專利名稱：智能納米藥物傳遞系統(tǒng)和制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料和納米技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種智能納米藥物傳遞系統(tǒng)的制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是當(dāng)前嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一?；瘜W(xué)藥物是除手術(shù)療法外最重要的治療手段。目前臨床上廣泛使用的藥物分子進(jìn)入體內(nèi)后大多將分布在體內(nèi)的各個器官，對病變部位的特異性分布很少。對于這些藥理作用強(qiáng)烈的抗癌藥物而言，其細(xì)胞毒性很大，在有效殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也會破壞正常的組織細(xì)胞，因此在治療過程中也會對正常組織或器官產(chǎn)生很大的毒性，出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，治療劑量下給患者帶來極大痛苦。為了提高藥物對腫瘤部位的特異性作用，提高藥物的治療效果，科研工作者們提出了靶向藥物傳遞系統(tǒng)的設(shè)想，即利用某種對腫瘤部位具有特殊親和力的納米材料，將抗腫瘤藥物選擇性地輸送到體內(nèi)的腫瘤部位，使腫瘤組織的藥物達(dá)到治療量以上，同時在正常組織內(nèi)沒有或有極少量的藥物，從而降低抗癌藥物對正常組織的毒副作用。近年來報道了一系列具有環(huán)境響應(yīng)性的新型靶向藥物系統(tǒng)，它們是通過靶向部位的特殊環(huán)境“激活”，將藥物可控釋放到靶向部位的一類新型藥物系統(tǒng)。這一新型靶向藥物系統(tǒng)在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中能夠穩(wěn)定存在，而在靶部位由于環(huán)境的改變，藥物系統(tǒng)隨即產(chǎn)生響應(yīng)性，結(jié)構(gòu)或性能上發(fā)生變化，通過載體解離，鍵斷裂，降解等方法使藥物釋放到靶向部位。藥物傳遞系統(tǒng)對藥物的靶向釋放既可以依賴于對外界環(huán)境的某種刺激信號做出相對應(yīng)的響應(yīng)；也可以依賴于對腫瘤微環(huán)境的因素做出響應(yīng)。pH響應(yīng)性靶向藥物系統(tǒng)是一類極具應(yīng)用前景的智能藥物傳遞系統(tǒng)。正常組織的PH值一般為7. 4，而腫瘤組織的環(huán)境略呈酸性，約為5. 7-7. 2。因此可以利用這兩種環(huán)境pH的微弱變化設(shè)計(jì)智能藥物載體，實(shí)現(xiàn)藥物對腫瘤的靶向傳遞與釋放。另一方面，腫瘤細(xì)胞中的內(nèi)涵體和溶酶體具有更強(qiáng)的酸性環(huán)境，如腫瘤細(xì)胞中早期內(nèi)涵體的PH值在5. 4-6. O左右，而晚期內(nèi)涵體的pH值一般在5. O左右、溶酶體的PH值在4. O 5. O。利用這一特點(diǎn)可以設(shè)計(jì)適宜的智能藥物載體實(shí)現(xiàn)藥物在特定細(xì)胞器的釋放，大大增加藥物在作用部位(如細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核)中的濃度，克服腫瘤的耐藥性。因此PH響應(yīng)性智能納米藥物載體在藥物傳遞和釋放領(lǐng)域的應(yīng)用可以極大提高腫瘤治療的有 效性。誘導(dǎo)分化治療作為腫瘤治療的一個新策略已經(jīng)成為現(xiàn)在腫瘤治療研究的新領(lǐng)域。在其發(fā)展過程中還有許多亟待解決的問題，如現(xiàn)有的誘導(dǎo)分化劑存在著毒副作用大、誘導(dǎo)分化能力較低等諸多弊端。以臨床應(yīng)用最為廣泛的ATRA為例，其副反應(yīng)主要有維甲酸綜合癥、聞白細(xì)胞綜合癥、聞盧頁內(nèi)壓綜合癥、聞組胺綜合癥等。因此，如何選擇合適的藥物載體將誘導(dǎo)分化藥物安全、高效地靶向到腫瘤組織是一個亟待解決的問題?？梢灶A(yù)計(jì)，pH響應(yīng)性智能納米藥物載體在腫瘤的誘導(dǎo)分化治療上同樣會發(fā)揮巨大的作用。目前對pH響應(yīng)性智能藥物載體的設(shè)計(jì)中常采用具有可發(fā)生質(zhì)子化的弱堿性或弱酸性聚合物制成聚合物膠束，當(dāng)PH發(fā)生改變時，聚合物的離子化狀態(tài)發(fā)生改變，使藥物從膠束中釋放出來。但是，研究中常用的聚合物常具有很高的分子量，進(jìn)入體內(nèi)后不易被排出。而低分子量化合物則更具有相對安全、生物相容性良好等特性，將是藥物緩釋系統(tǒng)的一個非常有用的補(bǔ)充。