專(zhuān)利名稱(chēng)：一種高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于活性化合物提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法。
背景技術(shù)：
枸杞多糖(Lycium Barbarum polysaccharide, LBP)是從枸杞子中提取的一種水溶性多糖，是枸杞子的主要功能活性成分，總含量大約占枸杞子重量的3. 36%。枸杞多糖分子量范圍多在兩萬(wàn)以上，均溶于水、難溶于酒精，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖六種單糖組成，是一種酸性雜多糖。大量藥理學(xué)研究及臨床醫(yī)學(xué)表明枸杞多糖具有降血糖、降血脂、抗炎癥、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等多種生理功能。多糖活性的研究一直得到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注，隨著多糖研究的深入，其越來(lái)越多 的生物活性逐漸顯現(xiàn)。甘璐等的研究表明，枸杞多糖可以通過(guò)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)來(lái)達(dá)到抗腫瘤目的。黃霞等的研究表明枸杞多糖以質(zhì)量濃度依賴(lài)方式抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，阻滯細(xì)胞在G0/G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。枸杞多糖可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)而阻止細(xì)胞周期的進(jìn)行，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。說(shuō)明枸杞多糖是一種新具有廣泛應(yīng)用前景的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性物質(zhì)。超濾是一種新型膜分離技術(shù)，利用不同的孔徑截留不同分子量物質(zhì)，不僅具有常溫操作、無(wú)相態(tài)變化，可以防止雜菌污染和熱敏性物質(zhì)失活等特點(diǎn)，而且比上述方法更適于工業(yè)化生產(chǎn)，可以克服從天然產(chǎn)物中分離提取多糖的工藝復(fù)雜，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)成本高等不利于工業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模臨床應(yīng)用的缺點(diǎn)。姚瑞祺等用超濾法分離枸杞多糖提取液，得到6種不同分子量的枸杞多糖樣品液。超濾能夠?qū)崿F(xiàn)不同分子量枸杞多糖的良好分離，可作為枸杞活性成分開(kāi)發(fā)利用的一種新方法。分子量在5000以下的枸杞多糖占多數(shù)，達(dá)到74. 5% ;分子量大于3萬(wàn)的較低，尚不到7%。分子量在3-10萬(wàn)的枸杞多糖抗氧化活性最強(qiáng)，其他5種枸杞多糖也都有一定程度的抗氧化活性；分子量5000以下的枸杞多糖為總多糖的主要功效成分，袁振林通過(guò)測(cè)定的不同分子量分布的枸杞多糖對(duì)S-180腫瘤和路易絲肺癌細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)只有分子量在20KD左右的枸杞多糖對(duì)S-180腫瘤和路易絲肺癌有較好的療效。超濾法應(yīng)用于多糖的提取分離，具有比傳統(tǒng)工藝分離效率高，避免活性物質(zhì)失活等優(yōu)勢(shì)，已成為活性多糖的重要研究手段。超濾能夠?qū)崿F(xiàn)不同分子量枸杞多糖的分離，可作為枸杞活性成分開(kāi)發(fā)利用的一種新方法。目前，現(xiàn)有技術(shù)主要利用超濾技術(shù)來(lái)除去雜質(zhì)、濃縮提取液或采用與色譜分離技術(shù)結(jié)合的方法分離提取枸杞多糖，柱層析操作復(fù)雜，不利于工業(yè)或生產(chǎn)。而且，目前雖有公開(kāi)文獻(xiàn)介紹了枸杞多糖的提取、分離和純化的方法，但是對(duì)有目的性的獲得單一組分的關(guān)注較少。通過(guò)檢索，發(fā)現(xiàn)多篇與超濾分離枸杞多糖相關(guān)的專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)I、枸杞多糖提取純化工藝(CN1263108 )，采用新鮮枸杞漿果分離除去枸杞籽后，制得枸杞原汁，先用50萬(wàn)分子量膜分離枸杞色素及不溶固形微粒，再用I一 10萬(wàn)分子量膜截留溶解枸杞多糖原汁部分，真空冷凍成枸杞多糖粗品，訂制Φ 45mm和Φ IOOmm大柱徑分離柱對(duì)枸杞多糖粗品柱層析，可以g量級(jí)以上制備純枸杞多糖。本工藝采用了先進(jìn)的膜分離技術(shù)和大柱層析技術(shù)，提高了枸杞多糖的制備效率和得率，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)，使枸杞多糖盡快轉(zhuǎn)化為藥品，用于醫(yī)學(xué)臨床。