專利名稱：雞新城疫和h9n2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
新城疫又稱亞洲雞瘟或偽雞瘟，具有很高的發(fā)病率和病死率，是危害養(yǎng)禽業(yè)的一種主要傳染病，OIE將其列為A類疫病。新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜和漿膜出血為特征。該病死亡率高，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危 害嚴(yán)重。1926年首先發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞，不久又在英國(guó)新城發(fā)現(xiàn)，世界各國(guó)均有流行記載。
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)隸屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，因?yàn)樵摬《臼茿IV負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA病毒，所以該病毒很容易發(fā)生變異并不斷的突破其感染宿主的種屬障礙，引起新的流感流行。自1966年首次在北美的火雞體內(nèi)分離到H9N2亞型AIV以來(lái)，該亞型的病毒不斷傳播，目前已在全世界范圍的禽群中廣泛存在。我國(guó)也于1992年首次報(bào)道了雞群中H9N2亞型AIV的感染，H9N2亞型是目前我國(guó)雞群中存在的AIV主要亞型，占禽流感總發(fā)病率的90%以上。H9N2亞型禽流感發(fā)病后雖然致死率不高(一般不超過(guò)30%),但常導(dǎo)致呼吸道癥狀，蛋雞的產(chǎn)蛋下降，并使雞群易繼發(fā)嚴(yán)重的呼吸道疾病，影響家禽生產(chǎn)性能。AIV不僅對(duì)我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的損失，而且對(duì)人類健康也構(gòu)成了威脅。目前新城疫、H9N2亞型禽流感嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，在各種防控措施中，疫苗的免疫仍為最重要的措施。針對(duì)新城疫、H9N2亞型禽流感，已有相應(yīng)的滅活單苗及二聯(lián)滅活苗，但是免疫劑量大，抗體水平低，對(duì)流行毒株的交叉免疫保護(hù)率不高，給免疫雞群帶來(lái)一定的風(fēng)險(xiǎn)。因此，研制出免疫劑量小，交叉免疫效果更好的新城疫、禽流感H9N2亞型二聯(lián)苗是一項(xiàng)具有重要意義的工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗，該二聯(lián)滅活疫苗中含有的H9亞型禽流感病毒HN03株，免疫原性好，產(chǎn)生的抗體水平高，不僅能夠抵抗同源病毒攻毒，而且能夠抵抗2011年以來(lái)新流行的H9N2亞型禽流感病毒SH01、H9N2亞型禽流感病毒JX02攻毒；該二聯(lián)滅活疫苗能夠產(chǎn)生高水平的抗體，持續(xù)期長(zhǎng)。本發(fā)明的另一目的在于提供雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，該方法簡(jiǎn)單，安全。本發(fā)明采用如下技術(shù)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的
一種雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗，含有雞新城疫病毒La Sota株和禽流感病毒 A/chicken/He Nan/03/2009/ (H9N2)株；所述禽流感病毒 A/chicken/HeNan/03/2009/ (H9N2)株縮寫為H9N2亞型禽流感病毒HN03株，保藏號(hào)為CGMCC NO :6258。所述雞新城疫病毒La Sota株和H9N2亞型禽流感病毒HN03株的含量比為2: I 30一種制備所述雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗，包括如下步驟
Cl)病毒液的制備將雞新城疫病毒La Sota株和H9N2亞型禽流感病毒HN03株分別接種SPF雞胚，分別收獲雞胚液，作為雞新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亞型禽流感病毒HN03株病毒液；
(2)病毒液的濃縮與滅活將雞新城疫病毒LaSota株病毒液和H9N2亞型禽流感病毒HN03株病毒液分別濃縮，然后分別加入丙內(nèi)酯獲得雞新城疫病毒La Sota株滅活病毒液和Η9Ν2亞型禽流感病毒ΗΝ03株滅活病毒液；
