一種β-catenin蛋白抑制劑-姜黃素在肝癌治療方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】β-catenin蛋白是Wnt通路的重要組成部分，β-catenin蛋白的過度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，本發(fā)明提供了一種化合物姜黃素是有效的Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑，能夠應(yīng)用于舍有內(nèi)源性激活的Wnt/β-catenin信號通路的癌癥治療藥物的制備中。
【專利說明】—種β -eaten i n蛋白抑制劑_姜黃素在肝癌治療方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種信號傳導(dǎo)系統(tǒng)抑制劑化合物在制備治療肝癌藥物方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)WHO統(tǒng)計，全世界惡性腫瘤每年發(fā)病1100多萬人，病死800多萬人，發(fā)達(dá)國家腫瘤年發(fā)病率高于300/10萬。WHO不久前在日內(nèi)瓦發(fā)表最新《世界癌癥報告》說，到2020年，全球癌癥發(fā)病率可能此現(xiàn)在增長50%以上，新增腫瘤患者將達(dá)2000萬人。肝癌是一種惡性程度高、浸潤和轉(zhuǎn)移性強且先天性耐藥的癌癥，嚴(yán)重危害人類健康。在男性腫瘤中，其發(fā)生率和死亡率分別位于第五位和第二位；在女性中，分別位于第七位和第六位。
[0003]Wnt信號通路在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程中的肝臟細(xì)胞增殖及成人肝臟基本功能方面起著重要作用，但其異常激活會使β -catenin積聚入核、進(jìn)而激活下游靶基因而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生與發(fā)展。
[0004]β -catenin蛋白的過度表達(dá)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān):β -catenin過度表達(dá)可出現(xiàn)于58.4%與HBV相關(guān)的HCC中，并和腫瘤大小、組織分化程度等因素有關(guān)。β-catenin基因(即CTNNBI)突變促進(jìn)肝癌發(fā)生，此突變類型大部分是發(fā)生在外顯子3的錯義突變，且與β -catenin的磷酸化及泛素化有關(guān)，發(fā)生在這個區(qū)域的突變將導(dǎo)致β -catenin穩(wěn)定性增加進(jìn)而積聚入核。肝細(xì)胞腺瘤的基因型_表型相關(guān)分析顯示，只有12%的腺瘤發(fā)生β-catenin突變，但在由腺瘤進(jìn)展來的HCC中β-catenin突變占到46%，這顯示了 β-catenin促進(jìn)癌前病變進(jìn)展到HCC。在轉(zhuǎn)基因小鼠模型發(fā)生肝臟腫瘤實驗中，β-catenin聚集在細(xì)胞核,并有c_myc及TGF-β過表達(dá)。
[0005]當(dāng)Wnt蛋白與其受體結(jié)合后,通過一系列胞質(zhì)蛋白的相互作用使得β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)累積進(jìn)而入核與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF共同作用激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，如cyclinDl、c-myc、VEGF等，這些基因多數(shù)是參與細(xì)胞增生與凋亡的基因，這些基因的過度表達(dá)與肝癌的發(fā)生相關(guān)。因此阻斷β-catenin信號通路的異常激活可能是治療肝癌的一種新途徑:以下我們將討論近年來靶向攻擊fct通路有成功希望的三個主要區(qū)域:(I)受體/配體相互作用:在特定腫瘤中，fct信號通路是通過自分泌機制而激活的。特定的腫瘤細(xì)胞系已經(jīng)顯示出表達(dá)高水平的特 異fct蛋白，因此可以使用Wnt抑制劑如Dkks或sFRP來抗腫瘤細(xì)胞增殖。(2)細(xì)胞質(zhì)中信號部件通路最上游的細(xì)胞內(nèi)部件是受體的胞內(nèi)部分。LRP5/6的磷酸化在啟動Wnt信號級聯(lián)反應(yīng)上起著關(guān)鍵性作用,Dvl家族蛋白在β -catenin降解復(fù)合體的破壞中起關(guān)鍵作用，CKl家族成員在Dvl的磷酸化及激活、LRP5/6及β -catenin的磷酸化中起正性作用，然而，其不同亞型在調(diào)節(jié)Wnt中起相反作用:0(1δ有助于LRP5/6的磷酸化,CKl ε磷酸化Dvl,這都會激活Wnt通路；而CKl α則磷酸化β-catenin起抑制作用。因此，可適當(dāng)選擇CKl調(diào)節(jié)因子來調(diào)控Wnt信號通路。相似的是，GSK-3 0在降解復(fù)合體中起著至關(guān)重要的作用，在fct信號極度活躍的環(huán)境下，能夠加強GSK-3 β活性的分子將有利于阻斷Wnt通路而用于治療。(3)細(xì)胞核信號部件:進(jìn)入細(xì)胞核后，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族成員相互作用來促使靶基因表達(dá)。與TCF/LEF相互作用并替代Groucho等阻遏物，同時招募各種活化劑例如CBP、p300、BCL9等。這些活化劑在驅(qū)使β -catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用，并因此成為潛在的治療靶標(biāo)。ICG-OOl顯示能選擇性干擾β-catenin/TCF和CBP之間的相互作用。本發(fā)明使用小分子物質(zhì)姜黃素能減少肝癌細(xì)胞中β-catenin蛋白的過度表達(dá)抑制下游基因cyclinDl、
