專利名稱：一種新型枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物學(xué)、免疫學(xué)和水產(chǎn)動(dòng)物病害防治領(lǐng)域，特別是涉及到一種用于防治魚類因弧菌、愛(ài)德華氏菌、鏈球菌和嗜水氣單胞菌引發(fā)病害的新型枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)成為世界上發(fā)展最快的動(dòng)物源性食品生產(chǎn)業(yè)之一。據(jù)世界糧農(nóng)組織(FAO) 2010年統(tǒng)計(jì)資料顯示自2000年以來(lái)，漁品的增長(zhǎng)主要來(lái)自于水產(chǎn)養(yǎng)殖。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；?、集約化和工業(yè)化的發(fā)展，展示在我們面前的將是一個(gè)以魚類養(yǎng)殖為發(fā)展
重點(diǎn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。然而，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，接踵而至的是各種病害的爆發(fā)。世界各國(guó)的生產(chǎn)實(shí)踐表明，病害爆發(fā)和蔓延已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)獲取更大發(fā)展的一個(gè)重要制約因素，各種重大傳染性疫病的風(fēng)險(xiǎn)始終是水產(chǎn)養(yǎng)殖漁業(yè)中最為重大的風(fēng)險(xiǎn)之一。我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖平均死亡損失率在30%以上，每年的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億元。病害問(wèn)題業(yè)已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵性制約因素之一。針對(duì)各種病害的發(fā)生，一個(gè)全球性關(guān)注的挑戰(zhàn)已經(jīng)凸現(xiàn)隨著抗生素抗藥病原的大量出現(xiàn)和蔓延而導(dǎo)致大量藥物防治效力的逐漸喪失、化學(xué)藥物等導(dǎo)致的環(huán)境污染以及水產(chǎn)品的藥物殘留等負(fù)面影響日趨嚴(yán)重，我們已步入一個(gè)后抗生素時(shí)代，水產(chǎn)品安全已成為備受關(guān)注的全球性問(wèn)題。 預(yù)防性治療可以防止或大幅減少易感病害的發(fā)生發(fā)展，利用生物技術(shù)開(kāi)發(fā)的各種疫苗使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有更多機(jī)會(huì)面對(duì)挑戰(zhàn)，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)的健康發(fā)展起到關(guān)鍵性支撐作用。為遏制各種環(huán)境因素和養(yǎng)殖密度激增等造成的水產(chǎn)養(yǎng)殖病害日益嚴(yán)重的趨勢(shì)，推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，接種疫苗已成為世界范圍內(nèi)現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)的生產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)范。我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)魚類品種繁多，主要為以羅非魚、草魚、鯰魚為代表的大宗淡水魚類和以鲆鰈魚類、鱸魚、大黃魚和石斑魚為代表的海水魚類。在過(guò)去的十多年中，世界范圍內(nèi)主要爆發(fā)的是弧菌病(Vibriosis,鰻弧菌Vibrio anguillarum、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、哈氏弧菌Vibrio harveyi等為重要病原)、愛(ài)德華氏菌病(Edwardsiel Iosis,其中遲純愛(ài)德華氏菌Edwardsiella tarda和魚愛(ài)德華氏菌Edwardsiella ictaluri為重要病原)、鏈球菌病(Streptococcicosis,海豚鏈球菌Streptococcus iniae和無(wú)乳鏈球菌Streptococcus agalactiae為重要病原)和氣單胞菌病(Haemorrhagic septicaemia and ulcer,嗜水氣單胞菌 Aeromonas hydrophila 為重要病原)等重大細(xì)菌性病害，嚴(yán)重制約了我國(guó)的魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)的健康可持續(xù)發(fā)展，使我國(guó)魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)蒙受巨大損失。針對(duì)上述重要魚類病害，目前主要采取以各種抗生素為代表的化學(xué)療法。我國(guó)除草魚出血病病毒疫苗外，尚未有任何商品化細(xì)菌性魚類疫苗問(wèn)世。在生產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中，由于各種病害病原可在養(yǎng)殖水體中同時(shí)傳播，養(yǎng)殖魚類面對(duì)的將是一個(gè)多病原共同侵襲的挑戰(zhàn)，因此只針對(duì)單一病原病害的單效價(jià)疫苗在生產(chǎn)中很難達(dá)到較好的實(shí)際防治應(yīng)用效果。開(kāi)發(fā)可同時(shí)預(yù)防多種重要病原的多價(jià)疫苗始終是水產(chǎn)疫苗的重要方向，有著巨大而現(xiàn)實(shí)的市場(chǎng)迫切需求。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)弧菌(Vibrio spp.)、鏈球菌(Streptococcus spp.)、愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella spp.)和氣單胞菌(Aeromonasspp.)的單效價(jià)疫苗或多聯(lián)疫苗已有不少文獻(xiàn)報(bào)道，但可同時(shí)針對(duì)上述四種重要細(xì)菌性病原而設(shè)計(jì)研發(fā)的多價(jià)疫苗還未有文獻(xiàn)報(bào)道。在水產(chǎn)疫苗的開(kāi)發(fā)中，疫苗接種給藥方式往往是制約其商業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵制約因素。魚類疫苗在生產(chǎn)應(yīng)用中主要有三種接種給藥方式注射、浸泡和口服。注射接種是目前已開(kāi)發(fā)的水產(chǎn)疫苗中所有接種方式中免疫效果最好，保護(hù)期也最長(zhǎng)，但由于其接種操作需要大量人力和特殊設(shè)備設(shè)施，耗時(shí)較長(zhǎng)，因此給藥成本最高，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)往往難以承受其給藥成本。同時(shí),注射接種往往給魚造成較高的應(yīng)激刺激,所以副作用和操作損失往往也較高。并且，這種接種方式很難應(yīng)用到魚苗期和幼魚期(一般大于20g以上)，在實(shí)際生產(chǎn)養(yǎng)殖 中其應(yīng)用范圍受到很大限制。浸泡接種是將魚放入一定濃度的疫苗稀釋液中一段時(shí)間進(jìn)行疫苗接種的方式，浸泡免疫的一個(gè)最大優(yōu)點(diǎn)是可為魚苗(體重I飛克)接種疫苗。其在生產(chǎn)應(yīng)用也較易為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)接受?？诜饕峭ㄟ^(guò)將疫苗和飼料結(jié)合通過(guò)飼喂方式進(jìn)行疫苗接種，這種接種方式在生產(chǎn)應(yīng)用中最方便也最溫和，不會(huì)給魚類造成應(yīng)激反應(yīng)。如果免疫效力得到保證，這是水產(chǎn)疫苗最為理想的疫苗產(chǎn)品應(yīng)用形式。但從國(guó)內(nèi)外的研制開(kāi)發(fā)和實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，該類型的疫苗由于無(wú)法避免魚類動(dòng)物腸道的消化破壞的影響，往往保護(hù)期很短、免疫效力低下，難以獲得理想的免疫效果。鑒于關(guān)鍵應(yīng)用技術(shù)尚未有突破，目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上尚未有具有良好免疫效果的口服水產(chǎn)疫苗產(chǎn)品問(wèn)世。綜上所述，針對(duì)養(yǎng)殖魚類主要重大病害，開(kāi)發(fā)具有多種病害防治效力的經(jīng)濟(jì)、高效、使用便利的多效價(jià)口服疫苗是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迫切需求。針對(duì)多價(jià)口服疫苗的產(chǎn)品特性要求，其需解決的關(guān)鍵技術(shù)在于如下兩點(diǎn)1)篩選一種或多種針對(duì)魚類主要病害病原的保護(hù)性廣譜抗原；2)篩選并選取一種能夠穩(wěn)定定植存活于魚類動(dòng)物腸道的載體菌株，其可耐受腸道的低PH環(huán)境和各種消化蛋白酶的破壞，能夠?qū)⒈Ｗo(hù)性廣譜抗原有效呈遞到魚類動(dòng)物的相關(guān)免疫系統(tǒng)中以激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答反應(yīng)。同時(shí)，該載體菌株可耐受飼料制備工藝中各種加工環(huán)節(jié)的考驗(yàn)，可方便地制備成飼料劑型產(chǎn)品，以實(shí)現(xiàn)口服接種的產(chǎn)品特性。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為一個(gè)看家基因廣泛存在于幾乎所有的生物體中。GAPDH是一個(gè)傳統(tǒng)糖酵解蛋白，然而近年來(lái)的研究表明GAPDH在不同的亞細(xì)胞部位顯示出和糖酵解無(wú)關(guān)的多種活性功能(3化(^6，14.，1997，了 Cell Biochem,66 (2):133-40;Sirove,M. A. , 1999,Biochim Biophys Acta，1432(2):159_184)。在許多微生物(酵母，細(xì)菌和致病性寄生蟲)的細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)有GAPDH存在，其中GAPDH做為外膜蛋白的潛在免疫保護(hù)性受到廣泛的關(guān)注。GAPDH的免疫原性首次發(fā)現(xiàn)于白色念珠菌(Gil-Navarro et al.，1997，J Bacteriol，179 :4992-4999)。目前在布魯氏菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌中已經(jīng)證實(shí)，GAPDH能夠激發(fā)宿主的保護(hù)性免疫反應(yīng)(Kawai K. et al,2004, Vaceine, 22 :3411-3418 ；RosinnhaG. M. et al. ,2002, J Med Mierobiol,51 (8) :661_671)。同時(shí)許多致病菌的 GAPDH 的相似性非常高，X. Li等已證實(shí)GAPDH是重要的廣譜性保護(hù)抗原，在不同的病原菌間具有顯著的交叉免疫力(X. Li et al. , 2012, Letters in Applied Microbiology, 54 (I): 1-9)。因此，GAPDH具有開(kāi)發(fā)成為一種針對(duì)多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物重要病原的候選廣譜抗原的潛力。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種好氧性的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,對(duì)人畜無(wú)害，常被作為動(dòng)物的益生菌廣泛應(yīng)用于陸地和水生動(dòng)物的養(yǎng)殖生產(chǎn)中，是國(guó)際上公認(rèn)的具有良好生物安全性的宿主菌株。