專利名稱：小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體為一種用于治療鼻咽癌的經(jīng)鼻給藥小核酸納米載體遞藥系統(tǒng)的制備方法。
背景技術(shù)：
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，占頭頸部腫瘤發(fā)病率首位。好發(fā)于兩廣、福建及嘉陵江流域，近年來發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)。放射治療是鼻咽癌的基本治療手段，可以取得較高的局部控制率，但由于鼻咽癌生長(zhǎng)迅速以及高轉(zhuǎn)移性，使該病存在著較高的治療失敗率，主要原因是局部區(qū)域復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。是否能夠?qū)⒒蛑委煈?yīng)用于鼻咽癌，是人們十分關(guān)注的問題。
小干擾RNA(SiRNA)由21 23個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成，可在細(xì)胞質(zhì)中特異性結(jié)合與其堿基對(duì)互補(bǔ)的信使RNA(mRNA)，經(jīng)核酸酶降解mRNA而阻斷其編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)，即通過RNA 干擾(RNAi)實(shí)現(xiàn)基因沉默。該過程既可沉默細(xì)胞內(nèi)有害基因，又可沉默外來病毒基因， 因此，siRNA作為藥物在癌癥和流感、肝炎等病毒感染疾病治療領(lǐng)域有重要科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。但是，親水性陰離子siRNA易被快速?gòu)难貉h(huán)中清除，難以跨越表面負(fù)電的疏水性細(xì)胞膜，易被核酸酶降解，需要安全高效的載體釋放系統(tǒng)保護(hù)并高效運(yùn)送進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮功能。
目前siRNA的非病毒載體主要為陽離子脂質(zhì)體和陽離子高分子，如聚乙烯亞胺 (PEI)和殼聚糖。盡管脂質(zhì)體易與細(xì)胞膜融合，但不穩(wěn)定且有較強(qiáng)細(xì)胞和體內(nèi)毒性；PEI質(zhì)子緩沖能力利于胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，但也有較強(qiáng)的細(xì)胞和體內(nèi)毒性。
殼聚糖(Chitosan, CS)是一種從奸皮、蟹殼中提取出來的天然高分子多糖，殼聚糖作為天然陽離子多糖，分子鏈上氨基質(zhì)子化后易黏附并跨越表面負(fù)電的疏水性細(xì)胞膜， 已被證明具有良好的生物相容性、生物可降解性和低/無毒性，因而CS是一種極具發(fā)展前景的基因載體材料。
文獻(xiàn)HOWARDKA, RAH BEK UL, L IU X，et al. RNA in terference in vi tro and in vivo using a ch itosan/s iRNA n anopart icle system[J]. MolTher, 2006, 14(4) :476-484.報(bào)導(dǎo)，Howard等制備了 siRNA殼聚糖納米粒，在體外通過熒光顯微鏡觀察到在Ih內(nèi)siRNA殼聚糖納米粒被小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH 3T3細(xì)胞攝取， 人肺癌細(xì)胞H 1299和鼠腹膜巨噬細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，4h后由納米粒介導(dǎo)的基因沉默所引起的綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)分別減少77. 9%和90%，而市售轉(zhuǎn)染劑TransIT2TK0作用24h 才能達(dá)到類似效果。原因可能是小粒徑(18(T330nm)和多余的正電荷有利于納米粒與細(xì)胞膜的相互作用。
鼻腔給藥試驗(yàn)表明，與錯(cuò)排siRNA的對(duì)照組和空白組相比，轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)支氣管上皮細(xì)胞EGFP表達(dá)分別降低37%和43%。
目前siRNA的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)研究很多，但是大部分都是基于靜脈注射給藥的傳遞系統(tǒng)，不適用于鼻咽部位給藥。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種小分子干擾核糖核酸殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)及制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，滿足臨床應(yīng)用的需要。
