專利名稱：一種具有緩釋性能的骨修復(fù)材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，涉及骨組織修復(fù)材料的研究，特別涉及ー種具有緩釋性能的骨修復(fù)材料的制備方法。
背景技術(shù)：
骨組織和器官損傷極大地危害了人類的健康，影響人們的日常工作和生活，毎年全球約有幾千萬(wàn)例患者，耗資數(shù)十億美元。對(duì)骨組織和器官損傷治療主要是通過(guò)異體器官移植、自體組織手術(shù)重建或人工假體進(jìn)行替代。然而，這些方法均存在器官或組織來(lái)源有限、對(duì)自體產(chǎn)生較長(zhǎng)時(shí)間的排斥反應(yīng)及手術(shù)成本高等缺點(diǎn)。組織工程方法的應(yīng)用為骨組織缺損或器官功能喪失的治療帶來(lái)新的策略。目前，最常見(jiàn)的是把分離出來(lái)的活細(xì)胞接種到 人工合成的三維支架上進(jìn)行培養(yǎng)，形成成熟的生物組織修復(fù)損傷骨組織和器官，其中，尋找具有較好的組織相容性、生物可降解性及成骨誘導(dǎo)性等生物活性支架材料成為研究的焦點(diǎn)。近年來(lái)，制備具有較高成骨誘導(dǎo)性的生物活性骨組織工程支架成為研究主要方向。為了提高材料生物活性，探究和制備出具有較好生物活性的多孔支架是研究熱點(diǎn)之一。通過(guò)化學(xué)和生物學(xué)手段將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽(RDG)偶聯(lián)到支架表面，均提高了細(xì)胞在多孔支架上粘附、擴(kuò)散、増殖及分化的能力，體現(xiàn)了較好的成骨誘導(dǎo)性(Wohlrab
S,Miiller S, Schmidt A, et al. Cell adhesion and proliferation on RGD-modifiedrecombinant spider silk proteins. Biomaterials 2012,33 (28) :6650_6659)。2012 年我國(guó)專利CN 102580160A研究了化學(xué)鍵接生物活性物質(zhì)的組織工程支架材料的制備方法，將生物活性物質(zhì)交聯(lián)到合成及天然高分子物質(zhì)上，通過(guò)靜電紡絲法制備多孔支架，具備良好的生物學(xué)性能和力學(xué)強(qiáng)度，能夠誘導(dǎo)骨、軟骨及皮膚等組織再生。在支架中人為添加具有較高生物活性的誘導(dǎo)因子(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白，合成或天然藥物成分等)對(duì)組織進(jìn)行刺激，并控制生長(zhǎng)因子或活性蛋白的釋放，成為又ー研究方向。Zhang等研究了裝載骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)兩種活性物質(zhì)的介孔生物玻璃/絲素蛋白支架對(duì)骨損傷的修復(fù)，體內(nèi)4周后具有較好的成骨誘導(dǎo)性(Zhang Y, Cheng N, Miron R, et al. Delivery of PDGF-B andBMP-7bymesoporous bioglass/silk iibrin scafiolds for the repair of osteoporoticdefects. Biomaterials 2012,33(28) :6698_6708)。Ma 等制備出孔徑為 30 60nm 超大介孔材料，作為金納米粒子的催化載體應(yīng)用于催化工業(yè)(Ma G, Yan X, Li Y, et al. OrderedNanoporous Silica with Periodic BOnmPores as an Effective support forGold Nanoparticle Catalysts with Enhanced Lifetime J. Am. Chem. Soc. 2010,132(28)9596-9597)。本發(fā)明將具有較高的比表面積和孔體積的介孔材料應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域，為裝載大分子活性蛋白提供可能。