同時(shí)，其具有顯著的胞外分泌功能，經(jīng)基因工程改造后可向胞外大量分泌表達(dá)特定生物活性物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵?？莶菅挎邨U菌還具有在營(yíng)養(yǎng)缺乏或其他脅迫條件下形成抗逆性休眠體芽孢的特點(diǎn)，芽胞具有極佳的的抗逆性，不僅能耐受100°C的高溫，還可耐受較低的酸性環(huán)境。因此，以枯草芽孢桿菌作為口服疫苗載體，以芽孢形式添加到飼料中，既可耐受飼料高溫加工過(guò)程的破壞和魚類胃液中的酸性環(huán)境，又可順利穿過(guò)胃腸屏障，通過(guò)向胞外大量分泌表達(dá)外源抗原激發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，達(dá)到較好的免疫效果。由于枯草芽孢桿菌這種顯著的的胞外分泌功能和芽孢獨(dú)特的抗逆性和免疫學(xué)特性以及生物安全性，使其成為極具商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值的口服疫苗載體?？莶菅挎邨U菌芽孢表面展示技術(shù)，通過(guò)芽孢表面展示蛋白與目標(biāo)蛋白相融合，將目標(biāo)蛋白展示在芽孢表面，可用于研制新型口服重組蛋白疫苗，近年來(lái)已成為國(guó)內(nèi)外科學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。Medaglini D等利用衣孢蛋白作為芽孢表面展示外源抗原的融合載體蛋白， 成功地在枯草芽孢桿菌芽孢表面展示了破傷風(fēng)毒素(TTFC)C末端的459氨基酸片段。試驗(yàn)結(jié)果證明TTFC抗原展示于芽孢表面，每個(gè)芽孢表面約有I. 15X IO3個(gè)TTFC蛋白分子，可被特異性抗體識(shí)別，并且TTFC的出現(xiàn)并未影響芽孢孢衣的結(jié)構(gòu)和功能(Medaglini D，2001，Vaccine, 19 :1931_9)。D. ning等將VP28展示在枯草芽孢桿菌表面，制備的對(duì)蝦口服疫苗對(duì)對(duì)蟲下白斑綜合癥病毒有一定的預(yù)防作用(D. ning et al. , 2011, J Appl Microbiol, 111
(6):1327-36),這些研究表明了枯草芽孢桿菌芽孢表面展示技術(shù)可有效用于口服疫苗的研究和開(kāi)發(fā)。穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPP)是具有細(xì)胞膜穿透能力的一小段堿性氨基酸多肽，如HIV-I TAT、HSP-VP22和Antennapedia (ANTP)等，能有效運(yùn)輸各物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞及細(xì)胞核的系統(tǒng)，也稱作蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Lindgren M et al., 2000, TrendsPharmacol Sci, 21 (3):99_103)。通過(guò)穿膜肽攜帶的物質(zhì)有蛋白質(zhì)、DNA、化學(xué)藥物、寡核苷酸等?，F(xiàn)在研究最多的、應(yīng)用范圍最廣的穿膜肽來(lái)源于人免疫缺陷病毒I型的轉(zhuǎn)錄激活因子(trans-activating transcriptional activator, TAT) Tat 蛋白，此多妝蛋白中部序列具有富含陽(yáng)離子區(qū)域，能夠攜帶外源分子轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)穿膜肽的轉(zhuǎn)導(dǎo)不依賴于能量、胞吞作用、受體及離子通道等作用，可直接穿越脂質(zhì)雙分子層完成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并且能攜帶其它DNA、多肽及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。由于穿膜肽的這一特殊功能，被廣泛應(yīng)用于藥物的研究(L. Crombez et al, 2009, Mol. Ther. ,17, pp. 95-103 ；S. C. Pero et al,2007, Br. J. Cancer, 96，pp. 1520-1525)和疫苗的開(kāi)發(fā)(Zhang Y et al，2012，Journalof virological methods,181 (1):59_67)。以枯草芽孢桿菌作為口服疫苗載體，經(jīng)基因工程改造后向胞外大量分泌表達(dá)穿膜肽和抗原蛋白融合形成的融合蛋白，利用穿膜肽具有將抗原蛋白跨膜攜帶進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的特點(diǎn)，使抗原蛋白直接進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)激發(fā)免疫反應(yīng)，達(dá)到體內(nèi)注射相似的效果，同時(shí)利用芽孢表面展示技術(shù)在枯草芽孢桿菌芽孢表面展示另一種病原菌抗原蛋白，達(dá)到交叉免疫保護(hù)的功效。該策略開(kāi)發(fā)的口服疫苗巧妙的將枯草芽孢桿菌顯著的胞外分泌特點(diǎn)、穿膜肽良好的穿膜特性、芽孢對(duì)高溫和酸性條件下優(yōu)異的耐受性以及芽孢表面展示技術(shù)作為疫苗開(kāi)發(fā)的優(yōu)越性高度集成在一起，開(kāi)發(fā)出一種具有安全性好、保護(hù)效率高、同時(shí)對(duì)抗多種病原的多價(jià)高效口服疫苗。以此策略進(jìn)行魚類疫苗的研究及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)在國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道，本發(fā)明為首次提出。本發(fā)明利用一種枯草芽孢桿菌重組菌株作為核心組成制備成一種新型的口服劑型多價(jià)載體疫苗，該枯草芽孢桿菌芽孢表面展示有以魚類重要病原無(wú)乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為模板的廣譜抗原蛋白，同時(shí)在其染色體上整合有穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)融合基因，使該菌株能持續(xù)向胞外分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗原蛋白的融合蛋白。該多價(jià)載體疫苗可通過(guò)口服給藥方式接種，能有效預(yù)防養(yǎng)殖魚類鏈球菌病、弧菌病、愛(ài)德華氏菌病和嗜水氣單胞菌病等重要細(xì)菌性病害。