所述的小分子干擾核糖核酸殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，以殼聚糖為傳遞主體，以所述傳遞系統(tǒng)的總重量為基準(zhǔn)，含有O. 5^2. 0%的小分子干擾核糖核酸和10% 25%的多聚磷酸鈉；
優(yōu)選的，所述的小分子干擾核糖核酸殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，以殼聚糖為傳遞主體，含有I. O I. 5%的小分子干擾核糖核酸和12% 18%的多聚磷酸鈉；
優(yōu)選的，所述的小分子干擾核糖核酸殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，還包括載體，所述載體選自環(huán)糊精衍生物或海藻糖中的一種以上；其中環(huán)糊精衍生物具有促進(jìn)納米粒鼻粘膜吸收的作用，海藻糖具有凍干時(shí)保護(hù)納米粒作用；
所述納米粒凍干前后粒徑為6(T200nm，Zeta電勢(shì)10 70mV ；
優(yōu)選的，凍干前后粒徑為8(Tl50nm，Zeta電勢(shì)20 40mV。
所述載體與殼聚糖、小分子干擾核糖核酸和多聚磷酸鈉總重量之比為
載體總重量=20 100 : I ;
優(yōu)選的為
載體總重量=50 70 I ；
優(yōu)選的，所述載體為環(huán)糊精衍生物和海藻糖的混合物，重量比為
環(huán)糊精衍生物海藻糖=1 3. 5 I ；
所述小分子干擾核糖核酸為無靶向功能基因(陰性)的小分子干擾核糖核酸、靶向 Bcl-2基因、survivin基因或其他鼻咽癌相關(guān)基因的小分子干擾核糖核酸(由百奧邁科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成);
Bcl-2基因的相關(guān)信息，在p53，pl6，bcl-2, cox-2與鼻咽癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J] 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26 (10) 1849-1851.有詳細(xì)的報(bào)導(dǎo)，Bcl_2基因位于18號(hào)染色體上， 含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，為抗凋亡基因，編碼相對(duì)分子量為25X IOOOu的癌蛋白，其高表達(dá)能阻礙腫瘤細(xì)胞的凋亡，并可能和鼻咽癌的發(fā)生、演進(jìn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Bcl-2可在細(xì)胞周期的任一階段抑制細(xì)胞的凋亡，其生物學(xué)機(jī)制尚處于研究階段。Bcl-2基因可抑制多種細(xì)胞凋亡，在多種惡性腫瘤中均有表達(dá)，如肺癌、卵巢癌、鼻咽癌、子宮癌等。一些研究發(fā)現(xiàn)，bcl-2是一種廣義的抗凋亡基因，有抑制癌細(xì)胞凋亡，從而使癌細(xì)胞增殖和增殖細(xì)胞的存活，使細(xì)胞平衡失調(diào)導(dǎo)致各種腫瘤發(fā)生的作用。
所述survivin基因在申請(qǐng)?zhí)枮镃N201110079879. X的中國(guó)專利中有詳細(xì)的報(bào)導(dǎo)， Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白成員之一，具有強(qiáng)大的抗細(xì)胞凋亡作用，并在維持細(xì)胞有絲分裂及血管形成調(diào)控過程中起重要作用，是致癌過程的重要因素。
殼聚糖的黏均分子量為5 100萬，脫乙酰度為80%以上。
所述環(huán)糊精衍生物如羥丙基_ β _環(huán)糊精或任意甲基化_ β _環(huán)糊精等；
所述的小分子干擾核糖核酸的納米粒傳遞系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟
將siRNA的DEPC水溶液與多聚磷酸鈉的DEPC水溶液混合，滴加入ρΗ4 6殼聚糖的醋酸鈉緩沖液，速度為10 25滴/分鐘，然后靜置20 40min，收集siRNA的納米粒溶液，再與載體混合，濃縮至原體積的10 30%，-30 25°C程序凍干，獲得凍干物，即為所述的小分子干擾核糖核酸的納米粒傳遞系統(tǒng)，2 8°C保存，用前DEPC水復(fù)溶成所需濃度；凍干物與水的重量比例1:廣1:10 ;
所述DEPC水，為經(jīng)焦碳酸二乙酯除核酸酶處理的水，簡(jiǎn)稱DEPC水；
siRNA 的 DEPC 水溶液的濃度為 10 40 μ g/100 μ I ；
多聚磷酸鈉的DEPC水溶液的濃度為I 2mg/ml ；
殼聚糖的醋酸鈉緩沖液中，殼聚糖的濃度為I 2mg/ml ；
體積比為
siRNA的DEPC水溶液多聚磷酸鈉的EDPC水溶液殼聚糖的醋酸鈉緩沖液= I I 4 5 20 ;
