用于有效表面展示抗原蛋白的新穎表達盒的制作方法【專利摘要】表達盒，其中所述表達盒包含：(a)來自白斑綜合征病毒的iel啟動子或其變體；(b)編碼N-端gp64信號肽的核酸序列或其變體、編碼抗原肽的核酸序列、編碼跨膜區(qū)的核酸以及編碼gp64胞質域的核酸或其變體；其中所述啟動子可操作地連接至所述核酸序列。【專利說明】用于有效表面展示抗原蛋白的新穎表達盒發(fā)明領域[0001]本發(fā)明通常涉及生物分子表面展示系統(tǒng)，連同展示抗原肽的特定應用，所述抗原肽例如病毒蛋白，諸如用作疫苗的病毒衣殼蛋白。特別地，本發(fā)明涉及用于治療和/或預防病毒感染的方法、疫苗、免疫組合物和試劑盒，并且涉及用于調節(jié)免疫反應的關聯(lián)方法?！?br>背景技術：
】[0002]數(shù)百種不同的已知病毒感染人類和動物。感染人類和動物的病毒常常通過呼吸排泄和腸排泄而傳播。例如，腸病毒71(EV71)為小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)家族中腸病毒屬(genusEnterovirus)的單股、RNA病毒。其在遺傳上分類成3組(A、B和C)以及11個基因型(A、B1-B5、C1-C5)。EV71包括4個主衣殼蛋白，例如VP1、VP2、VP3以及VP4。其中，VPl被認為是主要負責病毒向靶細胞的附著以及因此包容病毒中和的主要表位。實際上，不同腸病毒菌株的免疫學研究已經(jīng)指出多個中和性mAbs的顯性表位位于VPl上。EV71為導致手足口病的一種病毒。[0003]手足口病已變成為主要的新興感染性疾病并且是重要的威脅，尤其在亞洲。1998年在臺灣發(fā)生了由于EV71感染而導致的HFMD大爆發(fā)，包括129，106例個案報告，405名兒童患有嚴重的并發(fā)癥，并且多于80例死亡。自1997以來，EV71感染已經(jīng)呈示出新的重要性，并且個案數(shù)量越來越多。由各種EV71菌株造成的事件已經(jīng)持續(xù)地在其他國家再現(xiàn)，例如，泰國、中國以及越南。隨著最近在新加坡爆發(fā)，EV71感染的擴張的地理分布表明更多的人群處于危險中。常用的EV71疫苗基于失活病毒，其在細胞株內生產，并且通過化學手段而失活。然而，病毒的惡性本質要求病毒在生物安全水平條件下處理，從而使用常規(guī)技術的疫苗候選者的生產會要求現(xiàn)有制造程序的顯著改變，如果發(fā)生爆發(fā)，這可能會延遲疫苗的生產。[0004]控制流行性脊髓灰質炎和根除脊髓灰質炎病毒的福爾馬林失活的和減活的疫苗凸顯了通過群體接種來控制EV71流行病的可能性。據(jù)此，發(fā)展福爾馬林失活EV71疫苗是對1975年保加利亞流行病的反應而非用于控制流行病，并且從那時起一直未使用。此外，沒有可得的保加利亞疫苗效能的數(shù)據(jù)。[0005]因此，高度期望有效預防病毒感染如EV71的良好的疫苗。[0006]發(fā)明概述[0007]在第一方面，提供了表達盒，其中所述表達盒包含:[0008](a)來自白斑綜合征病毒的iel啟動子或其截序列；[0009](b)編碼N-端gp64信號肽的核酸序列或其變體、編碼抗原肽的核酸序列、編碼跨膜區(qū)的核酸以及編碼gp64胞質域的核酸或其變體；[0010]其中所述啟動子可操作地連接至所述核酸序列。[0011]在第二方面，提供了表達載體，其包括本文所述的表達盒。[0012]在第三方面，提供了試劑盒，其包括本文所述的表達盒或本文所述的表達載體以及為此的包裝材料。[0013]在第四方面，提供了宿主細胞，其包含本文中所述的表達盒或本文所述的表達載體。[0014]在第五方面，提供了免疫原性組合物，其包含本文所述的表達盒、本文所述的表達載體或本文所述的宿主細胞，連同藥物可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑。[0015]在第六方面，提供了疫苗，其包含本文所述的表達盒、本文中所述的表達載體或本文所述的宿主細胞，連同藥物可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑。[0016]在第七方面，提供了抗體，其由用本發(fā)明的疫苗接種的生物體所生產。[0017]第八方面，提供了抗血清，其包含本發(fā)明的抗體。[0018]在第九方面，提供了用于治療或預防個體疾病的本文所述的表達盒、本文所述的表達載體、本文所述的宿主細胞、本文中所述的免疫原性組合物、本文所述的疫苗、本文所述的抗體或本文所述的抗血清供，其中所述抗原肽由所述個體中的所述表達載體來表達。[0019]在第十方面，提供了用于調節(jié)免疫反應的方法，其中所述方法包括向個體給予有效量的本文所述的表達盒、本文所述的表達載體、本文所述的宿主細胞、本文所述的免疫原性組合物、本文所述的疫苗、本文所述的抗體或本文所述的抗血清。[0020]在第十一方面，提供了本文所述的表達盒、本文所述的表達載體、本文所述的宿主細胞、本文中所述的免疫原性組合物、本文所述的疫苗、本文所述的抗體或本文所述的抗血清在制造用于調節(jié)個體的免疫反應的藥物中的用途。[0021]在第十方面，提供了一種用于呈遞、生產或展示抗原肽的方法，其中所述方法包括:[0022](a)使編碼多肽的`核酸插入本文所述的表達載中；[0023](b)用表達載體來轉染至少一個宿主細胞；以及[0024](C)由所述表達載體來表達所述多肽，[0025]其中將所述多肽呈遞或展示在桿狀病毒的表面膜上。[0026]在第十方面，提供通過本文所述的方法獲得的抗原肽。[0027]在第十一方面，提供了診斷方法，其包括使用本文所述的抗原肽。[0028]附圖簡述[0029]參考下列附圖，僅以實例形式來描述本發(fā)明。[0030]圖1.如實施例1所詳細說明的使用PCR的融合基因的結構。執(zhí)行3個連續(xù)的PCR反應來產生最終PCR產物，其包含gp64信號序列、H3N2-HA跨膜域以及gp64的胞質域(CTD)。[0031]圖2.根據(jù)實施例1而制造的重組型桿狀病毒載體的圖示。使用EV71基因組作為模板，表1所列的引物用于擴增VPl基因，其然后能被插入PBac-HTA載體中。所生成的質體被稱為pBac-VPl。[0032]圖3.rVPl蛋白在SF-9II細胞質膜上的表面展示譜。第3示出該蛋白的GP64C-端部分位于在SF-9II細胞內部，而H3N2跨膜域及抗原肽位于細胞外的培養(yǎng)基內。