專利名稱：制備含氫氣微泡水溶液的方法,其產品及應用的制作方法
制備含氫氣微泡水溶液的方法，其產品及應用
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)療領域，具體涉及含氫氣微泡水溶液的制備，其產品及應用。
背景技術：
近年來，氫氣在生物醫(yī)療方面的應用越 來越引起人們的興趣。Dole等(Science，1975,4210:152-154)在《科學》雜志發(fā)表了連續(xù)呼吸8個大氣壓97.5%氫氣(2.5%氧)14天，高壓氫氣可有效治療動物皮膚惡性腫瘤的論文，一方面可降低氧氣的濃度，另一方面提高了氫氣在機體內的濃度。法國潛水醫(yī)學家Gharib 等(Life Sciences, 2001, 324 =719-724)也報道證明，呼吸8個大氣壓高壓氫氣可治療肝寄生蟲感染引起的炎癥反應，首次證明氫氣具有抗炎作用，并提出氫氣與羥自由基直接反應是治療炎癥損傷的基礎。日本醫(yī)科大學Ohsawa 教授(Nature Medicine, 2007,13:688-694)報道，呼吸 2%的氫氣就可有效清除自由基，顯著改善腦缺血再灌注損傷。他們采用化學反應、細胞學等手段證明，氫氣溶解在液體中可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子，而后兩者是氧化損傷的最重要介質。因此認為，氫氣治療腦缺血再灌注損傷的基礎是選擇性抗氧化作用，提出氫氣可選擇性中和毒性自由基，是一種選擇性抗氧化物質。該發(fā)現(xiàn)讓世界生物學界再次把眼光投向這個小小的氣體分子，迅速引起廣泛關注并引起了研究氫氣治療疾病的熱潮。隨后，該研究組又在肝和心肌缺血動物模型，證明呼吸2%的氫氣可治療肝和心肌缺血再灌注損傷(BBRC，2007，361:670-674)。美國匹斯堡大學移植中心發(fā)表了呼吸2%的氫氣可治療小腸移植引起的炎癥損傷的文章(Am JTransplant.2008，8 (10):2015-24)。第二軍醫(yī)大學孫學軍教授的實驗室發(fā)表了呼吸2%的氫氣可治療新生兒腦缺血缺氧損傷的文章(Neuroscience Letters,2008,441:167-172)。從疾病發(fā)生機制上考慮，氧化損傷幾乎是所有疾病的最基本病理生理過程，氫氣既然是選擇性抗氧化物質，就有可能對人類大部分疾病具有治療作用。大量動物試驗也證明，氫氣可通過減少氧化損傷、炎癥性損傷、細胞凋亡等病理過程，對40多種人類常見疾病具有顯著的治療效果。例如腦、心臟、其他各類重要器官如肝、腎和小腸缺血再灌注損傷；再如各類與衰老有關的神經退行性疾病老年性癡呆、巴金森病、糖尿病和肥胖等；還如各類炎癥性疾病，如關節(jié)炎、全身炎癥反應等等。雖然氫氣對許多疾病具有潛在的治療價值，但到目前為止，由于沒有大規(guī)模臨床證據(jù)，尚沒有任何一項研究可以明確肯定這種臨床治療價值。但關于氫氣治療疾病的臨床研究正逐漸增加，如在糖尿病、腎衰、中風、皮膚病、肝癌后放射治療造成的損傷等方面都有氫氣治療有效的文獻報道。目前用于治療的氫氣應用方式主要有呼入氫氣、口服含氫氣水和注射飽和氫氣生理鹽水三種類型。然而，這三種方式在實際應用中各自都存在一些問題。
