專利名稱：人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤靶向顯像技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
腫瘤被認(rèn)為是目前最難治愈的疾病之一，基因治療是治療腫瘤的一種有前景的手段。已經(jīng)有研究報道間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可以作為基因載體實(shí)現(xiàn)腫瘤治療，MSCs 一般是從骨髓、脂肪、真皮等組織中分離得到，從這些組織中分離MSCs需要選擇合適的供體并進(jìn)行侵入性操作。而且從單個供體中取得MSCs是有限的，并且不能進(jìn)行長期的增殖，這些都影響了 MSCs作為載體進(jìn)行基因治療的可操作性。胚胎干細(xì)胞是一種來自于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的全能干細(xì)胞，能夠在體外無限增值而不喪失其分化的潛能，并且胚胎干細(xì)胞(ESCs)相對于其他細(xì)胞，易于進(jìn)行基因改造，更適合作為基因載體，但是胚胎干細(xì)胞具有來源受限、倫理道德及操作技術(shù)等因素的限制，發(fā)展較為緩慢，而誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(inducedpluripotent stem cells, iPSCs)是使體細(xì)胞重編程獲得的具有胚胎干細(xì)胞樣特性的多能干細(xì)胞，現(xiàn)在iPSCs已經(jīng)可以取代ESCs，從而克服了 ESCs來源受限、倫理道德限制等問題，因此應(yīng)用iPSCs作為“載體”細(xì)胞將為腫瘤研究帶來了治療希望。到目前為止，經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)Hannon等在《Nature》(自然)雜志 2004 年第 431 卷第 7006 期 371-378 頁上發(fā)表文章 “Unlocking the potential ofthehuman genome with RNA interference”,該文報道了通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，向人類胚胎干細(xì)胞中添加了一個基因，該基因可以控制干細(xì)胞表達(dá)一種名為TRAIL的抗癌分子，當(dāng)將這種轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞注入長有腦瘤的老鼠體內(nèi)時，轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞便附著到腦瘤細(xì)胞上，并釋放出TRAIL分子。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，這些老鼠腦瘤的體積平均縮小了 50%，最多的甚至縮小了 70%。2012年崔大祥等人又在《Theranostics》(診療)雜志第2卷第6期618-628頁發(fā)表了文章“DiR-labeled Embryonic Stem Cells for Targeted Imaging of in vivoGastric Canc erCells”，該文報道了小鼠胚胎干細(xì)胞具有主動靶向識別體內(nèi)胃癌細(xì)胞的作用，并且這種遷移作用可能是由于體內(nèi)趨化因子CXCL12與CXCR4配對作用所導(dǎo)致。以上研究都發(fā)現(xiàn)了 ESCs具有靶向識別與治療腫瘤的效果，但是，至今為止，還沒有關(guān)于iPSCs靶向識別體內(nèi)腫瘤細(xì)胞方面的報道。實(shí)際上iPSCs具有來源方便、實(shí)現(xiàn)個體化治療、抗免疫排斥性、提高患者自身免疫力等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤的早期預(yù)警與治療方面具有很好的應(yīng)用前景，是一種有應(yīng)用前景的干細(xì)胞基治療腫瘤的工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制備方法及其用途。本發(fā)明的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能夠靶向體內(nèi)腫瘤病灶，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞通過標(biāo)記熒光磁性納米探針后，能夠通過靜脈注射后特異性富集于腫瘤病灶部位，同時還具有分子影像功能，示蹤細(xì)胞在活體狀態(tài)下在體內(nèi)的分布。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的第一個目的在于提供一種人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟將慢病毒轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞，得到人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。優(yōu)選地，所述人成纖維細(xì)胞為人真皮成纖維細(xì)胞或人包皮成纖維細(xì)胞。優(yōu)選地，所述慢病毒為攜帶有0ct4、Sox2、Nanog和Lin28轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒。優(yōu)選地，所述人成纖維細(xì)胞是通過原代培養(yǎng)的方法從腫瘤病人體內(nèi)獲得的人成纖維細(xì)胞。本發(fā)明的第二個目的在于提供前述人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在制備靶向體內(nèi)腫瘤病灶 制劑中的用途。優(yōu)選地，所述用途包括如下步驟將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制劑注射入人體，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能夠主動識別體內(nèi)腫瘤病灶。優(yōu)選地，所述腫瘤為胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或腦膠質(zhì)瘤。