[0033]圖4.EV71的rVPl的錨定(放大率X60)。為了確定rVPl蛋白是否恰當?shù)匾莆恢良毎砻?，細胞在無菌蓋玻片上培養(yǎng)，以為10的感染復數(shù)(MOI)來感染，以及感染后2天進行使用共焦顯微鏡的免疫熒光染色。DAPI染色用于檢測細胞核，而綠熒光標記的抗-VPl多株抗體用于檢測由Bac-VPl重組型桿狀病毒所展示的rVPl。第4圖明確地示出rVPl位于質膜，從而展現(xiàn)出rVPl錨定于Sf-9細胞的表面上。關于更多的細節(jié)，請參見實施例1。[0034]圖5.EV71的rVPl在Bac-VPl包膜上表達的確認。細胞以為10的MOI被感染并且感染后3天收集。采集上清液并進行使用抗-VPl(天竺鼠)多克隆抗體、然后使用抗天竺鼠HRP標記的二級抗體的免疫印跡分析。[0035]rBac-VPl1-編碼新穎的“表達盒”的重組型桿狀病毒。[0036]rBac-VPl2-編碼帶有全長gp64作為融合伙伴的表達盒的重組型桿狀病毒。[0037]如由圖5可見，在桿狀病毒-WT(野生型)中沒有檢測到蛋白。比較時，由從用rBac-Vpl1和rBac_Vpl2感染的細胞獲得的上清液看見清晰帶，表明rVPl成功地在Bac-VPl病毒包膜上表達。[0038]圖6.純化的桿狀病毒的免疫金電子顯微圖，其由抗-EV71和抗-VPl抗體作為初級抗體以及與5-nm金顆粒結合的抗小鼠IgG作為二級抗體而檢測(放大率200，000X，刻度尺=IOOnm)。金顆粒(示為黑點)表明EV71和VPl蛋白表達的位置。沒有金顆粒展現(xiàn)在桿狀病毒-WT(對照)的表面上，然而，EV71和VPl在本發(fā)明的重組型桿狀病毒的表面上被檢測到。[0039]圖7.在重組型桿狀病毒的包膜上展示的EV71的rVPl的定量。在桿狀病毒包膜上所展示的rVPl蛋白使用抗-VPl單克隆抗體來探測。在rBac-VPl(107/ml)、rBac_VPl2(107/ml)、EV71WT(B5菌株)(107/ml)、WT桿狀病毒上的VPl的量被校正成經(jīng)純化的重組型VPl蛋白的量。免疫印跡上的帶強度使用ODYSSEYLICOR熒光掃描儀和軟件進行掃描和分析。數(shù)據(jù)為3個獨立實驗的平均值。[0040]rBac-VPl1-編碼新穎的“表達盒”的重組型桿狀病毒[0041]rBac-VPl2-編碼帶有全長gp64作為融合伙伴的表達盒的重組型桿狀病毒。[0042]圖7示出rBac-VPl1(新穎表達盒)與B5-EV71和rBac-VPl2(全長gp64)相比具有最高的VPl蛋白表達，由此說明新穎的表達盒用于生產大量VPl抗原肽的效能。[0043]圖8.測試血清中和病毒感染性的能力。*含有100TCID5QEV71病毒的50μI病毒懸浮液在添加至96孔板中的RD細胞之前與50μI連續(xù)2倍稀釋的抗體一起預孵育30min。在37°C下3天之后，提供完整的保護免受CPE的中和性抗體滴定度被讀取為最高的稀釋。[0044]如由圖8可見，rBac-VPl與失活EV71(B5)病毒相比產生更高的中和滴定度。負對照PBS與桿狀病毒-WT(結果為重迭的，桿狀病毒-WT結果迭加在PBS結果上方)示出如預期那樣的可忽略的中和滴定度。[0045]圖9.帶有PCV2衣殼的表面展示衣殼區(qū)域(rBac_PCV2)的蔗糖梯度純化的桿狀病毒的免疫印跡，其使用8C2(抗0RF2)單克隆抗體(初級)，然后使用抗小鼠HRP標記的二級抗體。[0046]如由圖9可見，在經(jīng)純化的桿狀病毒內出現(xiàn)大量表達水平的各個衣殼蛋白區(qū)域。[0047]圖10.感染有PCV2的PK-15細胞的免疫熒光分析，其使用來自用純化的rBac-PCV2免疫的天竺鼠的抗體和AlexaFluor546標記的抗天竺鼠二級抗體(放大率X40)。圖10的淡灰色部份示出AlexaFluor546染色。因而，圖10示出感染有PCV2的細胞內PCV2蛋白的良好表達。[0048]圖11.PRRSV的蔗糖梯度純化的rBac_0RF7蛋白的免疫印跡，其使用5H2(0RF7)單克隆抗體(初級)，然后使用抗小鼠HRP標記的二級抗體。[0049]圖11清楚地示出存在PRRSV的0RF7蛋白的大量表達。[0050]圖12.感染有PRRSV的MARC-145細胞的免疫熒光分析，其使用來自用純化的rBac-0RF7蛋白免疫的天竺鼠的抗體,然后使用Alexafluor546標記的抗天竺鼠二級抗體(放大率X40)。圖11的淡灰色部份示出AlexaFluor546染色。因而，圖11示出感染有PRRSV的細胞內ORF蛋白的良好表達。[0051]圖13.在白斑綜合征病毒(WSSV)內的iel啟動子的順式元件的示意圖。[0052]圖14.桿狀病毒錨定的核衣殼α蛋白的免疫印跡分析。Bac_noda、β野田村病毒(Betanodavirus)和野生型桿狀病毒進行使用抗野田村衣殼多克隆抗體(天竺鼠)和各自二級HRP結合抗體的免疫印跡。(l)Bac-Noda，(2)β野田村病毒，(3)野生型桿狀病毒。[0053]如由圖14可見，在桿狀病毒-WT(野生型)內沒有檢測到蛋白。比較時，由感染有rBac-VPl1和rBac_VPl2的細胞獲得的上清液觀察到清晰帶，表明rVPl成功地在Bac-VPl病毒包膜之上表達。[0054]圖15.noda衣殼α蛋白的表達和錨定(放大率X60)。(a)在感染Bac_noda的Sf9_II的質膜上的α蛋白的錨定的確認。(b)在感染野生型桿狀病毒的Sf9_II細胞的質膜上觀察到?jīng)]有α蛋白的錨定。細胞在無菌的蓋玻片上培養(yǎng)并以為0.1的MOI而感染。細胞用4%PFA固定并用2%牛血清白蛋白在37°C阻斷30min。α蛋白用多克隆抗天竺鼠抗體(1:300)、然后用二級FITC-結合兔抗天竺鼠Mab(l:100稀釋，Dako)染色。[0055]圖15(a)示出rVPl位于質膜，從而表明VPl錨定在Sf_9細胞的表面上。[0056]圖16.VPl在非洲綠猴腎臟細胞內的轉導和表達(放大率X40)。非洲綠猴腎臟細胞與為200的感染復數(shù)(MOI)—起孵育并且在感染后48h用抗-VPl單克隆抗體、然后用FITC-結合二級抗體染色，(A)活Bac-VPl-轉導的非洲綠猴腎臟細胞，(B)與失活Bac-VPl一起孵育的非洲綠猴腎臟細胞。`[0057]圖16的淡灰色部份示出表達VPl之處。因而，圖16示出與失活Bac-VPl相比，VPl在用活Bac-VPl轉導的非洲綠猴腎臟細胞內良好表達。