直接呼入氫氣:由于氫氣的易燃易爆的特性，呼入高壓高氫氣存在巨大的安全隱患，雖然將氫氣體積濃度降低到4%可以避免爆炸，但大量氫氧混合物的制備、存儲、運輸都有巨大的風險，并且為了安全起見，需要一系列復雜的設備及嚴格的操作來保證呼吸氫氣的安全性?？诜缓瑲錃馑?雖然每天口服富含氫氣水似乎更具有可行性，但由于氫氣在水中的溶解度極低，加上氫氣容易滲透和擴散， 富含氫氣水的制備和存儲都有一定的難度。另夕卜，通過口服的方式遞送氫氣具有很大的不確定性，供給氫氣的濃度和位置都不可控，更適合持續(xù)的飲用來起保健作用，不適應于臨床疾病應用。注射飽和氫氣生理鹽水:采用注射的方式供給氫氣，比口服在劑量控制，給藥時間和反復給藥上更有優(yōu)勢，更容易控制濃度和位置，更具有臨床前景。但由于氫氣在水中低溶解和易擴散等性質，需要注射的量相對較大，每千克需要注射5-10ml的量，而且氫氣濃度不穩(wěn)定，存儲時間短。由于氫氣的高度可燃性及在水中極低的溶解性，20°C的常壓條件下，I體積水中的只能溶解0.0182體積的氫氣，目前除了通過加壓的辦法來提高氫氣在水中的溶解度，尚沒有看到有更有效的報道。因此，有必要開發(fā)更有效的氫氣遞送介質和途徑，提高氫氣在水中的溶解度用于醫(yī)療應用。

發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中用于醫(yī)療用途的氫氣溶液中氫氣溶解度低、濃度不穩(wěn)定且難以控制、儲存時間短的問題。為此，本發(fā)明一方面提供一種用于制備含氫氣微泡水溶液的方法，包括步驟:SI形成磷脂薄膜:于容器中使用低沸點有機溶劑溶解磷脂，之后以惰性氣流除去低沸點有機溶劑，以在所述容器壁上形成磷脂薄膜，其中所述磷脂為20個C原子的硬脂酸鏈，12-24個C原子的脂肪酸對應的雙鏈磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油，它們的混合物或經抗體、多肽靶向修飾的衍生物；S2薄膜水化:添加pH為7-7.4的水性緩沖液到所述容器中，加熱并保持在所述磷脂薄膜的相轉變溫度以上，超聲分散所述磷脂薄膜到水性緩沖液中，至溶液透明，形成磷脂水混合溶液；S3氣體置換:將所述磷脂水混合溶液置于密封容器中，置換容器內空氣為氫氣混合氣體，其中氫氣的體積百分數(shù)為0-90% ;以及S4震蕩形成含氫氣微泡水溶液。所述磷脂可以為1，2_花生酰甘油基磷脂酰膽堿、聚乙二醇2000修飾的硬脂酸單酯、硬質酸聚乙二醇2000酯、1，2_ 二硬脂?；?sn-甘油基_3_磷脂酰膽堿-聚乙烯二醇2000-葉酸，或它們的混合物，并且尤其可以為1，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿與聚乙二醇酯的混合物，其中1，2_花生酰甘油基磷脂酰膽堿的摩爾比百分數(shù)為85-90%，并且其中聚乙二醇酯選自聚乙二醇2000修飾的硬脂酸單酯、硬質酸聚乙二醇2000酯，或它們與1，2- 二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿-聚乙烯二醇2000-葉酸的混合物。步驟SI還可以包括真空干燥所述磷脂薄膜的操作。所述水性緩沖液可以為磷酸緩沖溶液、甘油-丙二醇-Tris三羥基氨甲烷混合溶液、生理鹽水，或它們的混合物。所述磷脂水混合溶液中，磷脂的濃度可以為0.5_15mg/ml。所述氫氣混合氣體可以為氫氣與六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷、氮氣，或它們的混合物的混合氣體，并且尤其可以為氫氣與三氟丙烷的混合氣體，并且氫氣與三氟丙烷的體積比為1: 1-3。所述步驟S4可以通過機械震蕩、探頭式細胞破碎機超聲、聲振法、微流控芯片、凍干再水化法進行。