(3)水相制備將雞新城疫病毒LaSota株滅活病毒液和Η9Ν2亞型禽流感病毒ΗΝ03株滅活病毒液混合，獲得混合病毒液；將混合病毒液與吐溫-80混合，制得水相；
(4)油相制備將注射用白油和司本一80混勻，作為油相；
(5)乳化將水相和油相混合均勻，即得雞新城疫和Η9Ν2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗。步驟(2)中，所述雞新城疫病毒La Sota株病毒液濃縮至每O. I暈升濃縮后雞新城疫病毒液中病毒含量為3X108_° EID5tl 3Χ IO9 tlEID5tl ;所述Η9Ν2亞型禽流感病毒HNO3株病毒液濃縮至每O. I暈升濃縮后禽流感Η9病毒液中病毒含量為3Χ IO8'0 EID50 3 XlO8- 5EID500所述步驟(2)中各滅活病毒液中β -丙內(nèi)酯的體積百分?jǐn)?shù)為O. 04% O. 06%。步驟(3)中所述混合病毒液中雞新城疫病毒La Sota株滅活病毒液與Η9Ν2亞型禽流感病毒ΗΝ03株滅活病毒液的體積比為2:1 3 ;步驟(3)中所述混合病毒液與吐溫_80混合的體積比為96 4。步驟(4)中所述注射用白油和司本一 80混合的體積比為94 6。步驟(5)所述水相和油相混合的體積比為1:3。有益效果
本發(fā)明雞新城疫和Η9Ν2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗中含有的Η9亞型禽流感病毒ΗΝ03株，是發(fā)明人自行分離、篩選、鑒定的，該毒株免疫原性好，產(chǎn)生的抗體水平高，不僅能夠抵抗同源病毒攻毒，而且能夠抵抗2011年以來(lái)新流行的Η9Ν2亞型禽流感病毒SHOl、Η9Ν2亞型禽流感病毒JX02攻毒；該二聯(lián)滅活疫苗能夠使接種對(duì)象產(chǎn)生高水平的抗體，持續(xù)期長(zhǎng)，不僅能夠抵抗Η9Ν2亞型禽流感病毒JX02攻毒，而且能夠抵抗2011年以來(lái)新流行的Η9Ν2亞型禽流感病毒SH01、Η9Ν2亞型禽流感病毒JX02攻毒。本發(fā)明制備雞新城疫和Η9Ν2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗的方法，簡(jiǎn)單，安全。因?yàn)橹苽浞椒ㄖ袑?duì)病毒液進(jìn)行了濃縮，所以提高單位體積疫苗中的抗原含量，有效降低了使用劑量，成年雞由原來(lái)免疫劑量O. 5ml/羽降到O. 3ml/羽，達(dá)到同樣的免疫效果；使用了使用了丙內(nèi)酯作為滅活劑，使產(chǎn)品中不含甲醛，確保受免動(dòng)物體內(nèi)無(wú)甲醛殘留，提高畜產(chǎn)品的品質(zhì)。
具體實(shí)施例方式實(shí)例I Η9Ν2亞型禽流感病毒ΗΝ03株的分離與鑒定
I.病料
病料為無(wú)菌采集死亡病雞的心血、肝、腦、肺組織。
2.組織觸片
將病料作心血涂片及各臟器的病毒組織觸片，并進(jìn)行染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)病毒組織觸片染色鏡檢結(jié)果為陰性。3.細(xì)菌培養(yǎng)
將上述病料，分別用馬丁肉湯和綿羊血培養(yǎng)基培養(yǎng)(按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄方法配制)，結(jié)果顯示無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明所述病料中不含有細(xì)菌。4.病料處理
將上述病料在無(wú)菌容器中剪碎、磨碎，用含青鏈霉素的滅菌生理鹽水(每毫升生理鹽水含2000單位的青霉素和2000單位的鏈霉素)作I : 5倍稀釋，反復(fù)凍融三次后，3000r/min離心20分鐘，取上清液保存于_20°C備用。 5.病毒分離、接種及收獲
將本實(shí)施例標(biāo)題4中獲得的上清液，尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚，每胚接種量
O.2ml，接種后置37°C條件孵化。接種24小時(shí)以內(nèi)死亡胚棄去，收獲24小時(shí)以后死亡雞胚尿囊液，測(cè)定尿囊液紅細(xì)胞凝集價(jià)，將紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于I : 64的尿囊液置-20°C保存，為雞胚擴(kuò)繁的第一代種毒，簡(jiǎn)稱El代種毒。將El代種毒繼續(xù)傳3代，即為E4代種毒，用于病毒生物學(xué)特性鑒定。紅細(xì)胞凝集價(jià)采用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(微量法)進(jìn)行檢測(cè)，具體方法如下在96孔(角度為110° )微量板上，從第I孔至12孔，每孔加入生理鹽水30 μ 1，用加液器吸取含毒尿囊液30 μ 1，從每排第I孔起，依次作倍比稀釋，至11孔，棄去加液器內(nèi)30 μ I液體，最后I個(gè)孔不加作為空白對(duì)照。每孔加入1%雞紅細(xì)胞懸液30 μ 1，立即在微量振蕩器上搖勻，置20°C室溫，20分鐘后觀察結(jié)果，使紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋度，作為判定終點(diǎn)。結(jié)果表明El代種毒的紅細(xì)胞凝集價(jià)為I : 256，E4代種毒的紅細(xì)胞凝集價(jià)為I : 1024。6.血凝抑制試驗(yàn)