發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗及其應(yīng)用，該疫苗是以枯草芽孢桿菌重組菌株作為核心制備而成的一種新型的口服劑型多價(jià)載體疫苗，通過(guò)誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌重組菌株可產(chǎn)生表面展示無(wú)乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)蛋白的芽孢，當(dāng)芽孢萌發(fā)形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞時(shí)可以分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)形成的融合蛋白。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案一種新型枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗，其特征在于所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢桿菌重組菌株，該菌株的分類命名是枯草芽孢桿菌HT5302 (Bacillus subtilis HT5302)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為 CCTCCNo M 2012380。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述枯草芽孢桿菌重組菌株在形成芽孢后能夠在芽孢表面展示無(wú)乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)蛋白。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上重組整合有以枯草芽孢桿菌衣殼蛋白基因cotB為分子載體并與無(wú)乳鏈球菌基因相融合的融合基因片段(SEQ ID NO: I)，所述融合基因片段重組整合在枯草芽孢桿菌重組菌株染色體上的amyE基因位點(diǎn)，通過(guò)誘導(dǎo)該枯草芽孢桿菌重組菌株可產(chǎn)生表面展示無(wú)乳鏈球菌3_磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)蛋白的芽孢。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述枯草芽孢桿菌重組菌株在形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞時(shí)能夠分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)形成的融合蛋白。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上還重組整合有由枯草芽孢桿菌分泌信號(hào)肽基因、穿膜肽tat基因和鰻弧菌甘油醛脫氫酶#3/70 基因相融合所獲得的sacB-tat~gapdh融合基因序列(SEQ ID NO: 2),該sacB-tat~gapdh融合基因序列克隆至枯草芽孢桿菌P43啟動(dòng)子下游并利用同源交換整合至枯草芽孢桿菌染色體的IacA基因位點(diǎn)，該枯草芽孢桿菌重組菌株在形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞時(shí)能夠胞外分泌表達(dá)穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)融合蛋白。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上還重組有抗生素壯觀霉素篩選標(biāo)記基因，所述壯觀霉素抗性基因重組整合在枯草芽孢桿菌重組菌株染色體上的必基因位點(diǎn)。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上還重組有抗生素紅霉素篩選標(biāo)記基因，所述紅霉素篩選標(biāo)記基因重組整合在枯草芽孢桿菌重組菌株染色體上的IacA基因位點(diǎn)。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌重組菌株構(gòu)建方法為
采用枯草芽孢桿菌芽孢表面展示技術(shù)，利用枯草芽孢桿菌孢衣蛋白基因mii 為分子載體，與無(wú)乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶基因濟(jì)識(shí)過(guò)融合，利用同源交換原理整合至枯草芽孢桿菌染色體政基因位點(diǎn)；然后以該枯草芽孢桿菌為出發(fā)載體菌株，進(jìn)一步從鰻弧菌中克隆基因并與枯草芽孢桿菌分泌信號(hào)肽基因和穿膜肽基因tat融合，獲得sacB-tat-gapdh融合基因，將融合基因克隆至枯草芽孢桿菌p43啟動(dòng)子下游并利用同源交換整合至上述枯草芽孢桿菌染色體基因位點(diǎn)。通過(guò)上述方法獲得的重組菌株即為枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗。本發(fā)明還提供了所述枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗在魚類養(yǎng)殖中防治因鏈球菌、弧·菌、愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌等引發(fā)的重要細(xì)菌性病害的應(yīng)用。