本發(fā)明另一方面提供一種根據(jù)本發(fā)明的方 法制備得到的含氫氣微泡水溶液，其特征在于，所述含氫氣微泡水溶液中的氫氣含量大于50ul/ml。本發(fā)明再一方面提供該含氫氣微泡水溶液在制備抗炎癥、腫瘤、缺血再灌注損傷的藥物中的應用，其特征在于，所述抗炎癥、腫瘤、缺血再灌注損傷的藥物用于治療腫瘤、缺血再灌注損傷、腎炎、肝炎、動脈粥樣硬化，并且所述藥物同時具有超聲造影的功能。所述藥物可以通過靜脈注射，或靜脈輸注給藥。所述藥物中的含氫氣微泡可通過超聲探頭控制釋放。本發(fā)明具有以下優(yōu)點:通過用磷脂膜包裹氫氣形成微泡，大大提高了氫氣在水中的溶解度、溶液中氫氣的濃度可控，且更穩(wěn)定。由此得到的含氫氣微泡水溶液在應用中不僅可以降低使用劑量，還兼具超聲造影功能。

圖1為氫氣氟碳混合氣體微泡溶液(左)和純氫氣微泡溶液(右)。圖2為根據(jù)本發(fā)明用于制備含氫氣微泡水溶液的方法流程3為氫氣微泡的氫氣含量測量裝置不意圖。圖4為根據(jù)本發(fā)明制備得到的含氫氣微泡水溶液中氫氣微泡的粒徑分布及濃度。圖5為根據(jù)本發(fā)明制備得到的含氫氣微泡水溶液中氫氣微泡的形貌圖。圖6A和6B分別為使用本發(fā)明的含氫氣微泡水溶液處理大鼠心肌缺血前后的心電圖。圖7A-C為使用本發(fā)明的含氫氣微泡水溶液治療心肌缺血，使用氯化硝基四氮唑藍液(NBT)的染色對照圖。
具體實施方式本發(fā)明提出一種以氫氣作為藥物的新劑型，來改善目前氫氣藥物溶液中，氫氣溶解度低，濃度不易控制，且穩(wěn)定性差的問題。本發(fā)明人注意到，超聲造影技術中，通過使用磷脂包裹氣泡形成氣體微泡可以獲得具有較高氣體含量的微泡溶液。然而，由于氫氣分子體積小，具有極強的擴散性，單純的氫氣幾乎不能被制備造影劑微泡的磷脂包裹形成氣泡，更不能用于造影和治療。為此，本發(fā)明人通過兩種方案對這個問題進行了優(yōu)化:一方面使用氫氣混合氣體，即氫氣與六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷、氮氣等氣體的混合氣體。由于氟碳、氮氣等氣體具有較大的分子量和分子體積，不容易穿過磷脂膜，從而可以起到骨架支撐的作用，使氫氣能夠分布在氣泡內。
第二方面在于:要制作氫氣微泡，需要對常用作微泡造影劑的材料進行改進，通過改進磷脂材料的種類，以增加外殼的厚度及緊密性，來提高磷脂膜對氫氣的包裹能力。本申請中，發(fā)明人將磷脂改成疏水性鏈的長度為20個碳原子的磷脂，例如1，2_花生酰甘油基磷脂酰膽堿(20: 0，PC)，或是22個甚至24個碳鏈長度的磷脂，等等，來提高氫氣微泡的穩(wěn)定性。圖1為氫氣氟碳混合氣體微泡溶液(左圖)和純氫氣微泡溶液(右圖)。從圖中可見，單純的氫氣幾乎不能形成微泡，或者形成極少部分的泡沫(右圖)，而氟碳和氫氣的混合，可以得到具有豐富泡沫的溶液(左圖)?？傮w上，本發(fā)明制作含氫氣微泡水溶液的方 法包括四個步驟，參見圖2所示的流程圖。首先，是步驟SI形成磷脂薄膜:于容器中使用低沸點有機溶劑溶解磷脂，之后以惰性氣流除去低沸點有機溶劑，以在所述容器壁上形成磷脂薄膜。為了能夠更完全地去除溶劑，還可以將得到的磷脂薄膜在真空烘箱中干燥處理。例如在45°C干燥2小時，或更久。低沸點溶劑為能夠溶解磷脂的有機溶劑，其沸點通常低于65°C，從而能夠容易地使用惰性氣流(如氮氣流)除去。例如，低沸點溶劑可以是三氯甲烷、甲醇、乙醚或他們的混合溶劑等。磷脂如上文所示，可以是20個C原子的硬脂酸鏈，或是12-24個C原子的脂肪酸對應的雙鏈磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油，或是它們的混合物。