2、一種枸杞多糖及其制備方法和應(yīng)用(CN1389475)，公開(kāi)了一種枸杞多糖，其所含活性多糖成分的組成及比例為分子量在10萬(wàn) 18萬(wàn)I萬(wàn) 8萬(wàn)O. 3萬(wàn) O. 8萬(wàn)=(4 20%) (8 40%) (4 20%)。本發(fā)明還公開(kāi)了上述枸杞多糖的制備方法以中藥枸杞為原料，加入8 20倍50 100°C的熱水，用高速剪切機(jī)剪切10 40分鐘，壓榨，取壓榨出的汁高速離心，離心液用截留分子量為5 10萬(wàn)的超濾膜過(guò)濾，超濾液再用截留分子量為3000 10000的超濾膜濃縮，冷凍干燥，即得。本發(fā)明枸杞多糖活性成分明確，質(zhì)量可控，用于治療因免疫能力低下而引起的疾病療效可靠，并且?guī)缀鯚o(wú)不良反應(yīng)。3、一種枸杞多糖提取物及其藥用用途(CN101564469)，明公開(kāi)了一種枸杞多糖提取物，其特征在于酸性多糖含量為85%-95%，中性多糖為1%-5%。本發(fā)明采用水提醇沉、 超濾和離子交換有機(jī)結(jié)合的方法，提取得到枸杞多糖提取物；藥理實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明枸杞多糖具有很好的治療腫瘤的作用。通過(guò)對(duì)比，本發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)與上述公開(kāi)的專(zhuān)利文獻(xiàn)存在本質(zhì)的不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種效率高，成本低，操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短、可獲得單一組分的高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，由該方法所獲得的枸杞多糖具有良好的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性，對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721生長(zhǎng)的抑制率達(dá)55%以上。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，提取過(guò)程中采用超濾法對(duì)枸杞多糖進(jìn)行分級(jí)分離。而且，所述的采用超濾法對(duì)枸杞多糖進(jìn)行分級(jí)分離步驟為采用截留分子量為30K的超濾膜對(duì)枸杞多糖溶液進(jìn)行分離，收集濾出液，再以截留分子量為IOK的超濾膜對(duì)上述濾出液分離，收集截留液；濾出液再用截留分子量為4K的超濾膜分離，收集濾出液。而且，所述的高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，步驟如下⑴枸杞多糖的提取稱(chēng)取干燥的枸杞子，按枸杞子乙醇溶液=1 3"6 (g :ml)的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，打漿、回流、過(guò)濾得濾渣，向?yàn)V渣中再按I :2 4 (g :ml)加入70%的乙醇，回流、過(guò)濾，濾渣再重復(fù)上述操作2 4次；收集濾渣，揮去乙醇，按I :3飛(g ml)加入蒸餾水，沸水浴浸提、過(guò)濾、收集濾液，將濾渣重復(fù)上述提取，合并濾液，真空濃縮；加無(wú)水乙醇至終質(zhì)量濃度為80%，分離、收集沉淀，揮發(fā)去除乙醇，復(fù)溶、脫蛋白、真空濃縮，得到枸杞粗多糖；⑵超濾一將枸杞粗多糖配制成濃度為I. Omg/mL枸杞多糖溶液，選用截留分子量為30K的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 08MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積，繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作7 11次，收集濾出液備用；
⑶超濾二 取步驟⑵中濾出液，調(diào)整其濃度為I. Omg/mL，選用截留分子量為IOK的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 003MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積，繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作4飛次，收集截留液，得截留液I ;濾出液備用；⑷超濾三取步驟⑶中濾出液，調(diào)整其濃度為I. Omg/mL，選用截留分子量為4K的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 08MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積，繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作4飛次，收集濾出液，得濾出液I ;(5)將截留液I和濾出液I分別經(jīng)真空濃縮，冷凍干燥，即為高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖。而且，所述⑴中分離為3000r/min離心15min，或者過(guò)濾分離。 