒定區(qū)的氨基酸序列。
[0059]SEQ ID NO:22:編碼如SEQ ID NO:21所示人IgGl恒定區(qū)的氨基酸序列的多核苷
酸序列。
[0060]SEQ ID NO:23:是人Ck恒定區(qū)的氨基酸序列。
[0061]SEQ ID NO:24:是編碼如SEQ ID NO:23所示的人Ck恒定區(qū)的氨基酸序列的多核苷酸序列。
[0062]SEQ ID NO:25是如圖2所示克隆5家兔抗IL-6R抗體的VH區(qū)的氨基酸序列。
[0063]SEQ ID NO:26是如圖2所示克隆21家兔抗IL-6R抗體的VH區(qū)的氨基酸序列。
[0064]SEQ ID NO:27是如圖2所示克隆23家兔抗IL-6R抗體的VH區(qū)的氨基酸序列。
[0065]SEQ ID NO:28是如圖2所示克隆36家兔抗IL-6R抗體的VH區(qū)的氨基酸序列。
[0066]SEQ ID NO:29是如圖2所示克隆37家兔抗IL-6R抗體的VH區(qū)的氨基酸序列。
[0067]SEQ ID NO:30是如圖2所示克隆40家兔抗IL-6R抗體的VH區(qū)的氨基酸序列。
[0068]SEQ ID NO:31是如圖2所示克隆42家兔抗IL-6R抗體的VH區(qū)的氨基酸序列。
[0069]SEQ ID NO:32是如圖2所示克隆51家兔抗IL-6R抗體的VH區(qū)的氨基酸序列。
[0070]SEQ ID NO:33是如圖2所示克隆R5家兔抗IL-6R抗體的VH區(qū)的氨基酸序列。
[0071]SEQ ID NO:34是如圖2所示克隆R15家兔抗IL-6R抗體的VH區(qū)的氨基酸序列。[0072]SEQ ID NO:35是如圖2所示克隆5家兔抗IL-6R抗體的VL區(qū)的氨基酸序列。
[0073]SEQ ID NO:36是如圖2所示克隆21家兔抗IL-6R抗體的VL區(qū)的氨基酸序列。
[0074]SEQ ID NO:37是如圖2所示克隆23家兔抗IL-6R抗體的VL區(qū)的氨基酸序列。
[0075]SEQ ID NO:38是如圖2所示克隆36家兔抗IL-6R抗體的VL區(qū)的氨基酸序列。
[0076]SEQ ID NO:39是如圖2所示克隆37家兔抗IL-6R抗體的VL區(qū)的氨基酸序列。
[0077]SEQ ID NO:40是如圖2所示克隆40家兔抗IL-6R抗體的VL區(qū)的氨基酸序列。
[0078]SEQ ID NO:41是如圖2所示克隆42家兔抗IL-6R抗體的VL區(qū)的氨基酸序列。
[0079]SEQ ID NO:42是如圖2所示克隆51家兔抗IL-6R抗體的VL區(qū)的氨基酸序列。
[0080]SEQ ID NO:43是如圖2所示克隆R5家兔抗IL-6R抗體的VL區(qū)的氨基酸序列。
[0081]SEQ ID NO:44是如圖2所示克隆R15家兔抗IL-6R抗體的VL區(qū)的氨基酸序列。
[0082]SEQ ID NO:45是如圖2所示克隆5家兔抗IL-6R抗體的VHCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0083]SEQ ID NO:46是如圖2所示克隆21家兔抗IL-6R抗體的VHCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0084]SEQ ID NO:47是如圖2所示克隆23家兔抗IL-6R抗體的VHCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0085]SEQ ID NO:48是如圖 2所示克隆36家兔抗IL-6R抗體的VHCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0086]SEQ ID NO:49是如圖2所示克隆37家兔抗IL-6R抗體的VHCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0087]SEQ ID NO:50是如圖2所示克隆40家兔抗IL-6R抗體的VHCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0088]SEQ ID NO:51是如圖2所示克隆42家兔抗IL-6R抗體的VHCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0089]SEQ ID NO:52是如圖2所示克隆51家兔抗IL-6R抗體的VHCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0090]SEQ ID NO:53是如圖2所示克隆R5家兔抗IL-6R抗體的VHCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0091]SEQ ID NO:54是如圖2所示克隆R15家兔抗IL-6R抗體的VHCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0092]SEQ ID NO:55是如圖2所示克隆5家兔抗IL-6R抗體的VHCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0093]SEQ ID NO:56是如圖2所示克隆21家兔抗IL-6R抗體的VHCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0094]SEQ ID NO:57是如圖2所示克隆23家兔抗IL-6R抗體的VHCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0095]SEQ ID NO:58是如圖2所示克隆36家兔抗IL-6R抗體的VHCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0096]SEQ ID NO:59是如圖2所示克隆37家兔抗IL-6R抗體的VHCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0097]SEQ ID NO:60是如圖2所示克隆40家兔抗IL-6R抗體的VHCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0098]SEQ ID NO:61是如圖2所示克隆42家兔抗IL-6R抗體的VHCDR2區(qū)的氨基酸序列。[0099]SEQ ID NO:62是如圖2所示克隆51家兔抗IL-6R抗體的VHCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0100]SEQ ID NO:63是如圖2所示克隆R5家兔抗IL-6R抗體的VHCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0101]SEQ ID NO:64是如圖2所示克隆R15家兔抗IL-6R抗體的VHCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0102]SEQ ID N0:65是如圖2所示克隆5家兔抗IL-6R抗體的VHCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0103]SEQ ID NO:66是如圖2所示克隆21家兔抗IL-6R抗體的VHCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0104]SEQ ID NO:67是如圖2所示克隆23家兔抗IL-6R抗體的VHCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0105]SEQ ID NO:68是如圖2所示克隆36家兔抗IL-6R抗體的VHCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0106]SEQ ID NO:69是如圖2所示克隆37家兔抗IL-6R抗體的VHCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0107]SEQ ID NO:70是如圖2所示克隆40家兔抗IL-6R抗體的VHCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0108]SEQ ID NO:71是如圖2所示克隆42家兔抗IL-6R抗體的VHCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0109]SEQ ID NO:72是如圖2所示克隆51家兔抗IL-6R抗體的VHCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0110]SEQ ID NO:73是如圖2所示克隆R5家兔抗IL-6R抗體的VHCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0111]SEQ ID NO:74是如圖2所示克隆R15家兔抗IL-6R抗體的VHCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0112]SEQ ID NO:75是如圖2所示克隆5家兔抗IL-6R抗體的VLCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0113]SEQ ID NO:76是如圖2所示克隆21家兔抗IL-6R抗體的VLCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0114]SEQ ID NO:77是如圖2所示克隆23家兔抗IL-6R抗體的VLCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0115]SEQ ID NO:78是如圖2所示克隆36家兔抗IL-6R抗體的VLCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0116]SEQ ID NO:79是如圖2所示克隆37家兔抗IL-6R抗體的VLCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0117]SEQ ID NO:80是如圖2所示克隆40家兔抗IL-6R抗體的VLCDRl區(qū)的氨基酸序列。[0118]SEQ ID NO:81是如圖2所示克隆42家兔抗IL-6R抗體的VLCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0119]SEQ ID NO:82是如圖2所示克隆51家兔抗IL-6R抗體的VLCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0120]SEQ ID NO:83是如圖2所示克隆R5家兔抗IL-6R抗體的VLCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0121]SEQ ID NO:84是如圖2所示克隆R15家兔抗IL-6R抗體的VLCDRl區(qū)的氨基酸序列。
[0122]SEQ ID NO:85是如圖2所示克隆5家兔抗IL-6R抗體的VLCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0123]SEQ ID NO:86是如圖2所示克隆21家兔抗IL-6R抗體的VLCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0124]SEQ ID NO:87是如圖2所示克隆23家兔抗IL-6R抗體的VLCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0125]SEQ ID NO:88是如圖2所示克隆36家兔抗IL-6R抗體的VLCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0126]SEQ ID NO:89是如圖2所示克隆37家兔抗IL-6R抗體的VLCDR2區(qū)的氨基酸序列。`
[0127]SEQ ID NO:90是如圖2所示克隆40家兔抗IL-6R抗體的VLCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0128]SEQ ID NO:91是如圖2所示克隆42家兔抗IL-6R抗體的VLCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0129]SEQ ID NO:92是如圖2所示克隆51家兔抗IL-6R抗體的VLCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0130]SEQ ID NO:93是如圖2所示克隆R5家兔抗IL-6R抗體的VLCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0131]SEQ ID NO:94是如圖2所示克隆R15家兔抗IL-6R抗體的VLCDR2區(qū)的氨基酸序列。
[0132]SEQ ID NO:95是如圖2所示克隆5家兔抗IL-6R抗體的VIXDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0133]SEQ ID NO:96是如圖2所示克隆21家兔抗IL-6R抗體的VLCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0134]SEQ ID NO:97是如圖2所示克隆23家兔抗IL-6R抗體的VLCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0135]SEQ ID NO:98是如圖2所示克隆36家兔抗IL-6R抗體的VLCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0136]SEQ ID NO:99是如圖2所示克隆37家兔抗IL-6R抗體的VLCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0137]SEQ ID NO:100是如圖2所示克隆40家兔抗IL-6R抗體的VLCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0138]SEQ ID NO:101是如圖2所示克隆42家兔抗IL-6R抗體的VLCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0139]SEQ ID NO:102是如圖2所示克隆51家兔抗IL-6R抗體的VLCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0140]SEQ ID NO:103是如圖2所示克隆R5家兔抗IL-6R抗體的VLCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0141]SEQ ID NO:104是如圖2所示克隆R15家兔抗IL-6R抗體的VLCDR3區(qū)的氨基酸序列。
[0142]發(fā)明詳述
[0143]本申請(qǐng)涉及與IL-6R特異性結(jié)合的抗體及其抗原結(jié)合片段，特別是具有特異性表位專屬性和功能性質(zhì)的抗體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括特異性人源化抗體及其片段，其能夠與IL-6R結(jié)合，阻斷IL-6R與IL-6結(jié)合，并抑制IL-6誘導(dǎo)的下游細(xì)胞信號(hào)和生物學(xué)效應(yīng)。在本發(fā)明更特定的實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述的抗體以約199皮摩爾的親和力與IL-6R特異性結(jié)合，并阻斷IL-6R與IL-6結(jié)合。
[0144]本發(fā)明的實(shí)施方式涉及抗IL-6R抗體或其抗原結(jié)合片段在診斷、評(píng)估和治療與IL-6或其異常表達(dá)相關(guān)的疾病和病癥中的用途。所述抗體用于治療或預(yù)防類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、卡斯特萊曼病、和漿細(xì)胞瘤/多發(fā)性骨髓瘤以及其他疾病。
[0145]除了有明確的相反說(shuō)明以外，本發(fā)明的方法涉及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)病毒學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、和分子生物學(xué)方法以及DNA重組技術(shù)，出于說(shuō)明目的，在下文中對(duì)其中的多數(shù)進(jìn)行描述。在文獻(xiàn)中對(duì)此類技術(shù)進(jìn)行了詳細(xì)的解釋。參見，例如，Current Protocols in Mol ecular Biology or Current Protocols in Immunology,John ffiley&Sons, New Yor k, N.Y.(2009) ；Ausubel et al., Short Protocols inMolecular Biology,3rded., ffiley&Sons,1995 ；Sambrook and Russell, MolecularCloning:ALaboratory Manual (第 3 版，2001) ；Maniatis et al., Molecular Cloning:ALaboratory Manual(1982) ；DNA Cloning:A Practical Approach, vol.1&II (D.Glover,ed.) ；01igonucleotide Synthesis(N.Gait, ed., 1984) ；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins, eds.,1985) !Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984) ；Animal Cell Culture(R.Freshney, ed.,1986) ；Perbal, A Practical Guideto Molecular Cloning(1984)和其他類似文獻(xiàn)。
[0146]如本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求中所使用的，除了另有明示以外，單數(shù)形式的“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)形式。
[0147]在本說(shuō)明書中，除了另有要求以外，可以理解詞語(yǔ)“包含”，或其變體如“包括”或“含有”是指包括所述的元素或整數(shù)，或者元素或整數(shù)的組，但不排除任意其他的元素或整數(shù),或者元素或整數(shù)的組。
[0148]除了另有明示以外，本說(shuō)明書的各實(shí)施方式在細(xì)節(jié)上做必要的修改可適用于其他各實(shí)施方式。
[0149]可以將標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于DNA重組、寡核苷酸合成、以及組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如，電穿孔，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)?？梢愿鶕?jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書、或根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法、或根據(jù)本申請(qǐng)中的描述進(jìn)行酶反應(yīng)和純化技術(shù)。通常，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法和根據(jù)本說(shuō)明書中引用和討論的多種一般和更特定的文獻(xiàn)中的描述執(zhí)行這些以及相關(guān)的技術(shù)和程序。除了有特別的定義以外，本申請(qǐng)所描述的術(shù)語(yǔ)以及實(shí)驗(yàn)程序和分子生物學(xué)、分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)、以及醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)技術(shù)均是本領(lǐng)域公知和常用的那些。可以將標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組技術(shù)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、化學(xué)分析、藥物制備、制劑、和遞送，以及患者治療。
[0150]本發(fā)明的實(shí)施方式涉及與IL-6受體(IL-6R)結(jié)合的抗體。特別地，本申請(qǐng)所述的抗體以意想不到的高親和性與IL-6R特異性結(jié)合，阻斷IL-6與IL-6R結(jié)合，阻斷IL-6活性并具有用于治療與IL-6異常表達(dá)相關(guān)疾病的治療用途。本申請(qǐng)所述的抗體還具有有益性質(zhì)，如具有抑制多種IL-6介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)(例如，STAT3磷酸化和下游信號(hào)活動(dòng)，Ras-Raf細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，IL-6誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，IL-6誘導(dǎo)的細(xì)胞分化，IL-6誘導(dǎo)產(chǎn)生CRP，纖維蛋白原，血清淀粉樣蛋白A，及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他IL-6介導(dǎo)的效應(yīng))的能力。本申請(qǐng)所述的抗體還具有影響IL-6R受體內(nèi)化的作用。
[0151]示例性抗體，或其抗原結(jié)合片段或其互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的序列如SEQ ID NO: 1-20和25-104所示。
[0152]如本領(lǐng)域公知的，抗體是一種免疫球蛋白分子，其能夠通過(guò)位于免疫球蛋白分子可變區(qū)的至少一個(gè)表位識(shí)別位點(diǎn)與靶點(diǎn)如碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等特異性結(jié)合。如本申請(qǐng)所使用的，該術(shù)語(yǔ)不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，還包括其片段(如dAb> Fab> Fab;、F(ab' )2、Fv)、單鏈(ScFv)、其合成變體、天然產(chǎn)生的變體、包括與特異性所需的抗原結(jié)合片段結(jié)合抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、以及包括抗原結(jié)合位點(diǎn)和特異性所需片段(表位識(shí)別位點(diǎn))的免疫球蛋白分子的任意其他修飾構(gòu)型。“雙體”，通過(guò)基因融合構(gòu)建的多價(jià)或多特異性片段(W094 / 13804 ；P.Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA906444-6448，1993)也是本申請(qǐng)中抗體的特殊形式。包含連接至CH3結(jié)構(gòu)域的scFv的微抗體也包括在本申請(qǐng)中(S.Hu等，Cancer Res.，56，3055-3061，1996)。參見，例如Ward,E.S.etal.,Nature341, 544-546 (1989) ；Bird etal.，Science, 242,423-426，1988 ；Huston etal.,PNAS USA,85, 5879-5883，1988 ；PCT / US92 / 09965 ；W094 / 13804 ；P.Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA906444-6448, 1993 ；Y.Reiter etal.,NatureBiotech,14，1239-1245，1996 ;S.Hu et al., Cancer Res.，56，3055-3061，1996。
[0153]如本申請(qǐng)所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合片段”指多肽片段，其含有免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈的至少一個(gè)CDR，所述免疫球蛋白與感興趣的抗原特別是IL-6受體結(jié)合。在這一點(diǎn)上，本申請(qǐng)所述抗體的抗原結(jié)合片段可以含有本申請(qǐng)所示與IL-6R結(jié)合抗體的VH和VL序列的1、2、3、4、5、或全部6個(gè)CDR。本申請(qǐng)所述的IL-6R-特異性抗體的抗原結(jié)合片段能夠與IL-6R結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，抗原結(jié)合片段或包含抗原結(jié)合片段的抗體阻止或抑制IL-6與IL-6R結(jié)合以及隨后的信號(hào)活動(dòng)。在一些實(shí)施方式中，抗原結(jié)合片段與人IL-6R特異性結(jié)合，和/或抑制或調(diào)節(jié)人IL-6R的生物學(xué)活性。