此外，磷脂還可以進行修飾，例如使用抗體、多肽等對磷脂進行修飾，已得到具有靶向功能的磷脂衍生物。具體地，磷脂可以使用1，2_花生酰甘油基磷脂酰膽堿、聚乙二醇2000修飾的硬脂酸單酯、硬質酸聚乙二醇2000酯、1，2- 二硬脂?；?sn-甘油基_3_磷脂酰膽堿-聚乙烯二醇2000-葉酸，或它們的混合物，例如當磷脂為1，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿與聚乙二醇酯的混合物時，前者的摩爾比百分數(shù)可以為85-90%。聚乙二醇酯可以是聚乙二醇2000修飾的硬脂酸單酯、硬質酸聚乙二醇2000酯，或它們與1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿-聚乙烯二醇2000-葉酸的混合物。接下來是步驟S2薄膜水化:添加pH為7-7.4的水性緩沖液到所述容器中，加熱并保持在所述磷脂薄膜的相轉變溫度以上，超聲分散所述磷脂薄膜到水性緩中液中，至溶液透明，形成磷脂水混合溶液。使用中性或弱堿性緩沖液是為了與生理環(huán)境保持等滲透性。該緩沖液可以是磷酸緩沖溶液、甘油-丙二醇-Tris三羥基氨甲烷混合溶液、生理鹽水，或它們的混合物。緩沖液的量對最終得到的含氫氣微泡水溶液中氫氣微泡的包膜厚度有影響，通常情況下，磷脂水混合溶液中，磷脂的濃度可以為0.5-15mg/ml。隨后是步驟S3氣體置換:將所述磷脂水混合溶液置于密封容器中，置換容器內空氣為氫氣混合氣體，其中氫氣的體積百分數(shù)為0-90 %。密封容器可以是例如西林瓶這樣的容器。氫氣混合氣體如上文所示，可以為氫氣與六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷、氮氣，或它們的混合物的混合氣體。優(yōu)選的情況中，氫氣混合氣體為氫氣與三氟丙燒的混合氣體，并且氫氣與三氟丙燒的體積比為I: 1-3。
最后是步驟S4:震蕩形成含氫氣微泡水溶液。該步驟可以通過機械震蕩、探頭式細胞破碎機超聲、聲振法、微流控芯片、凍干再水化法，等方法進行。使用本發(fā)明的方法得到的含氫氣微泡水溶液中，氫氣含量通常大于50ul/ml。這遠遠大于現(xiàn)有技術中氫氣在水中的溶解度(約IOppm)。本發(fā)明得到的含氫氣微泡水溶液具有氫氣的 治療作用，可以用來制備抗炎藥物，例如用于治療腫瘤、缺血再灌注損傷、腎炎、肝炎、動脈粥樣硬化。另外，由于制成了含氫氣微泡水溶液的劑型，其還具有超聲造影的功能，可以同時用作超聲造影劑。其給藥方式包括靜脈注射，或靜脈輸注等等。當所用的磷脂為經靶向修飾的磷脂時，本發(fā)明的含氫氣微泡水溶液還具有靶向標記作用。這進一步擴大了氫氣在治療上的應用范圍，和治療效果。而且，由于微泡具有超聲敏感性，本發(fā)明制備的含氫氣微泡水溶液在用于治療時，可以通過使用超聲探頭控制氫氣的釋放。下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