[0058]圖17.體內小鼠肌肉組織的桿狀病毒轉導(放大率X40)。在第一次免疫六天之后，肌肉組織樣品包埋在石蠟內并且進行切片。免疫組織化學染色使用抗-VPl單克隆抗體和HRP-結合兔抗小鼠抗體來進行。示出(A)Bac-VPl，(B)WT-Bac,(C)PBS注射的小鼠。箭頭指出表達VPl之處。因而，圖17示出VPl在來自Bac-VPl轉導的小鼠的小鼠肌肉組織中表達，然而，負對照內沒有VPl的表達。[0059]圖18.來自致命性EV71病毒攻擊的小鼠的保護。小鼠組(n=6)以14天的間隔疫苗接種2次。野生型桿狀病毒和PBS免疫的小鼠用作負對照。監(jiān)測小鼠的存活，持續(xù)21天的觀察期。結果基于存活百分率來表達。如由結果可見，EV71-B5和Bac-VPl(結果重迭于第18圖上)免疫的小鼠在7天后顯示出100%的存活，相比之下，對照小鼠則無一者。[0060]圖19.EV71拷貝數(shù)的實時RT-PCR定量。RNA由腦組織萃取并且對照的樣品以7dpi采集，并且預防性治療的小鼠樣品以20dpi采集。EV715'UTR區(qū)域的112_bp片段用作qRT-PCR引物的靶標。編碼EV71的全長基因組的質體用于獲得定量病毒拷貝數(shù)的標準曲線。數(shù)據(jù)為3個獨立分析的平均值土SD。[0061]如由圖19可見，與接種抗-EV71血清和Bac-VPl抗血清的小鼠相比，來自接種野生型桿狀病毒抗血清和PBS抗血清的小鼠的腦組織有顯著量的病毒RNA。因而，這表明來自Bac-VPl接種的生物體的抗血清用于提供被動式保護對抗VPl的效能。[0062]圖20.各種表達盒的示意圖。⑷帶有iel啟動子和gp64信號肽的表達盒；(B)帶有iel啟動子、gp64啟動子和跨膜區(qū)的表達盒；(C)帶有iel啟動子、gp64啟動子、跨膜區(qū)以及gp64胞質域的表達盒。[0063]圖表[0064]表1.用于構建重組型BAC-VPl融合基因的引物序列。[0065]表2.用于構建PCV2的0RF2的重組型BAC-PCV2衣殼融合基因的引物序列。[0066]表3.用于構建重組型BAC-PRRSV核衣殼蛋白(0RF7)融合基因的引物序列。[0067]表4.抗原肽的實例。[0068]序列[0069]SEQIDNO:1:用于擴增帶有gp64信號序列的額外重迭區(qū)域的整個全長VPl基因的正向引物。[0070]SEQIDNO:2:用于擴增帶有H3N2-HA跨膜序列的額外重迭區(qū)域的整個全長VPl基因的反向引物。[0071]SEQIDNO:3:用于擴增帶有H3N2-HA跨膜序列的整個序列的C-端VPl的反向引物。[0072]SEQIDNO:4:用于擴增N-端處的gp64信號序列的整個重迭區(qū)域的正向引物。[0073]SEQIDNO:5:用于擴增C-端處的gp64胞質域(CTD)的整個重迭區(qū)域的反向引物。[0074]SEQIDNO:6:用于擴增iel啟動子的正向引物。[0075]SEQIDNO:7:用于擴增iel啟動子的反向引物。[0076]SEQIDNO:8:用于擴增PCV2的衣殼76F區(qū)域的正向引物。[0077]SEQIDNO:9:用于擴增PCV2的衣殼135R區(qū)域的反向引物。[0078]SEQIDNO:10:用于擴增PCV2的衣殼121F區(qū)域的正向引物。[0079]SEQIDNO:11:用于擴增PCV2的衣殼180R區(qū)域的反向引物。[0080]SEQIDNO:12:用于擴增PRRSV的衣殼0RF7F區(qū)域的正向引物。[0081]SEQIDNO:13:用于擴增PRRSV的衣殼0RF7R區(qū)域的反向引物。[0082]SEQIDNO:14:N_端gp64信號肽的序列(20個氨基酸)。[0083]SEQIDNO:15:含有7個氨基酸的gp64細胞質域(CTD)的全長序列。[0084]SEQIDNO:16:含有6個氨基酸的gp64細胞質域的截序列(CTD)[0085]SEQIDNO:17:H3N2_HA跨膜域的序列。[0086]SEQIDNO:18:白斑綜合征病毒iel啟動子的序列。[0087]SEQIDNO:19:EV71病毒的VPl的序列。[0088]SEQIDNO:20:PCV2PRF2衣殼蛋白的序列。[0089]SEQIDNO:21=PRRSV衣殼蛋白的0RF7的序列。[0090]SEQIDNO:22:魚野田村病毒衣殼蛋白α的序列。[0091]SEQIDNO:23EV71_VP1-第167個-第178個氨基酸[0092]SEQIDNO:24EV71_VP1-第209個-第222個氨基酸[0093]SEQIDNO:25EV71_VP1-第240個-第260個氨基酸[0094]SEQIDNO:26PCV2-0RF2-第100個至第150個氨基酸[0095]SEQIDNO:27PCV2-0RF2-第151個至第200個氨基酸[0096]SEQIDNO:28PRRSV-0RF7-第18個至第57個氨基酸[0097]SEQIDNO:29PRRSV-0RF7-第58個至第123個氨基酸[0098]SEQIDNO:30PRRSV-0RF5-第28個至第65個氨基酸[0099]SEQIDNO:31PRRSV-0RF5-第132個至第200個氨基酸[0100]SEQIDNO:32PRRSV_0RF5-第28個至第65個以及132至第200個氨基酸的組合[0101]SEQIDNO:33對應于核酸序列SEQIDNO:19EV71_VP1的EV71病毒的VPl的氨基酸序列[0102]SEQIDNO:34對應于核酸序列SEQIDNO:20PCV2衣殼蛋白-PCV2PRF2的序列的PCV2衣殼蛋白的氨基酸序列[0103]SEQIDNO:35對應于核酸序列SEQIDNO:21PRRSV衣殼蛋白的0RF7-PRRSV0RF7的序列的PRRSV衣殼蛋白的0RF7的氨基酸序列[0104]SEQIDNO:36對應于核酸序列SEQIDNO:22:魚類野田村病毒衣殼蛋白-衣殼蛋白α的序列的魚類野田村病毒衣殼蛋白的氨基酸序列[0105]SEQIDNO:37用于擴增野田村病毒衣殼區(qū)域的正向引物[0106]SEQIDNO:38用于擴增野田村病毒衣殼區(qū)域的反向引物[0107]SEQIDNO:39用于擴增野田村病毒衣殼區(qū)域的可替代的反向引物[0108]SEQIDNO:40用于檢測VPlmRNA的正向引物[0109]SEQIDNO:41用于檢測VPlmRNA的反向引物[0110]定義[0111]如本文所用，術語“包含(comprising)”意指“主要包括，但是不必然唯一地包括”。