[0154]術(shù)語(yǔ)“抗原”指能夠與選擇性結(jié)合劑(如抗體)結(jié)合的分子或分子的一部分，并且還能夠?qū)⑵溆糜趧?dòng)物來(lái)生產(chǎn)能夠與該抗原表位結(jié)合的抗體?？乖梢跃哂幸粋€(gè)或多個(gè)表位。
[0155]術(shù)語(yǔ)“表位”包括任意決定簇，優(yōu)選多肽決定簇，其能夠與免疫球蛋白或T-細(xì)胞受體特異性結(jié)合。表位是與抗體結(jié)合的抗原區(qū)域。在一些實(shí)施方式中，表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面簇，如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?，以及可能在一些實(shí)施方式中具有特定的三維結(jié)構(gòu)特性，和/或特定的電荷特性。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)抗體在蛋白和/或大分子的復(fù)雜混合物中優(yōu)選識(shí)別其靶抗原時(shí)，將抗體稱為與抗原特異性結(jié)合。當(dāng)平衡解離常數(shù)< 10_7或10_8M時(shí)，將抗體稱為與抗原特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，平衡解離常數(shù)可以是≤10-9Μ或≤10-10Μ。
[0156]在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述的抗體及其抗原結(jié)合片段包括重鏈和輕鏈⑶R集合，其分別嵌入重鏈和輕鏈框架區(qū)(FR)集合之間，框架區(qū)對(duì)CDR提供支持并決定CDR彼此之間的空間關(guān)系。如本申請(qǐng)所使用的，術(shù)語(yǔ)“CDR集合”指重鏈或輕鏈V區(qū)的三個(gè)高變區(qū)。從重鏈或輕鏈的N-末端開始，將這些區(qū)域分別表示為“⑶R1”、“⑶R2”、和“⑶R3”。因此，抗原結(jié)合位點(diǎn)包括六個(gè)CDR，其包含位于各重鏈和輕鏈V區(qū)的CDR。在本申請(qǐng)中將包含單一⑶R(例如，⑶R1、⑶R2或⑶R3)的多肽稱為“分子識(shí)別單位”。對(duì)若干抗原-抗體復(fù)合物的結(jié)晶學(xué)分析證明，CDR的氨基酸殘基與結(jié)合的抗原廣泛接觸，其中最廣泛的抗原接觸是與重鏈CDR3的接觸。因此，分子識(shí)別單位主要負(fù)責(zé)抗原結(jié)合位點(diǎn)的特異性。
[0157]如本申請(qǐng)所使用的，術(shù)語(yǔ)“FR集合”指四個(gè)翼側(cè)氨基酸序列，其構(gòu)成重鏈或輕鏈V區(qū)的CDR集合中CDR的框架。某些FR殘基可以與結(jié)合的抗原接觸；但是，F(xiàn)R主要負(fù)責(zé)將V區(qū)折疊成抗原結(jié)合位點(diǎn)，特別是那些與CDR直接相鄰的FR殘基。在FR內(nèi)，一些氨基殘基和一些結(jié)構(gòu)特征是高度保守的。在這一點(diǎn)上，所有V區(qū)序列均含有約90個(gè)氨基酸殘基的內(nèi)部二硫鍵環(huán)。當(dāng)V區(qū)折疊成結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，CDR展示出為突出的環(huán)基序，其形成抗原結(jié)合表面。普遍認(rèn)為，F(xiàn)R的保守結(jié)構(gòu)區(qū)將CDR環(huán)的折疊形狀引導(dǎo)成某些“規(guī)范”的結(jié)構(gòu)——不管CDR具有何種精確的氨基酸序列。而且，已知一些FR殘基參與非共價(jià)的結(jié)構(gòu)域內(nèi)接觸，從而穩(wěn)定抗體重鏈和輕鏈的相互作用。
[0158]可以通過(guò)參考Kabat, E.A.et al., Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest.4th Edition.US Department ofHealth and Human Services.1987 以及即時(shí)從網(wǎng)上(immun0.bme.nwu.edu)獲得的更新版本確定免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位置。
[0159]“單克隆抗體”指同質(zhì)性的抗體群，其中單克隆抗體包括與表位選擇性結(jié)合有關(guān)的氨基酸(天然存在的或非天然存在的)。單克隆抗體具有較高的特異性，其直接針對(duì)單一表位。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”不僅包括完整的單克隆抗體和全長(zhǎng)單克隆抗體，還包括其片段(如Fab> Fab;、F(ab' )2、Fv)、單鏈(ScFv)、其變體、包括抗原結(jié)合部分的融合蛋白、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆抗體、以及包括具有所需特異性和與表位結(jié)合能力的抗原結(jié)合片段(表位識(shí)別位點(diǎn))的免疫球蛋白分子的任意其他修飾構(gòu)型。本申請(qǐng)并非旨在對(duì)抗體的來(lái)源或其制備方法(例如，雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等等)進(jìn)行限定。本術(shù)語(yǔ)包括上文在“抗體”的定義下所述的完整免疫球蛋白及其片段等。
[0160]木瓜蛋白酶優(yōu)選地裂解IgG分子以產(chǎn)生若干片段，其中(F(ab)片段)的兩個(gè)均包含含有完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)的共價(jià)異源二聚體。胃蛋白酶能夠裂解IgG分子，以提供若干片段，其包括包含兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的F(ab' )2片段。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，可以優(yōu)選通過(guò)蛋白裂解IgM，以及在少數(shù)情況下通過(guò)裂解IgG或IgA免疫球蛋白分子生產(chǎn)供使用的Fv片段。但是，更通常地使用本領(lǐng)域公知的重組技術(shù)制備Fv片段。Fv片段包括非共價(jià)的Vh:異源二聚體，其包含抗原識(shí)別位點(diǎn)，這些抗原識(shí)別位點(diǎn)保留了天然抗體分子的大部分抗原識(shí)別和結(jié)合能力。Inbar et al.，(1972)Proc.Nat.Acad.Sc1.USA69 =2659-2662 ；Hochman et al.，(1976)Biocheml5:2706-2710 ;和 Ehrlich et al.，(1980)Biocheml9:4091-4096。[0161]在一些實(shí)施方式中，涉及單鏈Fv或scFV抗體。例如，K體(111 et al.,Prot.Eng.10:949-57(1997));微抗體(Martin etal.，EMBO J13:5305-9(1994))；雙體(Holliger et al., PNAS90:6444-8(1993));或 Janusin 抗體(Traunecker et al.,EMB0J10:3655-59(1991)和 Traunecker et al., Int.J.CancerSuppl.7:51-52(1992)),其可以在本申請(qǐng)關(guān)于選擇具有所需特異性的抗體的教導(dǎo)下采用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備。在又一個(gè)實(shí)施方式中，可以制備包括本申請(qǐng)所述配體的雙特異性或嵌合抗體。例如，嵌合抗體可以包括來(lái)自不同抗體的⑶R和框架區(qū)，而雙特異性抗體可以通過(guò)一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與IL-6R特異性結(jié)合，并通過(guò)另一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與第二個(gè)分子結(jié)合?？梢酝ㄟ^(guò)重組分子生物學(xué)技術(shù)制備這些抗體，或者可以將這些抗體物理偶聯(lián)在一起。
[0162]單鏈Fv(sFv)多肽是共價(jià)連接的Vh:異源二聚體，其由融合基因表達(dá)，融合基因包括Vh-和Vf編碼基因，通過(guò)編碼肽的連接子連接。Huston et al.，(1988)Proc.Nat.AcadSc1.USA85(16):5879_5883。已有多種方法描述了化學(xué)結(jié)構(gòu)的識(shí)別方法，用于從抗體V區(qū)將天然聚集的(但化學(xué)分離的)輕鏈和重鏈多肽鏈轉(zhuǎn)化成sFV分子，使其折疊成基本上與抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)類似的三維結(jié)構(gòu)。參見，例如美國(guó)專利號(hào)5，091，513和5，132，405，Huston et al.;和美國(guó)專利號(hào) 4，946，778, Ladner et al.。
[0163]在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述的IL-6R結(jié)合抗體是雙體形式。雙體是多肽的多聚體，各多肽均包括包含免疫球蛋白輕鏈結(jié)合區(qū)的第一結(jié)構(gòu)域和包含免疫球蛋白重鏈結(jié)合區(qū)的第二結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是連接的(例如，通過(guò)肽接頭)，但彼此間不能結(jié)合以形成抗原結(jié)合位點(diǎn):通過(guò)使多聚體內(nèi)的一個(gè)多肽的第一結(jié)構(gòu)域與多聚體內(nèi)的另一個(gè)多肽的第二結(jié)構(gòu)域相結(jié)合以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)(W094 / 13804)。
[0164]抗體的dAb 片段由 VH 結(jié)構(gòu)域組成(Ward, E.S.et al., Nature341,544-546(1989))。
[0165]當(dāng)使用雙特異性抗體時(shí)，可以是常規(guī)的雙特異性抗體，其能夠通過(guò)多種方法制備(Holliger, P.and Winter G.Current Opinion Biotechnol.4,446-449 (1993)),例如，化學(xué)制備或來(lái)自雜交瘤，或可以是上文提及的任意雙特異性抗體片段。雙體和scFv的構(gòu)建可以不用Fe區(qū)、而僅僅使用可變結(jié)構(gòu)域，這樣可以有助于降低抗獨(dú)特型反應(yīng)的效應(yīng)。
[0166]相對(duì)于雙特異性完整抗體而言，雙特異性雙體還可能特別有用，因?yàn)槠湟子谠诖竽c桿菌中構(gòu)建和表達(dá)。使用噬菌體展示(W094 / 13804)能夠容易地將具有適宜的結(jié)合特異性的雙體(和多種其他的多肽如抗體片段)從文庫(kù)中篩選出來(lái)。如果雙體的一個(gè)臂保持恒定，例如，其對(duì)抗原X具有特異性，則可以制備另一臂變化的文庫(kù)，并選擇具有適宜特異性的抗體?？梢酝ㄟ^(guò)凹凸匹配(knobs-1nto-holes)技術(shù)制備雙特異性完整抗體(J.B.B.Ridgeway et al., Protein Eng.，9，616-621，1996)。
[0167]在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述的抗體可以是UniBody?形式。UniBody?是除去鉸鏈區(qū)的IgG4抗體(參見GenMab Utrecht, The Netherlands ;亦可參見，例如US20090226421)。該專利抗體技術(shù)能夠制備出穩(wěn)定的、更小的抗體形式，其與目前的小抗體形式相比具有更長(zhǎng)的治療窗。認(rèn)為IgG4抗體是惰性的，因而其不與免疫系統(tǒng)發(fā)生相互作用?？梢酝ㄟ^(guò)除去抗體的鉸鏈區(qū)對(duì)完整的人IgG4抗體進(jìn)行修飾，以獲得與相應(yīng)的完整IgG4 (GenMab,Utrecht)相比具有明顯穩(wěn)定性性質(zhì)的半-分子片段。將IgG4分子一分為二僅在UniBody?上留下一個(gè)可以與同源抗原(例如，疾病靶點(diǎn))結(jié)合的區(qū)域，因此UniBody?僅與靶細(xì)胞上的一個(gè)位點(diǎn)單價(jià)結(jié)合。對(duì)于某些癌細(xì)胞表面抗原而言，該單價(jià)結(jié)合可能不會(huì)刺激癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而在使用具有相同抗原特異性的二價(jià)抗體時(shí)可能出現(xiàn)這種情況，因此，UniBody?技術(shù)可能為常規(guī)抗體難以治療的某些類型的癌癥提供了治療選擇。當(dāng)治療某些
類型的癌癥時(shí)，UniBody?的小尺寸可能非常有益，其使得分子在更大的實(shí)體瘤上具有更好的分布，并且可能增加療效。
[0168]在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)的抗體可以是納米抗體形式。納米抗體由單基因編碼，其可以在幾乎所有的原核和真核宿主中有效生產(chǎn)，例如大腸桿菌(參見，例如美國(guó)專利號(hào)6，765，087)、霉菌(例如曲霉屬真菌(Aspergillus)或木霉屬真菌(Trichoderma))和酵母(例如酵母菌屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyvermyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)或畢赤酵母屬(Pichia))(參見，例如美國(guó)專利號(hào)6，838，254)。生產(chǎn)工藝是可擴(kuò)展的，已生產(chǎn)出幾千克量級(jí)的納米抗體?？梢詫⒓{米抗體制成具有較長(zhǎng)有效期的即用型溶液。用于生產(chǎn)針對(duì)所需靶點(diǎn)的納米抗體的納米克隆方法是一種專利方法(參見，例如W006 / 079372)，其基于B-細(xì)胞的自動(dòng)化高通量篩選。[0169]在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述的抗-1L-6R抗體或其抗原結(jié)合片段是人源化的。其指一般采用重組技術(shù)制備的嵌合分子，具有衍生自非人種屬的免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且該分子的其余免疫球蛋白結(jié)構(gòu)基于人免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和/或序列。抗原結(jié)合位點(diǎn)可以包括融合至恒定結(jié)構(gòu)域的完整的可變結(jié)構(gòu)域，或者僅是移植至可變結(jié)構(gòu)域適宜框架區(qū)的CDR。表位結(jié)合位點(diǎn)可以是野生型的，或通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換修飾。其消除了恒定區(qū)對(duì)在人個(gè)體中的免疫原性，但是仍保留針對(duì)外源性可變區(qū)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的可能性(LoBuglio, A.F.et al., (1989)Proc NatlAcadSci USA86:4220-4224 ;Queen et al.，PNAS (1988) 86:10029-10033 ；Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327)。將本申請(qǐng)公開的抗-1L-6R抗體人源化的示例性方法包括美國(guó)專利號(hào)7，462，697中所描述的方法。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的示例性人源化抗體包括SEQ ID NOs:9、10、19和20中的人源化序列。
[0170]另一種方法不僅著重于提供來(lái)自于人的恒定區(qū)，還著重于修飾可變區(qū)，以便對(duì)其進(jìn)行改造使其盡可能的接近于人的形式。已知重鏈和輕鏈可變區(qū)均含有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其對(duì)關(guān)注的表位的應(yīng)答有所不同，并決定結(jié)合能力。CDR側(cè)接有四個(gè)框架區(qū)(FR)，其在給定的種屬中相對(duì)保守，并且推測(cè)其為CDR提供支架。當(dāng)針對(duì)特定表位制備非人抗體時(shí)，可以通過(guò)將來(lái)自非人抗體的CDR移植到待修飾的人抗體的FR，從而對(duì)可變區(qū)進(jìn)行“整形”或“人源化”。Sato,K.et al.，(1993)CancerRes53:851-856已報(bào)道了該方法在制備不同抗體中的應(yīng)用。Riechmann,L et al.，(1988)Nature332:323-327 ；Verhoeyen,M.et al.，(1988)Science239:1534-1536 ;Kettleborough, C.A.et al., (1991)Protein Engineering^::773-3783 ；Maeda, H.et al., (1991)Human Antibodies Hybridoma2:124-134 ；Gorman,
S.D.et al.，(1991)Proc NatlAcadSci USA88:4181-4185 ;Tempest，P.R.et al.，(1991)Bio / Technology9:266-271 ；Co, M.S.et al., (1991)Proc NatlAcadSci USA88:2869-2873 ；Carter,P.et al.，(1992)Proc NatlAcadSci USA89:4285-4289 ;和 Co，M.S.etal.，(1992) J Immunol 148:1149_1154。在某些實(shí)施方式中，人源化的抗體保留了所有的⑶R序列(例如，人源化的小鼠抗體，其含有來(lái)自小鼠抗體的全部六個(gè)CDR)。在其他實(shí)施方式中，人源化抗體含有的一個(gè)或多個(gè)(一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè))CDR與原始抗體相比進(jìn)行過(guò)改造，也將其稱為“衍生自”原始抗體一個(gè)或多個(gè)CDR的一個(gè)或多個(gè)CDR。
[0171]在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)的抗體可以是嵌合抗體。在這一點(diǎn)上，嵌合抗體包含抗-1L-6R抗體的抗原結(jié)合片段，其可操作地連接至或融合至不同抗體的異源性Fe部分。在一些實(shí)施方式中，異源性Fe結(jié)構(gòu)域是人源的。在其他實(shí)施方式中，異源性Fe結(jié)構(gòu)域可以來(lái)自母體抗體的不同Ig類型，包括IgA(包括IgAl和IgA2亞類)、IgD、IgE、IgG(包括IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4亞類)、和IgM。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，異源性的Fe結(jié)構(gòu)域可以包括來(lái)自一個(gè)或多個(gè)不同Ig類的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。如上文所述的人源化的抗體，嵌合抗體的抗-1L-6R抗原結(jié)合片段可以僅包含一個(gè)或多個(gè)本申請(qǐng)所述的抗體的CDR(例如，本申請(qǐng)所述抗體的I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、或6個(gè)⑶R)，或可以包括完整的可變結(jié)構(gòu)域(VL、VH或二者)。
[0172]在一些實(shí)施方式中，IL-6R結(jié)合抗體包括本申請(qǐng)所述抗體的一個(gè)或多個(gè)⑶R。在這一點(diǎn)上，在某些例子中已顯示，可以僅轉(zhuǎn)移抗體的VHCDR3，同時(shí)仍保留所需的特異性結(jié)合(Barbas et al.，PNAS (1995) 92:2529-2533)。還可參見，McLane et al.，PNAS (1995) 92:5214-5218，Barbas 等，J.Am.Chem.Soc.(1994) 116:2161_2162。
[0173]Marks 等(Bio / Technology, 1992,10:779-783)描述了抗體可變結(jié)構(gòu)域的儲(chǔ)庫(kù)的生產(chǎn)方法，其中將位于或鄰近可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域51末端的通用引物與人VH基因第三框架區(qū)的通用引物聯(lián)合使用，以提供缺乏CDR3的VH可變結(jié)構(gòu)域的儲(chǔ)庫(kù)。Marks等進(jìn)一步描述了該儲(chǔ)庫(kù)是如何與特定抗體的CDR3組合的。使用類似技術(shù)，可以利用缺乏CDR3的VH或VL結(jié)構(gòu)域的儲(chǔ)庫(kù)與本申請(qǐng)所述抗體的⑶R3衍生的序列重新排列，并將重新排列的完整的VH或VL結(jié)構(gòu)域與同源的VL或VH結(jié)構(gòu)域組合，以提供與IL-6R結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。然后可以將儲(chǔ)庫(kù)在適宜的宿主系統(tǒng)中展示，如W092 / 01047中的噬菌體展示系統(tǒng)，這樣可以選擇出適宜的抗體或其抗原結(jié)合片段。儲(chǔ)庫(kù)可以由至少約IO4個(gè)成員以及若干數(shù)量級(jí)以上組成，例如，約從IO6至IO8或101°或更多成員。Stemmer也公開了類似的重新排列或組合技術(shù)(Nature，1994，370:389-391)，其描述了該技術(shù)與β -內(nèi)酰胺酶基因之間的關(guān)系，但觀察到該方法可以用于產(chǎn)生抗體 。
[0174]亦或通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)選定的VH和/或VL基因隨機(jī)突變以使整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)產(chǎn)生突變的方法產(chǎn)生新的VH或VL區(qū)，這些VH或VL區(qū)攜帶本發(fā)明實(shí)施方式中描述的一個(gè)或多個(gè)⑶R衍生的序列。Gram等對(duì)此技術(shù)進(jìn)行了描述(1992, Proc.Natl.Acad.Sc1., USA,89 =3576-3580)，其使用了易錯(cuò)配PCR。還可以使用另一種方法將VH或VL基因的CDR區(qū)直接誘變。Barbas 等(1994,Proc.Natl.Acad.Sc1.,USA,91:3809-3813)和 Schier 等(1996，J.Mol.Biol.263:551-567)公開了此技術(shù)。
[0175]在一些實(shí)施方式中，可以使用本申請(qǐng)所述抗體的特定VH和/或VL篩選互補(bǔ)可變結(jié)構(gòu)域文庫(kù)，以鑒定具有所需性質(zhì)的抗體，如對(duì)IL-6R親和性增加的抗體。此類方法已在例如 Portolano et al., J.1mmunol.(1993) 150:880-887 ；Clarkson et al.,Nature (1991) 352:624-628 中進(jìn)行了描述。
[0176]還可以使用其他方法混合和匹配⑶R，以鑒定具有所需結(jié)合活性的抗體，如與IL-6R 結(jié)合的抗體。例如:Klimka et al., British Journal ofCancer (2000) 83:252-260,其描述的篩選方法使用小鼠VL和人VH文庫(kù)，但CDR3和FR4仍然來(lái)自小鼠VH。獲得抗體后，針對(duì)人VL文庫(kù)對(duì)VH進(jìn)行篩選以獲得結(jié)合抗原的抗體。Beiboer et al., J.Mol.Biol.(2000)296 =833-849描述了使用完整小鼠重鏈和人輕鏈文庫(kù)的篩選方法。獲得抗體后，將一個(gè)VL與保留了小鼠CDR3的人VH文庫(kù)組合。獲得了能夠與抗原結(jié)合的抗體。Rader etal.，PNAS (1998) 95:8910-8915描述了一種與上述Beiboer等類似的方法。