實施例實施例1含氫氣微泡水溶液的制備SI按90: 10摩爾比將一定量的1，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿(20: 0，PC)，聚乙二醇2000修飾的1、2_ 二硬脂酰甘油基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)在三氯甲烷中用渦旋混合器混勻。用干燥的氮氣流除去三氯甲烷使溶解的材料在試管壁上形成一層均勻的薄膜，真空烘箱中45°C干燥2小時以上。S2根據(jù)上述磷脂的總質量，加入一定體積pH為7.4的緩沖溶液(含10% (體積比)甘油、10% (體積比)丙二醇和80% (體積比)0.1M的Tris三羥基氨甲烷)，將磷脂混合物薄膜水化，使得磷脂的最終濃度為3mg/ml。加熱到70°C以上，使其從試管壁上脫落。保持水溫在70°C以上用水浴式超聲震蕩器使磷脂水混合物徹底分散直至完全透明。S3以I毫升/瓶將磷脂水混合溶液裝入2毫升的西林瓶中，用橡膠塞和鋁塑蓋封口后，將西林瓶內部的空氣置換成氫氣和全氟丙烷體積比為1:1的混合氣體。S4用頻率為4500次/分鐘的機械震蕩器震蕩45秒到90秒，得到均勻豐富的微泡。氫氣含暈檢測使用如圖3所示的測量裝置，用注射器抽取上述微泡lml，注入IL總容量的上嘴抽濾瓶中，將出口用配套的有孔帶導氣管橡膠塞塞緊，導氣管的出口及抽濾瓶的上嘴口分別與氫氣檢測儀GT901的進氣和出氣口形成密閉循環(huán)。按下檢測儀開關進行檢測，待讀數(shù)穩(wěn)定后得到氣體體積分數(shù)為Nppm，經換算，Nppm相當于每升瓶中氣體含氫氣N ul，即Iml微泡即含有N ul的氫氣。針對該實施例，取Iml該微泡用氫氣檢測裝置分析，Iml氫氣微泡含有87.2ul氫氣。與Iml的飽和氫氣水中的氫氣含量IOppm相比，有了 8倍左右的提高。氫氣微泡的濃度及粒徑分布測試
用移液器取2.5微升上述微泡，注入到PSS780A顆粒計數(shù)分析儀的樣品腔中，測量得到氫氣微泡的粒徑分布及濃度，取一滴稀釋后夾在載玻片上，用顯微鏡觀察并拍照。圖4所示為該實施例制備得到的含氫氣微泡水溶液中氫氣微泡的粒徑分布及濃度。從圖中可見，99%以上的微泡小于8um，小于I微米的微泡占據(jù)了微泡數(shù)量的絕大部分，平均粒徑為1.03um,能夠安全的通過肺循環(huán)，微泡的濃度達到了每毫升1.33X IO10個。圖5為該實施例制備得到的含氫氣微泡水溶液 中氫氣微泡顯微鏡下的形貌圖。從圖中可見，微泡分布相對均勻，具有良好的分散性質，明場顯微鏡下呈現(xiàn)出暗色的磷脂外殼包圍著亮的氣體核心，為典型的微泡結構。心肌缺血再灌灃試齡腹腔麻醉后，全程心電圖監(jiān)測，如圖6所示，圖6A和6B分別為使用該實施例含氫氣微泡水溶液處理大鼠心肌缺血前后的心電圖。從圖中可見，缺血前后的心電圖ST段抬高，為心肌缺血的典型心電圖。后期通過依注射文思藍染色，確定缺血模型建立成功。對照組:進行左冠狀動脈結扎手術形成心肌缺血再灌注模型，再灌注前3分鐘通過靜脈注射0.5ml的生理鹽水。3分鐘后打開結扎部位，再灌注3小時后，注射伊文斯蘭染色，確定缺血區(qū)和非缺血區(qū)。然后通過氯化硝基四氮唑藍液(NBT)染色確定梗死區(qū)和非梗死區(qū)，通過重量法測量心肌平均梗死范圍為42.73%左右(圖7A)。氫氣治療組:左冠狀動脈結扎手術形成心肌缺血再灌注模型后，再灌注前3分鐘通過靜脈注射
0.1ml的上述氫氣微泡，3分鐘后打開結扎部位，再灌注3小時后，注射伊文斯蘭染色，確定缺血區(qū)和非缺血區(qū)，然后通過氯化硝基四氮唑藍液(NBT)染色確定梗死區(qū)和非梗死區(qū)，通過重量法測量心肌平均梗死范圍為27.43%左右(圖7B)。氫氣+超聲治療組:左冠狀動脈結扎手術形成心肌缺血再灌注模型后，再灌注前3分鐘通過靜脈注射