為了提高骨組織工程材料對(duì)生物活性因子的裝載量并控制其釋放速率，本發(fā)明將不同孔徑的介孔ニ氧化硅(MSN)與納米羥基磷灰石(HA)混合制備多孔支架，増加藥物釋放路徑，延長(zhǎng)釋放時(shí)間，提高生物組織對(duì)活性因子的利用效率，在骨組織工程領(lǐng)域中將具有較好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明目的在于提供一種具有緩釋性能的大孔/介孔骨組織修復(fù)材料的制備方法。將具有良好的生物相容性和成骨誘導(dǎo)性的羥基磷灰石，與無(wú)毒且具有較高比表面積的介孔材料結(jié)合，提高骨組織修復(fù)材料對(duì)藥物裝載量的同時(shí)延長(zhǎng)藥物釋放路徑。制備出具有較好孔隙率，生物可降解，組織相容性及成骨誘導(dǎo)性均較好的骨組織修復(fù)材料。技術(shù)方案一種具有緩釋性能的骨修復(fù)材料的制備方法，制備步驟為( I)混合漿料的制備 將納米羥基磷灰石分別與不同孔徑的介孔二氧化硅混合分散于5 15wt%聚乙烯醇溶液中，其中介孔二氧化硅與羥基磷灰石質(zhì)量比例為(30 100) :100，機(jī)械攪拌5 120min，超聲分散5 30min，獲得混合漿料的質(zhì)量百分比濃度為10 50%;所述介孔二氧化娃的孔徑分為三種小于IOnm, 10 20nm,大于20nm ;所述聚乙烯醇分子量為50000 100000 ；(2)大孔/介孔支架的制備將聚氨酯海綿浸泡于步驟(I)的混合漿料中，所述聚氨酯海綿的規(guī)格為15 50PPI，擠壓除去氣泡，使?jié){料進(jìn)入聚氨酯海綿中，去除多余漿料室溫晾干后，重復(fù)填充2 5次，于60 100°C干燥5 24h除去多余水分，采用程序升溫方式將填充漿料的聚氨酯海綿置于管式爐中煅燒，升溫程序?yàn)?5 100°C，Ih ;100 600°C，500min ;600°C維持30min ；600 1000°C，2h ;1000°C維持2h ;獲得具有緩釋性能的骨修復(fù)材料。所述人工合成高分子溶液優(yōu)選分子量75000的聚乙烯醇。所述步驟(2)中聚氨酯海綿的規(guī)格為20 30PPI。PPI為每英寸聚氨酯海綿所含有的孔數(shù)目。所述步驟(2)中聚氨酯海綿需經(jīng)如下預(yù)處理將3_7mm3的聚氨酯海綿于O. I 5mol/LNa0H中浸泡I 24h,洗漆干燥；再將洗漆干燥后的聚氨酯海綿浸入O. 01 1% wt的吐溫-80中I 48h，洗滌3次干燥備用。所述步驟(2)中多孔支架的填充方法為先填充羥基磷灰石漿料，后填充介孔二氧化硅與羥基磷灰石的混合漿料。有益效果本發(fā)明制備出對(duì)藥物具有較大的裝載量和較好的緩釋能力多孔支架，其中，包含超大孔徑介孔二氧化硅(20 30nm)作為生物活性因子(蛋白類、生長(zhǎng)因子及合成類大分子活性成分等)的載體，含有較小孔徑的介孔(5 15nm)可以作為合成類或天然活性藥物的載體，提高骨修復(fù)材料的成骨誘導(dǎo)性。同時(shí)，支架中的大孔還可以作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸通道和細(xì)胞擴(kuò)散、增殖及粘附的場(chǎng)所。本發(fā)明制備骨修復(fù)材料工藝簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，原料易得，價(jià)格低廉，利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。


圖I為實(shí)施例I以十六烷基三甲基溴化銨為表面活性劑制備介孔，獲得介孔二氧化娃孔徑約5 IOnm ；圖2為實(shí)施例2以P123為表面活性劑制備介孔，獲得介孔二氧化硅孔徑約10 15nm，右圖為左圖的局部放大；圖3為實(shí)施例3以F127為表面活性劑制備介孔，獲得介孔二氧化硅孔徑約15 30nm，右圖為左圖的局部放大；
圖4為棒狀羥基磷灰石TEM圖，羥基磷灰石為棒狀，直徑為20 30nm，長(zhǎng)度為30 200nm ；圖5為實(shí)施例4多孔支架的照片；圖6為實(shí)施例7HA/MSN多孔支架偶聯(lián)磺酸化絲素蛋白原理圖；圖7為實(shí)施例4骨修復(fù)材料FITC釋放曲線；圖8為實(shí)施例6骨修復(fù)材料FITC釋放曲線；圖9為實(shí)施例8骨修復(fù)材料FITC釋放曲線；圖10為實(shí)施例9骨修復(fù)材料吸附親和純化抗體熒光標(biāo)記羊抗小鼠IgG釋放曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖進(jìn)一步闡述發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例所使用的試劑純度均為分析純及以上純度指標(biāo)。以下具體實(shí)施方式