[0177]這些剛剛所述的技術(shù)均是本領(lǐng)域公知的。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠使用此類技術(shù)，根據(jù)本申請(qǐng)所述的本發(fā)明的若干實(shí)施方式，通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)方法獲得抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0178]本申請(qǐng)還公開了一種獲得對(duì)IL-6R抗原具有特異性的抗體抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法，該方法包括通過(guò)在本申請(qǐng)所示的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中增加、刪除、替換或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，形成VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體，任選地將由此得到的VH結(jié)構(gòu)域與一個(gè)或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域組合，并檢測(cè)VH結(jié)構(gòu)域或VH / VL的組合以識(shí)別特定的結(jié)合成員，或?qū)L-6R具有特異性的抗體抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且任選地還具有一個(gè)或多個(gè)所需的性質(zhì)。VL結(jié)構(gòu)域可以具有基本上如本申請(qǐng)所列出的氨基酸序列?？梢允褂妙愃品椒▽⒈旧暾?qǐng)所公開的VL結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)序列變體與一個(gè)或多個(gè)VH結(jié)構(gòu)域組合。
[0179]與抗體或多肽“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”(在本申請(qǐng)中可以互換使用)的表位是本領(lǐng)域公知的術(shù)語(yǔ)，并且確定此類特異性或優(yōu)先結(jié)合的方法也是本領(lǐng)域公知的。如果與其他細(xì)胞或底物相比，所述分子與特定細(xì)胞或底物反應(yīng)或結(jié)合時(shí)的頻率更高、速度更快、持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)和/或親和性更高，則認(rèn)為顯示出“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”。如果與同其他底物結(jié)合相比，抗體結(jié)合的親和性、親合力更高、更容易，和/或持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，則認(rèn)為抗體“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”至靶點(diǎn)。例如，特異性或優(yōu)先結(jié)合至IL-6R表位的抗體是指，與結(jié)合至其他IL-6R表位或非-1L-6R表位相比，與一個(gè)IL-6R表位結(jié)合的親和性、親合力更高、更容易，和/或持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)的抗體。通過(guò)閱讀該定義還可以理解，例如，與第一個(gè)靶點(diǎn)特異性或優(yōu)先結(jié)合的抗體(或部分或表位)可以與或可以不與第二個(gè)靶點(diǎn)特異性或優(yōu)先結(jié)合。正因如此，“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”不是必然要求排他結(jié)合(雖然可以將其包括在內(nèi))。通常，但非必然地，提到結(jié)合時(shí)是指優(yōu)先結(jié)合。
[0180]免疫結(jié)合通常是指免疫球蛋白分子與對(duì)免疫球蛋白具有特異性的抗原之間發(fā)生非共價(jià)類型的相互作用，例如用于解釋而非限制，其為靜電、離子、親水和/或疏水性吸引或排斥、空間力、氫鍵、范德華力、以及其他相互作用。可以用相互作用的解離常數(shù)(Kd)來(lái)表述免疫結(jié)合相互作用的力、或親和性，其中Kd越小表示親和性越高。可以使用本領(lǐng)域公知的方法對(duì)選定多肽的免疫結(jié)合性質(zhì)進(jìn)行定量。一個(gè)此類方法涉及測(cè)定抗原-結(jié)合位點(diǎn)/抗原復(fù)合物形成和解離的速率，其中該速率依賴于復(fù)合物各部分的濃度、相互作用的親和性、以及同樣影響兩個(gè)方向速率的幾何參數(shù)。因此，可以通過(guò)計(jì)算濃度以及聚合和解離的實(shí)際速率確定“開速率常數(shù)”(KtJ和“關(guān)速率常數(shù)”(U。Koff / Km的比率能夠刪去與親和性無(wú)關(guān)的所有參數(shù)，這樣其相當(dāng)于解離常數(shù)Kd。參見,一般地,Davies et al., (1990) AnnualRev.Biochem.59:439_473。
[0181]在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述的抗-1L-6R抗體具有的親和性為約100、150、155、160、170、175、180、185、190、191、192、193、194、195、196、197、198 或 199 皮摩，以及在某些實(shí)施方式中，抗體對(duì)IL-6R可能具有甚至更高的親和性。
[0182]術(shù)語(yǔ)“免疫活性”，當(dāng)用在具有或“保留免疫活性”的表位中時(shí)，指在不同條件下抗體(例如，抗-1L-6R抗體)與表位結(jié)合的能力，例如表位經(jīng)還原或變性條件處理后。
[0183]根據(jù)本申請(qǐng)的某些優(yōu)選實(shí)施方式，抗體或其抗原結(jié)合片段可以是與本申請(qǐng)所述的任意抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的IL-6R，其(i)與抗原特異性結(jié)合，并且(ii)包含本申請(qǐng)所公開的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域，或包含本申請(qǐng)所公開的VH CDR3、或任意這些的變體?？梢匀菀椎卦隗w外對(duì)抗體間的競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)行檢測(cè)，例如使用ELISA和/或在一個(gè)抗體上標(biāo)記特異性的報(bào)告分子，其能夠在存在其他非標(biāo)記抗體時(shí)被檢測(cè)到，以使得能夠識(shí)別與相同表位或重疊表位結(jié)合的特異性抗體。這些檢測(cè)被描述于，例如，實(shí)施例1中，其中確定了本申請(qǐng)所公開的克隆#51的抗IL-6R抗體結(jié)合至與已知抗IL-6R抗體，即托珠單抗(tocilizumab)不同的表位。因此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，包括人抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其與本申請(qǐng)所述的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IL-6R。
[0184]在這一點(diǎn)上，如本申請(qǐng)所使用的，術(shù)語(yǔ)“與......競(jìng)爭(zhēng)”、“抑制結(jié)合”和“阻止結(jié)
合”(例如，指抑制/或阻斷IL-6與IL-6R結(jié)合，或指抑制/阻斷抗-1L-6R抗體與IL-6R結(jié)合)在本申請(qǐng)中可以互換使用，包括部分和完全抑制/阻斷。抑制/阻斷IL-6與IL-6R的結(jié)合，可優(yōu)選地降低或改變當(dāng)IL-6結(jié)合至IL-6R、且不存在抑制或阻斷時(shí)，細(xì)胞信號(hào)的正常水平或類型。抑制和阻斷還旨在包括當(dāng)與本申請(qǐng)所公開的抗-1L-6R抗體接觸時(shí)，與配體不接觸抗-1L-6R抗體相比，任意可檢測(cè)的IL-6與IL-6R結(jié)合的降低，例如阻止IL-6與IL-6R 結(jié)合至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100%。
[0185]與可變區(qū)相比，免疫球蛋白恒定區(qū)的序列多樣性較低，其負(fù)責(zé)與多種天然蛋白結(jié)合以激發(fā)重要的生化事件。在人類中，有五種不同類型的抗體，包括IgA(包括IgAl和IgA2亞類)、IgD, IgE, IgG(包括IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4亞類)、和IgM。這些抗體類型之間的區(qū)別特征為其恒定區(qū)，盡管其V區(qū)可能存在細(xì)微差別。
`[0186]抗體的Fe區(qū)與多數(shù)Fe受體和配體之間發(fā)生相互作用，以傳遞一系列重要的功能性能力，稱為效應(yīng)器功能。對(duì)于IgG而言，F(xiàn)e區(qū)包括Ig結(jié)構(gòu)域CH2和CH3，且N-末端鉸鏈與CH2連接。針對(duì)IgG類型的Fe受體的重要家族為Fe Y受體(Fe y Rs)。這些受體介導(dǎo)抗體與免疫系統(tǒng)細(xì)胞臂之間的聯(lián)系(Raghavan et al., 1996,Annu Rev Cell Dev Bioll2:181-220 ；Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290)。在人類中，該蛋白家族包括 Fe Y RI (CD64)，其包括亞型 Fe y RIa, Fe y Rib、和 Fe y RIc ；Fc y RII (CD32)，其包括亞M Fe Y RIIa(包括同種異型 H131 和 R131), Fe y RIIb (包括 Fe y RIIb-1 和 Fe y RIIb-2)、和Fe YRIIc ；以及Fe Y RIII (CD16)，包括亞型Fe y RIIIa (包括同種異型V158和F158)和Fe Y RIIIb (包括同種異型 Fe Y RIIIb-NAl 和 Fe y RIIIb_NA2) (Jefferis et al.，2002，Immunol Lett82:57-65)。典型地,這些受體具有介導(dǎo)結(jié)合至Fe的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、和可能介導(dǎo)某些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。這些受體在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、B細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞、朗格罕氏細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、和T細(xì)胞。Fe / Fe Y R復(fù)合物的形成將這些效應(yīng)器細(xì)胞募集至結(jié)合抗原的位點(diǎn)，典型地導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)事件以及重要的隨后免疫應(yīng)答，如炎性介質(zhì)釋放、B細(xì)胞活化、胞吞作用、吞噬作用、和細(xì)胞毒攻擊。
[0187]介導(dǎo)細(xì)胞毒性和吞噬性效應(yīng)器功能的能力是抗體破壞靶細(xì)胞的潛在機(jī)制。表達(dá)Fe Y R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合抗體，并且隨后導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解，這種細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)被稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC) (Raghavan et al.，1996，Annu Rev Cell Dev Bioll2:181-220 ；Ghetie et al., 2000, Annu Rev Tmmunol 18:739-766 ；Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290)。表達(dá) Fe 伽馬 R 的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合抗體，并且隨后導(dǎo)致靶細(xì)胞吞噬，這種細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)被稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)。所有的Fe Y R結(jié)合Fe上的相同區(qū)域，在Cg2 (CH2)結(jié)構(gòu)域和前面鉸鏈的N-末端。該相互作用在結(jié)構(gòu)上已被很好地鑒定(Sondermannet al.,2001, J Mol Biol309:737-749)，并且結(jié)合至人Fe Y RIIIb細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的人Fe的若干結(jié)構(gòu)已被解析(pdb 登記代碼 1E4K) (Sondermann et al., 2000,Nature406:267-273.)(pdb 登記代碼 IIIS 和 11IX) (Radaev et al.,2001, J Biol Chem276:16469-16477.)
[0188]不同的IgG亞類對(duì)Fe Y R具有不同的親和性，典型地IgGl和IgG3與受體的結(jié)合基本上優(yōu)于 IgG2 和 IgG4 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett82:57-65)。所有的 Fe Y R與IgG Fe上的相同區(qū)域結(jié)合，但是其親和性不同:高親和性結(jié)合子Fe Y RI與IgGl的Kd為10-?-1,而低親和性受體Fe Y RII和Fe Y RIII通常分別在10_6和10_5結(jié)合。Fe y RIIIa和Fe YRIIIb的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域具有96 %的同一性，而Fe Y RIIIb不具有細(xì)胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。而且，F(xiàn)cYR1、FcYRIIa / c和Fe Y RIIIa反而是免疫復(fù)合物觸發(fā)活化的正向調(diào)節(jié)子，其特征為具有細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其具有免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)，F(xiàn)cyRIIb具有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)，因而其是抑制的。因此，將前者稱為激活受體，將Fe Y RIIb稱為抑制受體。受體在不同免疫細(xì)胞中的表達(dá)類型和水平也不同。還有另一層面的復(fù)雜性，即在人蛋白質(zhì)組中存在多種FcyR的多態(tài)性。具有臨床意義的特別相關(guān)的多態(tài)性為V158 / F158Fc Y RIIIa0與F158同種異型相比，人IgGl與V158同種異型的結(jié)合親和性更高。已表明，在親和性上的這種差異，以及可能地其對(duì)ADCC和/或ADCP的影響，是抗-⑶20抗體利妥昔單抗(Rituxan?, IDEC Pharmaceuticals Corporation的注冊(cè)商標(biāo))效能的顯著的決定因素。具有V158同種異型的患者對(duì)利妥昔單抗治療的應(yīng)答有利；然而，具有低親和性F158同種異型的患者的應(yīng)答較差(Cartron et al.，2002，Blood99:754-758)。約有10-20%的人是V158 / V158純合的，45%是V158 / F158雜合的，以及35-45 %的人是 F158 / F158 純合的(Lehrnbecher et al.，1999，Blood94:4220-4232 ；Cartronet al.，2002，Blood99:754-758)。因此，80-90 %的人是較差的應(yīng)答者，其具有至少一個(gè)F158Fc Y RIIIa 等位基因。
[0189]Fe區(qū)也與補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的活化相關(guān)。在經(jīng)典的補(bǔ)體途徑中，Cl與其Clq亞基結(jié)合至IgG或IgM的Fe片段，其與抗原形成復(fù)合物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，對(duì)Fe區(qū)的修飾作用包括改變(增強(qiáng)或減弱)本申請(qǐng)所述的IL-6R-特異性抗體的能力以活化補(bǔ)體系統(tǒng)的修飾作用(參見，例如美國(guó)專利7，740，847)。為評(píng)估補(bǔ)體的活化，可以進(jìn)行補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)檢測(cè)(參見，例如 Gazzano-Santoro et al.，J.1mmunol.Methods, 202:163(1996))。
[0190]因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種具有修飾的Fe區(qū)的抗-1L-6R抗體，其具有改變的功能性質(zhì)，如CDC活性減弱，CDC、ADCC、或ADCP活性增強(qiáng)，或?qū)μ囟ǖ腇e Y R的結(jié)合親和性增強(qiáng)或血清半衰期增加。本申請(qǐng)中涉及的其他修飾的Fe區(qū)已在下述文獻(xiàn)中描述，例如已授權(quán)的美國(guó)專利7，317，091 ;7，657，380 ;7，662，925 ;6，538，124 ；6，528,624 ;7，297，775 ;7，364，731 ;公開的美國(guó)專利申請(qǐng) US2009092599 ；US20080131435 ；US20080138344 ;和公開的國(guó)際申請(qǐng) W02006 / 105338 ；W02004 / 063351 ；W02006 /088494 ；W02007 / 024249。
[0191]因此，在一些實(shí)施方式中，將具有所需結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域融合至免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。在一些實(shí)施方式中，與Ig重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合，包括至少部分鉸鏈、CH2、和Ch3區(qū)。優(yōu)選在至少一個(gè)融合中存在含有輕鏈結(jié)合必須位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(ChI)。在單獨(dú)的表達(dá)載體中插入編碼免疫球蛋白重鏈融合的DNA，以及如有需要的話，免疫球蛋白輕鏈，并共轉(zhuǎn)染至適宜的宿主細(xì)胞。這樣能夠更靈活地調(diào)整三種多肽片段的各自比例，在某些實(shí)施方式中，需要在構(gòu)建中使用比例不相等的三種多肽鏈以便為所需的雙特異性抗體提供理想的收率。然而，當(dāng)相等比例的至少兩種多肽鏈表達(dá)的收率較高，或者當(dāng)比例對(duì)所需鏈組合的收率不具有顯著影響時(shí)，將兩種或全部三種多肽鏈的編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體也是有可能的。
[0192]還可以對(duì)本發(fā)明的抗體(及其抗原結(jié)合片段和變體)進(jìn)行修飾以包括表位標(biāo)簽或標(biāo)記，例如，用于純化或診斷應(yīng)用。本領(lǐng)域公知有多種用于制備抗體偶聯(lián)物的連接基團(tuán)，包括例如美國(guó)專利號(hào)5，208，020或EP專利0425235B1，以及Chari et al.，CancerResearch52:127-131 (1992)中公開的那些。連接基團(tuán)包括二硫鍵基團(tuán)、硫醚基團(tuán)、酸不穩(wěn)定基團(tuán)、光不穩(wěn)定基團(tuán)、肽酶不穩(wěn)定基團(tuán)、或酯酶不穩(wěn)定基團(tuán)，如上述的專利所公開的，優(yōu)選二硫鍵和硫醚基團(tuán)。
[0193]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述的抗-1L-6R-特異性抗體可以偶聯(lián)，或可操作地連接至另一個(gè)治療化合物，在本申請(qǐng)中稱為偶聯(lián)物。偶聯(lián)物可以是細(xì)胞毒劑、化療劑、細(xì)胞因子、抗血管生成劑、酪氨酸激酶抑制劑、毒素、放射性同位素、或其他治療活性劑?；焺⒓?xì)胞因子、抗血管生成劑、酪氨酸激酶抑制劑、和上文所述的其他治療劑、以及所有這些前述的治療劑均可以用作抗體偶聯(lián)劑。
[0194]在一個(gè)替代實(shí)施方式中，抗體偶聯(lián)或可操作地連接至毒素，包括但不限于細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的小分子毒素和酶活性毒素，包括其片段和/或變體。小分子毒素包括但不限于皂素(Kuroda K et al.，The Prostate70:1286-1294(2010) ；Lip, WL et al.，2007Molecular Pharmaceutics4:241-251 ；Quadros EV et al.，2010Mol Cancer Ther ；9(11) ;3033_40 ；Polito L et al.，2009British Journal ofHaematology，147，710-718)、剌孢霉素、美登素(美國(guó)專利號(hào)5，208，020)、單端孢霉烯、和CC1065。毒素包括但不限于RNase、白樹毒素、烯二炔、蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍亂毒素、白樹毒素、假單胞菌外毒素(PE40)、志賀桿菌毒素、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌毒素、和商陸抗病毒蛋白。
[0195]在一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)的抗體及其抗原結(jié)合片段偶聯(lián)至一種或多種美登素分子。美登素是通過(guò)抑制微管蛋白聚合發(fā)揮作用的有絲分裂抑制劑。美登素首次從東非灌木齒葉美登木中分離得到(美國(guó)專利號(hào)3，896，111)。隨后，發(fā)現(xiàn)某些微生物也產(chǎn)生美登素，如美登醇和C-3美登醇酯(美國(guó)專利號(hào)4，151，042)。合成的美登醇及其衍生物和類似物已在如下文獻(xiàn)中公開:例如美國(guó)專利號(hào)4，137，230 ;4，248，870 ;4，256，746 ;4，260，608 ；4，265，814 ;4，294，757 ;4，307，016 ;4，308，268 ;4，308，269 ;4，309，428 ;4，313，946 ；4，315，929 ;4，317，821 ;4，322，348 ;4，331，598 ;4，361，650 ;4，364，866 ;4，424，219 ；4，450，254 ;4，362，663 ;和4，371，533。包含美登素的免疫偶聯(lián)物及其治療用途已在例如美國(guó)專利號(hào) 5，208，020，5，416，064和歐洲專利EP0425235B1 中公開。Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93 =8618-8623(1996)中描述了免疫偶聯(lián)物，其包含命名為DMl的美登素，DMl連接至針對(duì)人結(jié)直腸癌的單克隆抗體C242。已發(fā)現(xiàn)該偶聯(lián)物對(duì)培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒性，且在體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)檢測(cè)中顯示出抗腫瘤活性。