0.1ml的上述氫氣微泡，用頻率2.25M聚焦深度5cm的單振元超聲探頭，4.5 %占空比輻照心臟區(qū)域30秒，進行氫氣釋放，3分鐘后打開結扎部位，再灌注3小時后，注射伊文斯蘭染色，確定缺血區(qū)和非缺血區(qū)，然后通過氯化硝基四氮唑藍液(NBT)染色確定梗死區(qū)和非梗死區(qū)，通過重量法測量心肌平均梗死范圍為22.56%左右(圖7C)。實施例2
_5] 含氫氣微泡水溶液的制備SI按90: 10摩爾比將一定量的1，2_ 二二十二烷基脂肪酰甘油基磷脂酰膽堿(22: 0PC)，聚乙二醇2000修飾的1、2_ 二硬脂酰甘油基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)在三氯甲烷中用渦旋混合器混勻。用干燥的氮氣流除去三氯甲烷使溶解的材料在試管壁上形成一層均勻的薄膜，真空烘箱中45°C干燥2小時以上。S2根據(jù)上述磷脂的總質量，加入一定體積pH為7.4的緩沖溶液(含10% (體積比)甘油、10% (體積比)丙二醇和80% (體積比)0.1M的Tris三羥基氨甲烷)，將磷脂混合物薄膜水化，使得磷脂的最終濃度為3mg/ml。加熱到70°C以上，使其從試管壁上脫落。保持水溫在80°C以上用水浴式超聲震蕩器使磷脂水混合物徹底分散直至完全透明。
S3以I毫升/瓶將磷脂水混合溶液裝入2毫升的西林瓶中，用橡膠塞和鋁塑蓋封口后，將西林瓶內部的空氣置換成氫氣和全氟丙烷體積比為1: 3的混合氣體。S4用頻率為4500次/分鐘的機械震蕩器震蕩45秒到90秒，得到均勻豐富的微泡。氫氣含暈檢測取Iml該微泡用上述氫氣檢測裝置分析，測得 Iml氫氣微泡含有50.7ul氫氣。和Iml的飽和氫氣水中的氫氣含量IOppm相比，有了 5倍左右的提高。實施例3含氫氣微泡水溶液的制備SI按85: 15摩爾比將一定量的1，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿(20: 0，PC)，硬質酸聚乙二醇2000酯(PEG40S)在三氯甲烷中用渦旋混合器混勻。用干燥的氮氣流除去三氯甲烷使溶解的材料在試管壁上形成一層均勻的薄膜，真空烘箱中45°C干燥2小時以上。S2根據(jù)上述磷脂的總質量，加入一定體積pH為7.4的緩沖溶液(含10% (體積比)甘油、10% (體積比)丙二醇和80% (體積比)0.1M的Tris三羥基氨甲烷)，將磷脂混合物薄膜水化，使得磷脂的最終濃度為3mg/ml。加熱到70°C以上，使其從試管壁上脫落。保持水溫在70°C以上用水浴式超聲震蕩器使磷脂水混合物徹底分散直至完全透明。S3然后I毫升/瓶裝入2毫升的西林瓶中，用橡膠塞和鋁塑蓋封口后，將西林瓶內部的空氣置換成氫氣和全氟丙烷體積比為1:1的混合氣體。S4用頻率為4500次/分鐘的機械震蕩器震蕩45秒到90秒，得到均勻豐富的微泡。氫氣含暈檢測取Iml該微泡用上述氫氣檢測裝置分析，測得Iml氫氣微泡含有80.5ul氫氣。和Iml的飽和氫氣水中的氫氣含量IOppm相比，有了 7倍左右的提高。實施例4含氫氣微泡水溶液的制備SI按90: 10摩爾比將一定量的1，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿(20: 0，PC)，硬質酸聚乙二醇2000酯(PEG40S)在三氯甲烷中用渦旋混合器混勻。用干燥的氮氣流除去三氯甲烷使溶解的材料在試管壁上形成一層均勻的薄膜，真空烘箱中45°C干燥2小時以上。根據(jù)上述磷脂的總質量，加入一定體積pH為7.4的緩沖溶液(含10% (體積比)甘油、10% (體積比)丙二醇和80% (體積比)0.1M的Tris三羥基氨甲烷)，將磷脂混合物薄膜水化，使得磷脂的最終濃度為3mg/ml。