因此開發(fā)出由相對較小分子量的物質(zhì)構(gòu)成的膠束作為藥物載體會有更好的應(yīng)用前景。聚酰胺-胺型樹枝狀大分子(polyamidoamine, PAMAM)是研究較為廣泛和成熟的一種樹枝狀大分子。3代以下的PAMAM分子量較小，容易被人體代謝，且細(xì)胞毒性很小，這些優(yōu)點(diǎn)為其作為藥物載體提供了得天獨(dú)厚的條件。研究表明，低代聚酰胺-胺型樹枝狀大分子經(jīng)修飾后可以形成膠束作為藥物載體，提高藥物的作用效果。但此膠束的靶向能力不強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決由低代樹枝狀大分子不能制備具有pH響應(yīng)性的智能納米藥物載體的問題，提供一種智能納米藥物傳遞系統(tǒng)的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的具有pH響應(yīng)性的智能納米藥物傳遞系統(tǒng)，包括納米藥物載體和包 封于載體中的藥物；所述的納米藥物載體是由如下(a)和(b)兩部分組成的(a)樹枝狀大分子，所述的樹枝狀大分子是聚酰胺_胺型樹枝狀大分子，或膽酸修飾的樹枝狀大分子，所述的膽酸修飾的樹枝狀大分子是含膽酸端基的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子；(b)連接在(a)中所述樹枝狀大分子上的分子配基，所述的分子配基是檸康酸或3，4，5，6-四氫苯酸。所述的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子是1-3代的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子和含膽酸端基的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子。分子配基與樹枝狀大分子的摩爾比是I : 1-8 I。本發(fā)明同時提供了一種具有pH響應(yīng)性的智能納米藥物傳遞系統(tǒng)的制備方法，該方法經(jīng)過以下步驟第I步、智能納米藥物載體的制備第I. I步、酸酐修飾聚酰胺-胺型樹枝狀大分子藥物載體的制備將聚酰胺-胺型樹枝狀大分子與檸康酸酐置于pH為8-10的磷酸緩沖液或碳酸鈉緩沖液中，在室溫下反應(yīng)O. 5-4小時，純化后得到檸康酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子;或者，將聚酰胺-胺型樹枝狀大分子與3，4，5，6-四氫苯酐置于pH為8_10的磷酸緩沖液或碳酸鈉緩沖液中，在室溫下O. 5-4小時，純化后得到3，4，5，6_四氫苯酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子；第I. 2步、酸酐修飾含膽酸端基的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子載體的制備將含膽酸端基的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子和檸康酸酐置于pH為8-10的磷酸緩沖液或碳酸鈉緩沖液中，在室溫下O. 5-4小時，純化后得到檸康酸膽酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子；或者，含膽酸端基的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子和3，4，5，6-四氫苯酐置于pH為8-10的磷酸緩沖液或碳酸鈉緩沖液中，在室溫下O. 5-4小時，純化后得到3，4，5，6-四氫苯酸膽酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子；其中，檸康酸酐或3，4，5，6-四氫苯酐與聚酰胺-胺型樹枝狀大分子或含膽酸端基的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的摩爾比是I :1-8:1;
第2步、智能納米藥物傳遞系統(tǒng)的制備將所選擇的藥物加入到第I. I步或第I. 2步制備的智能納米藥物載體溶液中，經(jīng)過室溫震蕩，制得將藥物包封于載體中的智能納米藥物傳遞系統(tǒng)。所述的藥物是抗腫瘤藥物或誘導(dǎo)分化藥物；具體包括氨甲蝶呤、喜樹堿、阿霉素或全反式維甲酸。所述的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子或含膽酸端基的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子，是指1-3代產(chǎn)物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明采用低代聚酰胺-胺型樹枝狀大分子，通過對其進(jìn)行簡單的表面修飾，可得到粒徑100-500nm左右的納米藥物載體。