[0196]通過(guò)將抗體與美登素分子化學(xué)連接制備抗體-美登素偶聯(lián)物，抗體或美登素分子的生物學(xué)活性均未出現(xiàn)顯著降低。每個(gè)抗體分子偶聯(lián)平均3-4個(gè)美登素分子顯示出有效增加靶分子的細(xì)胞毒性，且不會(huì)對(duì)抗體的功能或溶解度帶來(lái)負(fù)面影響，盡管與使用裸抗體相t匕，預(yù)計(jì)即使是一分子的毒素/抗體也將會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞毒性。美登素是本領(lǐng)域公知的，其可以通過(guò)已知技術(shù)合成或從天然來(lái)源分離。適宜的美登素已在例如美國(guó)專利號(hào)5，208，020和上文所述的其他專利和非專利出版物中公開。優(yōu)選的美登素是美登醇以及在美登醇分子的芳香環(huán)或其他位置修飾的美登醇類似物，如不同的美登醇酯。
[0197]感興趣的另一種偶聯(lián)物包括偶聯(lián)至一個(gè)或多個(gè)卡里奇霉素分子的抗體。卡里奇霉素家族的抗生素在皮摩爾以下的濃度下就能夠使雙鏈DNA斷裂。也可以使用卡里奇霉素的結(jié)構(gòu)類似物(Hinman et al., 1993, Cancer Research53:3336-3342 ;Lode et al.,1998，Cancer Research58:2925-2928)(美國(guó)專利號(hào) 5，714，586 ;美國(guó)專利號(hào) 5，712，374 ；美國(guó)專利號(hào)5，264，586 ;美國(guó)專利號(hào)5，773，001)。尾海兔素10類似物，如奧里斯他汀E(auristatin E (AE))和單甲基奧里斯他汀E (MMAE),可以用作本申請(qǐng)公開的抗體或其變體的偶聯(lián)物(Doronina et al., 2003, Nat Biotechnol21 (7):778-84 ;Francisco et al.，2003Bloodl02(4):1458-65)。有用的酶活性毒素包括但不限于白喉A鏈、白喉毒素?zé)o結(jié)合活性的片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮素A鏈、α -帚曲霉素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陸蛋白(ΡΑΡΙ、ΡΑΡΙΙ、和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、有絲分裂毒素(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、伊諾霉素和單端孢霉烯族化合物。參見例如PCT W093 / 21232。本申請(qǐng)進(jìn)一步涉及這樣的實(shí)施方式，在這些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述的IL-6R-特異性抗體與具有核溶解活性的化合物，例如核糖核酸酶或DNA核酸內(nèi)切酶如脫氧核糖核酸酶(DNase)，之間形成偶聯(lián)或融合。
[0198]在一個(gè)替代實(shí)施方式中，本申請(qǐng)公開的抗體可以偶聯(lián)或可操作地連接至放射性同位素以形成放射性偶聯(lián)物。可以利用多種具有放射活性的同位素生產(chǎn)放射性偶聯(lián)物抗體。例子包括但不限于 90Y、1231、1251、1311、186Re、188Re、211At、和 212Bi。
[0199]在某些其他實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述的抗體可以偶聯(lián)至治療性基團(tuán)，如細(xì)胞毒素(例如，細(xì)胞抑制劑或殺細(xì)胞劑)、治療劑或放射性元素(例如，α-發(fā)射體、Y-發(fā)射體等)。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒劑包括對(duì)細(xì)胞有害的任意試劑。例子包括紫杉醇(paclitaxel) /紫杉醇(paclitaxol)、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、秋水仙堿、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托葸醌、光神霉素、放線菌素D、l-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、皂草素、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、和嘌呤霉素及其類似物或同源物。治療劑包括但不限于，抗代謝藥(例如，甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪)、烷化劑(例如，氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂霉素C、和順二氯二胺鉬(II) (DDP)順鉬)、葸環(huán)類(例如，柔紅霉素(曾用名道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放線菌素(曾用名更生霉素)、博來(lái)霉素、光神霉素、和氨茴霉素(AMC))、和抗有絲分裂劑(例如,長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春花堿)。[0200]此外，在一些實(shí)施方式中，IL-6R-特異性抗體(如本申請(qǐng)所述包括其功能片段，如抗原結(jié)合片段)可以偶聯(lián)至治療性基團(tuán)，如放射性材料或大環(huán)螯合劑用于偶聯(lián)放射金屬離子。在一些實(shí)施方式中，大環(huán)螯合劑是1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N'，N"，N"'-四乙酸(DOTA)，可以通過(guò)接頭分子將其連接至抗體。此類接頭分子是本領(lǐng)域公知的，且在Denardo et al.,1998,Clin Cancer Res.4:2483-90 ；Peterson et al.,1999,Bioconjug.Chem.10:553 ;和 Zimmerman et al.，1999，Nuc1.Med.Biol.26:943-50 中進(jìn)行了描述。[0201]在又一個(gè)實(shí)施方式中，可以將抗體偶聯(lián)至“受體”(如鏈霉親和素)用于在腫瘤中預(yù)定位，其中將抗體-受體偶聯(lián)物給予患者，隨后使用清除劑將未結(jié)合的偶聯(lián)物從循環(huán)中除去，然后再給予“配體”(例如親和素)，其偶聯(lián)至細(xì)胞毒劑(例如，放射性核苷酸)。在一個(gè)替代實(shí)施方式中，抗體偶聯(lián)或可操作地連接至酶，以引入抗體依賴性酶介導(dǎo)的前藥治療(ADEPT)。可以通過(guò)將抗體偶聯(lián)或可操作地連接至前藥活化酶來(lái)使用ADEPT，前藥活化酶可以將前藥(例如，肽?；焺瑓⒁奝CT W081 / 01145)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物。參見，例如PCT W088 / 07378和美國(guó)專利號(hào)4，975，278。用于ADEPT的免疫偶聯(lián)物的酶成分包括能夠以使其轉(zhuǎn)化為活性更高的細(xì)胞毒形式的方式作用于前藥的任意酶。用于這些方法和相關(guān)實(shí)施方式的酶包括但不限于，用于將含有磷酸鹽的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；用于將含有硫酸鹽的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳基硫酸酯酶；用于將無(wú)毒性的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；蛋白酶，如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)，其用于將含有肽的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物；D-丙氨酰羧肽酶，其用于轉(zhuǎn)化含有D-氨基酸取代的前藥；碳水化合物裂解酶，如β -半乳糖苷酶和胞嘧啶脫氨酶，其用于將糖基化的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物；β -內(nèi)酰胺酶，其用于將β-內(nèi)酰胺衍生化的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物；以及青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，其分別用于將胺基上的氮被苯氧乙?；虮揭阴；鶊F(tuán)衍生化的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物?；蛘?，可以使用具有酶活性的抗體，在本領(lǐng)域亦稱為“抗體酶”，將前藥轉(zhuǎn)化為游離的活性藥物(參見，例如Massey，1987，Nature328:457-458)?？梢灾苽溆糜趯⒖贵w酶遞送至腫瘤細(xì)胞群的抗體-抗體酶偶聯(lián)物。
[0202]可以使用多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑制備免疫偶聯(lián)物，如N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸(Srop)、琥珀酰亞胺-4-(N-馬來(lái)酰亞胺)環(huán)己烷-1-羧酸、亞胺基四氫噻吩(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(如二甲基二亞酰胺鹽酸鹽)、活性酯(如二琥珀酰亞胺辛二酸)、醛(如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(如雙(P-疊氮基苯甲?；?己二胺)、雙-重氮衍生物(如雙-(P- 二重氮苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(如甲苯2，6- 二異氰酸酯)、以及雙-活性氟化合物(如1，5_ 二氟-2，4-二硝基苯)。特定的偶聯(lián)劑包括N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸(SPDP) (Carlsson et al.，Biochem.J.173:723-737 [1978])和N-琥珀酰亞胺-4-(2-吡啶硫代)戊酸(SPP)以提供二硫鍵。接頭可以是易于釋放一個(gè)或多個(gè)可裂解組分的“可裂解的接頭”。例如，可以使用酸不穩(wěn)定接頭(Cancer Research52:127-131 (1992);美國(guó)專利號(hào) 5，208，020)。
[0203]本申請(qǐng)還涉及本發(fā)明抗體(和多肽)的其他修飾。例如，抗體可以連接至多種非蛋白性聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。還可以通過(guò)例如凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合(例如，分別為羥甲基纖維素或明膠微囊和聚_(甲基甲基丙烯酸酯)微囊)將抗體包埋于微囊、膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳、納米粒子和納米膠囊)、或粗乳。此類技術(shù)已在Remington' s PharmaceuticalSciences,第 16 版，Oslo, A.，Ed.，(1980)中公開。
[0204]本申請(qǐng)所使用的“載劑”包括藥學(xué)上可接受的載劑、賦形劑、或穩(wěn)定劑，其在所使用的劑量和濃度下，對(duì)暴露于其中的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物無(wú)毒性。通常生理學(xué)上可接受的載劑是水性pH緩沖溶液。生理學(xué)上可接受載劑的例子包括緩沖液，如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其他有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖、和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑，如EDTA ;糖醇，如甘露醇或山梨醇；成鹽的抗衡離子，如鈉；和/或非離子表面活性劑，如聚山梨醇酯20(吐溫?)、聚乙二醇(PEG)、和泊洛沙姆(PLUR0NICS?)等。
[0205]可以采用多種本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法評(píng)估抗-1L-6R抗體所需的功能性性質(zhì)，如親和性/結(jié)合檢測(cè)(例如，表面等離子體共振，競(jìng)爭(zhēng)性抑制檢測(cè))；細(xì)胞毒性試驗(yàn)，細(xì)胞活力檢測(cè)，響應(yīng)于IL-6的細(xì)胞增殖或分化檢測(cè)(例如，TF-1細(xì)胞增殖試驗(yàn))，體外或體內(nèi)模型癌細(xì)胞和/或腫瘤生長(zhǎng)抑制。其他檢測(cè)可以測(cè)試本申請(qǐng)所述抗體阻斷正常IL-6 /IL-6R介導(dǎo)的反應(yīng)的能力，所述反應(yīng)例如STAT3磷酸化或STAT3信號(hào)活動(dòng)，或其他下游信號(hào)活動(dòng)?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的已建立的方案(參見，例如Current Protocolsin Molecular Biology(Greene Publ.Assoc.1nc.&John ffiley&Sons, Inc., NY, NY)；Current Protocols in Immunology(Edited by:John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David
H.Margulies, Ethan M.Shevach, Warren Strober200IJohn ffiley&Sons, NY, NY)或商品化的試劑盒進(jìn)行此類檢測(cè)。
[0206]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步包括分離的核酸，其編碼本申請(qǐng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，例如編碼本申請(qǐng)所述的CDR或VH或VL結(jié)構(gòu)域的核酸。核酸包括DNA和RNA。如本申請(qǐng)所述的這些和相關(guān)實(shí)施`方式可以包括多核苷酸，其編碼與IL-6R結(jié)合的抗體。如本申請(qǐng)所使用的，術(shù)語(yǔ)“分離的多核苷酸”指基因組、cDNA、或合成來(lái)源的多核苷酸或其組合，憑借其來(lái)源分離的多核苷酸(I)與在自然界中發(fā)現(xiàn)的分離的多核苷酸中的全部或部分多核苷酸無(wú)關(guān)，(2)連接至在自然界中并不與之連接的多核苷酸，或(3)在自然界中并未作為更長(zhǎng)序列的一部分存在。
[0207]術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指應(yīng)用該術(shù)語(yǔ)的組分所處的關(guān)系，即允許其在適宜條件下實(shí)施其固有功能。例如，轉(zhuǎn)錄控制序列“可操作地連接”至蛋白編碼序列，這樣在與控制序列的轉(zhuǎn)錄活性兼容的條件下實(shí)現(xiàn)蛋白編碼序列的表達(dá)。
[0208]如本申請(qǐng)所使用的，術(shù)語(yǔ)“控制序列”指能夠影響與之連接或可操作地連接的編碼序列表達(dá)、加工或細(xì)胞內(nèi)定位的多核苷酸序列。這樣的控制序列的性質(zhì)可能取決于宿主生物體。在特定實(shí)施方式中，原核生物的轉(zhuǎn)錄控制序列可以包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、和轉(zhuǎn)錄終止序列。在其他特定實(shí)施方式中，真核生物的轉(zhuǎn)錄控制序列可以包括包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止序列和多聚腺苷酸化序列。在一些實(shí)施方式中，“控制序列”可以包括前導(dǎo)序列和/或融合伴侶序列。
[0209]如本申請(qǐng)所使用的，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”指單鏈或雙鏈核酸聚合物。在一些實(shí)施方式中，包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或者這兩種核苷酸類型之一的修飾形式。所述修飾包括堿基修飾如溴尿核苷，核糖修飾如阿糖胞苷和2'，3' - 二脫氧核糖以及核苷酸間鍵修飾如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代憐酸酯(phosphorodiselenoate)、縮苯胺硫代憐酸酯(phosphoroanilothioate)、縮苯胺憐酸酯(phoshoraniIadate)和氨基憐酸酯。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”特別地包括單鏈和雙鏈形式的DNA。[0210]術(shù)語(yǔ)“天然存在的核苷酸”包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。術(shù)語(yǔ)“修飾的核苷酸”包括糖基等被修飾或取代的核苷酸。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸鍵”包括例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代憐酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代憐酸酯(phosphorodiselenoate)、縮苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、縮苯胺磷酸酯(phoshoraniIadate)、氨基磷酸酯等寡核苷酸鍵。參見，例如LaPlanche et al., 1986,Nucl.Acids Res., 14:9081 ;Stec etal.，1984, J.Am.Chem.Soc.，106:6077 ；Stein et al.，1988, Nucl.Acids Res.，16:3209 ；Zon et al.,1991,Ant1-Cancer Drug Design,6:539 ；Zon et al.,1991,OLIGONUCLEOTIDESAND ANALOGUES:A PRACTICAL APPROACH,pp.87-108(F.Eckstein,Ed.), Oxford UniversityPress, Oxford England ；Stec et al.,美國(guó)專利號(hào) 5,151, 510 ；Uhlmann and Peyman, 1990,Chemical Reviews, 90:543,出于任何目的公開的內(nèi)容在此通過(guò)引用并入。寡核苷酸可以包括能夠檢測(cè)寡核苷酸或其雜交的可檢測(cè)標(biāo)記。
[0211]使用的術(shù)語(yǔ)“載體”指用于將編碼信息轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的任意分子(例如，核酸、質(zhì)粒、或病毒)。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”指適宜宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化并且含有指引和/或控制插入異源核酸序列表達(dá)的核酸序列的載體。表達(dá)包括但不限于，方法如轉(zhuǎn)錄、翻譯、和RNA剪接，如果存在內(nèi)含子。
[0212]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，多核苷酸可以包括表達(dá)或可能適于表達(dá)蛋白、多肽、肽等的基因組序列、額外的基因組和質(zhì)粒編碼序列以及較小的設(shè)計(jì)基因片段。此類片段可以是天然分離的，或由本領(lǐng)域技術(shù)人員合成修飾的。
[0213]本領(lǐng)域技術(shù)人員還知曉，多核苷酸可以是單鏈(編碼或反義)或雙鏈的，并可以是DNA(基因組、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可以包括HnRNA分子，其含有內(nèi)含子且以一一對(duì)應(yīng)的方式對(duì)應(yīng)于DNA分子，以及不含內(nèi)含子的mRNA分子。本申請(qǐng)的多核苷酸中可以含有，但不是必須含有，附加的編碼或非編碼序列，以及多核苷酸可以，但不是必須，連接至其他分子和/或支持材料。多核苷酸可以包括天然序列，或可以包括編碼此類序列的變體或衍生物的序列。
[0214]因此，根據(jù)這些和相關(guān)的實(shí)施方式，本申請(qǐng)還提供了編碼本申請(qǐng)所述的抗-1L-6R抗體的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所提供的多核苷酸包括編碼本申請(qǐng)所述的抗體和此類多核苷酸補(bǔ)體的某些或全部多核苷酸序列。
[0215]在其他相關(guān)實(shí)施方式中，多核苷酸變體可能與編碼本申請(qǐng)所述的抗-1L-6R抗體的多核苷酸序列基本上具有同一性。例如，使用本申請(qǐng)所述的方法(例如，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析，如下文所述)，與參比多核苷酸序列如編碼本申請(qǐng)所述抗體的序列相比，多核苷酸可以是包含至少70%序列同一性，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性、氨基酸的相似性、閱讀框架位置等，可以對(duì)這些值進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以確定由兩個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白相應(yīng)的同一性。
[0216]通常，多核苷酸變體將含有一個(gè)或多個(gè)替換、添加、刪除和/或插入，優(yōu)選地變體多核苷酸編碼的抗體的結(jié)合親和性基本上不低于本申請(qǐng)所示的特定多核苷酸序列編碼的抗體。
[0217]在一些其他相關(guān)實(shí)施方式中，多核苷酸片段可以包含或基本上由不同長(zhǎng)度連續(xù)的序列組成，所述序列與本申請(qǐng)所述的編碼抗體的序列相同或互補(bǔ)。例如，所提供的多核苷酸包含或基本上由至少約 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、300、400、500 或 1000 個(gè)或更多連續(xù)的核苷酸序列組成，所述序列編碼本申請(qǐng)所公開的抗體或其抗原結(jié)合片段以及其間的所有中間長(zhǎng)度。容易理解，“中間長(zhǎng)度”在本申請(qǐng)中指所述值之間的任意長(zhǎng)度，如50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500、500_1，000等之間的所有整數(shù)?？梢栽谝粋€(gè)或兩個(gè)末端通過(guò)加入天然序列中不存在的核苷酸對(duì)本申請(qǐng)所述的核苷酸序列延長(zhǎng)。該附加序列可能由編碼本申請(qǐng)所述抗體的多核苷酸一個(gè)末端或編碼本申請(qǐng)所述抗體多核苷酸兩個(gè)末端的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或 20 個(gè)核苷酸組成。
[0218]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所提供的多核苷酸序列能夠在中度至高度嚴(yán)格條件下與本申請(qǐng)?zhí)峁┑木幋a抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸序列、或其片段、或其互補(bǔ)序列雜交。雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域所公知的。出于說(shuō)明的目的，用于檢測(cè)本申請(qǐng)所提供的多核苷酸與其他多核苷酸雜交的適宜中度嚴(yán)格條件包括，在5X SSC.0.5% SDSU.0mM EDTA(pH8.0)溶液中預(yù)洗；在50°C -60°C、5X SSC雜交過(guò)夜；隨后使用含0.1 % SDS的2X、0.5X和0.2XSSC，在65°C下洗滌兩次，每次20分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，雜交的嚴(yán)格性可以很容易地操作，如通過(guò)改變雜交溶液的鹽含量和/或雜交進(jìn)行的溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方式中，適宜的高度嚴(yán)格雜交條件包括上文所描述的那些條件，但是雜交溫度增至例如600C -65°C或 65°C -70°C。