作為所述應(yīng)用的進(jìn)一步改進(jìn)，所述枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗是以枯草芽孢桿菌芽孢形式添加到魚飼料及飼料添加劑中，以口服方式免疫。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的枯草芽孢桿菌疫苗株，形成芽孢后能夠在芽孢表面展示無(wú)乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH蛋白，在形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞時(shí)能夠分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶構(gòu)成的融合蛋白。本發(fā)明利用芽孢所具有的獨(dú)特抗逆性，將該枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗以芽孢形式添加到魚飼料中口服免疫，芽孢能攜帶無(wú)乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH蛋白順利通過(guò)魚的消化道屏障，激發(fā)魚的免疫反應(yīng)，同時(shí)芽孢在魚腸道定植萌發(fā)形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞能夠大量分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶構(gòu)成的融合蛋白，穿膜肽攜帶GAPDH透過(guò)胃腸道細(xì)胞的磷脂雙分子層進(jìn)入細(xì)胞，激活魚的免疫反應(yīng)。本發(fā)明構(gòu)建的枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗，相對(duì)于其它疫苗具有交叉保護(hù)、穿透魚消化道屏障并能夠及時(shí)將抗原傳遞到宿主細(xì)胞內(nèi)部的效果，并且該疫苗能夠添加到飼料中，耐受飼料的高溫定型，具有廣闊的商業(yè)開(kāi)發(fā)景。生物材料保藏
一種新型枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗，該菌株的分類命名是枯草芽孢桿菌HT5302(Bacillus subtilis HT5302)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏日期為2012年9月25日，保藏號(hào)為CCTCCNo M 2012380。


圖I是以大菱鲆為實(shí)驗(yàn)用魚的各實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)死亡率統(tǒng)計(jì)曲線圖。圖2是以羅非魚為實(shí)驗(yàn)用魚的各實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)死亡率統(tǒng)計(jì)曲線圖。圖3是以石斑魚為實(shí)驗(yàn)用魚的各實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)死亡率統(tǒng)計(jì)曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。實(shí)施例I :枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗的制備
I、培養(yǎng)基配制(I)DSM 液體培養(yǎng)基細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯(Difco) 8g，10% (w/v) KCl 10ml, I. 2% (w/v)MgSO4 ·7Η20 10ml, IM NaOH I. 5ml，調(diào) pH 至 7. 6，ddH20 定容至 1000ml。高壓滅菌后，冷卻至50°C，在使用前分別加入已滅菌的IM Ca (NO3)2、O. OIMMnCl2、ImMFeSO4各lml。(2) PBS 緩沖液=Na2HPO4 · 2H20 2. 74g/L，NaH2PO4 · H2O O. 63g/L，將所述成份溶解于IOOOml蒸餾水，于121°C滅菌20分鐘。(3)LB 培養(yǎng)基胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 10g/L，調(diào) pH 至 7. O。2、平板培養(yǎng)基復(fù)蘇取_80°C保存的保藏號(hào)為CCTCCNo M 2012380的枯草芽孢桿菌重組菌株種子劃線接種于LB固體平板上，在37°C培養(yǎng)過(guò)夜，使枯草芽孢桿菌重組菌株復(fù)壯，形成單菌落。3、種子的制備挑取單菌落接種于100ml DSM液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)18h，0D600 至2. O,作為種子液。4、發(fā)酵液的制備制備的種子液按照1%的接種量接種到5L生物反應(yīng)器中，采用DSM液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度37°C，通氣量2L/分鐘，pH7. 5，培養(yǎng)25_30h，至芽孢形成率90%以上，終止發(fā)酵，得發(fā)酵液。5、枯草芽孢桿菌芽孢菌粉的制備將上述發(fā)酵液于室溫以5000g離心10分鐘，收集菌泥，向菌泥中加入15%重量百分比的淀粉，噴霧干燥，得到水分重量百分含量〈5%的枯草芽孢桿菌芽孢菌粉，該枯草芽孢桿菌芽孢菌粉即為所述的枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗。6、疫苗飼料的制備將上述的枯草芽孢桿菌芽孢菌粉與魚飼料原料混合制粒，包被大約I X IO10個(gè)芽孢/ g飼料，飼料經(jīng)微粉碎后過(guò)40目篩，混合均勻后用小型顆粒飼料機(jī)加工成直徑I. 5mm的顆粒飼料備用，飼料加工過(guò)程中溫度65-70°C持續(xù)時(shí)間約lOmin。