本發(fā)明基于鼻咽部獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)和生理特點(diǎn)，研制了鼻腔局部治療鼻咽癌的 siRNA的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)。本發(fā)明能有效的將siRNA遞送進(jìn)入鼻咽癌組織，靶向性好，給藥劑量小，可避免siRNA注射給藥后，在到達(dá)鼻咽部之前的降解和其他組織的攝取。 CS納米?？捎行ПＷo(hù)siRNA不被鼻腔液破壞。本發(fā)明的siRNA傳遞系統(tǒng)，可在鼻咽癌細(xì)胞中有效抑制相關(guān)基因。


圖I為本發(fā)明例I的納米粒粒徑電位分布圖。
圖2為瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
圖3為本發(fā)明實(shí)施例3的納米粒對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。
圖4為本發(fā)明實(shí)施例4的納米粒對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的基因沉默效果(5#)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例中，如無特別說明，均為重量百分比。
實(shí)施例I
將40 μ g陰性siRNA用O. IgDEPC水溶解，獲得siRNA溶液；
取O. 035g siRNA溶液、O. 065g DEPC水和O. Ig重量濃度為O. 168%的多聚磷酸鈉 DEPC水溶液混合；
逐滴加入pH4的殼聚糖的醋酸鈉緩沖液O. 5g，其中殼聚糖的重量濃度為O. 2%，邊加邊渦旋混合，后靜置30min，即得siRNA — CS納米?；鞈乙?，殼聚糖的黏均分子量為100 萬；粒徑電位分布見圖I。
粒徑(nm) PDI (多分散系數(shù)) Zeta電勢(shì)(mV)
115.8O. 15127. 8
多分散系數(shù)的定義如下多分散系數(shù)(PDI)指納米粒的粒徑分散度，由儀器計(jì)算給出，PDI介于O到I, PDI值越小越好。
Zeta電勢(shì)(mV)是采用馬爾文激光粒度儀測(cè)得的，采用了激光多普勒測(cè)速法原理。
實(shí)施例2
I)將 40 μ g siRNA 用 O. IgEDPC 水溶解，取 O. 0375g siRNA 溶液、O. 0875g DEPC 水與多聚磷酸鈉TPP (O. 168%)的DEPC水溶液O. 125g混合，逐滴加入pH6的殼聚糖的醋酸鈉緩沖液O. 5g，其中，殼聚糖的重量濃度為O. 2%，殼聚糖的黏均分子量為10萬，即得siRNA — CS納米粒溶液；經(jīng)馬爾文激光粒度儀檢測(cè)納米粒粒徑為90nm，Zeta電勢(shì)為22mV。
2)在步驟I)的產(chǎn)物中，加入37. 5mg的輕丙基-β -環(huán)糊精和的37. 5mg海藻糖,超濾濃縮；
3)將2步驟得到的產(chǎn)物-30 25°C程序凍干，獲得陰性小分子干擾核糖核酸納米粒傳遞系統(tǒng)，2 8°C保存，用前DEPC水復(fù)溶；
采用DEPC水復(fù)溶納米粒，進(jìn)行鼻腔液穩(wěn)定性試驗(yàn)
大鼠戊巴比妥鈉麻醉后鼻腔用生理鹽水IOml灌流半小時(shí)，取灌流液O. 5ml，分別加入0.5ml 20 μ g/ml siRNA和實(shí)施例2凍干后復(fù)溶20 μ g/ml siRNA納米粒，37°C孵育，O、 30、2h、5h 取樣 O. 2ml, _20°C 存放。
上述樣品80°C加熱5min中止酶活性,5ul肝素加入50ul樣品后潤(rùn)旋離心,上清液 4%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察。
圖2為電泳結(jié)果，圖2中，從上至下依次為4種siRNA納米粒和裸siRNA鼻腔液孵育0min、2h的樣品。其中4號(hào)、9號(hào)樣為實(shí)施例2制備的納米粒。5號(hào)、10號(hào)為裸siRNA。
顯示siRNA納米粒隨鼻腔灌流液孵育時(shí)間延長(zhǎng)，siRNA條帶變淺。裸siRNA條帶較siRNA納米粒淺。
以上結(jié)果表明siRNA納米?？梢蕴岣遱iRNA在鼻腔液中的穩(wěn)定性。
實(shí)施例3
將40 μ g Cy3-siRNA 用 O. IgEDPC 水溶解，取 O. 035gCy3_siRNA 溶液、O. 065gEDPC 水與多聚磷酸鈉ΤΡΡ(0. 168%)的DEPC水溶液O. Ig混合，逐滴加入ρΗ5的殼聚糖的醋酸鈉緩沖液O. 5g，其中，殼聚糖的重量濃度為O. 2%，殼聚糖的黏均分子量為10萬，即得 Cy3-siRNA 一 CS納米粒溶液；經(jīng)馬爾文激光粒度儀檢測(cè)納米粒粒徑為llOnm，Zeta電勢(shì)為 28mV。
細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