不以任何形式限制本發(fā)明的技術(shù)方案，凡是采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I以十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)為表面活性劑制備介孔二氧化硅I. 5g CTAB溶解在67mL去離子水中，5mL 98% wt濃硫酸加入混合液中攪拌lh，3. 35mL正硅酸乙酯(TEOS)逐滴加入攪拌24h后，加入12. 5mL 25% wt氨水加入，攪拌Imin后，80°C老化 24h，最終反應(yīng)物 CTAB/H2S04/H20/TE0S/NH3 ·Η20 的摩爾比為 1/18. 7/741/3/47，反應(yīng)結(jié)束后用大量水洗滌過(guò)濾,室溫下干燥后，550°C煅燒,獲得5 IOnm介孔二氧化硅(MSN)，稱為 MSN1，如圖 I。實(shí)施例2以P123為表面活性劑制備介孔二氧化硅35°C條件下，4g P123溶解在150mL I. 6mol/L HCl溶液中，快速攪拌4h，滴加2g1,3, 5—三甲基苯(TMB)，繼續(xù)攪拌6h，恒壓滴入8. 54g正硅酸乙酯，繼續(xù)攪拌24h后，100°C回流晶化ld，抽濾干燥得白色粉末，用無(wú)水乙醇和鹽酸混合液索式提取回流10次，室溫干燥后，550°C煅燒，獲得10 20nm介孔二氧化硅MSN2,如圖2。實(shí)施例3以F127為表面活性劑制備介孔二氧化硅15°C條件下，Ig F127，1.2g TMB，2. 5g氯化鉀溶解在IOOmL lmol/L鹽酸中，攪拌lh, 4. 16g TEOS逐滴滴入并持續(xù)攪拌24h，合成過(guò)程中F127/KC1/TE0S/TMB/HC1/H20的摩爾比為O. 00147/0. 62/0. 37/0. 185/1. 85/100，反應(yīng)混合物100。。陳化24h，洗滌抽濾，室溫干燥，550°C煅燒，獲得大于20nm的介孔二氧化硅MSN3,如圖3。實(shí)施例4以HA與MSN1制備混合漿料制備骨修復(fù)材料將棒狀羥基磷灰石添加到5% wt分子量75000的聚乙烯醇溶液中，充分?jǐn)嚢?min,超聲30min分散混勻，抽真空除去衆(zhòng)料中的氣泡，獲得50% wt輕基磷灰石衆(zhòng)料,將預(yù)處理的聚氨酯海綿浸潰到漿料中，反復(fù)擠壓，使?jié){料完全浸入到海綿空隙中，超聲除去氣泡，浸潰完全后擠去多余漿料，室溫干燥24h。將干燥好的支架，以相同方法填充50% WtHA和MSN1的混合漿料(HA WSN1質(zhì)量比為10 3)，共填充兩次，室溫緩慢干燥48h后，60°C干燥24h，充分除去水分，程序升溫除去模板和聚氨酯海綿，獲得孔隙率為83%的骨修復(fù)材料。實(shí)施例5以HA與MSN1制備混合漿料制備骨修復(fù)材料將棒狀羥基磷灰石添加到8% wt分子量100000的聚乙烯醇溶液中，充分?jǐn)嚢?0min,超聲30min分散混勻，抽真空除去衆(zhòng)料中的氣泡,獲得30% wt輕基磷灰石衆(zhòng)料,將預(yù)處理的聚氨酯海綿浸潰到漿料中，反復(fù)擠壓，使?jié){料完全浸入到海綿空隙中，超聲除去氣泡，浸潰完全后擠去多余漿料，室溫干燥24h。將干燥好的支架，以相同方法填充30% wt HA和MSN1的混合漿料(HA =MSN1質(zhì)量比為I : I )，共填充兩次，室溫緩慢干燥48h后，60°C干燥24h，充分除去水分，程序升溫除去模板和聚氨酯海綿，獲得孔隙率為85%的骨修復(fù)材料。實(shí)施例6以HA與MSN2制備混合漿料制備骨修復(fù)材料 將棒狀羥基磷灰石添加到8% wt分子量75000的聚乙烯醇溶液中，充分?jǐn)嚢?0min,超聲5min分散混勻,抽真空除去衆(zhòng)料中的氣泡,獲得30% wt輕基磷灰石衆(zhòng)料,將預(yù)處理好的聚氨酯海綿浸潰到漿料中，反復(fù)擠壓，使?jié){料完全浸入到海綿空隙中，超聲除去氣泡，浸潰完全后擠去多余漿料，室溫干燥24h。