此外，措詞“包含(comprising)”的變化,例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”，具有相應變化的意義。[0112]如本文所用，術語“治療(treating)”及“治療(treatment)”是指任何的和所有的應用，其醫(yī)治疾病狀態(tài)或征狀，預防疾病狀態(tài)或疾病的建立，或是無論以何方式預防、阻礙、延遲、改善或逆轉疾病狀態(tài)或疾病或是其他不期望的征狀的進展。[0113]如本文所用，術語“有效量”在其意義之內包括無毒的但是足夠量的制劑或化合物來提供所需作用。所需要的確切的量會根據(jù)下列因素而隨個體變化，例如，待治療的物種、個體的年齡和一般疾病狀態(tài)、待治療的疾病狀態(tài)的嚴重性、被給藥的特定制劑和給藥方式等等。因而，不可能具體指定確切的“有效量”。然而，對于任何給定的情況，適當?shù)摹坝行Я俊笨梢詢H由本領域技術人員使用慣常實驗而確定。[0114]如本文所用，術語“多肽”、“肽”和“蛋白”可交換地使用來提及氨基酸殘基的聚合物以及提及其片段、變體、類似物、同系物(orthologues)或同源物(homologues)。因而,這些術語應用于氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸殘基為合成的非天然存在的氨基酸，例如相應天然存在的氨基酸的化學類似物，以及應用于天然存在的氨基酸聚合物。[0115]如本文所用，術語“多核苷酸”或“核酸”可交換地使用并且表示包含一個或多個核苷酸、或寡核苷酸、或其片段的分子，包括但不限于RNA或DNA核苷酸或其組合。[0116]如本文所用，在術語“蛋白”、“多肽”、“肽”、“多核苷酸”以及“核酸”的范疇內為片段及其變體，包括但不限于多核苷酸和核酸的反向互補形式和反義形式。[0117]術語“片段”是指多核苷酸或多肽序列，其編碼全長蛋白或基因的組成或為其的組成。對于多肽，片段可擁有與全長蛋白一樣的定性生物活性，例如，片段可以含有或編碼一個或多個表位，例如免疫顯性表位，其允許對該片段或由該片段編碼的序列產生相似的免疫反應，如同全長序列或由該片段編碼的序列。[0118]如本文所用，術語“變體”是指基本相似的序列。一般而言，核酸序列變體可以編碼具有共同的定性生物活性的多肽。一般而言，多肽序列變體亦可以擁有共同的定性的生物活性。此外，這些多肽序列變體可以共有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。[0119]如本文所用，術語“表達載體”意指具有在細胞或無細胞系統(tǒng)中賦予其所可操作地連接的核酸片段表達的能力的核酸。在本發(fā)明的上下文中，要了解的是，包含如本文所定義的啟動子的表達載體可以為質體、噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒亞基因組片段或基因組片段，或能夠維持和/或復制其被引入細胞的可表達形式的異源DNA的其他核酸。[0120]如本文所用，術語“表達系統(tǒng)”是指表達載體和該載體的宿主的組合，所述表達系統(tǒng)提供了環(huán)境以允許在宿主細胞中的外來基因表達，即，使以可檢測水平生產蛋白。表達系統(tǒng)的實例包括但不限于:病毒表達系統(tǒng)，基于細菌的系統(tǒng)如大腸桿菌(Escherichiacoli),酵母菌系統(tǒng)如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、畢赤酵母(Pichiapastoris)，基于昆蟲細胞的系統(tǒng)如桿狀病毒系統(tǒng)，哺乳動物系統(tǒng)如非洲綠猴腎臟系統(tǒng)，其他真核系統(tǒng)如利什曼(Leishamani)表達系統(tǒng)。[0121]如本文所用，術語“宿主細胞”是指用于生產本發(fā)明表達盒之內所編碼的蛋白的細胞。這樣的宿主細胞的實例包括真核細胞或更多的特定哺乳動物細胞；昆蟲細胞；魚細胞；酵母細胞；或植物細胞。這樣的細胞的實例包括但不限于:人類TK-143b細胞、猴Marc145細胞、非洲綠猴腎臟`細胞和豬PK15細胞、草地夜蛾Sf9和Sf_21細胞、Hink’s粉紋夜蛾Tn-368和ΒΤΙ-ΤΝ-5Β1-4細胞、鯉魚上皮瘤乳頭狀細胞(EPC)、CHSE-214、黑頭呆魚(FHM)、石紋棕真鮰(brownbullhead)(BB)、藍鰓太陽魚(bluegillfry)(BF2)或白鱘魚皮膚(WSSK-1)。如本文所用，術語“盒”是指表達載體的一部份，其編碼由載體表達的目標序列。例如，盒可以指表達載體的一部份，其編碼N-端gp64信號肽和抗原肽。盒可以進一步包含編碼其他組份的序列，例如C-端血球凝集素(例如H3N2-HA跨膜域)跨膜域和gp64胞質域。[0122]如本文所用，術語“可操作地連接”是指轉錄的和轉譯的調節(jié)性多核苷酸，其以使多核苷酸被轉錄和多肽被轉譯的方式而相對于編碼多肽的多核苷酸來定位。[0123]如本文所用，術語“啟動子”包括基因組基因的轉錄調節(jié)序列，包括TATA盒或起始子元件，其可能是準確轉錄啟動所需要的，伴隨有或沒有額外的調節(jié)元件，其對發(fā)展和/或外部刺激的反應而改變基因表達，或以組織特異性方式改變基因表達。在上下文中，術語“啟動子”亦用于描述重組型、合成或融合分子，或衍生物或片段，例如啟動子的截序列，其賦予、活化或提高其所可操作地連接的核酸分子的表達，以及編碼肽。[0124]iel啟動子內的順式元件在圖13中示出。如圖13所示，可以使用熒光素酶基因報導分析進行截斷分析來識別最小的啟動子區(qū)域。iel啟動子的最小區(qū)域通過漸進地由5’端刪除啟動子而確定。在一實施方案中，對于白斑綜合征病毒(WSSV)的iel啟動子，觀察到最小的啟動子活性在基因的位置-189和+1之間。[0125]如本文所用，措辭“與病毒相關的疾病”意指由病毒造成的或是與病毒相關的任何疾病、疾病狀態(tài)或病癥。[0126]如本文所用，術語“抗原”是指能夠由生物體的免疫系統(tǒng)識別的物質。免疫原為當向生物體給予時能刺激免疫反應的抗原。二個術語都可交換地在本文中使用。如本文所用，“抗原肽”為能夠在本文表達系統(tǒng)中表達的肽或多肽序列。