所述Cy3_siRNA指的Cy3標(biāo)記的陰性siRNA。其中，Cy3為近年新開發(fā)的一種紅色熒光探針，它比絕大部分其它的紅色熒光探針更加明亮，更加不容易淬滅，而且背景更低。
熒光標(biāo)記的siRNA是檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率、優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法最常用的一種方法。熒光標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可以直接使用用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，確定是否有效轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率的高低。熒光標(biāo)記的siRNA還可用作追蹤 siRNA在胞內(nèi)的定位及分布的情況。
CNE細(xì)胞加入24孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)基1640+10%FBS，分別加入Cy3_siRNA納米粒溶液使終濃度依次為10nM、20nM、50nM和IOOnM ；
CNE細(xì)胞指的是人鼻咽癌細(xì)胞，CNE細(xì)胞在《山東醫(yī)藥》2011年51期，PABA/NO抗咽癌細(xì)胞株CNE細(xì)胞增殖和遷移的作用中對(duì)此有詳細(xì)的報(bào)導(dǎo)；
陽性對(duì)照采用Lipofecatamine 2000 介導(dǎo)的 Cy3_siRNA (siRNA 濃度為 IOOnM)；
陰性對(duì)照采用裸Cy3_siRNA水溶液直接孵育(siRNA濃度為ΙΟΟηΜ)。
每個(gè)實(shí)驗(yàn)3個(gè)復(fù)孔。加入各種Cy3_siRNA制劑后孵育12 24小時(shí)，PBS洗滌細(xì)胞5 次，多聚甲醛固定，Hoechst染色lOmin，PBS洗滌細(xì)胞，熒光顯微鏡拍照。轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖3， Cy3-siRNA納米粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果優(yōu)于同濃度陽性對(duì)照。
實(shí)施例4
I)將 40 μ g BC12-siRNA 用 O. IgEDPC 水溶解，取 O. 0375g BC12_siRNA 溶液、O.087gDEPC水與多聚磷酸鈉TPP (O. 168%)的DEPC水溶液O. 125g混合，逐滴加入pH5的殼聚糖的醋酸鈉緩沖液O. 5g，殼聚糖的黏均分子量為5萬，殼聚糖的重量濃度為O. 2%，即得 siRNA - CS納米粒溶液；經(jīng)馬爾文激光粒度儀檢測(cè)納米粒粒徑為135nm，Zeta電勢(shì)為35mV。
2)在步驟I)的產(chǎn)物中，加入60mg任意甲基化-β-環(huán)糊精和18.75mg海藻糖，超濾濃縮；
3)將2步驟得到的混合物-30 25°C程序凍干，2°C保存，用前DEPC水復(fù)溶；細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
CNE細(xì)胞加入24孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)基1640+10%FBS，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞匯合度為30% 50%。將上述納米粒凍干粉復(fù)溶后和其他5種納米制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，BC12-siRNA終濃度均為 50nM ；
陽性對(duì)照為L(zhǎng)ipofecatamine 2000 轉(zhuǎn)染 BC12_siRNA (BC12_siRNA 濃度為 50nM)；
陰性對(duì)照為裸BC12_siRNA水劑直接孵育。72小時(shí)后，收集細(xì)胞，RISO提取細(xì)胞總 RNA。qRT-PCR定量分析。
-檢測(cè)BCl2 和 GAPDH 基因
-引物
Hs-BCL2-F’ :GGTCATGTGTGTGGAGAGC
Hs-BCL2-R’ :GATCCAGGTGTGCAGGTG
Hs-GD-F’ : GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
Hs-GD-RJ : GAAGATGGTGATGGGATTTC
-以GAPDH做均一化，采用2_ Λ Λ Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)率。
轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖4中5 #制劑，BC12基因沉默效果優(yōu)于陽性對(duì)照(PC)。
權(quán)利要求
