專利名稱：體外培養(yǎng)的組織工程血管的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種I型膠原及組織細胞在血管生物反應器內培養(yǎng)生成的組織工程血管。有較強的力學性能，能夠承受跨壁壓カ和血流對血管壁的順應力，有較好的抗血栓形成、抗血小板粘附的作用。生物相容性較好。用于心腦血管疾病的血管移植物。屬于醫(yī)用生物材料領域。
背景技術：
動脈粥樣硬化性心臟病為代表的動脈缺血性疾病是引起人類死亡的主要原因之一。其治療方法主要是進行動脈移植手木。另外先天性心臟病是一種常見的先天性畸形，需進行手術矯治，一些復雜先心病手術也需應用血管移植物。從前我們用的血管移植物多為高分子人工材料，如滌綸、聚四氟こ烯等，均表現(xiàn)出各自利弊?，F(xiàn)在國內外采用最多的為同種血管，但同種血管來源有限，同時同種血管經(jīng)冷凍保存，雖祛除了大部分抗原物質，但移植入體內后，仍會產生一定的排異反應，移植5-10年后鈣化、失去功能比例較高。異種血管來源方便，但因其移植后會產生強烈的排異反應，而至今未能在臨床上應用。自身血管臨床上應用較多，但由于來源和強度的限制，仍不能達到滿意的效果。有鑒于此，開發(fā)構建具有組織相容性好、具有生長潛能、不易鈣化和血栓形成、不易感染的組織工程血管變的尤為重要。由于天然血管主要有三層結構且膠原為血管壁細胞外基質中主要的結構性物質，占血管壁干重的20% _50%，故本公司利用膠原為基質，結合天然血管主要細胞體外培養(yǎng)生長的特點，采用逐層構建血管三層結構的方法制得。此方法制得的組織工程血管有較強的力學性能，能夠承受跨壁壓カ和血流對血管壁的順應力，有較好的抗血栓形成、抗血小板粘附的作用。為血管移植術提供了安全有效的移植物。

發(fā)明內容
本材料選用了 I型膠原及組織細胞在血管生物反應器內培養(yǎng)的方法制成。能夠滿足天然血管的要求，達到很好的血管移植效果。主要操作步驟如下1、膠原溶液的制備市售I型膠原，浸泡于0. 001mol/L 1. Omol/L的醋酸溶液， 制得濃度為0.1 % 1. 0% (w/w)的膠原溶液。2、膠原溶液涂層根據(jù)所需血管的尺寸的不同，選擇不同尺寸的玻璃管道，將膠原溶液加入滾筒式攪拌器的玻璃管道中進行滾動涂層，直至形成均勻的膠原膜，然后倒去多余的膠原溶液。3、聚こニ醇涂層市售聚こニ醇用生理鹽水稀釋至濃度為0.1 % 1.0% (w/w),均勻滴在膠原膜上，然后滾筒式攪拌器滾動涂層。4、平滑肌細胞與成纖維細胞的種植受體骨髄中分化、提取平滑肌細胞和成纖維細胞，1. 25X 105個/ml的濃度加入平滑肌細胞，連續(xù)種植2d后同時按同樣的濃度種植成纖維細胞。分別連續(xù)種植3d。5、血管內皮祖細胞和血管內皮生長因子的種植在平滑肌細胞與成纖維細胞種植完畢后將受體骨髓中提取的血管內皮祖細胞和血管內皮生長因子按5. Ong/ml 10. Ong/ml的濃度滴加進滾筒攪拌器的玻璃管道內，連續(xù)種植3d。6、組織工程血管的形成將組織細胞種植完畢的膠原膜取出放進血管生物反應器中，模擬人體血管所應承受的力學性能，及血液流動的情況進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間7d 21d。即可植入受體進行使用。
具體實施例方式實施例1、取市售I型膠原0. lg，浸泡在IOOml濃度為0. 2mol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進滾筒式攪拌器的玻璃管道內滾動涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇0.1g倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動涂層。按1. 25X 105個/ml的濃度加入受體自身骨髄分化 平滑肌細胞，連續(xù)種植2d，然后再同時按1. 25X 105個/ml的濃度種植受體自身骨髄分化成纖維細胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按9. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內皮祖細胞和血管內皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細胞的膠原膜取出放進血管生物反應器中，模擬人體血管所應承受的力學參數(shù)，及血液流動的情況進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間7d。實施例2、取市售I型膠原0. 2g，浸泡在IOOml濃度為0. 5mol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進滾筒式攪拌器的玻璃管道內滾動涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇0. 5g倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動涂層。按1. 25X 105個/ml的濃度加入受體自身骨髄分化平滑肌細胞，連續(xù)種植2d，然后再同時按1. 25X 105個/ml的濃度種植受體自身骨髄分化成纖維細胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按5. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內皮祖細胞和血管內皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細胞的膠原膜取出放進血管生物反應器中，模擬人體血管所應承受的力學參數(shù)，及血液流動的情況進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間14d。實施例3、取市售I型膠原1. Og，浸泡在IOOml濃度為0. Olmol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進滾筒式攪拌器的玻璃管道內滾動涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇0.1g倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動涂層。按1.25X 105個/ml的濃度加入受體自身骨髄分化平滑肌細胞，連續(xù)種植2d，然后再同時按1. 25X 105個/ml的濃度種植受體自身骨髄分化成纖維細胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按10. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內皮祖細胞和血管內皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細胞的膠原膜取出放進血管生物反應器中，模擬人體血管所應承受的力學參數(shù)，及血液流動的情況進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間14d。實施例4、取市售I型膠原0. 5g，浸泡在IOOml濃度為0. 05mol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進滾筒式攪拌器的玻璃管道內滾動涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇1. Og倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動涂層。按1.25X 105個/ml的濃度加入受體自身骨髄分化平滑肌細胞，連續(xù)種植2d，然后再同時按1. 25X 105個/ml的濃度種植受體自身骨髄分化成纖維細胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按5. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內皮祖細胞和血管內皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細胞的膠原膜取出放進血管生物反應器中，模擬人體血管所應承受的力學參數(shù)，及血液流動的情況進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間Id0實施例5、取市售I型膠原0. 5g，浸泡在IOOml濃度為0. 05mol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進滾筒式攪拌器的玻璃管道內滾動涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇0. 2g倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動涂層。按1.25X 105個/ml的濃度加入受體自身骨髄分化平滑肌細胞，連續(xù)種植2d，然后再同時按1. 25X 105個/ml的濃度種植受體自身骨髄分 化成纖維細胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按5. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內皮祖細胞和血管內皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細胞的膠原膜取出放進血管生物反應器中，模擬人體血管所應承受的力學參數(shù)，及血液流動的情況進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間21d。實施例6、取市售I型膠原0. 8g，浸泡在IOOml濃度為0. 9mol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進滾筒式攪拌器的玻璃管道內滾動涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇0. 8g倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動涂層。按1. 25X 105個/ml的濃度加入受體自身骨髄分化平滑肌細胞，連續(xù)種植2d，然后再同時按1. 25X 105個/ml的濃度種植受體自身骨髄分化成纖維細胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按6. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內皮祖細胞和血管內皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細胞的膠原膜取出放進血管生物反應器中，模擬人體血管所應承受的力學參數(shù)，及血液流動的情況進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間15d。實施例7、取市售I型膠原0. 6g，浸泡在IOOml濃度為0. lmol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進滾筒式攪拌器的玻璃管道內滾動涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇0. 3g倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動涂層。按1. 25X 105個/ml的濃度加入受體自身骨髄分化平滑肌細胞，連續(xù)種植2d，然后再同時按1. 25X 105個/ml的濃度種植受體自身骨髄分化成纖維細胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按8. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內皮祖細胞和血管內皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細胞的膠原膜取出放進血管生物反應器中，模擬人體血管所應承受的力學參數(shù)，及血液流動的情況進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間14d。實施例8、取市售I型膠原0. 2g，浸泡在IOOml濃度為0. 02mol/L醋酸溶液中。攪拌均勻充分溶解，然后放進滾筒式攪拌器的玻璃管道內滾動涂層。形成均勻膠原膜后倒出多余膠原溶液。市售聚こニ醇0. 5g倒入IOOml滅菌處理的生理鹽水中攪拌均勻，取適量聚こニ醇液體滴在膠原膜上，滾筒式攪拌器滾動涂層。按1.25X 105個/ml的濃度加入受體自身骨髄分化平滑肌細胞，連續(xù)種植2d，然后再同時按1. 25X 105個/ml的濃度種植受體自身骨髄分化成纖維細胞。分別連續(xù)種植3d。接下來按10. Ong/ml的濃度種植受體自身骨髄血管內皮祖細胞和血管內皮生長因子，連續(xù)種植3d。最后將種植完組織細胞的膠原膜取出放進血管 生物反應器中，模擬人體血管所應承受的力學參數(shù)，及血液流動的情況進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間IOcL
權利要求
1. 一種I型膠原及組織細胞在血管生物反應器內培養(yǎng)的方法制成。此產品組織相容性好、具有生長潛能、不易感染、有較強的力學性能，能夠承受跨壁壓力和血流對血管壁的順應力，有較好的抗血栓形成、抗血小板粘附的作用。其特征包括下列步驟 (1)、市售I型膠原，浸泡于O.OOlmol/L 1. Omol/L的醋酸溶液，制得濃度為O. 1%~.1.0% (w/w)的膠原溶液。
(2)、根據(jù)所需血管的尺寸的不同，選擇不同尺寸的玻璃管道，將膠原溶液加入滾筒式攪拌器的玻璃管道中進行滾動涂層，直至形成均勻的膠原膜，然后倒去多余的膠原溶液。形成初步的膠原基質層。
(3)、市售聚乙二醇用生理鹽水稀釋至濃度為O.1 % 1. O % (w/w)，均勻滴在膠原膜上，然后滾筒式攪拌器滾動涂層。完成為平滑肌細胞的粘附增長提供保障。
(4)、將從受體骨髓中分化提取的平滑肌細胞按1.25 X IO5個/ml的濃度種植在涂了聚乙二醇的膠原膜上，連續(xù)種植2d后同時按同樣的濃度種植從受體骨髓中分化提取的成纖維細胞。分別連續(xù)種植3d。完成血管外圍兩層結構的組織細胞的種植。
(5)、將受體骨髓中提取的血管內皮祖細胞和血管內皮生長因子按5.Ong/ml .10.Ong/ml的濃度滴加進滾筒攪拌器的玻璃管道內，連續(xù)種植3d。完成血管內層組織細胞的種植。
(6)、將組織細胞種植完畢的膠原膜取出放進血管生物反應器中，模擬人體血管所應承受的力學參數(shù)，及血液流動的情況進行培養(yǎng)，培養(yǎng)7d 21d。形成了體外培養(yǎng)的組織工程血管。可植入受體進行使用。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種可用于臨床血管移植手術的血管移植物及其制備方法。屬于醫(yī)用生物材料領域。主要解決目前臨床中自體血管取材受限，手術繁雜；異體血管風險高和高分子材料植入體內順應性差或者鈣化等問題。通過根據(jù)天然血管不同結構不同組織細胞的特點，分三層種植受體自身組織細胞，最終模擬體內血管所應承受力學參數(shù)及血流情況制備而成，達到自體血管修復的目的。通過此方法制備所得的材料是I型膠原及受體自身組織細胞在血管生物反應器培養(yǎng)而成，接近自體血管，生物相容性好，具有生長潛能，不易感染、有較強的力學性能，能夠承受跨壁壓力和血流對血管壁的順應力，有較好的抗血栓形成和抗血小板粘附的作用，有利于血管移植手術的血管修復。
文檔編號A61F2/06GK103006349SQ20121058960
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權日2012年12月26日
發(fā)明者萬力, 張春紅 申請人:天津市賽寧生物工程技術有限公司