將干燥好的支架，以相同方法填充30% WtHA和MSN2的混合漿料(HA =MSN2質(zhì)量比為I : I )，共填充三次，室溫緩慢干燥24h后，100°C干燥5h，充分除去水分，程序升溫除去模板和聚氨酯海綿，獲得孔隙率為79%的骨修復(fù)材料。實(shí)施例7以HA與MSN2制備混合漿料制備骨修復(fù)材料將棒狀羥基磷灰石添加到10% wt分子量50000的聚乙烯醇溶液中，充分?jǐn)嚢鑜h，超聲20min分散混勻，抽真空除去衆(zhòng)料中的氣泡,獲得30% wt輕基磷灰石衆(zhòng)料,將預(yù)處理好的聚氨酯海綿浸潰到漿料中，反復(fù)擠壓，使?jié){料完全浸入到海綿空隙中，超聲除去氣泡，浸潰完全后擠去多余漿料，室溫干燥24h。將干燥好的支架，以相同方法填充30% wt HA和MSN2的混合漿料(HA =MSN2質(zhì)量比為2 I)，共填充兩次，室溫緩慢干燥24h后，100°C干燥5h，充分除去水分，程序升溫除去模板和聚氨酯海綿，獲得孔隙率為87%的骨修復(fù)材料。實(shí)施例8以HA與MSN3制備混合漿料制備骨修復(fù)材料將棒狀羥基磷灰石(如圖4)添加到15% wt分子量75000的聚乙烯醇溶液中，充分?jǐn)嚢?0min,超聲30min分散混勻,抽真空除去衆(zhòng)料中的氣泡,獲得20% wt輕基磷灰石衆(zhòng)料，將預(yù)處理好的聚氨酯海綿浸潰到漿料中，反復(fù)擠壓，使?jié){料完全浸入到海綿空隙中，超聲除去氣泡，浸潰完全后擠去多余漿料，室溫干燥24h。將干燥好的支架，以相同方法填充20% WtHA和MSNJ^混合漿料(HA :1^乂質(zhì)量比為I : I )，共填充兩次，室溫緩慢干燥24h后，80°C干燥12h，充分除去水分，程序升溫除去模板和聚氨酯海綿，獲得孔隙率為80%的骨修復(fù)材料，如圖5。實(shí)施例9以HA與MSN3制備混合漿料制備骨修復(fù)材料將棒狀羥基磷灰石添加到10% wt分子量75000的聚乙烯醇溶液中，充分?jǐn)嚢?h，超聲30min分散混勻，抽真空除去衆(zhòng)料中的氣泡,獲得10% wt輕基磷灰石衆(zhòng)料,將預(yù)處理好的聚氨酯海綿浸潰到漿料中，反復(fù)擠壓，使?jié){料完全浸入到海綿空隙中，超聲除去氣泡，浸潰完全后擠去多余漿料，室溫干燥24h。將干燥好的支架，以相同方法填充10% wt HA和MSN3的混合漿料(HA =MSN3質(zhì)量比為I : 1)，共填充兩次，室溫緩慢干燥24h后，80°C干燥12h，充分除去水分，程序升溫除去模板和聚氨酯海綿，獲得孔隙率為83%的骨修復(fù)材料。實(shí)施例10大孔/介孔支架偶聯(lián)磺酸化絲素蛋白IOmLAPTES溶解在90mL95% (v/v)乙醇水溶液中，磁力攪拌O. 5h充分溶解獲得氨基化試劑。將Ig實(shí)施例4、6、8骨修復(fù)材料添加到APTES乙醇溶液中，室溫緩慢震搖24h后，取出骨修復(fù)材料，并用乙醇洗滌兩次，蒸餾水洗滌一次，除去未反應(yīng)的APTES，干燥，獲得氨基化的樣品。將50mg磺酸化絲素蛋白溶于IOmL馬琳乙磺酸緩沖溶液(O. 2mol/L, pH 6. O)中，將干燥骨修復(fù)材料放入磺酸化絲素蛋白溶液中，添加一定量的EDC · HCl和NHS，使溶液終濃度分別為5mmol/L和10mmol/L,抽真空，除去支架中多余氣泡,于搖床緩慢震搖,共價(jià)偶聯(lián)12h，取出支架并洗去未吸附的磺酸化絲素 蛋白，室溫緩慢干燥，修飾原理如圖6。實(shí)施例11偶聯(lián)磺酸化絲素蛋白骨修復(fù)材料對(duì)FITC的吸附及釋放將實(shí)施例10偶聯(lián)磺酸化絲素蛋白的骨修復(fù)材料約lOOmg，浸入2mL O. 2mmol/L的FITC水溶液中，抽真空除去支架中的氣泡，脫色搖床中搖動(dòng)，避光吸附24h，除去吸附后液體，室溫真空干燥。于37°C，0. lmol/L, pH 7. 4的PBS中釋放，分別在特定時(shí)間點(diǎn)取樣，利用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)釋放熒光強(qiáng)度，考查骨修復(fù)材料的釋放性能，結(jié)果如圖7、8、9。獲得的大孔/介孔骨修復(fù)材料對(duì)FITC具有一定的緩釋能力。