此納米藥物載體對環(huán)境pH具有較強(qiáng)的敏感性·和較低的細(xì)胞毒性。在酸性條件下，能夠提高負(fù)載藥物的細(xì)胞攝入量，從而提高誘導(dǎo)分化藥物對腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力，或提高抗腫瘤藥物對腫瘤細(xì)胞的毒性。該基于低代PAMAM的智能納米藥物傳遞系統(tǒng)是一種具有腫瘤靶向性的，可根據(jù)環(huán)境PH值變化進(jìn)行調(diào)控的智能納米藥物傳遞系統(tǒng)，在藥物的靶向運(yùn)輸方面具有應(yīng)用價值。該智能納米藥物傳遞系統(tǒng)制備簡單，成本低廉，易于推廣使用。


圖I為pH = 7. 4條件下智能納米藥物載體的透射電鏡圖。圖2為pH = 5. 0,6. O和7. O條件下智能納米藥物載體的水解動力學(xué)曲線。圖3為智能納米藥物載體的細(xì)胞毒性。圖4為智能納米藥物傳遞系統(tǒng)在裸鼠體內(nèi)腫瘤及各器官的分布情況。圖5為誘導(dǎo)分化藥物及智能納米藥物傳遞系統(tǒng)對HepG2細(xì)胞的抑制作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，可通過下述實(shí)施例予以證明，但它們不是對本發(fā)明作任何限制。實(shí)施例I.智能納米藥物載體的制備將O. 045mmoll代膽酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子和O. 045mmol朽1康酸酐溶于碳酸鈉緩沖溶液中，室溫反應(yīng)4小時。透析除去雜質(zhì)。冷凍干燥得檸康酸膽酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子。實(shí)施例2.智能納米藥物載體的制備將O. 045mmoll代膽酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子和O. 180mmol朽1康酸酐溶于碳酸鈉緩沖溶液中，室溫反應(yīng)4小時。透析除去雜質(zhì)。冷凍干燥得檸康酸膽酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子。實(shí)施例3.智能納米藥物載體的制備將O. 045mmoll代膽酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子和O. 180mmol3,4, 5,6-四氫苯酐溶于碳酸鈉緩沖溶液中，室溫反應(yīng)4小時。透析除去雜質(zhì)。冷凍干燥得膽酸3，
4,5,6-四氫苯修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子。實(shí)施例4.智能納米藥物載體的制備
將O. 07mmoll代聚酰胺-胺型樹枝狀大分子和O. 14mmol3,4, 5,6-四氫苯酐溶于PBS緩沖溶液中，室溫反應(yīng)O. 5小時。透析除去雜質(zhì)。冷凍干燥得3，4，5，6-四氫苯酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子。實(shí)施例5.智能納米藥物載體的制備將O. 07mmoll代聚酰胺-胺型樹枝狀大分子和和O. 28mmol檸康酸酐溶于碳酸鈉緩沖溶液中，室溫反應(yīng)2小時。透析除去雜質(zhì)。冷凍干燥得檸康酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子。實(shí)施例6.智能納米藥物載體的制備將O. 07mmoll代聚酰胺-胺型樹枝狀大分子和和O. 28mmol3,4, 5,6-四氫苯酐溶于碳酸鈉緩沖溶液中，室溫反應(yīng)2小時。透析除去雜質(zhì)。冷凍干燥得3，4，5，6-四氫苯酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子。實(shí)施例7.智能納米藥物載體的制備將O. 07mmoll代聚酰胺-胺型樹枝狀大分子和和I. 2mmol3,4, 5,6-四氫苯酐溶于碳酸鈉緩沖溶液中，室溫反應(yīng)4小時。透析除去雜質(zhì)。冷凍干燥得3，4，5，6-四氫苯酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子。實(shí)施例8.同實(shí)施例I合成檸康酸膽酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子。以緩沖液(pH =
7.4)為介質(zhì)配制濃度為O. lmg/ml的溶液，室溫振蕩，得到聚合物膠束。膠束的粒徑在IOOnm左右。結(jié)果見附圖I。實(shí)施例9.同實(shí)施例6合成3，4，5，6-四氫苯酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子。將3，4，
