專利名稱：一種同時分離王不留行黃酮苷和王不留行總皂苷的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥有效物質(zhì)提取的技術(shù)領(lǐng)域，采用乙醇回流提取，HPD-100大孔樹脂分離的方法一步同時獲得王不留行中王不留行黃酮苷和王不留行總皂苷，并評價、比較了這兩類組分對新生血管生成方面的作用。
背景技術(shù)：
中藥回流提取法是用乙醇等易揮發(fā)的有機溶劑提取原料成分，將浸出液加熱蒸餾，其中揮發(fā)性溶劑餾出后又被冷 卻，重復流回浸出容器中浸提原料，這樣周而復始，直至有效成分回流提取完全的方法?；亓魈崛】梢詫⒅兴幹械挠行С煞趾芎玫靥崛〕鰜?，又可以盡量避免部分雜質(zhì)的溶出。通過選擇不同溶劑可以針對性的提取出所需組分，或者改變?nèi)軇┑臐舛雀嗟奶崛〕鲇行С煞郑瑴p少雜質(zhì)的溶出。采用乙醇回流提取時，可以減少溶劑的添加量，也可以回收乙醇，減少成本，這種方法已經(jīng)成為現(xiàn)階段提取中藥有效成分的常規(guī)方法。大孔吸附樹脂是一類不含交換基團且有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹脂，具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，可以通過物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機物，故可根據(jù)所需提取物質(zhì)的極性，以及與大孔吸附樹脂吸附性能的強弱來選擇合適的大孔樹脂和相應(yīng)的洗脫溶劑將混合物中目標組分與非目標組分進行分離。大量研究報告表明，大孔樹脂內(nèi)部具有三維空間立體孔結(jié)構(gòu)，具有物理化學穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長、宜于構(gòu)成閉路循環(huán)、節(jié)省費用等諸多優(yōu)點，已在環(huán)保、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，近年來在我國也已廣泛用于中草藥有效成分的提取、分離、純化工作中。本發(fā)明涉及的HPD-100型大孔樹脂為非極性大孔樹脂，主要適用于天然產(chǎn)物中皂苷和黃酮苷的提取分離。王不留行是中國藥典一部收錄的一味常用中藥，為石竹科植物麥藍菜Vaccariasegetalis (Neck.) Garcke.的干燥成熟種子,具有活血通經(jīng)，下乳消腫，利尿通淋等功效，用于經(jīng)閉，通經(jīng)，乳汁不下，乳癰腫痛，淋證澀痛等癥[1、國家藥典委員會.中國藥典第一部，中國醫(yī)藥科技出版社，北京，P49.]。王不留行的藥用部位，具本草記載，多系根，莖，葉，花與種子并用，而目前則用種子。王不留行中主要含有三萜皂苷，黃酮苷，環(huán)肽，類脂和脂肪酸，單糖等。[2、李帆，梁敬鈺.王不留行的研究進展[J].海峽藥學.2007，19 (3)]。前期研究發(fā)現(xiàn)，王不留行中存在對新生血管生成具有相反作用的不同物質(zhì)，因此，選擇合適的分離方法將這兩種對血管生成具有相反作用的物質(zhì)分離開具有較好的現(xiàn)實意義。所以本發(fā)明采用乙醇回流提取，HPD-100型大孔樹脂分離的方法一步同時獲得這兩類組分，并對其進行理化性質(zhì)的鑒定和對新生血管生成作用的活性檢測，以期后續(xù)對這兩類組分加以綜合利用。新生血管在人體正常發(fā)育和許多疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，具有抑制或促進血管生成作用的物質(zhì)在醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品等領(lǐng)域中均具有良好的應(yīng)用前景和巨大的市場需求。例如，在治療心血管疾病的過程中，可以通過在缺血心肌已有的血管床上促進內(nèi)皮細胞發(fā)芽并長出新枝形成血管網(wǎng)，從而有效的改善心血管疾病的生命體征。腫瘤生長到一定階段也必須依賴相關(guān)的血管才能完成其生長，擴散和轉(zhuǎn)移的惡性行為，因此通過抑制腫瘤新生血管的生長來治療腫瘤已成為國內(nèi)外眾多藥學工作者的研究熱點。而血管內(nèi)皮細胞的增殖是促使新生血管生成的首要條件，所以本發(fā)明選用的HMEC細胞，即人微血管內(nèi)皮細胞，以其體外細胞增殖率為生物學活性評價模型，來評價所得組分對新生血管生成的影響是可行的方法之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是獲得一種能夠從王不留行中同時獲得王不留行黃酮苷和王不留行總皂苷分離方法。本發(fā)明所涉及的工藝參數(shù)為:將王不留行藥材粉碎，加4倍石油醚脫脂兩次，每次12小時，揮干溶劑后，脫脂藥材加10倍體積 70%乙醇回流提取兩次，每次2小時，所得提取液經(jīng)過濾后旋轉(zhuǎn)濃縮至干，加水復溶后經(jīng)減壓真空干燥得干粉。