優(yōu)選地，所述用途包括如下步驟通過熒光標(biāo)記人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，注射入人體，體內(nèi)示蹤，顯示人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在體內(nèi)的分布，進(jìn)而顯示體內(nèi)腫瘤病灶的位置。優(yōu)選地，所述熒光標(biāo)記使用的材料為無機(jī)熒光納米材料。優(yōu)選地，所述無機(jī)熒光納米材料為量子點(diǎn)、熒光磁性納米粒子、二氧化硅包覆的熒光納米粒子或上轉(zhuǎn)換材料?，F(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明提供了一種人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在制備靶向體內(nèi)腫瘤病灶制劑中的用途，本發(fā)明的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能夠靶向體內(nèi)腫瘤病灶，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞通過標(biāo)記熒光磁性納米探針后，能夠通過靜脈注射后特異性富集于腫瘤病灶部位，同時還具有分子影像功能，示蹤細(xì)胞在活體狀態(tài)下在體內(nèi)的分布。


通過閱讀參照以下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會變得更明顯圖I為實(shí)施例I中的人iPSCs的堿性磷酸酶染色圖；圖2為實(shí)施例I中的人iPSCs的免疫熒光染色圖；圖3為實(shí)施例I中懸浮培養(yǎng)形成類胚體(EB)的形態(tài)圖(A)和RT-PCR定量分析人iPSCs和EB中各胚層特異性基因的表達(dá)(B)；圖4為實(shí)施例2中未標(biāo)記的人iPSCs細(xì)胞(A)和熒光磁性納米粒子標(biāo)記的人iPSCs細(xì)胞(B)的可見光與熒光成像復(fù)合圖；圖5為實(shí)施例2中未標(biāo)記的人iPSCs細(xì)胞(A)和熒光磁性納米粒子標(biāo)記的人iPSCs細(xì)胞(B)的普魯士藍(lán)-核固紅復(fù)染照片圖；圖6為實(shí)施例2中FMNPs (A)和FMNPs標(biāo)記的iPSCs (B)在尾靜脈注射進(jìn)入荷瘤小鼠體內(nèi)之后Ih和6h時間點(diǎn)小鼠活體熒光成像圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I、人iPSCs的制備本實(shí)施例涉及一種人iPSCs的制備，包括如下步驟步驟一，細(xì)胞制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryo fibroblast,MEF)購自上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司，傳代培養(yǎng)至第三 五代的MEF細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞；原代培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞(Human Dermal Fibroblasts, HDF):無菌條件下取患者腹部2 3cm2的皮膚，去除皮下組織和表皮層，用膠原酶消化真皮層，保持溫度為37°C，時間為2個小時，然后擠壓消化過的皮膚，并用單層紗布過濾，培養(yǎng)液用DMEM培養(yǎng)基添加 10%胎牛血清放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一周后原代細(xì)胞建立，采用原代培養(yǎng)的方法制備HDF細(xì)胞，將原代培養(yǎng)至第三 五代的HDF細(xì)胞用于病毒轉(zhuǎn)染制備iPSCs ；步驟二，人iPSCs的建立將第4代HDF細(xì)胞接種在直徑為IOcm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小時后當(dāng)細(xì)胞達(dá)到50%左右的匯合度時，更換無抗生素培養(yǎng)基；將包裝48小時后的20mL新鮮的攜帶有0ct4、Sox2、Nanog和Lin28轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒液(四種轉(zhuǎn)錄因子病毒液各5ml)，此慢病毒液可以通過病毒包裝得到，或者從公開的市售渠道購買，加入培養(yǎng)基內(nèi)，同時加入終濃度為8 ii g/ml的polybrene，轉(zhuǎn)導(dǎo)HDF細(xì)胞；24小時后棄掉培養(yǎng)液，根據(jù)同樣的方法用收集包裝72小時后的新鮮病毒混合液再次轉(zhuǎn)導(dǎo)HDF細(xì)胞。24小時后更換為正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時。72小時后用含有篩選劑Puromycin (10 u g/mL)的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，以后每天更換一次培養(yǎng)液，直至出現(xiàn)初始化的iPSCs克??；步驟三，人iPSCs的擴(kuò)增培養(yǎng)顯微鏡下用機(jī)械法剔除邊緣彌散的細(xì)胞克隆，將中間致密的胚胎干細(xì)胞樣克隆分割為小塊接種在經(jīng)絲裂霉素C處理過的MEF細(xì)胞上，用添加Y-27632 (10 u mol/L, Rho激酶抑制劑)的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天更換人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，密切觀察其形態(tài)變化，經(jīng)過5 7天的培養(yǎng)可進(jìn)行第二次傳代；步驟四，人iPSCs的生物學(xué)特性和多潛能性鑒定堿性磷酸酶表達(dá)鑒定將第三代iPSCs細(xì)胞用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定20min，PBS再洗滌2次，25mM Tris-Cl (pH9. 0)漂洗I次，加入新鮮配制的堅(jiān)牢紅AP染色液，室溫放置約15-30分鐘后陽性細(xì)胞即呈現(xiàn)紅色，PBS漂洗以終止反應(yīng)，顯微鏡下觀察，如圖I所示。