長效肽類似物的制作方法
【專利摘要】本文提供了CLR/RAMP受體的長效激動劑類似物，其具有延長的體內(nèi)半衰期。
【專利說明】長效肽類似物
【背景技術(shù)】
[0001]生理學(xué)的許多方面，例如饑餓、應(yīng)激反應(yīng)和生殖都依賴于控制的激素平衡。這種平衡能夠響應(yīng)于內(nèi)部和外部刺激。例如，垂體前葉的激素分泌在很大程度上受到下丘腦的控制，下丘腦是恰位于垂體前葉上方的大腦區(qū)域。已知下丘腦神經(jīng)元通過在腦垂體中產(chǎn)生特定激素的特定細(xì)胞組制造并釋放刺激或抑制該特定激素分泌的肽因子。
[0002]不同的下丘腦釋放肽在調(diào)節(jié)不同垂體前葉激素(例如GH、ACTH、TSH、LH和FSH)的分泌中是重要的。然而，垂體前葉釋放的催乳素(或催乳激素)的調(diào)節(jié)更加復(fù)雜，并且涉及來源于下丘腦和垂體中葉的刺激因子(參見Laudon等人(1990) Endocrinology 126:3185-319 2; Ben-Jonathan 和 Hnasko (2001) Endocr.Rev.22:724-763)。盡管已經(jīng)很好地證明了垂體中葉在調(diào)節(jié)催乳素分泌中的作用，并且中葉和后葉對于由哺乳和雌二醇誘導(dǎo)催乳素釋放增加是必不可少的，但來自中葉的催乳素釋放因子的確認(rèn)仍然有待表征(Allen等人(1995) Endocrino1gyI36:3093-3099)。
[0003]垂體降鈣素受體樣受體(CRLR)與催乳素釋放有關(guān)(Meeran等人1997.J.Clin.Endocrinol.Metab.82:95-100)，但缺少與大腦中降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)結(jié)合位點重疊的降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)表達(dá)譜(Krugerl988.Brain Res.463:223-244)。最初作為鈣平衡必須的多肽激素分離的降鈣素屬于一組肽類激素，包括^ CGRP, ^ CGRP、腎上腺髓質(zhì)素 (ADM)和胰淀素(Eto (2001)122:1693-1711)。這些組織特異性肽是用于在血管和呼吸系統(tǒng)中維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要內(nèi)分泌和神經(jīng)分泌整合子(integrator )。
[0004]這些肽的生物學(xué)作用經(jīng)由與兩種緊密相關(guān)的II型G蛋白偶合受體 (GPCR) (即，降鈣素受體和CRLR結(jié)合而介導(dǎo)(Christopoulos等人(1999)Mol.Pharmacol.56:235-242;Poyner 等人(2002)Pharmacol.Rev.54:233-246)。盡管降鈣素受: 體是降鈣素作用的主要調(diào)節(jié)子，但其也結(jié)合胰淀素。最近的克隆和功能性研究已經(jīng)表明， CGRPs, ADM與CRLR和三種受體活性調(diào)節(jié)蛋白(RAMP)的不同組合發(fā)生相互作用，并且胰淀素以較小的程度與CRLR和三種受體活性調(diào)節(jié)蛋白(RAMP)的不同組合發(fā)生相互作用；參見 McLatchie 等人(1998) Nature393:333-339。
[0005]許多細(xì)胞表達(dá)多種RAMP。需要降鈣素受體樣受體(CRLR)和受體活性調(diào)節(jié)蛋白 (RAMP)的共表達(dá)以生成降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)和腎上腺髓質(zhì)素(ADM)的功能性受體。 RAMP和CRLR之間的異質(zhì)二聚體形成對于適當(dāng)?shù)募?xì)胞表面靶向以及CGRP和ADM受體的藥理學(xué)特性是必不可少的。RAMP家族包含三個成員(RAMP-l、RAMP-2和RAMP-3)，其共有少于 30%的序列同一性,但卻是常見的拓?fù)浣M織(common topological organization)。它們是小的固有膜蛋白(預(yù)期大小:Mrl4，000-17，000)，具有大的細(xì)胞外N末端(~100個氨基酸)、 單個跨膜結(jié)構(gòu)域和非常短的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(10個氨基酸)。RAMPl與CRLR的共表達(dá)導(dǎo)致形成CGRP受體，而RAMP2和RAMP3促進(jìn)ADM受體的表達(dá)。當(dāng)降鈣素受體與RAMPl共表達(dá)時， 其提供CGRP/胰淀素受體，而當(dāng)降鈣素受體與RAMP3共表時，其提供胰淀素受體。
[0006]利用a CGRP、ADM或胰淀素缺陷的突變小鼠進(jìn)行的研究表明，在不同的系統(tǒng)中， CRLR對于心血管形態(tài)發(fā)生、感覺神經(jīng)傳遞、炎癥反應(yīng)、疼痛行為和葡萄糖穩(wěn)態(tài)是很重要的。因此，通過受體結(jié)合特異性和個別配體的組織表達(dá)譜來確定該家族中肽的生理功能。