5,6-四氫苯酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子和全反式維甲酸以DMEM培養(yǎng)基為介質(zhì)配制3,4,5,6-四氫苯酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子濃度為O. 065mmol/L、全反式維甲酸濃度為lOymol/L的溶液，室溫振蕩，得到智能納米藥物傳遞系統(tǒng)。實(shí)施例10.同實(shí)施例7合成3，4，5，6-四氫苯酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子。以緩沖液(pH = 5. 0,6. 0,7. 4)為介質(zhì)配制濃度為O. lmg/ml的溶液。將溶液置于37°C恒溫水浴搖床振蕩。每隔一段時間測定膠束中游離氨基的含量，計(jì)算水解百分率。結(jié)果見圖2。實(shí)施例11.同實(shí)施例6合成3，4，5，6_四氫苯酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子。將其溶解于DMEM培養(yǎng)基，配置成不同濃度的3，4，5，6_四氫苯酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子溶液。過濾除菌。25mg噻唑蘭(MTT)溶于5ml PBS中，過濾除菌，制成MTT溶液。將H印G2細(xì)胞種到96孔板中，每孔100 μ 1，約IO4個細(xì)胞，培養(yǎng)24h，然后加入上面所配置的不同濃度的3，4，5，6-四氫苯酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子溶液100 μ I，每組5個孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。吸去培養(yǎng)基后，細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗I遍，向每孔加入等量新鮮培養(yǎng)基及10 μ IMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，最后吸出孔中的液體，用PBS洗I次，加入150 μ I的DMS0，避光震蕩IOmin0酶標(biāo)儀檢測，測得聚合物膠束的體外毒性在100μ g/ml及其以下時沒有毒性，結(jié)果見附圖3。
實(shí)施例12.同實(shí)施例2合成檸康酸膽酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子。將檸康酸膽酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子和過量的尼羅紅染料溶于DMEM培養(yǎng)基中，攪拌24h后過濾，得到包含尼羅紅的檸康酸膽酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子溶液。雄性BALB/C裸鼠背部皮下注射5父106個!1印62細(xì)胞。10天后，通過裸鼠尾靜脈注射負(fù)載上述溶液。4h后處死，解剖分離腫瘤，肝臟，肺，腎，脾，心臟。將各器官在活體成像系統(tǒng)下觀察尼羅紅的熒光分布，分析智能納米藥物傳遞系統(tǒng)的體內(nèi)分布。結(jié)果見附圖4。實(shí)施例13.同實(shí)施例4合成3，4，5，6-四氫苯酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子。將其與 全反式維加酸溶解于DMEM培養(yǎng)基，配置成含不同濃度全反式維甲酸的3，4，5，6_四氫苯酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子溶液。過濾除菌。25mg噻唑蘭(MTT)溶于5ml PBS中，過濾除菌，制成MTT溶液。將IO4個H印G2細(xì)胞種到96孔板中，培養(yǎng)24h，然后加入上述溶液，每組5個孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。吸去培養(yǎng)基后，細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗I遍，向每孔加入等量新鮮培養(yǎng)基及10 μ I MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，最后吸出孔中的液體，用PBS洗I次，加入150 μ I的DMS0，避光震蕩lOmin。酶標(biāo)儀檢測，得到智能納米藥物傳遞系統(tǒng)對誘導(dǎo)分化藥物作用的影響。結(jié)果見附圖5。
權(quán)利要求