[0006]c_myc、VEGF。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]β-catenin基因(即CTNNBI)突變促進(jìn)肝癌發(fā)生，β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)累積進(jìn)而入核與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF共同作用激活下游祀基因的轉(zhuǎn)錄,如eyeIinD1、c-myc、VEGF等,這些基因多數(shù)是參與細(xì)胞增生與凋亡的基因，這些基因的過度表達(dá)促進(jìn)了肝癌的發(fā)生。在這項專利申請的內(nèi)容中，我們用一系列生物實驗證明了姜黃素(一種β-catenin蛋白小分子抑制劑)能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402、QGY-7703的生長。
[0008]在體外實驗中姜黃素能抑制肝癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)其凋亡，并呈劑量依賴性。姜黃素能降低胞質(zhì)蛋白β-catenin的水平。PCR法顯示姜黃素能減少下游祀基因c_myc、VEGF、cyclinDl的表達(dá)。因此我們認(rèn)為EGCG是一種治療肝癌的新方法。
[0009]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供了一種β -catenin信號傳導(dǎo)系統(tǒng)抑制劑化合物在制備治療肝癌藥物方面的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為姜黃素的分子式。
[0011]圖2為上述實施例1的結(jié)果:經(jīng)不同濃度的姜黃素處理48h后，BEL-7402、QGY-7703細(xì)胞生長受到不同程度的抑制，隨藥物濃度的增大，抑制率逐漸增高，呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。工作濃度為5、10、20、40、80ymol/L的姜黃素處理BEL-7402、QGY-7703細(xì)胞48h 后的抑制率分別為 6.7% ±3.3%U5.1% ±2.7%,35.5% ±5.9%,57.2% ±3.1%,85.2 % ±4.3% 和 8.3% ±1.5%、14.5% ±1.9%、35.4% ±2.5%、55.8% ±4.5%、89.3% ±2.2%。
[0012]圖3為上述實施例2的結(jié)果:BEL_7402細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長，呈多角形，在姜黃素作用下，它們生長速度減慢，形態(tài)發(fā)生改變，部分細(xì)胞變圓，脫壁。用10、20、40、80ymol/L姜黃素處理作用48h后，其凋亡率分別為8.2%U1.8%U4.9%,39.2%,58.4%和 8.6%U5.7%, 17.9%,28.8%,50.3%，呈現(xiàn)濃度依賴性。
[0013]圖4為上述實施例2的結(jié)果:QGY_7703細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長，呈多角形，在姜黃素作用下，它們生長速度減慢，形態(tài)發(fā)生改變，部分細(xì)胞變圓，脫壁。用10、20、40、80ymol/L姜黃素處理作用48h后，其凋亡率分別為8.2%,11.8%,14.9%,39.2%,58.4%和 8.6%U5.7%U7.9%,28.8%,50.3%，呈現(xiàn)濃度依賴性。
[0014]圖5為上述實施例3的結(jié)果:經(jīng)不同濃度的姜黃素處理48h后，BEL-7402、QGY-7703細(xì)胞中β -catenin蛋白的表達(dá)受到不同程度的抑制，隨藥物濃度的增大，表達(dá)量逐漸減少，呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。工作濃度為10、20、40、80μπιΟ1/1的姜黃素處理BEL-7402、QGY-7703 細(xì)胞 48h 后 β -catenin 蛋白的表達(dá)量。[0015]圖6為上述實施例4的結(jié)果:經(jīng)不同濃度的姜黃素處理48h后，BEL-7402、QGY-7703細(xì)胞中c-myC、VEGF、CyClinDl基因的表達(dá)受到不同程度的抑制，隨藥物濃度的增大，表達(dá)量逐漸減少，呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。工作濃度為10、20、40、80μπιΟ1/1的姜黃素處理 BEL-7402、QGY-7703 細(xì)胞 48h 后 c_myc、VEGF, cyclinDl 基因的表達(dá)量。
【具體實施方式】
[0016]為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式并配合附圖詳予說明。