[0219]在一些實(shí)施方式中，上文所描述的多核苷酸，例如多核苷酸變體、片段和雜交序列，編碼結(jié)合IL-6R的抗體或其抗原結(jié)合片段。在其他實(shí)施方式中，此類多核苷酸編碼抗體或其抗原結(jié)合片段，或其CDR， 其與IL-6R的結(jié)合能力與本申請(qǐng)所示特定的抗體序列至少約50%、至少約70%，和在一些實(shí)施方式中，至少約90%相同。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，此類多核苷酸編碼的抗體或其抗原結(jié)合片段或其CDR結(jié)合至IL-6R的親和性高于本申請(qǐng)所示的抗體，例如其結(jié)合力在數(shù)量上是本申請(qǐng)所示特定的抗體序列的至少約105 %>106%>107%>108%、109%、或 110%。
[0220]如本申請(qǐng)其他地方描述的，可以通過(guò)常規(guī)方法，例如用選定的天然或非天然氨基酸替換、添加、刪除或插入一種或多種氨基酸，制得示例多肽(例如，如本申請(qǐng)所提供的變體IL-6R-特異性抗體，如具有本申請(qǐng)所提供的抗原結(jié)合片段的抗體蛋白)，其三維結(jié)構(gòu)可以通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)行測(cè)定，以確定這樣衍生的結(jié)構(gòu)變體保留了在此公開的種類的空間填充性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知有多種計(jì)算機(jī)程序，可用于確定在抗體內(nèi)適宜的氨基酸取代(或編碼氨基酸序列的適宜多核苷酸)，從而例如維持親和性或獲得更好的親和性。
[0221]本申請(qǐng)所描述的多核苷酸，或其片段，無(wú)論其編碼序列自身的長(zhǎng)度如何，均可以與其他DNA序列組合，如啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)、附加限制性酶位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其他編碼片段等等，這樣其全長(zhǎng)可能有很大變化。因此，預(yù)計(jì)可以采用幾乎任意長(zhǎng)度的核酸片段，優(yōu)選將其總長(zhǎng)度限制在易于在計(jì)劃的重組DNA方案中制備和使用。例如，預(yù)計(jì)使用的示例性多核苷酸片段的總長(zhǎng)度為約10，000、約5000、約3000、約2，000、約I, 000、約500、約200、約100、約50個(gè)堿基對(duì)等(包括所有中間長(zhǎng)度)。
[0222]當(dāng)對(duì)多核苷酸序列進(jìn)行比較時(shí)，當(dāng)兩個(gè)序列按下文所述進(jìn)行比對(duì)以達(dá)到最大對(duì)應(yīng)時(shí)，如果核苷酸序列相同，則將兩個(gè)序列稱為是“同一的”。一般通過(guò)在比較窗口內(nèi)比較序列，以識(shí)別和比較序列的局部區(qū)域的相似性，從而進(jìn)行兩個(gè)序列之間的比較。如本申請(qǐng)所使用，“比較窗口”指至少約20個(gè)連續(xù)位置的片段，通常為30至約75、40至約50，在這個(gè)片段中，在兩個(gè)序列優(yōu)化比對(duì)后，將一個(gè)序列與具有相同數(shù)量連續(xù)位置的參比序列進(jìn)行比較。
[0223]可以使用Lasergene生物信息學(xué)軟件套裝(DNASTAR, Inc., Madison, WI)中的Megalign程序，采用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行用于比較的序列優(yōu)化比對(duì)。該程序體現(xiàn)了下述參考文獻(xiàn)中描述的幾個(gè)比對(duì)方案:Dayhoff, M.0.(1978) A model of evolutionarychange in proteins—Matrices for detecting distant relationships.1n Dayhoff,M.0.(ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical ResearchFoundation, Washington DC Vol.5, Supp1.3, pp.345-358 ；Hein J., UnifiedApproachto Alignmennt andPhylogenes, pp.626-645(1990) ；Methods in Enzymology vol.183,Academic Press, Inc., San Diego, CA ；Higgins, D.G.和 Sharp, P.M., CAB10S5:151-153(1989) ；Myers, E.ff.和 Muller W.，CAB10S4:11-17(1988) ；Robinson, E.D., Comb.Theorll:105(1971) ；Santou, N.Nes, M.，Mol.Biol.Evol.4:406-425(1987) ；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.,Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of NumericalTaxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA(1973) ；ffilbur, ff.J.and Lipman, D.J.,Proc.Natl.Acad, Sc1.USA80:726-730 (1983)。
[0224]或者，可以通過(guò)Smith and Waterman, Add.APL.Math2:482 (1981)的局部同一性算法、通過(guò) Needleman and Wunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970)的同一性比對(duì)算法、通過(guò)Pearson and Lipman, Proc.Natl.Acad Sc1.USA85:2444 (1988)的相似性方法探索、通過(guò)這些算法(威斯康辛遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和TFASTA，GeneticsComputer Group (GCG), 575Scien`ce Dr.,Madison, WI)的計(jì)算機(jī)執(zhí)行、或通過(guò)檢視進(jìn)行用于比較的序列優(yōu)化比對(duì)。
[0225]適于確定序列同一性和序列相似性百分率的算法的一個(gè)優(yōu)選的例子為BLAST和BLAST2.0 算法，已分別在 Altschul et al.，Nucl.Acids Res.25:3389-3402 (1977)，和Altschul et al., J.Mol.Biol.215 =403-410 (1990)中對(duì)其進(jìn)行了描述。BLAST 和 BLAST2.0可以使用例如本申請(qǐng)所描述的參數(shù)，以確定兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸之間的序列同一性百分率。美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心公開提供了用于進(jìn)行BLAST分析的軟件。在一個(gè)說(shuō)明性的例子中，可以使用參數(shù)M(匹配殘基對(duì)的獎(jiǎng)勵(lì)分?jǐn)?shù)；始終>0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分；始終〈0)計(jì)算核苷酸序列的累積得分。在下列情況下停止在各方向上對(duì)字碼采樣的延伸:累積比對(duì)得分從其達(dá)到的最大值下降數(shù)量X ;由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)分殘基比對(duì)的累積，使累積得分達(dá)到零或以下；或到達(dá)任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定比對(duì)的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的缺省值為:字長(zhǎng)(W) 11，和期望(E) 10，以及BL0SUM62評(píng)分矩陣(參見 Henikoffand Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915(1989))算法(B) 50，期望(E) 10，M=5, N=-4和對(duì)兩條鏈進(jìn)行比較。
[0226]在一些實(shí)施方式中，通過(guò)在至少20個(gè)位置的比較窗內(nèi)對(duì)兩個(gè)優(yōu)化比對(duì)的序列進(jìn)行比較，以確定“序列同一性百分率”，其中為達(dá)到兩個(gè)序列的優(yōu)化比對(duì)，多核苷酸序列在比較窗中的部分與參比序列(不包含添加或刪除)相比，可以包括20%或以下的添加或刪除(即，間隙)，通常5至15%，或10至12%。所述百分率如下計(jì)算，確定在兩個(gè)序列中均出現(xiàn)相同核酸的位置數(shù)，得到匹配的位置數(shù)，將匹配位置數(shù)除以在參比序列中的總位置數(shù)(即，窗尺寸)，并將得到的結(jié)果乘以100，從而得到序列同一性百分率。
[0227]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性，有多個(gè)編碼本申請(qǐng)所述抗體的核苷酸序列。這些多核苷酸中的某些與編碼結(jié)合IL-6R的抗體的天然或原始多核苷酸序列具有最小的序列同一性。盡管如此，因使用不同密碼子導(dǎo)致的多核苷酸改變是本申請(qǐng)可以明確預(yù)期的。在一些實(shí)施方式中，特別關(guān)注了已經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的序列。
[0228]因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用誘變方法如位點(diǎn)特異性誘變制備本申請(qǐng)所述抗體的變體和/或衍生物。通過(guò)該方法，可以通過(guò)對(duì)編碼其的多核苷酸誘變，以制備在多肽序列中的特異性修飾。這些技術(shù)提供了制備和檢測(cè)序列變體的直接方法，例如通過(guò)在多核苷酸中引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的改變，從而引入一個(gè)或多個(gè)前述考慮因素。
[0229]位點(diǎn)特異性誘變通過(guò)使用編碼所需突變的DNA序列的特異性寡核苷酸序列，以及足夠數(shù)量的鄰近核苷酸，以提供具有足夠大小和序列復(fù)雜性的引物序列，以便越過(guò)被刪除的接點(diǎn)在其兩側(cè)形成穩(wěn)定雙螺旋，從而產(chǎn)生突變體。可以在選定的多核苷酸序列中引入突變，以使多核苷酸本身改善、改變、減少、修飾或改變其性質(zhì)，和/或改變編碼的多肽的性質(zhì)、活性、組分、穩(wěn)定性、或主要序列。
[0230]在一些實(shí)施方式中，發(fā)明人關(guān)注了編碼本申請(qǐng)公開的抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸序列的誘變，以改變所編碼的多肽的一種或多種性質(zhì)，如抗體或其抗原結(jié)合片段的結(jié)合親和性，或特定Fe區(qū)的功能，或針對(duì)特定Fe Y R的Fe區(qū)的親和性。位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，已廣泛用于 產(chǎn)生多肽和多核苷酸的變體。例如，位點(diǎn)特異性誘變經(jīng)常用于改變DNA分子的特定部分。在此類實(shí)施方式中，一般使用含有約14至約25個(gè)核苷酸或其左右的長(zhǎng)度的引物，在被改變序列的接點(diǎn)處的兩側(cè)具有約5至約10個(gè)殘基。
[0231]本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)經(jīng)常采用以單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體。在位點(diǎn)定向誘變中使用的典型載體包括如M13噬菌體的載體。這些噬菌體易于購(gòu)買獲得，并且其使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。雙鏈?zhǔn)删w也常規(guī)地用于位點(diǎn)定向誘變，其減少了將感興趣的基因從質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至噬菌體的步驟。
[0232]在通常情況下，按照本申請(qǐng)進(jìn)行的位點(diǎn)定向誘變通過(guò)首先獲得單鏈載體或兩條鏈熔化分開的雙鏈載體進(jìn)行，所述載體的序列包括編碼所需肽的DNA序列。一般通過(guò)合成制備產(chǎn)生具有所需突變序列的寡核苷酸引物。然后用單鏈載體對(duì)該引物進(jìn)行退火，并加入DNA聚合酶如大腸桿菌聚合酶I Klenow片段，以完成突變鏈的合成。因此，形成異源雙鏈，其中一條鏈編碼原始非突變的序列，另一條鏈帶有所需突變。然后使用該異源雙鏈載體轉(zhuǎn)化適宜細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞，并選擇包括攜帶突變序列排布的重組載體的克隆。
[0233]使用位點(diǎn)定向突變制備選定肽編碼DNA片段的序列變體提供了一種生產(chǎn)可能有用的種類的方法，但并不意味著限制，因?yàn)檫€有其他方法可以獲得肽序列變體和編碼其的DNA序列。例如，可以使用誘變劑，如羥胺，處理編碼所需肽序列的重組載體以獲得序列變體。關(guān)于這些方法和方案的具體細(xì)節(jié)參見Maloy et al., 1994 ；Segal, 1976 ；Prokop andBajpai, 1991 ；Kuby, 1994 ；以及Maniatis et al.，1982的教導(dǎo)，其均通過(guò)引用并入本申請(qǐng)，用于該目的。[0234]如本申請(qǐng)所使用的，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸定向誘變操作”指模板依賴性過(guò)程和載體介導(dǎo)的繁殖，其導(dǎo)致特定核酸分子的濃度相對(duì)于其初始濃度增加，或可檢測(cè)信號(hào)的濃度增加，如擴(kuò)增。如本申請(qǐng)所使用的，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸定向誘變操作”是用來(lái)指涉及引物分子的模板依賴性延伸的過(guò)程。術(shù)語(yǔ)模板依賴性過(guò)程指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成核酸鏈的序列是由公知的堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)則決定的(參見，例如Watson，1987)。通常，載體介導(dǎo)的方法涉及將核酸片段引入DNA或RNA載體、載體的克隆擴(kuò)增、和擴(kuò)增核酸片段的恢復(fù)。這種方法的例子參見美國(guó)專利號(hào)4，237，224，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用特別地并入本申請(qǐng)。
[0235]在用于生產(chǎn)多肽變體的另一種方法中，可以采用如美國(guó)專利號(hào)5，837，458中所描述的遞歸序列重組。在該方法中，進(jìn)行重組和篩選或選擇的迭代循環(huán)，以“進(jìn)化”出例如結(jié)合親和性增加的個(gè)體多核苷酸變體。一些實(shí)施方式還以質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒的形式提供了構(gòu)建體，其包括至少一個(gè)如本申請(qǐng)所述的多核苷酸。
[0236]根據(jù)一些相關(guān)的實(shí)施方式，提供了一種重組的宿主細(xì)胞，其包括一種或多種本申請(qǐng)所描述的構(gòu)建體；一種核酸，其編碼任意抗體、CDR、VH或VL結(jié)構(gòu)域，或其抗原結(jié)合片段；以及編碼產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，該方法包括從編碼的核酸表達(dá)。通過(guò)在適宜條件下培養(yǎng)含有核酸的重組宿主細(xì)胞方便地實(shí)現(xiàn)表達(dá)。通過(guò)表達(dá)生產(chǎn)后，可以采用任意適宜的技術(shù)分離和/或純化抗體或其抗原結(jié)合片段，然后根據(jù)需要使用。
[0237]如本申請(qǐng)?zhí)峁┑目贵w或其抗原結(jié)合片段，以及編碼核酸分子和載體，可以是基本上純凈或均質(zhì)的形式，例如從其自然環(huán)境中被分離和/或純化，或者就核酸而言，不含或基本不含除編碼具有所需功能多肽的序列以外來(lái)源的核酸或基因。核酸可以包括DNA或RNA，并且可以是全部或部分合成的。除非上下文另有要求，否則本申請(qǐng)所示的核苷酸序列包括具有特定序列的DNA分子，并且包括具有特定序列的RNA分子，所述特定序列中U被替換為T。
[0238]在多種不同的宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是公知的。適宜的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)。本領(lǐng)域用于表達(dá)異源性多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、NSO小鼠黑色素瘤細(xì)胞和多種其他細(xì)胞。通常優(yōu)選的細(xì)菌宿主是大腸桿菌。
[0239]抗體和抗原結(jié)合片段在原核細(xì)胞如大腸桿菌中的表達(dá)已在本領(lǐng)域中成功建立。綜述參見，例如Pluckthun, A.Bio / Technology9:545-551 (1991)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以利用在培養(yǎng)的真核細(xì)胞中的表達(dá)作為生產(chǎn)抗體或其抗原結(jié)合片段的選擇，參見最新綜述，例如Ref，M.E.(1993)Curr.0pinion Biotech.4:573-576 ；Trill J.J.et al.，(1995)Curr.0pinion Biotech6:553_560o
[0240]可以選擇或構(gòu)建含有適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的適宜載體，包括啟動(dòng)子序列、終止子序列、多聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記物基因和其他適當(dāng)?shù)男蛄?。載體可以是質(zhì)粒、病毒例如曬菌體、或嗜菌粒，視情況而定。有關(guān)進(jìn)一步的詳細(xì)情況,參見例如Molecular Cloning:a Laboratory Manual:2nd edition, Sambrook et al.,1989, Cold Spring HarborLaboratory Press。針對(duì)核酸的操作有多種已知的技術(shù)和方法,例如核酸構(gòu)建體的制備、誘變、測(cè)序、將DNA引入細(xì)胞和基因的表達(dá)、以及蛋白分析,其在Current Protocols inMolecular Biology,第二版，Ausubel 等編著，John Wiley&Sons, 1992,或隨后的更新版中對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)的描述。
[0241]術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”用于指被引入，或能夠引入編碼本申請(qǐng)所述的一種或多種抗體的核酸序列的細(xì)胞，并且其進(jìn)一步表達(dá)或能夠表達(dá)感興趣的選定基因，如編碼任意本申請(qǐng)所述抗體的基因。該術(shù)語(yǔ)包括親代細(xì)胞的子代，無(wú)論其在形態(tài)學(xué)或遺傳組成上是否與親代相同，只要存在選定基因即可。因此，還涉及一種包括將此類核酸引入宿主細(xì)胞的方法。該引入可以使用任何可用的技術(shù)。對(duì)于真核細(xì)胞而言，適宜的技術(shù)可以包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染以及使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如牛痘，對(duì)于昆蟲細(xì)胞，使用桿狀病毒。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞而言，適宜的技術(shù)包括氯化鈣轉(zhuǎn)染、電穿孔和使用細(xì)菌噬菌體的轉(zhuǎn)染。例如通過(guò)在使基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，在引入之后引起或允許核酸的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，將核酸整合至宿主細(xì)胞的基因組(例如，染色體)。按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過(guò)包含促進(jìn)與基因組重組的序列可以促進(jìn)整合。
[0242]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了一種方法，其包括在表達(dá)系統(tǒng)中使用上文所述的構(gòu)建體以表達(dá)特定多肽，如本申請(qǐng)所描述的IL-6R-特異性抗體。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)導(dǎo)”用于指將基因從一個(gè)細(xì)菌中傳遞至另一個(gè)，通常使用噬菌體?！稗D(zhuǎn)導(dǎo)”也指通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒獲得和轉(zhuǎn)移真核細(xì)胞序列。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”用于指細(xì)胞攜帶外來(lái)的或外源性DNA，當(dāng)外源性DNA被引入細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)，細(xì)胞被“轉(zhuǎn)染”。多種轉(zhuǎn)染技術(shù)均是本領(lǐng)域所公知的，并且在本申請(qǐng)中公開。參見例如，Graham et al., 1973, Virology52:456 ；Sambrook et al., 2001,MOLECULARCLONINGjA LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratories ；Davis et al.,1986,BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier ;和 Chu et al.，1981，Genel3:197。可以使用此類技術(shù)將一種或多種外源性的DNA部分引入適宜的宿主細(xì)胞。