1.一種具有PH響應(yīng)性的智能納米藥物傳遞系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)包括納米藥物載體和包封于載體中的藥物；所述的納米藥物載體是由如下(a)和(b)兩部分組成的(a)樹枝狀大分子，所述的樹枝狀大分子是聚酰胺-胺型樹枝狀大分子，或膽酸修飾的樹枝狀大分子，所述的膽酸修飾的樹枝狀大分子是含膽酸端基的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子；(b)連接在(a)中所述樹枝狀大分子上的分子配基，所述的分子配基是檸康酸或3，4，5，6-四氫苯酸。
2.一種具有pH響應(yīng)性的智能納米藥物傳遞系統(tǒng)的制備方法，其特征在于包括如下步驟 第I步、智能納米藥物載體的制備 第1.1步、酸酐修飾聚酰胺-胺型樹枝狀大分子藥物載體的制備將聚酰胺-胺型樹枝狀大分子與檸康酸酐置于PH為8-10的磷酸緩沖液或碳酸鈉緩沖液中，在室溫下反應(yīng)O. 5-4小時，純化后得到檸康酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子；或者，將聚酰胺-胺型樹枝狀大分子與3，4，5，6-四氫苯酐置于pH為8-10的磷酸緩沖液或碳酸鈉緩沖液中，在室溫下反應(yīng)O. 5-4小時，純化后得到3，4，5，6-四氫苯酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子； 第I. 2步、酸酐修飾含膽酸端基的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子載體的制備將含膽酸端基的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子和檸康酸酐置于PH為8-10的磷酸緩沖液或碳酸鈉緩沖液中，在室溫下反應(yīng)O. 5-4小時，純化后得到檸康酸膽酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子； 或者，將含膽酸端基的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子和3，4，5，6-四氫苯酐置于pH為8-10的磷酸緩沖液或碳酸鈉緩沖液中，在室溫下反應(yīng)O. 5-4小時，純化后得到3，4，5，6-四氫苯酸膽酸修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子； 其中，檸康酸酐或3，4，5，6-四氫苯酐與聚酰胺-胺型樹枝狀大分子或含膽酸端基的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的摩爾比是I :1-8:1; 第2步、智能納米藥物傳遞系統(tǒng)的制備 將所選擇的藥物加入到第I. I步或第I. 2步制備的智能納米藥物載體溶液中，制得將藥物包封于載體中的智能納米藥物傳遞系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的藥物是抗腫瘤藥物或誘導(dǎo)分化藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的抗腫瘤藥物或誘導(dǎo)分化藥物是指氨甲蝶呤、喜樹堿、阿霉素或全反式維甲酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子或含膽酸端基的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子，是指1-3代產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述的智能納米藥物傳遞系統(tǒng)是經(jīng)過室溫震蕩制成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有pH響應(yīng)性的智能納米藥物傳遞系統(tǒng)和制備方法及其應(yīng)用。所述的傳遞系統(tǒng)包括納米藥物載體和包封于載體中的藥物；載體是由樹枝狀大分子和連接在其上的分子配基兩部分組成；樹枝狀大分子是聚酰胺－胺型樹枝狀大分子，或含膽酸端基的聚酰胺－胺型樹枝狀大分子；所述的分子配基是檸康酸或3,4,5,6-四氫苯酸。所述的藥物是抗腫瘤藥物或誘導(dǎo)分化藥物。該藥物傳遞系統(tǒng)通過對低代聚酰胺－胺型樹枝狀大分子進(jìn)行修飾制備而成，制備過程簡單。實(shí)驗(yàn)證明該系統(tǒng)對抗癌藥物及腫瘤分化藥物具有很好的細(xì)胞投遞作用?？捎行岣呖拱┧幬锏寞熜А⑻岣呖狗只幬飳Π┘?xì)胞的誘導(dǎo)分化能力，在生物體內(nèi)的毒副作用小?？捎糜诎┌Y的治療。
文檔編號A61K31/519GK102973513SQ20121058479
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者于奡, 王永健, 張堃, 王大偉, 齊林雙 申請人:南開大學(xué)