所得提取干粉后續(xù)采用HPD-100型大孔樹脂進行分離，具體操作是待樣品上柱吸附2小時后，依次用6倍柱體積去離子水，10%乙醇，30%乙醇和70%乙醇進行梯度洗脫，洗脫流速為4ml/min。收集洗脫液并經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮和真空干燥得干粉，其中，30%乙醇洗脫組分即為王不留行黃酮苷組分，70%乙醇洗脫組分即為王不留行總皂苷組分。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所述工藝可以同時從王不留行中分離得到對血管新生具有相反作用的兩種物質(zhì)，分離效率比較高，對于今后這兩種對新生血管具有相反作用的物質(zhì)規(guī)?；a(chǎn)和綜合利用提供了技術(shù)支持。


圖1和圖2分別涉及實施案例2和實施案例3中有關(guān)的王不留行黃酮苷的檢測和相關(guān)組分細胞活性的測定。圖1為用高效液相色譜法檢測30%乙醇洗脫組分和70%乙醇洗脫組分中是否含有王不留行黃酮苷，(1:HPD-100 70%乙醇洗脫組分檢測圖2:HPD-10030%乙醇洗脫組分檢測圖3:王不留行黃酮苷標準品檢測圖)。圖2為王不留行黃酮苷組分和王不留行總皂苷組分對人微血管內(nèi)皮細胞體外增殖率的影響。
具體實施例方式實施例1:王不留行樣品的回流提取方法和HPD-100型大孔樹脂分離IOOg王不留行脫脂干燥粉末用IOOOml 70%乙醇回流提取兩次，每次2小時，冷卻后，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，去離子水復溶，真空干燥得干粉，備用。將HPD-100型大孔樹脂用95%乙醇浸泡后濕法裝柱，徑高比為1: 7。先用95%乙醇洗至洗脫液與2倍去離子水混合后不顯渾濁后，繼續(xù)用去離子水洗柱，待洗脫液中無乙醇味時，備用。將上述制得的王不留行干粉加去離子水溶解，精密吸取王不留行樣品液20ml (0.013g/ml)上柱(18cmX2.5cm)，吸附兩小時后，依次用6倍柱體積蒸餾水，10 %乙醇，30 %乙醇，70 %乙醇進行梯度洗脫，洗脫流速為4ml/min。將大孔樹脂各醇洗脫組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加水復溶，真空干燥，得干粉，備用。其中，30%乙醇洗脫組分的提取率為1.32% ((洗脫組分干粉質(zhì)量/藥材脫脂干粉質(zhì)量)X 100% )，70%乙醇洗脫組分的提取率為2.02% ((洗脫組分干粉質(zhì)量/藥材脫脂干粉質(zhì)量)X 100% )實施例2 =HPD-1OO型大孔樹脂30%乙醇洗脫組分和70 %乙醇洗脫組分的定性鑒別2.1王不留行黃酮苷的檢視:根據(jù)中國藥典2010版第一部中HPLC方法檢測王不留行黃酮苷的條件，對HPD-100型大孔樹脂30%乙醇洗脫組分中王不留行黃酮苷進行檢視，具體色譜條件為:以甲醇為流動相A，以0.3%磷酸溶液為流動相B，檢測波長為280nm ;按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫。表I高效液相色譜法檢測王不留行黃酮苷的流動相洗脫梯度表
權(quán)利要求
1.一種同時分離王不留行黃酮苷和王不留行總皂苷的分離方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征為選取王不留行脫脂藥材，采用70%乙醇10倍體積回流提取兩次，每次兩小時，所得提取物后續(xù)采用HPD-100型大孔樹脂進行分離，依次用去離子水，10%乙醇，30%乙醇和70%乙醇進行洗脫，洗脫體積均為6倍柱體積，洗脫流速4mL/min，并收集30%乙醇洗脫組分和70%乙醇洗脫組分，提取物干燥后即得王不留行黃酮苷組分和王不留行總皂苷組分。
3.根據(jù)權(quán)利 要求2所述的分離方法所得的兩種組分，其特征是王不留行黃酮苷組分具有促進新生血管生成的作用，王不留行總皂苷組分具有抑制新生血管生成的作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述得到的兩種化合物的應(yīng)用，其特征是王不留行黃酮苷和王不留行總皂苷用于食品，醫(yī)藥，保健品和化妝品的生產(chǎn)。
全文摘要
一種同時分離王不留行黃酮苷和王不留行總皂苷的分離方法，屬于中藥有效物質(zhì)提取領(lǐng)域。本發(fā)明提供一種可同時分離和制備王不留行黃酮苷和王不留行總皂苷的方法，用含水有機溶劑來提取王不留行脫脂干粉，并將提取液過濾，濃縮，干燥后繼續(xù)用大孔樹脂進行分離和制備，洗脫液經(jīng)濃縮，干燥而成。本發(fā)明首次用一種方法同時制備王不留行中對人微血管內(nèi)皮細胞的增殖具有相反作用的兩種組分，分離效率比較高，分離得到的王不留行黃酮苷和王不留行總皂苷提取物可用于藥物，食品，保健品和/或化妝品等用途。
文檔編號A61P9/10GK103102376SQ20121051277
公開日2013年5月15日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者邱麗穎, 馮磊, 洪奎, 馬麗萍, 謝鳳珊, 孫娟, 蘇曉琴 申請人:江南大學