[0243]如本申請(qǐng)所使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指細(xì)胞遺傳特性的改變，當(dāng)其被修飾以含有新的DNA時(shí)細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。例如，當(dāng)從其天然狀態(tài)被遺傳修飾后，細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)后，轉(zhuǎn)化DNA可以通過(guò)物理地整合至細(xì)胞的染色體與細(xì)胞重組，或者可以作為不復(fù)制的附加體元件瞬時(shí)保持，或者可以作為質(zhì)粒獨(dú) 立地復(fù)制。當(dāng)DNA隨著細(xì)胞的分裂而復(fù)制時(shí)，則認(rèn)為細(xì)胞已被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“天然存在的”或“天然的”與生物學(xué)材料如核酸分子、多肽、宿主細(xì)胞等聯(lián)用時(shí)，指在自然界中發(fā)現(xiàn)且未經(jīng)過(guò)人為處理的材料。類似地，如本申請(qǐng)所使用的“非天然存在的”或“非天然的”指在自然界中不存在或已被人為地進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾或合成的材料。
[0244]術(shù)語(yǔ)“多肽”、“蛋白”、“肽”和“糖蛋白”可以互換使用，指并不限定任何特定長(zhǎng)度的氨基酸的聚合物。該術(shù)語(yǔ)并未排除修飾，如十四烷基化、硫酸化、糖基化、磷酸化和信號(hào)序列的添加或刪除。術(shù)語(yǔ)“多肽”或“蛋白”指一條或多條氨基酸鏈，其中每條鏈均包含通過(guò)肽鍵共價(jià)連接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白可以包括非共價(jià)和/或通過(guò)肽鍵共價(jià)連接在一起的多條鏈，具有天然蛋白的序列，即蛋白是通過(guò)天然存在的且特別是非重組的細(xì)胞生產(chǎn)的，或通過(guò)遺傳工程化或重組的細(xì)胞生產(chǎn)的序列，并且包括具有天然蛋白氨基酸序列的分子，或者天然序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被刪除、添加和/或替換的分子。術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白”特別地包括本申請(qǐng)的與IL-6R結(jié)合的抗體，或抗IL-6R抗體的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被刪除、添加、和/或替換的序列。因此，“多肽”或“蛋白”可以包括一條(稱為“單體”)或多條(稱為“多聚體”)氨基酸鏈。[0245]術(shù)語(yǔ)“分離的蛋白”在本申請(qǐng)中指對(duì)象蛋白(I)不含至少某些在自然界中常見的其他蛋白，(2)基本不含其他來(lái)自相同來(lái)源的蛋白，例如來(lái)自相同物種，(3)被來(lái)自不同物種的細(xì)胞表達(dá)，⑷已從至少約50%的多核苷酸、脂質(zhì)、碳水化合物、或在自然界與其相關(guān)的其他材料中分離，(5)與同“分離的蛋白”在自然界相關(guān)聯(lián)的蛋白的部分不相關(guān)聯(lián)(通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)相關(guān)作用)，(6)與在自然界同其不相關(guān)聯(lián)的多肽可操作地相關(guān)聯(lián)(通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)相關(guān)作用)，或者(7)在自然界中不存在。此類分離的蛋白可以由基因組DNA、cDNA、mRNA或其他RNA編碼，可以是合成來(lái)源的，或其任意組合。在一些實(shí)施方式中，分離的蛋白基本上不含存在于自然環(huán)境中干擾其使用(治療、診斷、預(yù)防、研究或其他用途)的蛋白或多肽或其他污染物。
[0246]術(shù)語(yǔ)“多肽片段”指多肽，可以是單體或多聚體，其具有天然存在的或重組生產(chǎn)的多肽的氨基末端刪除、羧基末端刪除、和/或內(nèi)部刪除或替換。在一些實(shí)施方式中，多肽片段可以包括至少5至約500個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸鏈。將理解在一些實(shí)施方式中，片段為至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、或450個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。特別有用的多肽片段包括功能性結(jié)構(gòu)域，包括抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或片段。在抗-1L-6R抗體中，有用的片段包括，但不限于=CDR區(qū)，特別是重鏈或輕鏈的CDR3區(qū)；重鏈或輕鏈的可變區(qū)；抗體鏈的一部分或僅僅是其包括兩個(gè)CDR的可變區(qū)；等等。
[0247]多肽可以包含位于蛋白N-末端的信號(hào)(或前導(dǎo))序列，其為共翻譯或翻譯后蛋白的轉(zhuǎn)移定向。多肽還可以融合于框架或與接頭或其他序列偶聯(lián)，以使多肽(例如，聚-His)易于合成、純化或鑒定，或者增強(qiáng)多肽與固體支持物的結(jié)合。
[0248]如有必要，還可以引入肽接頭/間隔區(qū)序列以通過(guò)足夠的距離分隔多種多肽組分，以確保將各多肽折疊成其二級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以將此類肽接頭序列整合至融合多肽。
[0249]可以基于例如下述標(biāo)準(zhǔn)選擇一些肽間隔區(qū)序列:(I)其能夠采用柔性伸展構(gòu)象；
(2)其不能采用能夠與第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二級(jí)結(jié)構(gòu)；和/或(3)缺乏可能與多肽功能性表位反應(yīng)的疏水性或帶電荷的殘基。
[0250]在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方式中,肽間隔區(qū)序列含有例如Gly、Asn和Ser殘基。也可以將其他近似的中性氨基酸如Thr和Ala包括在間隔區(qū)序列中。
[0251]可以將可能有用的其他氨基酸序列引入作為間隔區(qū)，包括那些在Maratea etal., Gene40:3946(1985) ；Murphy et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:82588262(1986)；美國(guó)專利號(hào)4，935，233和美國(guó)專利號(hào)4，751，180中描述的氨基酸序列。
[0252]其他示例性的間隔區(qū)可以包括，例如
[0253]Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp (Chaudhary etal.，1990，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.87:1066-1070)和
[0254]Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp (Bird et al.,1988, Science242:423-426)。
[0255]在某些實(shí)施方式中，當(dāng)?shù)谝缓偷诙嚯木哂心軌蛴糜诜指艄δ苄越Y(jié)構(gòu)域和阻止立體干擾的非必需的N-末端氨基酸區(qū)域時(shí)，不需要間隔區(qū)序列。可以將兩個(gè)編碼序列直接融合，不需要任何間隔區(qū)，或通過(guò)使用例如由五聚體Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重復(fù)I至3次組成的柔性聚合接頭。通過(guò)將此類間隔區(qū)插入VH和VL之間構(gòu)建單鏈抗體(scFv) (Bird etal., 1988, Science242:423-426 ；Huston et al., 1988, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85:5979-5883)。
[0256]在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)肽間隔區(qū)以便能夠在形成單鏈抗體可變區(qū)的兩個(gè)β片層之間發(fā)生正確的相互作用。
[0257]在一些示例性的實(shí)施方式中，肽間隔區(qū)在I至5個(gè)氨基酸之間、在5至10個(gè)氨基酸之間、在5至25個(gè)氨基酸之間、在5至50個(gè)氨基酸之間、在10至25個(gè)氨基酸之間、在10至50個(gè)氨基酸之間、在10至100個(gè)氨基酸之間，或者氨基酸的任意插入范圍。
[0258]在其他示例性的實(shí)施方式中，肽間隔區(qū)的長(zhǎng)度包括約1、5、10、15、20、25、30、35、40,45,50或更多個(gè)氨基酸。
[0259]涉及本申請(qǐng)所描述抗體的氨基酸序列的修飾。例如，其可能是改善抗體的結(jié)合親和性和/或其他生物學(xué)性質(zhì)所需的。例如，可以通過(guò)將適宜的核苷酸改變引入編碼抗體、或其鏈的多核苷酸，或通過(guò)肽合成制備抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括，例如在抗體的氨基酸序列內(nèi)刪除、和/或插入和/或替換殘基。在最終的抗體中可以引入刪除、插入、和替換的任意組合，只要最終的構(gòu)建體具有所需特性(例如，與IL-6R的高結(jié)合親和性)。氨基酸改變還可以改變抗體的翻譯后過(guò)程，如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量或位置。上文所描述的針對(duì)本發(fā)明多肽的任意變體和修飾均可以包括在本發(fā)明的抗體中。
[0260]本申請(qǐng)?zhí)峁┝吮旧暾?qǐng)的抗體的變體。在一些實(shí)施方式中，此類變體抗體或抗原結(jié)合片段，或其⑶R結(jié)合至11^-61?至少約50%、至少約70%，以及在一些實(shí)施方式中，至少約90%以及與本申請(qǐng)所示特定的抗體序列相同。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,此類抗體變體或其抗原結(jié)合片段，或其CDR，與本申請(qǐng)所示的抗體相比，其以更高的親和性結(jié)合至IL-6R，例如在數(shù)量上結(jié)合至少約105 %、106 %、107 %、108 %、109 %、或110 %以及與本申請(qǐng)所示特定的抗體序列相同。`
[0261]在特定實(shí)施方式中，對(duì)象抗體可以具有:a)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其具有的氨基酸序列與本申請(qǐng)所描述的抗-1L-6R抗體的重鏈可變區(qū)具有至少80%的同一性、至少95%的同一性、至少90%、至少95%或者至少98%或99%的同一性；和b)輕鏈可變區(qū)，其具有的氨基酸序列與本申請(qǐng)所描述的抗-1L-6R抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%的同一性、至少85 %、至少90 %、至少95 %或者至少98 %或99 %的同一性。示例性重鏈和輕鏈區(qū)的氨基酸序列如 SEQ IDNO:1、2、9-12、19、20 和 25-44 所示。
[0262]在特定實(shí)施方式中，抗體可以包括:a)重鏈可變區(qū)，其包含:1.⑶Rl區(qū)，其與本申請(qǐng)所描述的選定抗體的重鏈CDRl區(qū)的氨基酸序列具有同一性；i1.CDR2區(qū)，其與本申請(qǐng)所述選定抗體的重鏈CDR2區(qū)的氨基酸序列具有同一性；和ii1.CDR3區(qū)，其與本申請(qǐng)所述選定抗體的重鏈⑶R3區(qū)的氨基酸序列具有同一性；以及b)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含:1.⑶Rl區(qū)，其與本申請(qǐng)所述選定抗體的輕鏈CDRl區(qū)的氨基酸序列具有同一性；i1.CDR2區(qū)，其與本申請(qǐng)所述選定抗體的輕鏈CDR2區(qū)的氨基酸序列具有同一性；和ii1.CDR3區(qū)，其與本申請(qǐng)所述選定抗體的輕鏈CDR3區(qū)的氨基酸序列具有同一性；其中抗體與選定靶點(diǎn)(例如，IL-6R)特異性結(jié)合。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，抗體或其抗原結(jié)合片段是變體抗體，其中變體包含與選定抗體具有同一性的重鏈和輕鏈，除了在VH和VL區(qū)的⑶R區(qū)有至多8、9、10、11、12、13、14、15個(gè)、或更多的氨基酸替換以外。在這一點(diǎn)上，在選定抗體的⑶R區(qū)可能有1、2、3、4、5、
6、7、8個(gè)，或者在一些實(shí)施方式中，有9、10、11、12、13、14、15個(gè)、或更多的氨基酸替換。替換可以在 VH 和 / 或 VL 區(qū)的 CDR(參見例如 Muller, 1998，Structure6:1153-1167)。
[0263]可以通過(guò)常規(guī)方法，例如用選定的天然或非天然氨基酸替換、添加、刪除或插入一種或多種氨基酸，制得示例多肽(例如，如本申請(qǐng)所提供的變體IL-6R-特異性抗體，如具有本申請(qǐng)所提供的抗原結(jié)合片段的抗體蛋白)，其三維結(jié)構(gòu)可以通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)行測(cè)定，以確定這樣衍生的結(jié)構(gòu)變體保留了在此公開的種類的空間填充性質(zhì)。參見，例如Donate et al.,1994Prot.Sc1.3:2378 ；Bradley et al., Science309: 1868-1871(2005)；Schueler-Furman et al., Science310:638 (2005) ；Dietz et al., Proc.Nat.Acad.Sc1.USA103:1244(2006) ；Dodson et al., Nature450:176(2007) ；Qian et al., Nature450:259(2007) ；Raman et al.，Science327:1014-1018 (2010)?？梢杂糜谶@些和相關(guān)的實(shí)施方式的計(jì)算機(jī)算法的一些附加的非限制性例子，如針對(duì)本申請(qǐng)?zhí)峁┑腎L-6R-特異性抗體及其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的合理設(shè)計(jì)，包括VMD，這是一個(gè)使用3-D圖形和內(nèi)置腳本用于顯示、動(dòng)畫和分析較大的分子生物系統(tǒng)的分子可視化程序(參見Theoretical and ComputationalBiophysics Group 的網(wǎng)站，University of Illinois at Urbana-Champagne,at ks.uiuc.edu / Research / vmd / )。多種其他計(jì)算機(jī)程序均是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的和可用的，其可以用于通過(guò)能量最小化構(gòu)象的空間填充模型(范德華半徑)確定原子的尺寸；GRID，其用于確定不同化學(xué)基團(tuán)的高親和性區(qū)域，以增強(qiáng)結(jié)合，Monte Carlo檢索，用于數(shù)學(xué)比對(duì)，以及 CHARMM (Brooks et al.，(1983) J.Comput.Chem.4:187-217)和 AMBER (Weiner etal.， (1981) J.Comput.Chem.106:765),其評(píng)估力場(chǎng)計(jì)算結(jié)果和分析(亦參見，Eisenfieldet al.，(1991) Am.J.Physiol.261:C376_386 ；Lybrand(1991) J.Pharm.Belg.46:49-54 ；Froimowitz (1990) Biotechniques8:640-644 ；Burbam et al., (1990) Proteins7:99-111 ；Pedersen(1985)Environ.Health Perspect.61:185-190 ；和 Kini et al., (1991)J.Biomol.Struct.Dyn.9:475-488)。多種適宜的計(jì)算用計(jì)算機(jī)程序也可購(gòu)買獲得，如從Schr6dinger (Munich, Germany)購(gòu)買。
[0264]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，抗-1L-6R抗體及其人源化形式是衍生自家兔單克隆抗體，并且特別地使用RabMAb?技術(shù)產(chǎn)生。這些抗體是有利的，因?yàn)槠湫枰钚〉男蛄行揎?，以利于在使用突變譜系引導(dǎo)(MLG)人源化技術(shù)(參見，例如美國(guó)專利號(hào)7，462，697)進(jìn)行人源化后保留功能性質(zhì)。因此，用于制備本申請(qǐng)的抗-1L-6R抗體的示例性方法包括，例如在美國(guó)專利5，675，063和7，429，487中已描述的RabMab?家兔單克隆抗體技術(shù)。在這一點(diǎn)上，在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)的抗-1L-6R抗體在家兔中生產(chǎn)。在特定實(shí)施方式中，將能夠與家兔脾細(xì)胞融合的家兔來(lái)源的永生化B-淋巴細(xì)胞用于生產(chǎn)產(chǎn)生抗體的雜交細(xì)胞。永生化的B-淋巴細(xì)胞并不會(huì)可檢測(cè)地表達(dá)內(nèi)源性的免疫球蛋白重鏈，并且在某些實(shí)施方式中可能含有改變的免疫球蛋白重鏈編碼基因。
[0265]組合物和使用方法
[0266]本申請(qǐng)?zhí)峁┝税琁L-6R-特異性抗體及其抗原結(jié)合片段的組合物，以及在多種治療設(shè)置中給予此類組合物。
[0267]術(shù)語(yǔ)“主體”是指包括任何哺乳動(dòng)物或任何脊椎動(dòng)物，其可以用作人類疾病的模型系統(tǒng)。主體的例子包括人類，猴，猩猩，狗，貓，小鼠，大鼠，魚，斑馬魚，鳥，馬，豬，牛，綿羊，山羊肩，鴨，驢，火雞，孔雀，龍貓，雪紹，沙鼠，兔，豚鼠，倉(cāng)鼠，及它們的轉(zhuǎn)基因物種。在特定的實(shí)施方式中，主體是患有需要治療的特定疾病的人類患者，如本申請(qǐng)中進(jìn)一步所述。[0268]以純化形式或適宜的藥物組合物形式給予本申請(qǐng)所述的IL-6R-特異性抗體可以通過(guò)類似用途試劑的任意可接受給藥模式實(shí)現(xiàn)。藥物組合物可以通過(guò)將抗體或含有抗體的組合物與適宜的生理學(xué)上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑組合制備，可以被制成固體、半固體、液體或氣體形式的制劑，如片劑、膠囊、粉劑、顆粒、軟膏、溶液劑、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球、和氣霧劑。此外，其他藥物活性成分(包括如本申請(qǐng)其他地方所描述的其他抗癌劑)和/或適宜的賦形劑如鹽、緩沖劑和穩(wěn)定劑可以，但并非必須，存在于組合物中?？梢酝ㄟ^(guò)多種不同途徑實(shí)現(xiàn)給藥，包括口服、胃腸外、鼻內(nèi)、靜脈、皮內(nèi)、皮下或局部。優(yōu)選的給藥方式取決于待治療或預(yù)防狀況的性質(zhì)。給藥后，將降低、抑制、阻止或延遲癌癥的進(jìn)展和/或轉(zhuǎn)移的量認(rèn)為是有效的。
[0269]在一些實(shí)施方式中，給藥量足以導(dǎo)致腫瘤消退，這可以由存活腫瘤的量在數(shù)據(jù)學(xué)上顯著減少來(lái)指示，例如，腫瘤質(zhì)量至少減少50 %，或通過(guò)掃描尺寸的改變(例如，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的減少)。在其它實(shí)施方式中，給藥量足以導(dǎo)致風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀臨床有關(guān)的減少，比如，但不限于，疲勞，食欲不振，低熱，腺體腫大，乏力，關(guān)節(jié)腫脹，關(guān)節(jié)疼痛，晨僵，溫?zé)?warm),壓痛(tender),和不使用一小時(shí)時(shí)關(guān)節(jié)僵硬,雙側(cè)關(guān)節(jié)疼痛(可能影響手指(而不是指尖)，腕，肘，肩，臀部，膝蓋，腳踝，腳趾，下巴，頸部)；受影響關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍減少，胸膜炎，眼燒灼感，眼癢，眼分泌物，皮膚下結(jié)節(jié)，肢體麻木，刺痛，或手腳灼燒感中一種或多種的減輕。
[0270]精確的劑量和治療持續(xù)時(shí)間是所治療疾病的函數(shù)，可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)使用本領(lǐng)域公知的檢測(cè)方法確定，或通過(guò)在本領(lǐng)域已知的模型系統(tǒng)中測(cè)試組合物外推確定。也可以進(jìn)行受控的臨床試驗(yàn)?？梢砸罁?jù)待緩解狀況的嚴(yán)重程度改變劑量。通常將藥物組合物制成制劑并給藥，以發(fā)揮有用的治療效果，同時(shí)使不需要的副作用最小化。組合物可以一次給予，或者可以分成多個(gè)更小的劑量在時(shí)間間隔下給予。對(duì)于任何特定對(duì)象而言，可以根據(jù)個(gè)體的需要隨時(shí)間調(diào)整特定給藥方案。
[0271]含有IL-6R-特異性抗體的組合物可以單獨(dú)給藥，或與其他已知的癌癥療法聯(lián)合給藥，如放療、化療、移植、免疫療法、激素療法、光動(dòng)力學(xué)療法等。組合物還可以與抗生素聯(lián)合給藥。
[0272]因而，這些和相關(guān)的藥物組合物的典型給藥途徑包括，但不限于，口服、局部、經(jīng)皮、吸入、胃腸外、舌下、直腸、陰道、和鼻內(nèi)。如本申請(qǐng)所使用的，術(shù)語(yǔ)胃腸外包括皮下注射、靜脈、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，將藥物組合物制成制劑，以使得將藥物組合物給予患者后，其中含有的活性成分成為生物可利用的。將給予對(duì)象或患者的組合物可以是具有一種或多種劑量單位的形式，其中例如片劑可以是單一劑量單位，和本申請(qǐng)所描述的IL-6R-特異性抗體以氣霧劑形式在其中的容器，其可以具有多個(gè)劑量單位。制備此類劑型的實(shí)際方法是已知的，或?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的；例如參見Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第20版(PhiladelphiaCollege ofPharmacy and Science, 2000)。在任何情況下,待給予的組合物將含有本申請(qǐng)的治療有效量的抗體，在本申請(qǐng)的教導(dǎo)下用于治療感興趣的疾病或狀況。
[0273]藥物組合物可以是固體或液體形式。在一個(gè)實(shí)施方式中，載劑是顆粒，以使得組合物是，例如，片劑或粉劑形式。載劑可以是液體，組合物是例如口服油、可注射液體或氣霧劑，其用于例如吸入給藥。當(dāng)用于口服給藥時(shí)，藥物組合物優(yōu)選固體或液體形式，半固體、半液體、混懸劑和凝膠形式包括在本申請(qǐng)所述的固體或液體形式內(nèi)。
[0274]作為用于口服給藥的固體組合物，可以將藥物組合物制成粉劑、顆粒、壓制片、丸劑、膠囊、口香糖、或薄片等。此類固體組合物將典型地含有一種或多種惰性稀釋劑或可食用載劑。此外，可以存在下述中的一種或多種:粘合劑如羧甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、西黃耆膠或明膠；賦形劑如淀粉、乳糖或糊精；崩解劑如海藻酸、海藻酸鈉、羧甲基淀粉鈉(Primogel)、玉米淀粉等；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或氫化植物油(Sterotex);助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；調(diào)味劑如薄荷油、水楊酸甲酯或桔子調(diào)味劑；和著色劑。當(dāng)藥物組合物是膠囊形式時(shí)，例如明膠膠囊，除上述類型的材料以外，其還可能含有液體載劑，如聚乙烯乙二醇或油。
[0275]藥物組合物可以是液體形式，例如酏劑、糖漿、溶液、乳劑或混懸劑。作為兩個(gè)例子，液體可以用于口服給藥或用于通過(guò)注射遞送。當(dāng)用于口服給藥時(shí)，除了本化合物以外，優(yōu)選的組合物還含有一種或多種甜味劑、防腐劑、染料/著色劑和增香劑。在用于注射給藥的組合物中，可以包括一種或多種表面活性劑、防腐劑、潤(rùn)濕劑、分散劑、混懸劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑和等張劑。