[0127]如本文所用，術語“調節(jié)”當涉及免疫反應而使用時意指直接地或間接地增加或減少對抗抗原的免疫反應。[0128]如本文所用，術語“信號肽”是指氨基酸序列，其能夠引發(fā)其所可操作地連接的多肽的進入宿主細胞的內質網(wǎng)(ER)中。信號肽通常由肽鏈內切酶(例如特定的位于ER的信號肽酶)切開以釋放(成熟的)多肽，雖然存在信號肽可以不切割的情況。信號肽的長度典型地為約10個至約40個氨基酸。在本文所用的一實施方案中，術語“編碼信號肽的核酸序列”在其范圍內不包括編碼同源多肽的全長序列的核酸序列，因為信號肽天然引發(fā)進入內質網(wǎng)。可能的信號肽的實例包括熒光素酶信號肽以及蜜蜂蜂毒肽信號肽。例如，在一實施方案中，可以使用gp64的信號肽。在特定實施方案中，gp64的信號肽為由SEQIDNO:14所編碼的蛋白或其變體。[0129]本文所述的核酸序列可以視需要包括額外的核苷酸，例如以促進表達。例如，連接子序列(若存在)可以視需要在信號肽與抗原肽之間和/或在抗原肽與跨膜域之間提供。核酸序列可以視需要進一步或是可替代地在表達盒內所含有的任何其他序列之間包含連接子序列。這樣的連接子序列可以為異源的或是同源的。連接子序列可以為I個至40個氨基酸，10個至25個氨基酸，6個至10個氨基酸或為例如2、3、4或5個氨基酸。[0130]如本文所用，術語“疫苗”是指成為非病原性或較少病原性的整個的(活的或失活的)或分次的細菌/病毒的懸浮液。疫苗可以概括地分類成3個一般組:減毒病毒、失活(殺滅)的病毒體，以及純化的病毒組份(亞單位疫苗)。基于本發(fā)明表達盒而獲得的疫苗屬于次單位疫苗組。[0131]如本文所用，術語“佐劑”是指可以刺激免疫系統(tǒng)并增加對抗原或免疫原的反應的制劑。[0132]如本文所用，術語“接種載體”是指當被引入合適的宿主細胞中時會導致抗原肽的表達的表達載體，抗原肽的表達可以被調整以刺激一系列免疫反應，包括抗體、T輔助細胞(⑶4+T細胞)以及胞毒型T淋巴球(CTL，⑶8+T細胞)介導的免疫。[0133]如本文所用，術語“免疫原性組合物”是指當向人類或是動物給予時導致免疫反應的組合物，所述免疫反應包括抗體、T輔助細胞(⑶4+T細胞)以及胞毒型T淋巴球(CTL，⑶8+T細胞)介導的免疫。[0134]如本文所用，術語“胞質域”(或“CTD”)是指提供了錨定域的氨基酸序列，該錨定域允許融合蛋白在重組型病毒如桿狀病毒的包膜表面上表達。胞質域可以為5個至40個氨基酸，10個至25個氨基酸，6個至10個氨基酸或為例如，2、3、4或5個氨基酸。[0135]如本文所用，術語“gp64胞質域”為如SEQIDNO:15所示的7個氨基酸的區(qū)域。在一實施方案中，gp64胞質域為如SEQIDNO:16所示的gp64CTD的變體。gp64胞質域的變體的其他實例可以包含gp64胞質域，其對SEQIDNO:15具有80%或85%或90%或92%或95%或96%或98%或99%的序列同一性。[0136]如本文所用，術語“跨膜域”是指橫跨細胞膜之內的氨基酸序列?？缒び蚩梢詾榧s5個至約60個氨基酸,約5個至約40個氨基酸,約10個至約25個氨基酸,約6個至約10個氨基酸，或例如，序列可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個氨基酸或是由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個氨基酸所組成?？缒び蚩梢詾間p64跨膜域，或可以為適合用于該系統(tǒng)內的任何其他跨膜域，例如，跨膜域可以為糖蛋白跨膜域，例如血球凝集素跨膜域，其為流感表面上的糖蛋白并允許病毒結合至細胞唾液酸并與宿主膜融合。血球凝集素跨膜域的實例包括但不限于:H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15以及H16。[0137]在一實施方案中，血球凝集素跨膜域為H3N2跨膜域或H5N1跨膜域。H3N2跨膜域例如含有半胱氨酸殘基，其可以經(jīng)受軟脂?；?pamitoylation)并由此與SF9-1I質膜連接并使VPl蛋白能在表面上定位。如本文所用，術語“gp64跨膜域”為如SEQIDN0:17所示的27個氨基酸的區(qū)域。在一實施方案中，gp64胞質域為gp64跨膜域的截序列并且包含以下或是由以下組成:約10個至約25個氨基酸，約6個至約10個氨基酸或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個氨基酸，所述氨基酸如SEQIDNO:17所示。[0138]如本文所用，術語“功能性片段”是指能夠執(zhí)行蛋白域的全部功能的蛋白領域的片段。[0139]在本發(fā)明中，可以使用不同的表達系統(tǒng)來表達本文所述的表達盒。這樣的表達系統(tǒng)的實例包括但不限于:病毒表達系統(tǒng)如腺病毒、慢病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒和桿狀病毒表達系統(tǒng)，基于細菌的系統(tǒng)如大腸桿菌，酵母系統(tǒng)如啤酒酵母、畢赤酵母，基于昆蟲細胞的系統(tǒng)如InsectSelectStable表達系`統(tǒng)，哺乳動物系統(tǒng)如非洲綠猴腎臟系統(tǒng)，以及其他真核系統(tǒng)如利什曼表達系統(tǒng)。在一實例中，使用桿狀病毒表達系統(tǒng)。[0140]桿狀病毒起初被認為僅感染昆蟲和無脊椎動物，并已經(jīng)廣泛地用于昆蟲細胞內許多重組型蛋白的生產。然而，在20世紀80年代早期，苜蓿銀紋夜蛾多核多角體病毒(AcMNPV)發(fā)展成真核蛋白表達系統(tǒng)標志著這種病毒開始廣泛用于使異源蛋白在昆蟲細胞內表達。從那時以來，已經(jīng)做出許多嘗試來發(fā)展桿狀病毒載體，其可以攜帶哺乳動物表達盒以用于體外和體內基因療法研究、藥物篩選以及重組型蛋白表達。桿狀病毒表達系統(tǒng)的主要優(yōu)點包括其大的插入容量、其相對容易的構建，以及存在強大的啟動子和轉譯后加工能力。[0141]使用gp64全長蛋白，在20世紀90年代中期首次發(fā)展出外來蛋白在桿狀病毒膜之上的表達(表面展示)。典型地，包含編碼目標異源蛋白或肽的基因的“表達載體”在多角體蛋白或PlO啟動子的控制下框內融合在全長gp64基因的N-端。