實(shí)施例2 :以大菱鲆為實(shí)驗(yàn)用魚的口服免疫效力評(píng)價(jià)試驗(yàn)。病原菌懸浮液的制備在TSB (2% NaCl)液體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌至0D600為O. 6，在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)嗜水氣單胞菌至0D600為O. 6，然后于室溫以5000rpm離心10分鐘，收集沉淀菌體，用PBS緩沖液懸浮至終濃度為I X 107cfu/ml。實(shí)驗(yàn)用魚的飼養(yǎng)從山東購(gòu)置的試驗(yàn)用魚(大菱鲆)暫養(yǎng)于200L水族箱，配以流動(dòng)循環(huán)水處理和凈化系統(tǒng)，養(yǎng)殖水溫維持18±2°C，暫養(yǎng)I周后，剔除不健康個(gè)體。選擇體長(zhǎng)為12-15cm的健康大菱鲆隨機(jī)分組至20L試驗(yàn)水族箱，每個(gè)水族箱30尾，實(shí)驗(yàn)水族箱每天換水兩次，換水量為1/3，維持水溫18±2°C，繼續(xù)暫養(yǎng)2周。免疫效力評(píng)價(jià)上述已分組水族箱分別設(shè)置口服對(duì)照組A、免疫對(duì)照組A、免疫組A、口服對(duì)照組B、免疫對(duì)照組B、免疫組B、口服對(duì)照組C、免疫對(duì)照組C、免疫組C和空白對(duì)照組，口服對(duì)照組A、口服對(duì)照組B和口服對(duì)照組C飼喂基礎(chǔ)飼料，免疫對(duì)照組A、免疫對(duì)照組B和免疫對(duì)照組C飼喂普通枯草芽孢桿菌混拌的基礎(chǔ)飼料，免疫組A、免疫組B和免疫組C飼喂實(shí)施例I制備的疫苗飼料，空白對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料，每組設(shè)置2個(gè)平行。將上述各組大菱鲆連續(xù)飼喂免疫3天，每條魚每天免疫Ig飼料，免疫3天后各組停止免疫，均改喂普通基礎(chǔ)飼料，停止免疫28天后，對(duì)除空白對(duì)照組外的各組大菱鲆分別攻毒，其中口服對(duì)照組A、免疫對(duì)照組A和免疫組A分別腹腔注射遲鈍愛(ài)德華氏菌病原菌懸浮液，口服對(duì)照組B、免疫對(duì)照組B和免疫組B分別腹腔注射鰻弧菌病原菌懸浮液，口服對(duì)照組C、免疫對(duì)照組C和免疫組C分別腹腔注射嗜水氣單胞菌病原菌懸浮液，每條魚的注射劑量為100 μ I。在以后的14天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況，14天后，各組的累計(jì)死亡率穩(wěn)定，統(tǒng)計(jì)各組魚的累計(jì)死亡率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖I所示。利用下列公式計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率
相對(duì)免疫保護(hù)率(RPS)% =(穩(wěn)定后的口服對(duì)照組的累計(jì)死亡率-穩(wěn)定后的免疫組的累計(jì)死亡率)/穩(wěn)定后的口服對(duì)照組的累計(jì)死亡率X 100%。經(jīng)計(jì)算，實(shí)施例I制備的枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗對(duì)鰻弧菌的免疫保護(hù)率達(dá)到93. 4%，對(duì)遲鈍愛(ài)德華式菌的免疫保護(hù)率達(dá)到79. 3%，對(duì)嗜水氣單胞菌的免疫保護(hù)率達(dá)到70%，由此可見(jiàn)，該疫苗對(duì)鰻弧菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌毒株感染都具有很好的防治效果，能有效地保護(hù)大菱鲆抵御鰻弧菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌的侵染，呈現(xiàn)出顯著的交叉免疫力。實(shí)施例3 以羅非魚為實(shí)驗(yàn)用魚的口服免疫效力評(píng)價(jià)試驗(yàn)
病原菌懸浮液的制備在腦心浸出液肉湯(BHI)培養(yǎng)基(胰蛋白質(zhì)胨10. Og/L，氯化鈉5. Og/L，磷酸氫二鈉2. 5g/L，葡萄糖2. Og/L，牛心浸出液500mL/L，pH7. 4)中分別培養(yǎng)無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌至0D600為O. 6，在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)嗜水氣單胞菌至0D600為O. 6，然后于室溫以5000rpm離心10分鐘，收集沉淀菌體，用PBS緩沖液懸浮至終濃度為I X IO7Cfu/ml ο實(shí)驗(yàn)用魚的飼養(yǎng)從山東購(gòu)置的試驗(yàn)用魚(羅非魚)暫養(yǎng)于200L水族箱，配以流動(dòng)循環(huán)淡水處理和凈化系統(tǒng)，養(yǎng)殖水溫維持24±2°C，暫養(yǎng)I周后，剔除不健康個(gè)體。選擇體長(zhǎng)為12-15cm的健康羅非魚隨機(jī)分組至20L試驗(yàn)水族箱，每個(gè)水族箱30尾，實(shí)驗(yàn)水族箱每天換水兩次，換水量為1/3，維持水溫24±2°C，繼續(xù)暫養(yǎng)2周。免疫效力評(píng)價(jià)上述已分組水族箱分別設(shè)置口服對(duì)照組A、免疫對(duì)照組A、免疫組A、口服對(duì)照組B、免疫對(duì)照組B、免疫組B、口服對(duì)照組C、免疫對(duì)照組C、免疫組C和空白對(duì)照組，口服對(duì)照組A、口服對(duì)照組B和口服對(duì)照組C飼喂基礎(chǔ)飼料，免疫對(duì)照組A、免疫對(duì)照組B和免疫對(duì)照組C飼喂普通枯草芽孢桿菌混拌的基礎(chǔ)飼料，免疫組A、免疫組B和免疫組C飼喂實(shí)施例I制備的疫苗飼料，空白對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料，每組設(shè)置2個(gè)平行。將上述各組羅非魚連續(xù)飼喂免疫3天，每條魚每天免疫Ig飼料，免疫3天后各組停止免疫，均改喂普通基礎(chǔ)飼料，停止免疫28天后，對(duì)除空白對(duì)照組外的各組羅非魚分別攻毒，其中口服對(duì)照組A、免疫對(duì)照組A和免疫組A分別腹腔注射無(wú)乳鏈球菌病原菌懸浮液，口服對(duì)照組B、免疫對(duì)照組B和免疫組B分別腹腔注射海豚鏈球菌病原菌懸浮液，口服對(duì)照組C、免疫對(duì)照組C和免疫組C分別腹腔注射嗜水氣單胞菌病原菌懸浮液，每條魚的注射劑量為100 μ I。在以后的14天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況，14天后，各組的累計(jì)死亡率穩(wěn)定，統(tǒng)計(jì)各組魚的累計(jì)死亡率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2所示。利用下列公式計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率