[0276]液體藥物組合物，無(wú)論其是溶液、混懸液或其他形式，其可以包括一種或多種下述輔劑:無(wú)菌稀釋劑如注射用水、鹽溶液，優(yōu)選生理鹽水、林格氏溶液、等滲氯化鈉、不揮發(fā)性油如合成甘油單酯或二酯，其可以作為溶劑或混懸基質(zhì)、聚乙烯乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶劑；抗菌劑如苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和調(diào)節(jié)張力的試劑，如氯化鈉或右旋糖?？梢詫⑽改c外制劑密封于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量藥瓶中。生理鹽水是優(yōu)選的輔劑?？勺⑸涞乃幬锝M合物優(yōu)選是無(wú)菌的。
[0277]用于胃腸外或口服給藥的液體藥物組合物應(yīng)含有一定量的本申請(qǐng)公開的IL-6R-特異性抗體，以獲得適 宜的劑量。通常，該劑量為組合物中至少0.01%的抗體。當(dāng)用于口服給藥時(shí)，該劑量可以在組合物重量的0.1至約70%之間變化。一些口服藥物組合物含有約4%至約75%的抗體。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明制備藥物組合物和制備物，使得在稀釋前胃腸外劑量單位中含有以重量計(jì)0.01至10%的抗體。
[0278]藥物組合物可以用于局部給藥，在這種情況下適宜的載劑可以包括溶液、乳劑、軟膏或凝膠基質(zhì)?；|(zhì)，例如，可以包括下述中的一種或多種:凡士林油、羊毛脂、聚乙烯乙二醇、蜂蠟、礦物油、稀釋劑，如水和醇、以及乳化劑和穩(wěn)定劑。在用于局部給藥的藥物組合物中可以存在增稠劑。如果用于經(jīng)皮給藥，組合物可以包括經(jīng)皮貼片或離子電滲療法設(shè)備。藥物組合物可以用于直腸給藥，例如栓劑形式，其將在直腸內(nèi)融化并釋放藥物。用于直腸給藥的組合物可以含有油狀基質(zhì)作為適宜的非刺激性賦形劑。此類基質(zhì)包括，但不限于，羊毛脂、可可豆脂和聚乙烯乙二醇。
[0279]藥物組合物可以包括多種材料，其修飾固體或液體劑量單位的物理形式。例如，組合物可以包括在活性成分外形成衣殼的材料。形成衣殼的材料一般是惰性的，可以選自，例如糖、蟲膠、和其他腸溶性包衣劑。或者，可以將活性成分包裝在明膠膠囊中。固體或液體形式的藥物組合物可以包括與本發(fā)明抗體結(jié)合的試劑，從而輔助化合物的遞送?？梢园l(fā)揮該作用的適宜試劑包括其他單克隆或多克隆抗體，一種或多種蛋白或脂質(zhì)體。藥物組合物可以基本上由能夠作為氣霧劑給予的劑量單元組成。術(shù)語(yǔ)氣霧劑用于表示多種系統(tǒng)，其范圍為具有膠體性質(zhì)的系統(tǒng)至由加壓包裝組成的系統(tǒng)?？梢酝ㄟ^(guò)液化或壓縮氣體或通過(guò)使活性成分分散的適宜的泵系統(tǒng)遞送。氣霧劑可以在單相、二相、或三相系統(tǒng)中遞送，以遞送活性成分。氣霧劑的遞送包括必須的容器、活性劑、閥、內(nèi)部容器等，其在一起可以形成試劑盒。在不需要過(guò)度實(shí)驗(yàn)的情況下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員就可以確定優(yōu)選的氣霧劑。
[0280]可以通過(guò)藥物領(lǐng)域公知的方法制備藥物組合物。例如,用于注射給藥的藥物組合物可以通過(guò)將包含本申請(qǐng)所述的IL-6R-特異性抗體的組合物與任選地一種或多種鹽、緩沖劑和/或穩(wěn)定劑組合，加入無(wú)菌蒸餾水以形成溶液。可以加入表面活性劑以便于形成均一的溶液或混懸液。表面活性劑是與抗體組合物發(fā)生非共價(jià)相互作用以便于抗體在水性遞送系統(tǒng)中溶解或均勻混懸的化合物。
[0281]可以以治療有效量給予組合物，治療有效量取決于多種因素，包括所使用的特定化合物(例如，IL-6R-特異性抗體)的活性；化合物的代謝穩(wěn)定性和作用長(zhǎng)度；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別、和飲食；給藥方式和時(shí)間；排泄速率；藥物合用；特定疾病或狀況的嚴(yán)重程度；以及接受治療的對(duì)象。一般情況下，每日治療有效量(針對(duì)70kg的哺乳動(dòng)物)為約0.0Olmg / kg(即，0.07mg)至約IOOmg / kg(即，7.0g);優(yōu)選地治療有效量(針對(duì)70kg的哺乳動(dòng)物)為約0.01mg / kg(即，0.7mg)至約50mg / kg(即，3.5g);更優(yōu)選地，治療有效量(針對(duì)70kg的哺乳動(dòng)物)為約Img / kg(即，70mg)至約25mg / kg(即，
1.75g)。
[0282]包含本申請(qǐng)的IL-6R-特異性抗體的組合物還可以與一種或多種其他治療劑同時(shí)、在其之前或之后給藥。此類聯(lián)合治療可以包括給予單一藥物劑型，其含有本發(fā)明的化合物和一種或多種附加活性劑，以及給予組合物，其包含本發(fā)明的抗體，并且各活性劑分別在其各自藥物劑型中。例如，本申請(qǐng)所描述的抗體和另一種活性劑可以在單一口服劑型組合物如片劑或膠囊中一并給予患者，或各試劑分別在單獨(dú)的口服劑型中給予。類似地，本申請(qǐng)所描述的抗體和另一種活性劑可以在單一`胃腸外劑型組合物如溶液或其他生理學(xué)可接受的溶液中一并給予患者，或各試劑分別在單獨(dú)的胃腸外劑型中給予。當(dāng)使用單獨(dú)劑型時(shí)，包含抗體和一種或多種附加活性劑的組合物可以基本上同時(shí)給予，即同時(shí)地，或在單獨(dú)的交錯(cuò)時(shí)間，即連續(xù)地和以任何順序給予；將聯(lián)合治療理解為包括所有這些方案。
[0283]因此，在一些實(shí)施方式中，還涉及將本申請(qǐng)的抗-1L-6R抗體組合物與一種或多種其他治療劑聯(lián)合給予。本領(lǐng)域可以接受此類治療劑作為本申請(qǐng)所描述的特定疾病狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)治療，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥或癌癥。示例性的治療劑包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、類固醇、NSAID、DMARD、抗炎劑、化療劑、放療劑、或其他活性和輔助試劑。
[0284]在一些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)公開的抗-1L-6R抗體可以與任意量的放療劑聯(lián)合給予。放療劑的例子包括:烷化劑，如噻替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXAN?);烷基磺酸鹽，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙唳類，如苯多巴(benzodopa)、卡巴醌、偏尿多巴(meturedopa)、和尿多巴(uredopa);乙撐亞胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亞乙基膦酰胺、三亞乙基硫化磷酰胺和三羥甲基蜜胺；氮芥類，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、鹽酸甲氧氮芥、美法侖、新恩比興、苯芥膽留醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司汀；亞硝基脲，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司??；抗生素，如阿克拉霉素、放線菌素、葸霉素、重氮絲氨酸、博來(lái)霉素、放線菌素C、卡里奇霉素、卡柔比星、洋紅霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔紅霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊達(dá)比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲菌素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝類，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，如氟達(dá)拉濱、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、脫氧氟脲苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU;雄激素，如卡普睪酮、屈他雄酮丙酸酯、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺素劑，如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑，如亞葉酸；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安口丫唳；阿莫斯汀(bestrabucil);比生群；依達(dá)曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地卩丫醌；艾弗咪辛(elformithine);依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；蘑燕多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托葸醌；莫哌達(dá)醇；硝基可潤(rùn)；噴司他丁 ；苯來(lái)美特；吡柔比星；鬼白酸；2_乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK.RTM.;雷佐生；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2'，2"-三氯三乙胺；烏拉坦；長(zhǎng)春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴燒；伽胞喃唳(gacytosine);阿糖胞苷(〃Ara_C〃)；環(huán)磷酰胺；塞替派；紫杉燒類,例如紫杉醇(TAXOL?, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)和多西他賽(TAXOTERE?., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France);苯丁酸氮芥；吉西他濱;6_ 硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲氨蝶呤；鉬類似物，如順鉬和卡鉬；長(zhǎng)春堿；鉬；依托泊苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C ;米托葸醌；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春瑞濱；諾維本；諾安托；替尼泊苷；柔紅霉素；氨基蝶呤；希羅達(dá)；伊班膦酸鹽；CPT-11 ;拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000 ;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);維甲酸衍生物，如蓓薩羅丁 ?(貝沙羅汀)、PanretinTM(阿利維甲酸)；0NTAK?(地尼白介素-毒素連接物);埃斯培拉霉素；卡培他濱；以及任意上述藥物的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在該定義中還包括抗激素劑，其在腫瘤中調(diào)節(jié)或抑制激素的作用，如抗雌激素，其包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制劑4 (5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛西芬、LY117018、奧那司酮和托瑞米芬(法樂(lè)通)；和抗雄激素，如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、醋酸亮丙瑞林、和戈舍瑞林；以及任意上述藥物的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。
[0285]多種其他治療劑可以用于與本申請(qǐng)所描述的抗-1L-6R抗體聯(lián)用。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體與抗炎劑聯(lián)合給藥?？寡讋┗蛩幬锇?，但不限于，留體激素和糖皮質(zhì)激素(包括倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氫化可的松、氫化可的松、氫化可的松、甲基強(qiáng)的松龍、潑尼松龍、潑尼松、曲安西龍)、非留體抗炎藥(NSAIDS)，其包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、來(lái)氟米特，抗-TNF藥物、環(huán)磷酰胺，和霉酚酸酯。
[0286]可以將包含本申請(qǐng)所描述的IL-6R-特異性抗體的組合物給予罹患本申請(qǐng)所描述的疾病的主體，所述疾病如炎性疾病或癌癥。在這個(gè)方面，可以將包含如本申請(qǐng)所描述的IL-6R特異性抗體的所述組合物給予患有炎性疾病的主體，所述炎性疾病例如,但不限于，青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、結(jié)腸炎、皮炎、牛皮癬、憩室炎、肝炎、腸易激綜合征(IBS)、紅斑狼瘡、腎炎、帕金森氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化癥(MS)、阿爾茨海默氏癥、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、和多種心血管疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化和血管炎。在某些實(shí)施方式中，所述炎性疾病選自糖尿病、痛風(fēng)、冷批啉(cryopyrin)相關(guān)的周期性綜合癥、慢性阻塞性肺疾病。在這方面，一個(gè)實(shí)施方式提供了一種方法，其通過(guò)給予所需患者治療有效量的本申請(qǐng)組合物來(lái)治療、減輕炎性疾病的嚴(yán)重程度或預(yù)防炎性疾病。
[0287]一個(gè)實(shí)施方式提供了一種治療，減輕癌癥的嚴(yán)重程度或預(yù)防癌癥，所述癌癥包括，但不限于，多發(fā)性骨髓瘤，血漿細(xì)胞白血病，腎細(xì)胞癌，卡波濟(jì)氏肉瘤，大腸癌，胃癌，黑色素瘤，白血病，淋巴瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，肺癌(包括但不限于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC ;腺癌和鱗狀細(xì)胞癌))，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金病，漿細(xì)胞瘤，肉瘤，胸腺瘤，乳腺癌，前列腺癌，肝細(xì)胞癌，膀胱癌，子宮癌，胰腺癌，食道癌，腦腫瘤，頭頸部癌，卵巢癌，宮頸癌，睪丸癌，胃癌，食道癌，肝癌，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，T-ALL，急性髓系白血病(AML)，慢性髓系白血病(CML)和慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)，唾腺癌或其他癌癥。
[0288]本申請(qǐng)的另一個(gè)實(shí)施方式提供了一種治療，減輕疾病的嚴(yán)重程度或預(yù)防疾病的方法，所述疾病選自敗血癥,骨吸收(骨質(zhì)疏松癥)，惡病質(zhì),與癌癥有關(guān)的疲勞,銀屑病,全身型青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，系膜增生性腎小球腎炎，高Y球蛋白血癥，卡斯特萊曼病(Castleman’ s disease), IgM丙種球蛋白病,心臟粘液瘤和自身免疫性胰島素依賴型糖尿病。
[0289]在體內(nèi)使用用于治療疾病，特別是人類疾病時(shí)，一般在給藥前將本申請(qǐng)所描述的抗體混入藥物組合物。藥物組合物包含本申請(qǐng)所描述的一種或多種抗體聯(lián)合本申請(qǐng)其他地方描述的生理學(xué)上可接受的載劑或賦形劑。為制備藥物組合物，將有效量的一種或多種化合物與本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的適于特定給藥形式的任意藥物載劑或賦形劑混合。藥物載劑可以是液體、半液體或固體。用于胃腸外、皮內(nèi)、皮下或局部應(yīng)用的溶液或混懸液可以包括，例如無(wú)菌稀釋劑(如水)、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙烯乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗微生物劑(如苯甲醇和尼泊金甲酯)；抗氧劑(如抗壞血酸和酸性亞硫酸鈉)和螯合劑(如乙二胺四乙酸(EDTA));緩沖劑(如醋酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽)。如果靜脈給藥，適宜的載劑包括生理鹽水或磷酸緩沖鹽(PBS)，以及含有增稠劑和增溶劑的溶液，如葡萄糖、聚乙烯乙二醇、丙二醇及其混合物。
[0290]包含本申請(qǐng)所描述的IL-6R-特異性抗體的組合物可以由載劑制備，其保護(hù)抗體不從機(jī)體迅速消除，如緩釋制劑和包衣。此類載劑包括控釋制劑，例如但不限于，植入劑和微囊遞送系統(tǒng)，以及生物可降解的、生物相容性的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的那些聚合物。
[0291]本申請(qǐng)?zhí)峁┝耸褂门cIL-6R結(jié)合的抗體治療的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體給予患有與IL-6的不適宜表達(dá)有關(guān)的疾病的患者,在本申請(qǐng)的上下文中的意思中包括，以IL-6的表達(dá)或活化異常為特征的疾病和病癥，由于例如蛋白存在量的改變(例如，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加或減少)、或存在突變蛋白、或二者兼有導(dǎo)致。過(guò)量可能由任何原因?qū)е拢ǖ幌抻冢肿铀降倪^(guò)表達(dá)、在作用位點(diǎn)的延遲或蓄積出現(xiàn)、或相對(duì)于正常可檢測(cè)的IL-6(或IL-6R)的活性增加(例如，以具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的方法)?？梢韵鄬?duì)于正常表達(dá)、外觀、或IL-6或IL-6R信號(hào)事件的活性對(duì)此類IL-6的過(guò)表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并且所述檢測(cè)在本申請(qǐng)所描述的抗體的開發(fā)和/或臨床檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
[0292]特別地，本發(fā)明的抗體可用于多種與IL-6表達(dá)相關(guān)的癌癥的治療。例如，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供了一種用于治療癌癥的方法，癌癥包括，但不限于，多發(fā)性骨髓瘤，漿細(xì)胞白血病，腎細(xì)胞癌，卡波濟(jì)氏肉瘤，口腔鱗狀細(xì)胞癌，胰腺癌和結(jié)腸癌，所述方法通過(guò)向癌癥患者給予治療有效量的本發(fā)明公開的IL-6R特異性抗體。給藥后，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上顯著(即，相對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)?shù)膶?duì)照)抑制，阻止或延遲癌癥的進(jìn)展和/或轉(zhuǎn)移的量被認(rèn)為是有效的。
[0293]另一個(gè)實(shí)施方式提供了一種用于預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的方法，癌癥包括，但不限于，多發(fā)性骨髓瘤，漿細(xì)胞白血病，腎細(xì)胞癌，卡波濟(jì)氏肉瘤，口腔鱗狀細(xì)胞癌，胰腺癌，結(jié)腸癌，所述方法通過(guò)向癌癥患者給予治療有效量的本發(fā)明所公開的IL-6R特異性抗體(例如，給藥后，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上顯著抑制，阻止或延遲癌癥轉(zhuǎn)移的量，即，相對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)?shù)膶?duì)照)。
[0294]另一個(gè)實(shí)施方式提供了一種用于預(yù)防癌癥的方法，癌癥包括，但不限于，多發(fā)性骨髓瘤，漿細(xì)胞白血病，腎細(xì)胞癌，卡波濟(jì)氏肉瘤，口腔鱗狀細(xì)胞癌，胰腺癌，結(jié)腸癌，所述方法通過(guò)向癌癥患者給予治療有效量的本發(fā)明公開的IL-6R特異性抗體。
[0295]另一個(gè)實(shí)施方式提供了一種治療，抑制疾病進(jìn)展或`預(yù)防疾病的方法，所述疾病為敗血癥，骨吸收(骨質(zhì)疏松癥)，惡病質(zhì)，與癌癥有關(guān)的疲勞，銀屑病，全身型青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，系膜增生性腎小球腎炎，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，高Y球蛋白血癥，卡斯特萊曼病(Castleman’s disease),心臟粘液瘤，IgM丙種球蛋白病和自身免疫性胰島素依賴型糖尿病，所述方法通過(guò)向患有一個(gè)或多個(gè)這些疾病的患者給予治療有效量的本申請(qǐng)公開的IL-6R特異性抗體。
[0296]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗-1L-6R抗體用于確定結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)，例如構(gòu)象表位，然后可以用該結(jié)構(gòu)，通過(guò)例如化學(xué)建模和SAR方法來(lái)開發(fā)具有或模擬該結(jié)構(gòu)的化合物。
[0297]本發(fā)明的其他各實(shí)施方式，部分地，涉及用于檢測(cè)是否存在表達(dá)IL-6R的細(xì)胞或組織的診斷應(yīng)用。因此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N檢測(cè)樣品中的IL-6R的方法，如檢測(cè)表達(dá)IL-6R的細(xì)胞或組織。此類方法可以應(yīng)用于多種已知的檢測(cè)形式，包括但不限于，免疫組織化學(xué)(IHC)、免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)、原位雜交(ISH)、整體原位雜交(WISH)、熒光DNA原位雜交(FISH)、流式細(xì)胞術(shù)、酶免疫法(EIA)、和酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)。
[0298]ISH是一種雜交類型，其使用標(biāo)記的互補(bǔ)DNA或RNA鏈(即，第一結(jié)合劑)，以便在細(xì)胞或組織(原位)的一部分或切片上定位特定的DNA或RNA序列，或者如果組織足夠小，則可以在整個(gè)組織上定位(整體ISH)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，這與免疫組織化學(xué)不同，后者使用抗體作為第一結(jié)合劑在組織切片上定位蛋白。DNA ISH可以用于基因組DNA以確定染色體的結(jié)構(gòu)。熒光DNA ISH(FISH)可以，例如，用于醫(yī)療診斷以評(píng)價(jià)染色體的完整性。RNA ISH (雜交組織化學(xué))用于在組織切片或全組織標(biāo)本中檢測(cè)和定位mRNA和其他轉(zhuǎn)錄物。