[0007]肽類激素是臨床應(yīng)用和治療開發(fā)中很感興趣的，包括高血壓的治療和心血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。除了這些作用之外，催乳素釋放因子的識別也是人們感興趣的。盡管催乳素在哺乳動物妊娠期和哺乳期內(nèi)十分重要并且與乳腺發(fā)育和促進(jìn)乳汁合成有關(guān)，但迄今為止特異性催乳素釋放激素仍然是未知的。
[0008]相關(guān)出版物
[0009]Hay 和 Smith (2001) Trends Pharmacol.ScL 22:57-59;以及 Shindo 等人(2001) Circulationl04:1964-197討論了腎h腺髓質(zhì)素在血管中的重要件。Zhang等人(2001) Pain89:265-273; Salmon 等人(1999) NeuroreportlO: 849-854;以及 Salmon 等人(2001) Nat.Neurosc1.4:357-358 討論了 CGRP 的作用。Mulder 等人(2000) Am.1.Physiol.Endocrinol.Metab.278:E684_691 討論了胰淀素的作用。
[0010]GenBank 登錄 AF529213。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本文提供了長效肽類似物，其具有垂體中葉素或腎上腺髓質(zhì)素的生物活性，包括擔(dān)當(dāng)降鈣素受體樣受體的配體，但與天然多肽相比，其具有實質(zhì)上更長的體內(nèi)半衰期。與天然肽相比，本發(fā)明的類似物具有持續(xù)至少2倍長的持續(xù)時間的體內(nèi)效力，并且可以是5倍長、10倍長、20倍長或更長。可以通過確定多肽的穩(wěn)定性、生理作用的時間長短等在體內(nèi)或體外測量增加的體內(nèi)活性。
[0012]在本發(fā)明的一些實施方式中，該類似物包含在N-末端被修飾的生物活性垂體中葉素或腎上腺髓質(zhì)素多肽。所關(guān)注的N-末端修飾包括結(jié)合于脂肪酸，通常為C4至C30脂肪酸，其可以是不飽和的或飽和的。感興趣的脂肪酸包括，但不限于，棕櫚酸；硬脂酸；花生酸；月桂酸；肉豆蘧酸；肉豆蘧油酸；棕櫚油酸；十六碳烯酸(sapienic acid);油酸；亞油酸；a -亞麻酸；花生四烯酸；二十碳五烯酸；芥酸；二十二碳六烯酸 ；等。在其他的實施方式中，通過聚乙二醇化、糖基化來修飾、結(jié)合于大的蛋白(例如白蛋白)或結(jié)合于聚合物并結(jié)合氨基酸修飾(例如，利用D-氨基酸或P氨基酸)來修飾多肽，以增加生物半衰期。
[0013]本發(fā)明的類似物提供了 CLR/RAMP受體的長效激動劑類似物。該類似物可提供對心率的有限作用，而對血壓產(chǎn)生顯著作用。血清中長效肽的區(qū)室化(compartmentalization) 在給定的時間點有效減少了細(xì)胞刺激激動劑的可用部分，從而減輕了注射的肽的波峰和波谷效應(yīng)并消除了不希望的副作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1A-1C是用長效垂體中葉素肽(棕櫚酸-修飾的MD，IMD-PA)處理后的SHR大鼠中的血壓測量值的實施例，A.30nmol/kg體重(BW) ；B/C, IOOnmoI/kg BW。
[0015]圖2A-2B是注射野生型垂體中葉素肽(MD，IOOnmoI/kg BW)后的SHR大鼠中的血壓測量值的實施例。頂D-PA肽的降壓作用在體內(nèi)持續(xù)超過5小時，而未經(jīng)修飾的MD肽則持續(xù)小于I小時。
[0016]圖3A-3B是在對照動物中注射PBS后的BP測量值。
[0017]圖4示出了表達(dá)三種不同受體(CLR/RAMP1、CLR/RAMP2和CLR/RAMP3)的293T細(xì)胞中MD和MD-PA的刺激效應(yīng)。
[0018]圖5A-5C示出了在注射長效腎上腺髓質(zhì)素肽(棕櫚酸-結(jié)合的ADM，ADM-PA, lOOnmol/kg BW)之后SHR大鼠的收縮壓測量值的實施例。該肽的降壓作用在體內(nèi)持續(xù)超過 5小時。相對而言，未經(jīng)修飾的ADM肽的降壓作用通常持續(xù)小于1.5小時。
[0019]圖6A-6B示出了在注射對照鹽水之后SHR大鼠的收縮壓測量值的實施例。
[0020]圖7示出了在表達(dá)重組腎上腺髓質(zhì)素受體I (CLR/RAMP2)和2 (CLR/RAMP3)的 293T細(xì)胞中ADM和ADM-PA的刺激作用。盡管ADM-PA肽在體外的刺激作用低于野生型ADM， 但其在體內(nèi)具有顯著更長的有效期(effective life)。
[0021]圖8示出了在腹腔內(nèi)注射后12小時，與ADM肽相比，在體內(nèi)保留顯著較高水平的免疫反應(yīng)性ADM-PA。
【具體實施方式】
[0022]本發(fā)明提供了作為降鈣素肽激素家族成員的垂體中葉素或腎上腺髓質(zhì)素的新型多肽類似物。