相對(duì)免疫保護(hù)率(RPS)% =(穩(wěn)定后的口服對(duì)照組的累計(jì)死亡率-穩(wěn)定后的免疫組的累計(jì)死亡率)/穩(wěn)定后的口服對(duì)照組的累計(jì)死亡率X 100%。經(jīng)計(jì)算，實(shí)施例I制備的枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗對(duì)無(wú)乳鏈球菌的免疫保護(hù)率達(dá)到93. 4%，對(duì)海豚鏈球菌的免疫保護(hù)率達(dá)到90%，對(duì)嗜水氣單胞菌的免疫保護(hù)率達(dá)到76%，由此可見(jiàn)，該疫苗對(duì)無(wú)乳鏈球菌、海豚鏈球菌和嗜水氣單胞菌毒株感染都具有很好的防治效果，能有效地保護(hù)羅非魚抵御無(wú)乳鏈球菌、海豚鏈球菌和嗜水氣單胞菌的侵染，呈現(xiàn)出顯著的交叉免疫力。
實(shí)施例4 :以石斑魚為實(shí)驗(yàn)用魚的口服免疫效力評(píng)價(jià)試驗(yàn)
病原菌懸浮液的制備在腦心浸出液肉湯(BHI)培養(yǎng)基(胰蛋白質(zhì)胨10. Og/L，氯化鈉5. Og/L，磷酸氫二鈉2. 5g/L，葡萄糖2. Og/L，牛心浸出液500mL/L，pH7. 4)中培養(yǎng)海豚鏈球菌至0D600為O. 6，在TSB (2%NaCl)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)溶藻弧菌至0D600為O. 6，在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)嗜水氣單胞菌至0D600為O. 6，然后于室溫以5000rpm離心10分鐘，收集沉淀菌體，用PBS緩沖液懸浮至終濃度為I X 107cfu/ml。實(shí)驗(yàn)用魚的飼養(yǎng)從山東購(gòu)置的試驗(yàn)用魚(石斑魚)暫養(yǎng)于200L水族箱，配以流動(dòng)循環(huán)海水處理和凈化系統(tǒng)，養(yǎng)殖水溫維持23±2°C，暫養(yǎng)I周后，剔除不健康個(gè)體。選擇體長(zhǎng)為12-15cm的健康石斑魚隨機(jī)分組至20L試驗(yàn)水族箱，每個(gè)水族箱30尾，實(shí)驗(yàn)水族箱每天換水兩次，換水量為1/3，維持水溫23±2°C，繼續(xù)暫養(yǎng)2周。免疫效力評(píng)價(jià)上述已分組水族箱分別設(shè)置口服對(duì)照組A、免疫對(duì)照組A、免疫組A、口服對(duì)照組B、免疫對(duì)照組B、免疫組B、口服對(duì)照組C、免疫對(duì)照組C、免疫組C和空白對(duì)照組，口服對(duì)照組A、口服對(duì)照組B和口服對(duì)照組C飼喂基礎(chǔ)飼料，免疫對(duì)照組A、免疫對(duì)照組B和免疫對(duì)照組C飼喂普通枯草芽孢桿菌混拌的基礎(chǔ)飼料，免疫組A、免疫組B和免疫組C飼喂實(shí)施例I制備的疫苗飼料，空白對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料，每組設(shè)置2個(gè)平行。將上述各組石斑魚連續(xù)飼喂免疫3天，每條魚每天免疫Ig飼料，免疫3天后各組停止免疫，均改喂普通基礎(chǔ)飼料，停止免疫28天后，對(duì)除空白對(duì)照組外的各組石斑魚分別攻毒，其中口服對(duì)照組A、免疫對(duì)照組A和免疫組A分別腹腔注射海豚鏈球菌病原菌懸浮液，口服對(duì)照組B、免疫對(duì)照組B和免疫組B分別腹腔注射溶藻弧菌病原菌懸浮液，口服對(duì)照組C、免疫對(duì)照組C和免疫組C分別腹腔注射嗜水氣單胞菌病原菌懸浮液，每條魚的注射劑量為100μ I。在以后的14天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況，14天后，各組的累計(jì)死亡率穩(wěn)定，統(tǒng)計(jì)各組魚的累計(jì)死亡率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3所示。利用下列公式計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率
相對(duì)免疫保護(hù)率(RPS)% =(穩(wěn)定后的口服對(duì)照組的累計(jì)死亡率-穩(wěn)定后的免疫組的累計(jì)死亡率)/穩(wěn)定后的口服對(duì)照組的累計(jì)死亡率X 100%。經(jīng)計(jì)算，實(shí)施例I制備的枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗對(duì)海豚鏈球菌的免疫保護(hù)率達(dá)到90%，對(duì)溶藻弧菌的免疫保護(hù)率達(dá)到86. 2%，對(duì)嗜水氣單胞菌的免疫保護(hù)率達(dá)到73. 4%，由此可見(jiàn)，該疫苗對(duì)海豚鏈球菌、溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌毒株感染都具有很好的防治效果，能有效地保護(hù)石斑魚抵御海豚鏈球菌、溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌的侵染，呈現(xiàn)出顯著的交叉免疫力。需要指出的是，上述實(shí)施例僅僅作為本發(fā)明的說(shuō)明，而不是限制。本發(fā)明所指的魚類并不局限于上述實(shí)施例所描述的大菱鲆、羅非魚和石斑魚，對(duì)于經(jīng)充分說(shuō)明的本發(fā)明來(lái)說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明的所闡述的內(nèi)容進(jìn)行簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)所作出的變換及改型的方案，仍然屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？傊?，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)包括那些對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的變換或替代以及改型。