這樣的構造然后使用各種適合的方法而整合入桿狀病毒基因組，例如Bac-To-Bac系統(tǒng)(Invitrogen)。融合蛋白在表達為額外的拷貝之后移位至質膜并且并入病毒包膜中，導致異源蛋白在桿狀病毒膜表面上表達。[0142]在一實施方案中，本發(fā)明涉及表達盒，其包含ieI啟動子或其截序列、N-端gp64信號肽和抗原肽，其中啟動子可操作地連接至核酸序列(見圖20A)。在一實施方案中，前面提及的gp64信號肽由SEQIDNO:14或其變體編碼。[0143]在另一實施方案中，本發(fā)明涉及新穎的“表達盒”，其包含iel啟動子或其變體、N-端信號肽(例如N-端gp64信號肽)、抗原肽以及跨膜區(qū)，其中啟動子可操作地連接至核酸序列(見圖20B)。在一實施方案中，前面提及的跨膜區(qū)為H3N2或H5N1或H3N2-HA(SEQIDNO:17或其變體)跨膜區(qū)。[0144]在另一實施方案中，本發(fā)明涉及表達盒，其包含iel啟動子或其截序列、N-端信號肽(例如N-端gp64信號肽)、抗原肽、跨膜區(qū)以及gp64胞質域，其中啟動子可操作地連接至核酸序列(見圖20C)。在一實施方案中，前面提及的胞質域由SEQIDNO:15或16或是其變體編碼。[0145]在一實施方案中，本發(fā)明涉及表達盒，其至少編碼N-端gp64信號肽(20個氨基酸[aa])、抗原衣殼蛋白、C-端H3N2-HA-跨膜域(27aa)和gp64_胞質域(6aa)，并且其由WSSV立即早期iel啟動子(SEQIDNO:18)或其片段或截斷版本轉錄地控制。[0146]在一些實施方案中，啟動子序列為WSSViel啟動子的區(qū)域。在一實施方案中，啟動子序列為WSSViel啟動子的區(qū)域，其包含由基因的位置-189至+1的核苷酸的序列或是由其組成?！氨磉_盒”可以并入適于用于病毒表達系統(tǒng)如桿狀病毒的“表達載體”中，并隨后使用本領域技術人員公知的各種手段而并入桿狀病毒基因組中。[0147]特別地，發(fā)明人已經(jīng)闡明通過抗原肽如病毒蛋白(例如病毒衣殼蛋白)的協(xié)同表面展示和基因轉導來將病毒表達系統(tǒng)如桿狀病毒表達系統(tǒng)用作抗病毒的免疫試劑。在重組型病毒如桿狀病毒的表面上有效率地展示顯性免疫蛋白賦予了接種策略方面的主要優(yōu)點。如本文所述，除了將這種病毒表達系統(tǒng)用作EV71、PCV2、PRRSV、野田村病毒的接種載體之外，病毒膜展示系統(tǒng)還可以用于表征廣泛種類的抗原肽如病毒蛋白(例如病毒衣殼蛋白)的結構和功能。[0148]例如，在來自白斑綜合征病毒的iel啟動子的控制之下，VPl病毒衣殼基因使用病毒載體如桿狀病毒載體而有效率地在昆蟲細胞和哺乳動物細胞二者之中表達。小鼠體內通過使用桿狀病毒表面展示的VPl作為免疫原而產生的抗體有效率地中和體外EV71感染性。因此，重組型桿狀病毒是用于治療例如EV71感染的良好的疫苗。[0149]在示例性實施方案中，本發(fā)明的表達盒使用本領域已知的標準分子技術而克隆入適合用于所選蛋白表達系統(tǒng)的表達載體中，例如Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)(Invitrogen)。[0150]然后，多拷貝的表達載體通過使表達載體轉染入細胞株如大腸桿菌中而獲得。然后,表達載體系被轉染入宿主細胞株如昆蟲Sf9中，并且被釋放入宿主細胞株所生長的培養(yǎng)基中的出芽病毒顆粒在轉染后4天進行收集。然后，病毒顆粒用作小鼠接種的亞單元疫苗。[0151]使用“表達盒”設計的相同策略也用于產生遺傳工程病毒以表達豬環(huán)狀病毒(PCV2)和豬呼吸與生殖癥候群病毒(PRRSV)的免疫原性肽或蛋白。使表達盒插入病毒基因組如桿狀病毒基因組中，并且發(fā)現(xiàn)得到大量地表達且在各個病毒表面上展示。在本文所述的一實例中，基因重組型桿狀病毒展示來自PCV2或PRRSV的免疫原性肽，并且用于免疫天竺鼠，生產有效率地中和各病毒的感染性(中和性)抗體。[0152]本文所提及的表達來自PCV2或PRRSV的免疫原性肽的重組型桿狀病毒的產生以及其作為抗各病毒的感染的免疫原的效能，表現(xiàn)出本文“表達盒”的設計的廣泛效能并說明其作為工具的可能性，所述工具用于產生對抗抗原肽如病毒蛋白(例如任何病毒的衣殼蛋白)的疫苗以及還用于生產供診斷試劑盒內使用的抗原。[0153]用于呈遞或展示生物分子的方法、試劑盒以及系統(tǒng)[0154]本發(fā)明公開了生物分子表面展示系統(tǒng)，連同這樣的系統(tǒng)用于展示作為疫苗的肽的特定應用。如本領域技術人員會顯而易見的，這些生物分子表面展示系統(tǒng)不限于本文所公開的特定應用，而是在其中期望呈遞生物分子、特別是抗原肽如病毒蛋白(例如病毒衣殼蛋白)的任何情況中得到廣泛應用。[0155]因此，在一實施方案中，本發(fā)明公開了用于涉及肽的表面展示的疫苗生產的方法、試劑盒以及系統(tǒng)。這些方法、試劑盒以及系統(tǒng)可以例如使用本文所例示的與生產抗病毒的疫苗相關的基于桿狀病毒的表面展示系統(tǒng)。然而，本領域技術人員會認識且理解到，用于涉及肽的表面顯示的疫苗生產的方法、試劑盒以及系統(tǒng)不限于本文所公開的疫苗生產。[0156]因此，本發(fā)明提供了用于呈遞或展示多肽的方法，其中所述方法包括:[0157](a)使編碼所述多肽的核酸插入本文所公開的表達載體中；[0158](b)用所述表達載體來轉染至少一個宿主細胞；以及[0159](c)由所述表達載體來表達所述多肽，[0160]其中所述多肽呈遞或展示在桿狀病毒的表面膜上。[0161]本發(fā)明進一步提供了用于呈遞或展示多肽的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包括:[0162](a)插入表達載體中的編碼所述多肽的核酸，其中所述表達載體包含來自白斑綜合征病毒的iel啟動子；[0163](b)用于使用所述表達載體轉染至少一個宿主細胞的構件；以及[0164](C)用于由所述表達載體表達所述多肽的構件，[0165]其中所述多肽呈遞或展示在病毒如桿狀病毒的表面膜上。[0166]抗原肽[0167]本發(fā)明所用的抗原肽包括能夠在本表達系統(tǒng)中表達的多肽或肽。本文所用的抗原肽可以為細菌、病毒或原蟲抗原，其包括但不限于:病毒包膜、病毒衣殼、病毒顯性免疫區(qū)或病毒表面抗原。