免疫熒光法鑒定iPSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)iPSCs用PBS洗3次，再用4%多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗滌2次，每次3 5分鐘；0. 2%Triton X-100透化5分鐘，PBS洗三次，5%BSA 室溫封閉 30 分鐘，用 1%BSA 稀釋四種一抗(SSEA-3、SSEA4、Tra-1-60、Tra_l_81)，將稀釋好的一抗分別滴加到細(xì)胞上，不加一抗的作為實(shí)驗(yàn)對照，放在4°C過夜，PBS洗三次，力口二抗(用1%BSA稀釋)避光孵育2小時，PBS洗3次，DAPI復(fù)染核，置于熒光顯微鏡下觀察，如圖2所示。類胚體的形成鑒定細(xì)胞用IV膠原酶消化，37°C孵育40min以上，待細(xì)胞克隆脫落后，收集細(xì)胞團(tuán)，自然沉降，去上清。換成人類胚胎體(EB)培養(yǎng)基，在無飼養(yǎng)層的低貼附板中懸浮培養(yǎng)7天。培養(yǎng)7天后將形成的EB轉(zhuǎn)入0. 1%明膠處理的培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁培養(yǎng)2周，借助RT-PCR檢測EB表達(dá)各胚層的標(biāo)志性基因從EB中提取總RNA，采用TIANGEN公TIANScript RT Kit合成cDNA，然后以cDNA為模板利用如下表I所示的RT-PCR檢測各胚層標(biāo)志性基因表達(dá)的引物序列，擴(kuò)增各胚層的標(biāo)志性基因，各胚層的標(biāo)志性基因在人iPSCs中的表達(dá)作為陰性對照。結(jié)果如圖3所示。表I
權(quán)利要求
1.一種人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟將慢病毒轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞，得到人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求I所述的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述人成纖維細(xì)胞為人真皮成纖維細(xì)胞或人包皮成纖維細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求I所述的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述慢病毒為攜帶有0ct4、Sox2、Nanog和Lin28轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒。
4.如權(quán)利要求I所述的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述人成纖維細(xì)胞是通過原代培養(yǎng)的方法從腫瘤病人體內(nèi)獲得的人成纖維細(xì)胞。
5.一種如權(quán)利要求I所述的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在制備靶向體內(nèi)腫瘤病灶制劑中的用途。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述用途包括如下步驟將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制劑注射入人體,人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能夠主動識別體內(nèi)腫瘤病灶。
7.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述腫瘤為胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或腦膠質(zhì)瘤。
8.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述用途包括如下步驟通過熒光標(biāo)記人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，注射入人體，體內(nèi)示蹤，顯示人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在體內(nèi)的分布，進(jìn)而顯示體內(nèi)腫瘤病灶的位置。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述熒光標(biāo)記使用的材料為無機(jī)熒光納米材料。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述無機(jī)熒光納米材料為量子點(diǎn)、熒光磁性納米粒子、二氧化硅包覆的熒光納米粒子或上轉(zhuǎn)換材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腫瘤靶向顯像技術(shù)領(lǐng)域的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制備方法及其用途，所述制備方法包括如下步驟將慢病毒轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞，得到人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。本發(fā)明還涉及所述人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在制備靶向體內(nèi)腫瘤病灶制劑中的用途。本發(fā)明的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能夠靶向體內(nèi)腫瘤病灶，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞通過標(biāo)記熒光磁性納米探針后，能夠通過靜脈注射后特異性富集于腫瘤病灶部位，同時還具有分子影像功能，示蹤細(xì)胞在活體狀態(tài)下在體內(nèi)的分布。
文檔編號A61K49/00GK102965393SQ201210440090
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者崔大祥, 阮靜, 李超 申請人:上海交通大學(xué)