加熱到70°C以上，使其從試管壁上脫落。保持水溫在70°C以上用水浴式超聲震蕩器使磷脂水混合物徹底分散直至完全透明。S3然后I毫升/瓶裝入2毫升的西林瓶中，用橡膠塞和鋁塑蓋封口后，將西林瓶內部的空氣置換成氫氣和全氟丙烷體積比為1:1的混合氣體。S4在通入氫氣和全氟丙烷1:1混合氣體的情況下，用探頭式細胞破碎機超聲30s即可得到豐富的白色泡沫。氫氣含暈檢測取Iml該微泡用上述氫氣檢測裝置分析，測得Iml氫氣微泡含有60.3ul氫氣。和Iml的飽和氫氣水中的氫氣含量IOppm相比，有了 6倍左右的提高。
實施例5含氫氣微泡水溶液的制備SI按90: 5: 5的摩爾比將一定量的1，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿(24: 0，PC)，硬質酸聚乙二醇2000酯(PEG40S) ,1,2- 二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿-聚乙烯二醇2000-葉酸(DSPC-PEG-folate)在三氯甲烷中用渦旋混合器混勻。用干燥的氮氣流除去三氯甲烷使溶解的材料在試管壁上形成一層均勻的薄膜，真空烘箱中45°C干燥2小時以上。根據(jù)上述磷脂的總質量，加入一定體積pH為7.4的緩沖溶 液(含10% (體積比)甘油、10% (體積比)丙二醇和80% (體積比)0.1M的Tris三羥基氨甲烷)，將磷脂混合物薄膜水化，使得磷脂的最終濃度為3mg/ml。加熱到70°C以上，使其從試管壁上脫落。保持水溫在85°C以上用水浴式超聲震蕩器使磷脂水混合物徹底分散直至完全透明。S3然后I毫升/瓶裝入2毫升的西林瓶中，用橡膠塞和鋁塑蓋封口后，將西林瓶內部的空氣置換成氫氣和全氟丙烷體積比為1:1的混合氣體。S4用頻率為4500次/分鐘的機械震蕩器震蕩45秒到90秒，得到具有葉酸配體的
氫氣微泡。氫氣含暈檢測取Iml該微泡用上述氫氣檢測裝置分析，Iml氫氣微泡含有74.5ul氫氣。和Iml的飽和氫氣水中的氫氣含量IOppm相比,有了 7.5倍左右的提高。以上所述本發(fā)明的具體實施方式
，并不構成對本發(fā)明保護范圍的限定。任何根據(jù)本發(fā)明的技術構思所作出的各種其他相應的改變與變形，均應包含在本發(fā)明權利要求的保護范圍內。
權利要求
1.一種用于制備含氫氣微泡水溶液的方法，包括步驟: Si形成磷脂薄膜:于容器中使用低沸點有機溶劑溶解磷脂，之后以惰性氣流除去低沸點有機溶劑，以在所述容器壁上形成磷脂薄膜，其中 所述磷脂為20個C原子的硬脂酸鏈，12-24個C原子的脂肪酸對應的雙鏈磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油，它們的混合物或經抗體、多肽靶向修飾的衍生物； S2薄膜水化:添加pH為7-7.4的水性緩沖液到所述容器中，加熱并保持在所述磷脂薄膜的相轉變溫度以上，超聲分散所述磷脂薄膜到水性緩沖液中，至溶液透明，形成磷脂水混合溶液； S3氣體置換:將所述磷脂水混合溶液置于密封容器中，置換容器內空氣為氫氣混合氣體，其中氫氣的體積百分數(shù)為0-90% ;以及 S4震蕩形成含氫氣微泡水溶液。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂為I，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿、聚乙二醇2000修飾的硬脂酸單酯、硬質酸聚乙二醇2000酯、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿-聚乙烯二醇2000-葉酸，或它們的混合物。