而且，所述⑴中回流條件為70°C水浴回流O. 5h。而且，所述⑴中脫蛋白采用聚酰胺色譜柱法或savag法。而且，所述聚酰胺色譜柱法的具體步驟如下將枸杞粗多糖溶解，質(zhì)量濃度為1%_2%，加入聚酰胺色譜柱，上樣量為柱容量的15%-20%，以水洗脫，收集洗脫液，濃縮至可溶性固形物濃度達(dá)到5%以上。而且,所述savag法的具體步驟如下取枸杞粗多糖，加水至完全溶解，再依次加入氯仿和正丁醇，枸杞多糖溶液氯仿正丁醇的體積比為25 5 :1，劇烈振搖20min靜置分層，傾出上清液，棄去下層有機(jī)溶液和中間變性蛋白質(zhì)層，上清液重復(fù)操作數(shù)次，直至無(wú)變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)為止，收集上清液，真空濃縮至可溶性固形物濃度達(dá)到5%以上。而且，所獲得的枸杞多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721生長(zhǎng)的抑制率達(dá)55%以上。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是I、本發(fā)明提取方法以水提法提取枸杞多糖，脫蛋白，然后采用超濾技術(shù)對(duì)多糖進(jìn)行分級(jí)分離，采用多個(gè)截留分子量的超濾膜進(jìn)行多次分離，克服了柱層析操作復(fù)雜，不利于工業(yè)或生產(chǎn)等缺點(diǎn)，具有效率高、成本低、操作簡(jiǎn)單、條件溫和、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，為活性化合物的開(kāi)發(fā)及工業(yè)化應(yīng)用提供了新思路。2、本發(fā)明提取方法獲得的枸杞多糖具有良好的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性，對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率達(dá)55%以上，由于本方法提取過(guò)程中無(wú)相態(tài)變化，因此細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性穩(wěn)定。而且，該提取方法是以分子量分布為依據(jù)，因此可有目的性的獲得單一組分，獲得的枸杞多糖細(xì)胞成分明確。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明實(shí)施例中所使用的試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售產(chǎn)品；所使用的試驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法；所使用的儀器如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)儀器。本發(fā)明以枸杞子為原料，采用水提法獲得枸杞多糖，以分子量分布為依據(jù)，通過(guò)超濾技術(shù)分離枸杞多糖組分，獲得具有高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性的枸杞多糖。實(shí)施例I
一種高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，具體步驟如下⑴枸杞多糖的提取定量稱(chēng)取干燥的枸杞子200g，打漿機(jī)粉碎，按比例I :3(g ml)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，于70°C水浴回流提取O. 5h，過(guò)濾，得濾渣，再按比例I :3 (g :ml)加入70%的乙醇，水浴加熱條件下重復(fù)提取2次，收集濾渣，在濾渣中按比例I :3 (g ml)加入蒸餾水，沸水浴浸提I. 5h，過(guò)濾，收集濾液，將濾渣再重復(fù)提取3次，合并濾液，真空濃縮，使可溶性固形物大于10% ;加無(wú)水乙醇至終濃度為80%(v/v)，過(guò)濾分離，收集沉淀，揮發(fā)去除乙醇，復(fù)溶，脫蛋白，真空濃縮，得到枸杞粗多糖；其中，聚酰胺色譜柱法脫蛋白將枸杞多糖溶解，濃度為1%_2%，加入聚酰胺色譜柱，上樣量為柱容量的15%-20%，以水洗脫，收集洗脫液，濃縮至可溶性固形物濃度達(dá)到5%以上，備用；⑵超濾一配制濃度為I. Omg/mL枸杞多糖溶液，選用截留分子量為30K的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 08MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積，繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作9次，收集濾出液備用；⑶超濾二 取步驟⑵中濾出液，調(diào)整其濃度為I. Omg/mL，選用截留分子量為IOK的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 003MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積，繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作5次，收集截留液，真空濃縮，冷凍干燥，得高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖I ;濾出液備用。⑷超濾三取步驟⑶中濾出液，調(diào)整其濃度為I. Omg/mL，選用截留分子量為4K的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 08MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積，繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作5次。收集濾出液，真空濃縮，冷凍干燥，得高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖2。經(jīng)檢測(cè)本發(fā)明提取方法獲得的枸杞多糖具有良好的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性，濃度為400mg/L，作用2天可使人肝癌細(xì)胞SMMC-7721阻滯于G0/G1期，發(fā)生細(xì)胞凋亡，細(xì)胞的抑制率達(dá)55%以上，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性穩(wěn)定。以上述方法制得的枸杞多糖的組成為枸杞多糖I的中性糖含量為24. 2%，半乳糖醛酸含量19. 7%，蛋白質(zhì)含量2.6%。枸杞多糖2的中性糖含量為33. 9%，半乳糖醛酸含量29. 0%，蛋白質(zhì)含量O. 1%。實(shí)施例2一種高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，具體步驟如下⑴枸杞多糖的提取定量稱(chēng)取干燥的枸杞子200g，打漿機(jī)粉碎，按比例I :3飛(g ml)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，于70°C水浴回流提取O. 5h，過(guò)濾，得濾渣，再按比例I :3飛(g :ml)加入70%的乙醇，水浴加熱條件下重復(fù)提取3次，收集濾渣，在濾渣中按比例I :3飛(g :ml)加入蒸餾水，沸水浴浸提I. 5h，過(guò)濾，收集濾液，將濾渣再重復(fù)提取3次，合并濾液，真空濃縮，使可溶性固形物大于10% ;加無(wú)水乙醇至終濃度為80% (v/v),分離(3000r/min離心15min)，收集沉淀，揮發(fā)去除乙醇，復(fù)溶，脫蛋白，真空濃縮，得到枸杞粗多糖；其中，Sevag法脫蛋白脫取枸杞粗多糖，加水至完全溶解，再依次加入氯仿和正丁醇，枸杞多糖溶液氯仿正丁醇的體積比為25 5 :1，劇烈振搖20min靜置分層，傾出上清液，棄去下層有機(jī)溶液和中間變性蛋白質(zhì)層，上清液重復(fù)操作7次，直至無(wú)變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)為止，達(dá)到脫除蛋白質(zhì)的目的，收集上清液，真空濃縮至可溶性固形物濃度達(dá)到5%以上，備用;⑵超濾一配制濃度為I. Omg/mL枸杞多糖溶液，選用截留分子量為30K的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 08MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積，繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作11次，收集濾出液備用；⑶超濾二 取步驟⑵中濾出液，調(diào)整其濃度為I. Omg/mL，選用截留分子量為IOK的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 003MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積，繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作4次，收集截留液，真空濃縮，冷凍干燥，得高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖I ;濾出液備用。⑷超濾三取步驟⑶中濾出液，調(diào)整其濃度為I. Omg/mL，選用截留分子量為4K的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 08MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積，繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作6次。收集濾出液，真空濃縮，冷凍干燥，得高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖2。 經(jīng)檢測(cè)本發(fā)明提取方法獲得的枸杞多糖具有良好的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性，濃度為400mgL，做用2天可使人肝癌細(xì)胞SMMC-7721阻滯于G0/G1期，發(fā)生細(xì)胞凋亡，細(xì)胞的抑制率達(dá)55%以上，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性穩(wěn)定。以上述方法制得的枸杞多糖的組成為枸杞多糖I的中性糖含量為24. 2%，半乳糖醛酸含量19. 7%，蛋白質(zhì)含量2.6%。枸杞多糖2的中性糖含量為33. 9%，半乳糖醛酸含量29. 