實(shí)施例12包含大于20nm骨修復(fù)材料對(duì)小鼠熒光抗體的吸附及釋放將獲得的骨修復(fù)材料lOOmg，浸入2mL I. 28mg/mL親和純化抗體熒光標(biāo)記羊抗小鼠IgG的PBS (0. lmol/L,pH 7. 4)溶液中，抽真空除去骨修復(fù)材料中的氣泡，脫色搖床中搖動(dòng)，避光吸附24h后，除去多余液體，室溫真空干燥。與37°C，0. lmol/L，pH 7. 4的PBS中釋放，分別在特定時(shí)間點(diǎn)取樣，利用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度，考查釋放性能，釋放曲線結(jié)果如圖10。獲得的含有大孔/超大介孔的骨修復(fù)材料對(duì)親和純化抗體熒光標(biāo)記羊抗小鼠IgG具有一定的緩釋能力。
權(quán)利要求
1.一種具有緩釋性能的骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于制備步驟為 (1)混合漿料的制備 將納米羥基磷灰石分別與不同孔徑的介孔二氧化硅混合分散于5 15wt%聚乙烯醇溶液中，其中介孔二氧化硅與羥基磷灰石質(zhì)量比例為(30 100) :100，機(jī)械攪拌5 120min，超聲分散5 30min，獲得混合漿料的質(zhì)量百分比濃度為10 50%;所述介孔二氧化娃的孔徑分為三種小于IOnm, 10 20nm,大于20nm ;所述聚乙烯醇分子量為50000 100000 ； (2)大孔/介孔支架的制備 將聚氨酯海綿浸泡于步驟(I)的混合漿料中，所述聚氨酯海綿的規(guī)格為15 50PPI，擠壓除去氣泡，使?jié){料進(jìn)入聚氨酯海綿中，去除多余漿料室溫晾干后，重復(fù)填充2 5次，于60 100°C干燥5 24h除去多余水分，采用程序升溫方式將填充漿料的聚氨酯海綿置于 管式爐中煅燒，升溫程序?yàn)?5 100。。，Ih ;100 60(TC，500min ;600°C維持30min ;600 IOOO0C, 2h ;1000°C維持2h ;獲得具有緩釋性能的骨修復(fù)材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種具有緩釋性能的骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中聚氨酯海綿的規(guī)格為20 30PPI。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種具有緩釋性能的骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中聚氨酯海綿需經(jīng)如下預(yù)處理將3-7mm3的聚氨酯海綿于0. I 5mol/L NaOH中浸泡I 24h，洗滌干燥；再將洗滌干燥后的聚氨酯海綿浸入0. 01 1% wt的吐溫-80中I 48h，洗滌3次干燥備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種具有緩釋性能的骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中填充方法為先填充羥基磷灰石漿料，后填充介孔二氧化硅與羥基磷灰石的混合漿料。
全文摘要
一種具有緩釋性能的骨修復(fù)材料的制備方法，制備步驟為(1)混合漿料的制備將納米羥基磷灰石分別與不同孔徑的介孔二氧化硅混合分散于5～15wt％人工合成高分子溶液中，獲得混合漿料的質(zhì)量百分比濃度為10～50％；(2)大孔/介孔支架的制備將聚氨酯海綿浸泡于步驟(1)的混合漿料中，擠壓除去氣泡，使混合漿料進(jìn)入聚氨酯海綿中，去除多余漿料室溫晾干后，干燥除去多余水分，采用程序升溫方式將多孔支架置于管式爐中煅燒，獲得具有緩釋性能的骨修復(fù)材料。本發(fā)明制備骨修復(fù)材料工藝簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，原料易得，價(jià)格低廉，利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61L27/56GK102961780SQ20121054840
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者顏輝, 李紹群, 江明珠, 段艷波, 賈俊強(qiáng), 吳瓊英 申請(qǐng)人:江蘇科技大學(xué)