[0017]實施例1:MTT法測定姜黃素對BEL-7402、QGY-7703細(xì)胞增殖的影響:設(shè)對照組和加用姜黃素組(5、10、20、40、80 μ mo I/L姜黃素)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化后用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μ L (含約5 * 103個細(xì)胞)，待細(xì)胞貼壁后去培養(yǎng)液并加藥，每組設(shè)4個復(fù)孔，另設(shè)4個調(diào)零孔(不加細(xì)胞，只加100 μ L培養(yǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)48h。吸掉培養(yǎng)基并用PBS100 μ L洗2遍，然后每孔加入含MTTlO μ L的培養(yǎng)液IOOul，4h后終止培養(yǎng)，棄上清液，每孔加入150 μ L的溶解液，置水平搖床上震蕩lOmin，在酶標(biāo)儀(Tecan F200)上測490nm波長的吸光度(OD)值。結(jié)果見附圖2
[0018]實施例2:流式細(xì)胞儀檢測姜黃素誘導(dǎo)BEL-7402、QGY-7703細(xì)胞凋亡:取對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化后用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后種于六孔板中，每孔約含2 * IO5個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后去培養(yǎng)液并加藥，分別加入2mL含有
O、10、20、40、80 μ mol/L姜黃素的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后，用不含EDTA的胰酶消化離心收集細(xì)胞，用冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次。然后用^OyLlXAnnexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入5 μ L Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后避光孵育15min，后加入10 μ L PI染色液避光孵育5min，在Ih內(nèi)用流式細(xì)胞儀(Accuri C6)檢測。姜黃素誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞凋亡結(jié)果見附圖3姜黃素誘導(dǎo)QGY-7703細(xì)胞凋亡結(jié)果見附圖4。
[0019]實施例3 =Western blot分析:BEL-7402、QGY_7703分別接種于六孔培養(yǎng)板中(約2X105/孔)，姜黃素處理48小時后提取蛋白并使用BCA試劑盒蛋白定量。制膠加樣品和mark液后通電:70V，40min，后改為110V，1小時。轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜，按要求浸泡膜后由下至上逐張疊放、精準(zhǔn)對齊:3層濾紙、凝膠、PVDF膜、3層濾紙。插入電極，打開電泳儀開關(guān)調(diào)至100V,65min,封閉lh。洗漆后加入一抗β _catenin4°C過夜后加入二抗孵育lh。最后使用ECL發(fā)光試劑盒，目標(biāo)蛋白在暗室中顯影。結(jié)果見附圖5。
[0020]實施例4 =RT-PCR分析=Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度，重復(fù)測定3次，計算A260nm/A280nm，比值在1.8~2.0的RNA標(biāo)本用于反轉(zhuǎn)錄。瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品的完整性，總RNA按說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA用于RT PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:94°C 30s55°C 30s72°C lmin,30個循環(huán)，最后在72°C保存5min，結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4°C待電泳檢測。2%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物cDNA條帶與β-actin內(nèi)參條帶的吸光度值的比值作為mRNA的相對表達(dá)。結(jié)果見附圖6。
[0021]以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同 理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.Wnt/ β -catenin信號通路系統(tǒng)抑制劑化合物-姜黃素在制備治療肝癌藥物方面的應(yīng)用，姜黃素的分子式見圖1。
【文檔編號】A61P1/16GK103830211SQ201210490539
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月27日
【發(fā)明者】徐學(xué)軍, 趙琳琳 申請人:上海曼克爾瑞生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司