0%，蛋白質(zhì)含量O. 1%。實(shí)施例3一種高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，具體步驟如下⑴枸杞多糖的提取定量稱(chēng)取干燥的枸杞子200g，打漿機(jī)粉碎，按比例I :3飛(g ml)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，于70°C水浴回流提取O. 5h，過(guò)濾，得濾渣，再按比例I :3飛(g :ml)加入70%的乙醇，水浴加熱條件下重復(fù)提取4次，收集濾渣，在濾渣中按比例I :3飛(g :ml)加入蒸餾水，10(TC水浴浸提I. 5h，過(guò)濾，收集濾液，將濾渣再重復(fù)提取3次，合并濾液，真空濃縮，使可溶性固形物大于10% ;加無(wú)水乙醇至終濃度為80% (v/v)，分離(3000r/min離心15min，或者過(guò)濾分離)，收集沉淀，揮發(fā)去除乙醇，復(fù)溶，脫蛋白(采用聚酰胺色譜柱法或savag法),真空濃縮,得到枸杞粗多糖；其中，Sevag法脫蛋白取枸杞粗多糖，加水至完全溶解，再依次加入氯仿和正丁醇，枸杞多糖溶液氯仿正丁醇的體積比為25 5 :1，劇烈振搖20min，離心(3000r/min) 15min，傾出上清液，棄去下層有機(jī)溶液和中間變性蛋白質(zhì)層，上清液重復(fù)操作6次，直至無(wú)變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)為止，達(dá)到脫除蛋白質(zhì)的目的，收集上清液，真空濃縮至可溶性固形物濃度達(dá)到5%以上，備用；⑵超濾一配制濃度為I. Omg/mL枸杞多糖溶液，選用截留分子量為30K的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 08MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積，繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作7次，收集濾出液備用；⑶超濾二 取步驟⑵中濾出液，調(diào)整其濃度為I. Omg/mL，選用截留分子量為IOK的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 003MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積，繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作4次，收集截留液，真空濃縮，冷凍干燥，得高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖I ;濾出液備用。
⑷超濾三取步驟⑶中濾出液，調(diào)整其濃度為I. Omg/mL，選用截留分子量為4K的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 08MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積， 繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作6次。收集濾出液，真空濃縮，冷凍干燥，得高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖2。經(jīng)檢測(cè)本發(fā)明提取方法獲得的枸杞多糖具有良好的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性，濃度為400mg/L，做用2天可使人肝癌細(xì)胞SMMC-7721阻滯于G0/G1期，發(fā)生細(xì)胞凋亡，細(xì)胞的抑制率達(dá)55%以上，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性穩(wěn)定。以上述方法制得的枸杞多糖的組成為枸杞多糖I的中性糖含量為24. 2%，半乳糖醛酸含量19. 7%，蛋白質(zhì)含量2.6%。枸杞多糖2的中性糖含量為33. 9%，半乳糖醛酸含量29. 0%，蛋白質(zhì)含量O. 1%。
權(quán)利要求
1.一種高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，其特征在于提取過(guò)程中采用超濾法對(duì)枸杞多糖進(jìn)行分級(jí)分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，其特征在于所述的采用超濾法對(duì)枸杞多糖進(jìn)行分級(jí)分離步驟為 采用截留分子量為30K的超濾膜對(duì)枸杞多糖溶液進(jìn)行分離，收集濾出液，再以截留分子量為IOK的超濾膜對(duì)上述濾出液分離，收集截留液；濾出液再用截留分子量為4K的超濾膜分離，收集濾出液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，其特征在于步驟如下 ⑴枸杞多糖的提取稱(chēng)取干燥的枸杞子，按枸杞子乙醇溶液=1 :3^6 (g :ml)的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，打漿、回流、過(guò)濾得濾渣，向?yàn)V渣中再按I :2 4 (g ml)加入70%的乙醇，回流、過(guò)濾,濾渣再重復(fù)上述操作2 4次；收集濾渣，揮去乙醇，按I :3飛(g :ml)加入蒸餾水，沸水浴浸提、過(guò)濾、收集濾液，將濾渣重復(fù)上述提取，合并濾液，真空濃縮；加無(wú)水乙醇至終質(zhì)量濃度為80%，分離、收集沉淀，揮發(fā)去除乙醇，復(fù)溶、脫蛋白、真空濃縮，得到枸杞粗多糖； ⑵超濾一將枸杞粗多糖配制成濃度為1.0mg/mL枸杞多糖溶液，選用截留分子量為30K的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 08MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積，繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作7 11次，收集濾出液備用； ⑶超濾二 取步驟⑵中濾出液，調(diào)整其濃度為I. Omg/mL，選用截留分子量為IOK的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 003MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積，繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作4飛次，收集截留液，得截留液I ;濾出液備用; ⑷超濾三取步驟⑶中濾出液，調(diào)整其濃度為I. Omg/mL，選用截留分子量為4K的中空纖維超濾膜，在壓力為O. 08MPa，室溫下超濾至多糖溶液體積變?yōu)樵瓉?lái)的1/2時(shí)，以蒸餾水將其體積補(bǔ)足至原體積，繼續(xù)超濾，重復(fù)上次操作4飛次，收集濾出液，得濾出液I ; (5)將截留液I和濾出液I分別經(jīng)真空濃縮，冷凍干燥，即為高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，其特征在于所述⑴中分離為3000r/min離心15min,或者過(guò)濾分離。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，其特征在于所述⑴中回流條件為70°C水浴回流O. 5h。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，其特征在于所述⑴中脫蛋白采用聚酰胺色譜柱法或savag法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，其特征在于所述聚酰胺色譜柱法的具體步驟如下 將枸杞粗多糖溶解，質(zhì)量濃度為1%_2%，加入聚酰胺色譜柱，上樣量為柱容量的15%-20%，以水洗脫，收集洗脫液，濃縮至可溶性固形物濃度達(dá)到5%以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，其特征在于所述savag法的具體步驟如下取枸杞粗多糖，加水至完全溶解，再依次加入氯仿和正丁醇，枸杞多糖溶液氯仿正丁醇的體積比為25 5 :1，劇烈振搖20min靜置分層，傾出上清液，棄去下層有機(jī)溶液和中間變性蛋白質(zhì)層，上清液重復(fù)操作數(shù)次，直至無(wú)變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)為止，收集上清液，真空濃縮至可溶性固形物濃度達(dá)到5%以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至8任一項(xiàng)所述的高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，其特征在于所獲得的枸杞多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721生長(zhǎng)的抑制率達(dá)55%以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖的提取方法，以枸杞子為原料，經(jīng)提取得到枸杞粗多糖后，采用截留分子量為30K的超濾膜對(duì)枸杞多糖進(jìn)行分離，收集濾出液，再以截留分子量為10K的超濾膜對(duì)上述濾出液分離，收集截留液1，濾出液再用截留分子量為4K的超濾膜分離，收集濾出液1，將截留液1和濾出液1經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥，得高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性枸杞多糖。本發(fā)明提取方法以水提法提取枸杞多糖，脫蛋白，然后采用超濾技術(shù)對(duì)多糖進(jìn)行分級(jí)分離，采用多個(gè)截留分子量的超濾膜進(jìn)行多次分離，克服了柱層析操作復(fù)雜，不利于工業(yè)或生產(chǎn)等缺點(diǎn)，具有效率高、成本低、操作簡(jiǎn)單、條件溫和、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，為活性化合物的開(kāi)發(fā)及工業(yè)化應(yīng)用提供了新思路。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102942635SQ201210476728
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者張民, 唐秀麗 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)