在一實施方案中，抗原為病毒衣殼肽抗原。使用本文所述的系統(tǒng)，可以表達病毒包膜和非包膜蛋白二者。本文所用的抗原肽在其范圍內可以包括或可以不包括編碼全長序列的多肽的核酸序列。本文所用的抗原肽可以為能含有或編碼一個或多個表位如顯性免疫表位的片段，相對于全長序列或由該片段編碼的序列，所述表位允許對該片段或由該片段編碼的序列產生相似的免疫反應?？乖慰梢詾?-500個氨基酸，20-400個氨基酸，30-300個氨基酸，例如，片段可以為約100、200、250、300或350個氨基酸。[0168]抗原肽可以為病毒、細菌或原生動物肽，例如病毒衣殼肽，其選自以下細菌:疏螺旋體屬、克氏錐蟲(Trypanosomacruzi)、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)、巨細胞病毒、登革熱、艾-巴病毒、EV71、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、皰疹、HIV、人類嗜T淋巴細胞病毒(HTLV)、流感病毒如H5N1、H1N1、惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)、間日痕原蟲(Plasmodiumvivax)、卵形痕原蟲(Plasmodiumovale)、三日痕原蟲(Plasmodiummalariae)、麻疫病毒、野田村病毒、β野田村病毒、PCV2、PRRSV、風疫病毒、SARS冠狀病毒、弓形蟲、梅毒螺旋體(Treponemapallidum)、西尼羅病毒或水痘病毒。肽可以由病毒、細菌或原生動物來表達或衍生自病毒、細菌或原生動物。肽可以為重組型或經(jīng)純化的。[0169]本文所用的抗原肽可以為病毒或逆轉錄病毒或其免疫原性片段的衣殼蛋白。[0170]本文所用的抗原肽可以得自EV71病毒，例如抗原肽選自VP0、VP1以及VP3或其表位或片段，例如抗原肽可以包含以下或由以下所組成:VPl的氨基酸167-178(SEQIDNO:23);VPl的氨基酸209-222(SEQIDNO:24);和/或VPl的氨基酸240-260(SEQIDNO:25)或其免疫原性片段?？乖牡氖纠詫嵤┓桨冈诘?圖中示出。[0171]本文所用的抗原肽可以得自PCV2病毒，例如抗原肽為由0RF2編碼的PCV2衣殼蛋白，或是其表位或片段，例如抗原肽可以包含以下或由以下所組成:0RF2的氨基酸100-150(SEQIDNO:26)和/或0RF2的氨基酸151-200(SEQIDNO:27)或其免疫原性片段。[0172]本文所用的抗原肽可以得自PRRSV病毒，例如抗原肽由選自以下的ORF所編碼:0RF-4、0RF-5(主要包膜蛋白)以及0RF-7(核衣殼蛋白)或其表位或片段，例如抗原肽可以包含以下或由以下所組成:0RF7的氨基酸18-57(SEQIDNO:28);0RF7的氨基酸58-123(SEQIDNO:29);0RF5的氨基酸28-65(SEQIDNO:30)和/或0RF7的氨基酸132-200(SEQIDNO:31)或其免疫原性片段。[0173]本文所用的抗原肽可以得自來自螺旋體屬的細菌，例如抗原肽選自P41和C6或其表位或片段。[0174]本文所用的抗原肽可以得自克氏錐蟲，例如抗原肽為TcF或是其表位或片段。[0175]本文所用的抗原肽可`以得自衣原體細菌，例如抗原肽為主要外膜蛋白或其表位或片段。[0176]本文所用的抗原肽可以得自登革熱病毒，例如抗原肽為非結構性蛋白I或其表位或片段。[0177]本文所用的抗原肽可以得自艾-巴病毒，例如抗原肽為非結構性蛋白I或是其表位或片段。[0178]本文所用的抗原肽可以得自A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎，并且抗原肽例如為HBsAg或El肽，或其表位或片段。[0179]本文所用的抗原肽可以得自皰疹病毒，例如抗原肽為Hl或其表位或片段。[0180]本文所用的抗原肽可以得自于HIV病毒，例如抗原肽為gpl20或是其表位或片段。[0181]本文所用的抗原肽可以得自人類嗜T淋巴細胞病毒(HTLV)，例如抗原肽為gp46或是其表位或片段。[0182]本文所用的抗原肽可以得自流感病毒，例如H5N1或是HlNl，并且抗原肽例如為血球凝集素或其表位或片段。[0183]本文所用的抗原肽可以得自惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲，并且抗原肽為例如為裂殖子表面蛋白2(MSP2)或其表位或片段。[0184]本文所用的抗原肽可以得自麻疹病毒，例如抗原肽為麻疹或其表位或片段。[0185]本文所用的抗原肽可以得自風疹病毒，例如抗原肽為El或是其表位或片段。[0186]本文所用的抗原肽可以得自于SARS冠狀病毒，并且抗原肽例如為S蛋白或其表位或片段。[0187]本文所用的抗原肽可以得自弓形蟲，并且抗原肽例如為SAG-1或P30或其表位或片段。[0188]本文所用的抗原肽可以得自梅毒螺旋體，并且抗原肽例如為主要外鞘蛋白(Msp)或其表位或片段。[0189]本文所用的抗原肽可以得自西尼羅病毒，并且抗原肽例如為E蛋白或其表位或片段。[0190]本文所用的抗原肽可以得自野田村病毒，例如抗原肽為野田村病毒的衣殼蛋白或其表位或片段。[0191]可以用于本發(fā)明的抗原肽的實例在以下表4中示出:[0192]表4[0193]【權利要求】1.表達盒，其中所述表達盒包含:(a)來自白斑綜合征病毒的iel啟動子或其變體；(b)編碼N端gp64信號肽的核酸序列或其變體、編碼抗原肽的核酸序列、編碼跨膜區(qū)的核酸以及編碼gp64胞質域的核酸或其變體；其中所述啟動子可操作地連接至所述核酸序列。2.如權利要求1所述的表達盒，其中所述抗原肽來自病毒、或逆轉錄病毒、或細菌、或原生動物、或其免疫原性片段。3.如權利要求1或2所述的表達盒，其中所述抗原肽是來自以下細菌的肽:疏螺旋體屬，或克氏錐蟲，或衣原體屬，或巨細胞病毒，或登革熱病毒，或EV71，或PCV2，或PRRSV，或HSV-1，或HSV-2，或艾-巴病毒，或脊髓灰質炎病毒，或A型肝炎病毒，或B型肝炎病毒，或C型肝炎病毒，或D型肝炎病毒，或E型肝炎病毒(HEV)，或β野田村病毒，或皰疹，或HIV，或HTLV,或流感病毒如Η5Ν1、HlNl，或麻疹病毒，或野田村病毒，或風疹病毒，或SARS病毒，或西尼羅病毒，或水痘病毒，或弓形蟲，或密螺旋體，或惡性瘧原蟲，或間日瘧原蟲，或卵形瘧原蟲，或三日瘧原蟲。