1.小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，其特征在于，以殼聚糖為傳遞主體， 以所述傳遞系統(tǒng)的總重量為基準(zhǔn)，含有O. 5^2. 0%的小分子干擾核糖核酸和10% 25%的多聚磷酸鈉，所述納米粒凍干前后粒徑為60 200nm, Zeta電勢(shì)10 70mV。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，其特征在于，含有I. O I. 5%的小分子干擾核糖核酸和12% 18%的多聚磷酸鈉，凍干前后粒徑為 80 150nm，Zeta 電勢(shì) 20 40mV。
3.小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，其特征在于，以殼聚糖為傳遞主體， 以所述傳遞系統(tǒng)的總重量為基準(zhǔn)，含有O. 5^2. 0%的小分子干擾核糖核酸和10% 25%的多聚磷酸鈉以及載體，所述載體選自環(huán)糊精衍生物或海藻糖中的一種以上，所述載體與殼聚糖、小分子干擾核糖核酸和多聚磷酸鈉總重量之比為載體總重量=20 100 : I ；所述納米粒凍干前后粒徑為6(T200nm，Zeta電勢(shì)10 70mV。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，其特征在于，含有I. O I. 5%的小分子干擾核糖核酸和12% 18%的多聚磷酸鈉以及載體，所述載體選自環(huán)糊精衍生物或海藻糖中的一種以上，所述載體與殼聚糖、小分子干擾核糖核酸和多聚磷酸鈉總重量之比為載體總重量=50 70 : I ;凍干前后粒徑為8(Tl50nm, Zeta 電勢(shì)20 40mVo
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，其特征在于，所述載體為環(huán)糊精衍生物和海藻糖的混合物，重量比為環(huán)糊精衍生物海藻糖=1 3.5 1，殼聚糖的黏均分子量為5 100萬，脫乙酰度為80%以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，其特征在于，所述載體為環(huán)糊精衍生物和海藻糖的混合物，重量比為環(huán)糊精衍生物海藻糖=1 3.5 1，殼聚糖的黏均分子量為5 100萬，脫乙酰度為80%以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求I 6任一項(xiàng)所述的小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，其特征在于，所述小分子干擾核糖核酸為無靶向功能基因的小分子干擾核糖核酸、靶向 Bcl-2基因、survivin基因或其他鼻咽癌相關(guān)基因的小分子干擾核糖核酸。
8.權(quán)利要求I 7任一項(xiàng)所述的小分子干擾核糖核酸的納米粒傳遞系統(tǒng)的制備方法， 其特征在于，包括如下步驟將siRNA的DEPC水溶液與多聚磷酸鈉的DEPC水溶液混合，滴加入pH4 6殼聚糖的醋酸鈉緩沖液，速度為10 25滴/分鐘，然后靜置20 40min，收集siRNA的納米粒溶液，再與載體混合，濃縮至原體積的10 30%，-30 25°C程序凍干，獲得凍干物，即為所述的小分子干擾核糖核酸的納米粒傳遞系統(tǒng)，2 8°C保存，用前DEPC水復(fù)溶成所需濃度；凍干物與水的重量比例1:廣1:10 ;所述DEPC水，為經(jīng)焦碳酸二乙酯除核酸酶處理的水，簡(jiǎn)稱DEPC水；siRNA的DEPC水溶液的濃度為10 40 μ g/100 μ I ；多聚磷酸鈉的DEPC水溶液的濃度為I 2mg/ml ；殼聚糖的醋酸鈉緩沖液中，殼聚糖的濃度為I 2mg/ml ；體積比為siRNA的DEPC水溶液多聚磷酸鈉的EDPC水溶液殼聚糖的醋酸鈉緩沖液=I I . 4 5 20。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)及制備方法，小分子干擾核糖核酸的殼聚糖納米粒傳遞系統(tǒng)，以殼聚糖為傳遞主體，以所述傳遞系統(tǒng)的總重量為基準(zhǔn)，含有0.5~2.0%的小分子干擾核糖核酸和10%～25%的多聚磷酸鈉，所述納米粒凍干前后粒徑為60~200nm，Zeta電勢(shì)10～70mV。本發(fā)明能有效的將siRNA遞送進(jìn)入鼻咽癌組織，靶向性好，給藥劑量小，可避免siRNA注射給藥后，在到達(dá)鼻咽部之前的降解和其他組織的攝取。CS納米?？捎行ПＷo(hù)siRNA不被鼻腔液破壞。本發(fā)明的siRNA傳遞系統(tǒng)，可在鼻咽癌細(xì)胞中有效抑制相關(guān)基因。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102908315SQ20121043486
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月2日
發(fā)明者吳聞?wù)? 侯惠民, 姚孝林, 謝佳雯, 徐曉寒 申請(qǐng)人:上?，F(xiàn)代藥物制劑工程研究中心有限公司