權(quán)利要求
1.一種新型枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗，其特征在于所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢桿菌重組菌株，該菌株的分類命名是枯草芽孢桿菌HT5302 (Bacillussubtilis HT5302)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNo M 2012380。
2.如權(quán)利要求I所述的新型枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗，其特征在于所述枯草芽孢桿菌重組菌株在形成芽孢后能夠在芽孢表面展示無(wú)乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的新型枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗，其特征在于所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上重組整合有以枯草芽孢桿菌衣殼蛋白基因cotB為分子載體并與無(wú)乳鏈球菌識(shí)/7過(guò)基因相融合的融合基因片段(SEQ ID NO: 1)，所述融合基因片段重組整合在枯草芽孢桿菌重組菌株染色體上的_yE基因位點(diǎn)，通過(guò)誘導(dǎo)該枯草芽孢桿菌重組菌株可產(chǎn)生表面展示無(wú)乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)蛋白的芽孢。
4.如權(quán)利要求2所述的新型枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗，其特征在于所述枯草芽孢桿菌重組菌株在形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞時(shí)能夠分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)形成的融合蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的新型枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗，其特征在于所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上還重組整合有由枯草芽孢桿菌分泌信號(hào)肽基因、穿膜肽iai基因和鰻弧菌甘油醒脫氫酶基因相融合所獲得的融合基因序列(SEQ ID NO: 2)，該識(shí)/7過(guò)融合基因序列克隆至枯草芽孢桿菌p43啟動(dòng)子下游并利用同源交換整合至枯草芽孢桿菌染色體的基因位點(diǎn)，該枯草芽孢桿菌重組菌株在形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞時(shí)能夠胞外分泌表達(dá)穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)融合蛋白。
6.權(quán)利要求f5任一項(xiàng)所述的新型枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗在魚類養(yǎng)殖中防治因鏈球菌、弧菌、愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌等引發(fā)的重要細(xì)菌性病害的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗是以枯草芽孢桿菌芽孢形式添加到魚飼料及飼料添加劑中，以口服方式免疫。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗及其應(yīng)用。所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢桿菌重組菌株，該菌株分類命名是枯草芽孢桿菌HT5302，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNoM2012380。該枯草芽孢桿菌多價(jià)載體疫苗是以枯草芽孢桿菌重組菌株作為核心制備而成，通過(guò)誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌重組菌株可產(chǎn)生表面展示無(wú)乳鏈球菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)蛋白的芽孢，芽孢萌發(fā)形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞時(shí)可以分泌穿膜肽與鰻弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)形成的融合蛋白。該疫苗具有對(duì)鏈球菌病、弧菌病、愛(ài)德華氏菌病和嗜水氣單胞菌等細(xì)菌性病害的多效價(jià)防護(hù)作用。
文檔編號(hào)A61K39/02GK102949713SQ20121037603
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
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