4.如權利要求2或3所述的表達盒，其中所述抗原肽選自:P41、C6、TcF、主要外膜蛋白、非結構性蛋白1、HBsAg,EUHUgpl20、gp46、血球凝集素、裂殖子表面蛋白2(MSP2)、S蛋白、SAG-1、P30、主要外鞘蛋白(Msp)以及E蛋白。5.如權利要求3所述的表達盒，其中所述病毒為EV71，并且所述抗原肽選自:VP0、VP1、VP3及其片段。6.如權利要求3所述的表達盒，其中所述病毒為PCV2，并且所述抗原肽為由0RF-2編碼的PCV2衣殼肽或其片段。`7.如權利要求3所述的表達盒，其中所述病毒為PRRSV，并且所述抗原肽為由選自以下的ORF所編碼:0RF-4、0RF-5(主要包膜蛋白)、0RF-7(核衣殼蛋白)及其片段。8.如權利要求3所述的表達盒，其中所述病毒為野田村病毒，并且所述抗原肽選自野田村病毒的衣殼肽及其片段。9.如權利要求3所述的表達盒，其中所述病毒為β野田村病毒，并且所述抗原肽選自β野田村病毒的衣殼肽及其片段。10.如前述權利要求中任一權利要求所述的表達盒，其中所述跨膜區(qū)為糖蛋白跨膜區(qū)。11.如權利要求10所述的表達盒，其中所述糖蛋白跨膜區(qū)為血球凝集素跨膜區(qū)。12.如權利要求11所述的表達盒，其中所述血球凝集素跨膜區(qū)選自:Η1、Η2、Η3、Η4、Η5、Η6、Η7、Η8、Η9、Η10、Η11、Η12、Η13、Η14、Η15以及Η16。13.如權利要求12所述的表達盒，其中所述血球凝集素跨膜區(qū)選自Η3Ν2、Η5Ν1以及Η3Ν2-ΗΑ。14.如權利要求13所述的表達盒，其中所述Η3Ν2跨膜區(qū)由SEQIDNO:17或其變體所編碼。15.如前述權利要求中任一權利要求所述的表達盒，其中所述gp64胞質域由SEQIDNO:15或SEQIDNO:16或其變體所編碼。16.如前述權利要求中任一權利要求所述的表達盒，其中所述N端gp64信號肽由SEQIDNO:14或其變體所編碼。17.如前述權利要求中任一權利要求所述的表達盒，其中所述iel啟動子為SEQIDNO:18或其變體。18.表達載體，其包含前述權利要求中任一權利要求所述的表達盒。19.如權利要求18所述的表達載體，其中所述載體與蛋白表達系統(tǒng)相容，所述蛋白表達系統(tǒng)包含選自以下的宿主細胞:細菌細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、魚細胞、酵母菌細胞以及植物細胞。20.如權利要求19所述的表達載體，其中所述宿主細胞為Sf9-1I。21.如權利要求18至20中任一權利要求所述的表達載體，其中所述表達載體適用于病毒表達系統(tǒng)內。22.如權利要求21所述的表達載體,其中所述病毒表達系統(tǒng)選自:腺病毒、慢病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒以及桿狀病毒。23.如權利要求22所述的表達載體,其中所述病毒表達系統(tǒng)為桿狀病毒表達系統(tǒng)。24.試劑盒，其包含權利要求1至17中任一權利要求所述的表達盒或權利要求18至23中任一權利要求所述的表達載體以及為此的包裝材料。25.分離的宿主細胞，其包含權利要求1至17中任一權利要求所述的表達盒或權利要求18至23中任一權利要求所述的表達載體。26.免疫原性組合物，其包含權利要求1至17中任一權利要求所述的表達盒，或權利要求18至23中任一權利要求所述的表達載體，連同藥物可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑中的一種或多種。27.疫苗，其包含權利要求1至17中任一權利要求所述的表達盒、權利要求18至23中任一權利要求所述的表達載體，連同藥物可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑中的一種或多種。28.抗體，其從接種權利要求27所述的疫苗的生物體而獲得。29.抗血清，其含有權利要求28所述的抗體。30.用于治療或預防個體的疾病的權利要求1至17中任一權利要求所述的表達盒，或權利要求18至23中任一權利要求所述的表達載體，或權利要求26所述的免疫原性組合物，或權利要求27所述的疫苗，其中所述抗原肽由所述表達載體在所述個體中表達。31.用于治療或預防個體的疾病的權利要求28所述的抗體或權利要求29所述的抗血清。32.用于調節(jié)免疫反應的方法，其中所訴方法包括向主體給予有效量的權利要求1至17中任一權利要求所述的表達盒，或權利要求18至23中任一權利要求所述的表達載體，或權利要求26所述的免疫原性組合物，或權利要求27所述的疫苗，或權利要求28所述的抗體，或權利要求29所述的抗血清。33.權利要求1至17中任一權利要求所述的表達盒，或權利要求18至23中任一權利要求所述的表達載體，或權利要求26所述的免疫原性組合物，或權利要求27所述的疫苗，或權利要求28所述的抗體，或權利要求29所述的抗血清制在造用于調節(jié)個體免疫反應的藥物中的用途。34.如權利要求30所述的表達盒或表達載體或免疫原性組合物或疫苗；或權利要求31所述的抗體或抗血清；或權利要求32所述的方法；或權利要求33所述的用途；其中所述個體為哺乳動物，或鳥類，或甲殼類動物，或無顎魚，或多骨魚，或爬蟲類動物或兩棲動物。35.如權利要求34所述的表達盒或表達載體或免疫原性組合物或疫苗或抗體或抗血清或方法或用途，其適用于口服給藥。36.如權利要求30所述的表達盒或表達載體或免疫原性組合物或疫苗；或權利要求31所述的抗體或抗血清；其中所述疾病選自:手足口病、斷奶后多系統(tǒng)消耗性癥候群、豬生殖與呼吸癥候群、皰疹、流感、癌癥、肝炎、弓形蟲癥、梅毒、瘧疾以及病毒性神經(jīng)壞死病。37.用于呈遞、生產或展示抗原肽的方法，其中所述方法包括:(a)將編碼所述抗原肽的核酸插入權利要求18至23中任一權利要求所述的表達載體內；(b)用所述表達載體轉染至少一個宿主細胞；以及(c)由所述表達載體表達所述抗原肽；其中所述抗原肽被呈遞或展示在桿狀病毒的表面膜上。【文檔編號】A61K39/125GK103562389SQ201280016937【公開日】2014年2月5日申請日期:2012年2月8日優(yōu)先權日:2011年2月8日【發(fā)明者】普萊莫南德·巴爾拉賈,況慧星,安布·庫馬爾·卡魯帕南申請人:淡馬錫生命科學研究院有限公司