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷脂為1，2-花生酰甘油基磷脂酰膽堿與聚乙二醇酯的混合物，其中1，2_花生酰甘油基磷脂酰膽堿的摩爾比百分數(shù)為85-90 %，并且其中聚乙二醇酯選自聚乙二醇2000修飾的硬脂酸單酯、硬質酸聚乙二醇2000酯，或它們與1，2- 二硬脂?；?sn-甘油基_3_磷脂酰膽堿-聚乙烯二醇2000-葉酸的混合物。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟SI還包括真空干燥所述磷脂薄膜的操作。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述水性緩沖液為磷酸緩沖溶液、甘油-丙二醇-Tris三羥基氨甲烷混合溶液、生理鹽水，或它們的混合物。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂水混合溶液中，磷脂的濃度為0.5_15mg/ml。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述氫氣混合氣體為氫氣與六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷、氮氣，或它們的混合物的混合氣體。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法,其特征在于,所述氫氣混合氣體為氫氣與三氟丙燒的混合氣體，并且氫氣與三氟丙烷的體積比為1: 1-3。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S4通過機械震蕩、探頭式細胞破碎機超聲、聲振法、微流控芯片、凍干再水化法進行。
10.根據(jù)權利要求1-9中任一項所述的方法制備得到的含氫氣微泡水溶液，其特征在于，所述含氫氣微泡水溶液中的氫氣含量大于50ul/ml。
11.權利要求10所述的含氫氣微泡水溶液在制備抗炎癥、腫瘤、缺血再灌注損傷的藥物中的應用，其特征在于，所述抗炎癥、腫瘤、缺血再灌注損傷的藥物用于治療腫瘤、缺血再灌注損傷、腎炎、肝炎、動脈粥樣硬化，并且所述藥物同時具有超聲造影的功能。
12.根據(jù)權利要求11所述的應用，其特征在于，所述抗炎癥、腫瘤、缺血再灌注損傷的藥物通過靜脈注射，或靜脈輸注給藥。
13.根據(jù)權利要求11所述的應用，其特征在于，所述抗炎癥、腫瘤、缺血再灌注損傷的藥物的含氫氣微泡可通過超聲`探頭控制釋放。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含氫氣藥物新劑型。通過使用磷脂包裹，將氫氣制成含氫氣微泡水溶液，大大提高了溶液中氫氣的含量、濃度可控，且更加穩(wěn)定。此外，由于采用微泡技術，使得到的含氫氣微泡水溶液還可以用作超聲造影劑，具有多重功能效果。
文檔編號A61K33/00GK103099780SQ20121053311
公開日2013年5月15日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權日2012年12月11日
發(fā)明者鄭海榮, 嚴飛, 靳巧鋒, 楊偉, 鄧志婷 申請人:中國科學院深圳先進技術研究院