[0299]在不同實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所描述的抗體偶聯(lián)至可以被直接或間接檢測(cè)的可檢測(cè)標(biāo)記。在這一點(diǎn)上，抗體“偶聯(lián)”指共價(jià)連接至可檢測(cè)標(biāo)記的抗-1L-6R抗體。在本發(fā)明中，DNA探針、RNA探針、單克隆抗體、及其抗原結(jié)合片段和其抗體衍生物，如單鏈可變片段抗體或表位標(biāo)簽抗體，均可以共價(jià)連接至可檢測(cè)標(biāo)記。在“直接檢測(cè)”中，僅使用一個(gè)可檢測(cè)抗體，即第一可檢測(cè)抗體。因此，直接檢測(cè)指偶聯(lián)至可檢測(cè)標(biāo)記的抗體本身可以被檢測(cè)，而不需要加入另一個(gè)抗體(二抗)。[0300]“可檢測(cè)標(biāo)簽”是能夠產(chǎn)生可檢測(cè)(如可見地、電子地或其他)信號(hào)的分子或材料，所述信號(hào)指示樣品中存在標(biāo)記和/或其濃度。當(dāng)偶聯(lián)至抗體時(shí)，可檢測(cè)標(biāo)記可以用于定位和/或定量特異性抗體指示的靶點(diǎn)。因此，可以通過(guò)檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)檢測(cè)樣品中靶點(diǎn)的存在情況和/或其濃度。可以直接或間接地檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記，可以使用偶聯(lián)至不同特異性抗體的若干不同可檢測(cè)標(biāo)記聯(lián)合檢測(cè)一種或多種靶點(diǎn)。
[0301]可以被直接檢測(cè)的可檢測(cè)標(biāo)記的例子包括，熒光染料和放射性物質(zhì)以及金屬粒子。而相反地，間接檢測(cè)要求在使用一抗后使用一種或多種附加抗體，即二抗。因此，通過(guò)檢測(cè)二抗或結(jié)合劑與第一檢測(cè)抗體的結(jié)合進(jìn)行該檢測(cè)。需要加入第二結(jié)合劑或抗體的第一檢測(cè)結(jié)合劑的例子包括，酶檢測(cè)結(jié)合劑和半抗原檢測(cè)結(jié)合劑或抗體。
[0302]在某些實(shí)施方式中，可檢測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)至核酸聚合物，其包含第一結(jié)合劑(例如，在ISH、WISH、或FISH過(guò)程中)。在其他實(shí)施方式中，可檢測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)至抗體，其包含第一結(jié)合劑(例如，在IHC過(guò)程中)。
[0303]可以偶聯(lián)至本申請(qǐng)方法中使用的抗體的可檢測(cè)標(biāo)記的例子包括，熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、聚合物、聚合物粒子、金屬粒子、半抗原、和染料。
[0304]熒光標(biāo)記的例子包括,5-(和6)-羧基熒光素、5-或6-羧基熒光素、6_(熒光素)-5-(和6)-羧酰胺基已酸、異硫氰酸酯熒光素、羅丹明、四甲基羅丹明、和染料，如Cy2、Cy3、和Cy5，任選取代的香豆素，包括AMCA、PerCP，藻膽蛋白包括R-藻紅蛋白(RPE)和別藻紅蛋白(APC)、得克薩斯紅、普林斯頓紅、綠色熒光蛋白(GFP)及其類似物、和R-藻紅蛋白或別藻紅蛋白的偶聯(lián)物，無(wú)機(jī)熒光標(biāo)記如基于半導(dǎo)體材料如涂覆CdSe納米晶的粒子。
[0305]聚合物粒子標(biāo)記的例子包括，聚苯乙烯微?；蚰z乳粒子、PMMA或二氧化硅，其可以嵌入熒光染料，或者聚合物膠 束或膠囊，其含有染料、酶或底物。
[0306]金屬粒子標(biāo)記的例子包括金粒子和涂層金粒子，其可以通過(guò)銀染被轉(zhuǎn)化。半抗原的例子包括DNP、熒光素異硫氰酸酯(FITC)、生物素、和地高辛。酶標(biāo)記的例子包括辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(ALP或AP)、β -半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖_6_磷酸脫氫酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、蔗糖酶、黃嘌呤氧化酶、螢火蟲熒光素酶和葡萄糖氧化酶(GO)。辣根過(guò)氧化物酶常用底物的例子包括，3，3' -二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、鎳增強(qiáng)的二氨基聯(lián)苯胺、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、聯(lián)苯胺二鹽酸鹽(BDHC)、Hanker-Yates試劑(HYR)、靛酚藍(lán)(IB)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、4_氯-1-萘酚(CN)、α -萘酚派洛寧U-NP)、鄰聯(lián)茴香胺(OD)、5_溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)、硝基四氮唑藍(lán)(ΝΒΤ)、2-(ρ-碘苯基)-3-ρ-硝基苯基-1-5-苯基氯化四氮唑(INT)、四硝基四氮唑藍(lán)(TNBT)、5_溴-4-氯-3-吲哚酚-β -D-半乳糖苷/鐵-鐵氰化鉀(BCIG / FF)。
[0307]堿性磷酸酶常用底物的例子包括，萘酚-AS-Bl-磷酸鹽/快速紅TR (ΝΑΒΡ / FR)、萘酚-AS-MX-磷酸鹽/快速紅TR (ΝΑΜΡ / FR)、萘酚-AS-Bl-磷酸鹽/ -快速紅TR (ΝΑΒΡ /FR)、萘酚-AS-MX-磷酸鹽/快速紅TR(NAMP / FR)、萘酚-AS-Bl-磷酸鹽/新品紅(NABP /NF)、溴氯吲哚磷酸鹽/硝基四氮唑藍(lán)(BCIP / NBT)、5_溴-4-氯-3-吲哚基-b—d_吡喃半乳糖苷(BCIG)。
[0308]發(fā)光標(biāo)記的例子包括魯米諾、異魯米諾、吖啶酯、1，2-二氧戊環(huán)和吡啶并噠嗪。電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的例子包括釕衍生物。放射性標(biāo)記的例子包括碘、鈷、硒、氚、碳、硫和磷的同位素。
[0309]可以將可檢測(cè)標(biāo)記連接至本申請(qǐng)所描述的抗體或與感興趣的生物學(xué)標(biāo)記物特異性結(jié)合的任意其他分子，例如抗體、核酸探針、或聚合物。而且，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，還能夠?qū)⒖蓹z測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)至第二、和/或第三、和/或第四、和/或第五結(jié)合劑或抗體等。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，用于表征感興趣的生物學(xué)標(biāo)記物的每個(gè)附加的結(jié)合劑或抗體可以用于信號(hào)放大步驟。當(dāng)可檢測(cè)底物是例如染料、膠體金粒子、發(fā)光劑時(shí)，可以使用例如光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡對(duì)生物學(xué)標(biāo)記物進(jìn)行目測(cè)檢測(cè)。還可以使用質(zhì)譜對(duì)連接至生物學(xué)標(biāo)記物的目測(cè)檢測(cè)底物進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)可檢測(cè)底物是放射性同位素時(shí)，可以通過(guò)放射自顯影目測(cè)檢測(cè)，或使用閃爍計(jì)數(shù)器非目測(cè)檢測(cè)。參見例如，Larsson, 1988,Immunocytochemistry:Theory and Practice, (CRC Press, Boca Raton, Fla.) ；Methodsin Molecular Biology, vol.801998, John D.Pound(ed.)(Humana Press, Totowa, N.J.)。
[0310]本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于檢測(cè)樣品中的IL-6R或者表達(dá)IL-6R的細(xì)胞或組織的試劑盒，其中所述試劑盒含有本申請(qǐng)所描述的至少一種抗體、多肽、多核苷酸、載體或宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，試劑盒可以含有緩沖劑、酶、標(biāo)記、底物、小珠或供本發(fā)明的抗體附著的其他表面等等，以及使用說(shuō)明。
實(shí)施例
[0311]實(shí)施例1
[0312]抗-1L-6R抗體的生產(chǎn)和人源化
[0313]使用在完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich)中的0.4mg重組人IL-6R-細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)皮下免疫四只新西蘭白兔。初次免疫后，使用在不完全弗氏佐劑中的0.2mg IL-6R加強(qiáng)免疫動(dòng)物5次，間隔3周。在用于細(xì)胞融合的脾切除術(shù)前，向具有最高血清滴度和IL-6R-E⑶中和活性的家兔連續(xù) 4天靜脈給予在PBS中的0.4mg IL-6R-E⑶。
[0314]杭體產(chǎn)牛
[0315]從免疫家兔中收獲脾細(xì)胞，并使用PEG4000 (Sigma Chemical, St.Louis, MO)與家兔漿細(xì)胞瘤細(xì)胞240E-W2融合。在通過(guò)HAT (次黃嘌呤、氨基蝶呤、和胸腺嘧啶)選擇后，將在原始96孔板中生長(zhǎng)的雜交瘤克隆轉(zhuǎn)移至更換培養(yǎng)基的新96孔板中。收集雜交瘤上清液并篩選在直接ELISA中與IL-6R-E⑶的特異性結(jié)合。在ELISA結(jié)合檢測(cè)中篩選出572個(gè)陽(yáng)性克隆，對(duì)其進(jìn)行功能性篩選。
[0316]雜交瘤的功能性篩選
[0317]對(duì)于功能性篩選而言，對(duì)24孔板中已確證的572個(gè)陽(yáng)性克隆的上清進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)ELISA測(cè)定IL-6R / IL-6結(jié)合的中和。這些實(shí)驗(yàn)鑒定出25個(gè)獨(dú)特的陽(yáng)性克隆，進(jìn)一步測(cè)定其IL-6-誘導(dǎo)的TF-1細(xì)胞(人前髓細(xì)胞系)增殖的中和。發(fā)現(xiàn)十六個(gè)克隆具有中和IL-6的活性。進(jìn)一步選擇中和IL-6活性最高的10個(gè)克隆進(jìn)行分子克隆和重組表達(dá)，以用于進(jìn)一步的功能鑒定。
[0318]重組抗-1L-6R抗體
[0319]利用PCR擴(kuò)增來(lái)自最高的10個(gè)克隆的家兔IgG的L鏈和H鏈可變區(qū)(VH)的DNA片段。將L鏈片段在Hind III和Not I位點(diǎn)克隆至pTT5載體，將VH片段在Hind III和KpnI位點(diǎn)克隆至ρΤΤ5載體H鏈的恒定區(qū)。對(duì)于各雜交瘤而言，將L或H鏈的三個(gè)DNA克隆測(cè)序，鑒定帶有共有序列的質(zhì)粒，并用于重組表達(dá)。為表達(dá)重組抗體，將L和H鏈質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至 293-6E 細(xì)胞(National Research Council Canada)。5 天后，收集上清液并使用 ELISA檢測(cè)進(jìn)行定量，以在功能性檢測(cè)之前測(cè)定IgG的濃度。
[0320]重組抗-1L-6R抗體的功能性篩選
[0321]進(jìn)行多種實(shí)驗(yàn)以表征如前所鑒定的最高的10個(gè)抗IL-6R抗體。特別地，測(cè)試抗IL-6R抗體與表達(dá)IL-6R的U266B1細(xì)胞上的IL-6R的結(jié)合，測(cè)試其在ELISA中阻斷受體-配體結(jié)合的能力，測(cè)試其抑制IL-6-誘導(dǎo)的TFl細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，以及其抑制STAT-3磷酸化的能力。這些研究結(jié)果總結(jié)在下面的表1中。
[0322]表1:最筒的10個(gè)克隆的總結(jié)
[0323]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，包括(i)重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO:3所示的VHCDRl區(qū)、SEQ ID NO:4所示的VHCDR2區(qū)、和SEQID NO:5所示的VHCDR3區(qū)；以及(ii)輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID N0:6所示的 VLCDRl 區(qū)、SEQ ID NO:7 所示的 VLCDR2 區(qū)、和 SEQ ID NO:8 所示的 VLCDR3 區(qū)； 或者所述抗體的變體，或其抗原結(jié)合片段，其包括與(i)和(ii)所述重鏈和輕鏈可變區(qū)相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)，但是在所述CDR區(qū)有至多8個(gè)氨基酸替換。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
4.一種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，包括重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包括輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括與SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包括輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
7.一種分離的抗體 ，或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，包括輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包括重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
9.一種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，包括(i)重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO:13所示的VHCDRl區(qū)、SEQ ID NO:14所示的VHCDR2區(qū)、和SEQID NO:15所示的VHCDR3區(qū)；以及(ii)輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO: 16所示的 VLCDRl 區(qū)、SEQ ID NO:17 所示的 VLCDR2 區(qū)、和 SEQ ID NO:18 所示的 VLCDR3 區(qū)； 或者所述抗體的變體，或其抗原結(jié)合片段，其包括與(i)和(ii)所述重鏈和輕鏈可變區(qū)相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)，但是在所述CDR區(qū)有至多8個(gè)氨基酸替換。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列。
12.—種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，其包括重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包括輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括與12所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包括輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列。
15.一種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，其包括輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，包括重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括與SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的分離的抗體，其中所述抗體為人源化的。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的分離的抗體，其中所述VH區(qū)包括SEQID NO:9所示的氨基酸序列，并且所述VL區(qū)包括SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的分離的抗體，其中所述VH區(qū)包括SEQID NO:19所示的氨基酸序列，并且所述VL區(qū)包括SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的分離的抗體，其中所述抗體選自下組:單鏈抗體、ScFv、缺乏鉸鏈區(qū)的單價(jià)抗體,和微抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的分離的抗體，其中所述抗體是Fab或Fab’片段。
22.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的分離的抗體，其中所述抗體是F(ab’)2片段。
23.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的分離的抗體，其中所述抗體是完整的抗體。
24.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求9所述的分離的抗體，所述抗體包括人IgG恒定結(jié)構(gòu)域。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的分離的抗體，其中所述IgG恒定結(jié)構(gòu)域包括IgGlCHl結(jié)構(gòu)域。`
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的分離的抗體，其中所述IgG恒定結(jié)構(gòu)域包括IgGlFc區(qū)。
27.一種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與權(quán)利要求9所述的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人IL-6R。
28.一種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與IL-6R結(jié)合，結(jié)合的KD值為1.3nM或更低。
29.—種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與IL-6R結(jié)合，結(jié)合的Kd值為0.5nM或更低。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-17和27-29任意一項(xiàng)所述的分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其中所述分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段: a.阻斷IL6與IL6R結(jié)合； b.抑制IL6R信號(hào)； c.抑制IL6或IL6R介導(dǎo)的一種或多種生物學(xué)功能； d.抑制STAT3磷酸化； e.a-d中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的組合。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段阻斷IL-6與IL-6R結(jié)合、抑制IL-6R信號(hào)、抑制IL6或IL-6R介導(dǎo)的一種或多種生物學(xué)功能，以及抑制STAT3磷酸化。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述IL6或IL-6R介導(dǎo)的一種或多種生物學(xué)功能選自下組:IL-6誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、IL-6誘導(dǎo)的細(xì)胞分化，以及IL-6誘導(dǎo)產(chǎn)生CRP、纖維蛋白原或血清淀粉樣蛋白A。
33.一種分離的多核苷酸,其編碼如權(quán)利要求1、9、18、19和27-32中任意一項(xiàng)所述的分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段。
34.一種組合物，其包括生理學(xué)上可接受的載體，和治療有效量的如權(quán)利要求1、9、18、19和27-32中任意一項(xiàng)所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。
35.一種治療炎性疾病的方法，所述方法包括向患有所述炎性疾病的主體給予如權(quán)利要求34所述的組合物，從而治療所述炎性疾病。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述炎性疾病是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述炎性疾病是青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎。
38.一種治療卡斯特萊曼病(Castleman’s disease)的方法,所述方法包括向患有卡斯特萊曼病的患者給予如權(quán)利要求34所述的組合物，從而治療所述卡斯特萊曼病。
39.一種治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的方法，所述方法包括向患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者給予如權(quán)利要求34所述的組合物，從而治療所述患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者。
40.一種治療與IL-6表達(dá)異常相關(guān)的癌癥的方法，所述方法包括向患有癌癥的患者給予如權(quán)利要求34所述的組合物，從而治療所述與IL-6表達(dá)異常相關(guān)的癌癥。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。
42.一種治療與癌癥相關(guān)的疲勞或惡病質(zhì)的方法，所述方法包括向患有與癌癥相關(guān)的疲勞或惡病質(zhì)的患者給予如權(quán)利要求34所述的組合物，從而治療所述與癌癥有關(guān)的疲勞或惡病質(zhì)。
43.一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，包括(i)重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括圖2所示VH區(qū)中任意一個(gè)的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3 ;以及(ii)輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括圖2所示抗體中任意一個(gè)的相應(yīng)VL區(qū)的VIXDR1、VIXDR2和VLCDR3 區(qū)； 或所述抗體的變體，或其抗原結(jié)`合片段，其包括與(i)和(ii)所述重鏈和輕鏈可變區(qū)相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)，但是在所述CDR區(qū)有至多8個(gè)氨基酸替換。
44.一種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，包括重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括圖2所示VH區(qū)中的任意一個(gè)。
45.一種分離的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其與人IL-6R結(jié)合，包括輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括圖2所示VL區(qū)中的任意一個(gè)。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK103502274SQ201280021430
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月3日
【發(fā)明者】李森偉, 柯耀煌, 張永克 申請(qǐng)人:埃派斯進(jìn)有限公司