[0023]垂體中葉素是降鈣素受體樣受體的配體。人垂體中葉素基因編碼148個氨基酸的開放閱讀框，具有用于在N-末端分泌的24個氨基酸信號肽和成熟的酰胺化肽(在SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2中示出)。成人垂體中葉素肽包括但不限于40氨基酸肽(垂體中葉素-短或頂DS)，如SEQ ID NO:3所示，其對應(yīng)于成熟蛋白的殘基8-47 ;和47-氨基酸成熟肽(垂體中葉素-長或頂DL) （在SEQ ID N0:4所示。該垂體中葉素肽可用末端賴氨酸殘基取代以易于修飾。例如，感興趣的垂體中葉素肽示于SEQ ID NO: 7:K(mod)GCVLGTCQVQNLSH RLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY，其中末端賴氨酸被修飾，例如通過連接脂質(zhì)或其他基團(tuán)。
[0024]腎上腺髓質(zhì)素是降鈣素受體樣受體的配體。ADM基因編碼前激素原，其被翻譯后修飾以生成2種生物活性肽:腎上腺髓質(zhì)素和前體腎上腺髓質(zhì)素N-末端20肽(PAMP)。腎上腺髓質(zhì)素由52個氨基酸構(gòu)成，其具有I個分子內(nèi)二硫鍵，并且顯示出與降鈣素基因相關(guān)肽少量同源。該前體被稱為前體腎上腺髓質(zhì)素，長度為185個氨基酸。參見Genbank編號 NM_001124，其通過引用方式結(jié)合于本文。該前體多肽(SEQ ID NO:5)具有如下的氨基酸序列:
[0025]MKLVSVALMYLGSLAFLGADTARLDVASEFRKKWNKWALSRGKRELRMSSSYPTG LADVKAGPAQTLI RPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRVKRYRQSMNNFQGLRSFGCR FGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQ GYGRRRRRSLPEAGPGRTLVSSK PQAHGAPAPPSGSAPHFL。
[0026]出于本發(fā)明的目的，除非另外具體說明，術(shù)語“腎上腺髓質(zhì)素肽”可以是指衍生自腎上腺髓質(zhì)素前體肽的任何活性肽。尤其感興趣的是降壓肽。該活性肽包括，但不限于，具有如下氨基酸序列(SEQ ID NO:6)的腎上腺髓質(zhì)素肽:
[0027]K (mod) GCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGY，其中位于殘基 I 處的賴氨酸被修飾，例如通過連接脂質(zhì)或其他基團(tuán)。
[0028]在本發(fā)明的一些實施方式中，通過本發(fā)明的方法修飾垂體中葉素和腎上腺髓質(zhì)素中的一種或多種，以提供壽命長的類似物。
[0029]在本發(fā)明的一些實施方式中，該類似物包含在N-末端被修飾的生物活性多肽，如結(jié)構(gòu)I所示。在其他的實施方式中，可通過聚乙二醇化、糖基化、連接于(conjugation to)大的蛋白(例如白蛋白)、或連接于聚合物并結(jié)合氨基酸修飾(例如，利用D-氨基酸或e氨
基酸)來修飾該多肽，以增加生物半衰期。
【權(quán)利要求】
1.一種生物活性垂體中葉素或腎上腺髓質(zhì)素肽，其血清半衰期大于1.5小時。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中，所述肽通過將聚合物結(jié)合于所述肽的氨基末端而被修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肽，其中，所述肽具有如下結(jié)構(gòu):
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其中，Rl選自棕櫚酸鹽；硬脂酸鹽；花生酸；月桂酸；肉豆蘧酸；肉豆蘧油酸；棕櫚油酸；十六碳烯酸；油酸；亞油酸；a -亞麻酸；花生四烯酸；十二碳五烯酸；芥酸；和二十二碳六烯酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中，所述肽包含如SEQID NO: 3; SEQ ID NO: 4;或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3 ；SEQ ID NO:4 ;或SEQ ID N0:7所示的氨基酸序列組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中，所述肽包含如SEQID N0:6所示的氨基酸序列或由如SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列組成。
7.—種藥物組合物，包含治療有效劑量的權(quán)利要求1-6中任一項所述的肽，以及可藥用衍生物。
8.一種向宿主動物長時間遞送CLR/RAMP受體活性的長效激動劑的方法，所述方法包括向所述動物給予權(quán)利要求7所述的藥物組合物。
9.一種降低個體中外周血壓同時增加心輸出量的方法，所述方法包括:向所述個體給予根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中，以大于每四小時一次的時間間隔遞送所述肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，以大于每12小時一次的時間間隔遞送所述肽。
【文檔編號】A61K38/16GK103458916SQ201280016897
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月7日
【發(fā)明者】許曉瑜, 張嘉琳 申請人:小利蘭·斯坦福大學(xué)托管委員會