將E4代種毒用滅菌生理鹽水作I : 256稀釋，即為4個(gè)血凝單位抗原。分別用購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的雞新城疫、雞產(chǎn)蛋下降綜合征、禽流感(H9)、禽流感(H5)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)(參照現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》中方法)，結(jié)果顯示被檢E4代種毒只可被禽流感(H9)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清抑制，其它三種血清均不能抑制，初步說(shuō)明本株病毒為H9亞型禽流感病毒。7.病毒含量測(cè)定
將E4代種毒10倍倍比稀釋，取10_7、10_8、10_9三個(gè)稀釋度，分別通過(guò)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚O. 1ml，置37°C孵育120小時(shí)。120小時(shí)后，逐胚測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)(方法同前)，以紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于I : 16判為感染，按Reed-Muench方法計(jì)算病毒含量。結(jié)果表明E4代種毒的病毒含量為108 5EID5(i/0. Iml08.靜脈致病指數(shù)(IVPI)測(cè)定
參照二 000年版《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(以下簡(jiǎn)稱《規(guī)程》)附錄448頁(yè)方法進(jìn)行。結(jié)果表明E4代種毒的靜脈致病指數(shù)為0，表明該毒株為低致病禽流感H9亞型病毒。9.雞胚最小致死量的平均死亡時(shí)間(MDT/MLD)測(cè)定
按《規(guī)程》附錄447頁(yè)方法進(jìn)行。結(jié)果表明E4代種毒的雞胚最小致死量的平均死亡時(shí)間為81. 5小時(shí)/10'10.免疫原性測(cè)定
將E4代種毒按常規(guī)方法制成含量為108_°EID5(i/0. 3ml的滅活疫苗。按O. 2ml/羽份免疫I月齡SPF雞10只，另取5只不免疫，作為空白對(duì)照。免疫21天后，所有試驗(yàn)雞采血，分離血清，參照現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》中方法進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。同時(shí)對(duì)免疫組和對(duì)照組進(jìn)行攻毒，靜脈注射E4代種毒IO5 tlEID5tl/只，免疫后第5天逐只用棉拭子采集雞喉頭分泌物，過(guò)濾除菌，接種9 10日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品尿囊腔接種5枚雞胚，O. 2ml/胚。37°C孵育120小時(shí)，測(cè)定尿囊液紅細(xì)胞凝集價(jià)。5枚雞胚中只要有I枚雞胚的雞胚液的紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于I : 16 (微量法)則判為感染。對(duì)病毒感染為陰性的雞胚，應(yīng)盲傳一次。結(jié)果表明 ，該疫苗按照O. 2ml/羽份劑量免疫后21天，免疫組血清中E4代種毒血凝抑制抗體水平不低于I 128 (微量法)，空白對(duì)照組均不高于I : 4 (微量法)，免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫組10/10病毒分離為陰性，對(duì)照組5/5病毒分離為陽(yáng)性。11.血凝素HA基因及神經(jīng)氨酸酶NA基因鑒定
由哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，鑒定結(jié)果為E4代種毒的HA基因(如SEQ ID NO: I所示)屬于A型流感病毒H9亞型，NA基因(如SEQ ID NO: 2所示)屬于A型流感病毒N2亞型。因此，將該毒株命名為禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株，縮寫為H9N2亞型禽流感病毒HN03株。將E4代種毒進(jìn)行保藏。保藏信息如下
保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所。分類命名禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/ (H9N2)株。保藏號(hào)CGMCCNO :6258。保藏日期2012年7月2日。為了方便描述，將禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株縮寫為H9N2亞型禽流感病毒HN03株。12.對(duì)流行毒株的交叉攻毒保護(hù)性研究 A/Chinken/Shanghai/01/2011/ (H9N2)(簡(jiǎn)稱 H9N2 亞型禽流感病毒 SHOl )，由上海獸
醫(yī)研究所2011年于上海分離。A/Chinken/Jiaxing/02/2011/ (H9N2)(簡(jiǎn)稱H9N2亞型禽流感病毒JX02)由南京天邦公司生物技術(shù)研究所2011年于浙江嘉興分離。將H9N2亞型禽流感病毒HN03株按常規(guī)方法制成病毒含量為108_°EID5(i/0. 3ml的滅活疫苗，免疫I月齡SPF雞30只；另取15只I月齡SPF雞，分為3組，5只/組，不免疫作為空白對(duì)照組。免疫后21天，將免疫組隨機(jī)分成三組，其中一組靜脈注射H9N2亞型禽流感病毒HN03株尿囊液攻毒，另一組靜脈注射H9N2亞型禽流感病毒SHOl尿囊液攻毒，剩余的一組靜脈注射H9N2亞型禽流感病毒JX02尿囊液攻毒；3個(gè)空白對(duì)照組的攻毒方法同免疫組。攻毒后第5天，逐只用棉拭子采集雞喉頭分泌物，過(guò)濾除菌，接種擴(kuò)10日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品尿囊腔接種5枚雞胚，O. 2ml/胚。37°C孵育120小時(shí)，測(cè)定尿囊液紅細(xì)胞凝集價(jià)。5枚雞胚中只要有I枚雞胚的雞胚液的紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于I : 16 (微量法)則判為感染。對(duì)病毒分離陰性的樣品，肓傳一代。結(jié)果表明H9N2亞型禽流感病毒HN03株對(duì)同源毒及非同源毒保護(hù)率均為100%，表明該毒株不但可以針對(duì)同源毒提供良好保護(hù)，對(duì)2011新分離的流行毒株也同樣具有良好的保護(hù)性。H9N2亞型禽流感病毒HN03株生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，該毒株可在雞胚中高滴度增殖，血凝效價(jià)較高，為I : 1024(微量法)，免疫原性好，能完全抵抗同源病毒攻擊，異源攻毒保護(hù)率也高達(dá)100%。因此可作為H9N2亞型禽流感疫苗候選毒株，用于制備滅活疫苗。
實(shí)施例2雞新城疫和H9N2禽流感二聯(lián)滅活疫苗的制備
I.制苗用毒種來(lái)源
制造本品用的毒種為雞新城疫病毒La Sota株和禽流感病毒A/chicken/HeNan/03/2009/(H9N2)株 CGMCC NO :6258,其中禽流感病毒 A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株縮寫為H9N2亞型禽流感病毒HN03株。
雞新城疫病毒La Sota株(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌毒種編號(hào)CVCC AV1615株)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，H9N2亞型禽流感病毒HN03株由國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心按照實(shí)施例I方法分離，經(jīng)哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定，提交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏。2.病毒液的制備將雞新城疫病毒La Sota株和H9N2亞型禽流感病毒HN03株分別接種SPF雞胚，分別收獲雞胚液，作為雞新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亞型禽流感病毒HN03株病毒液；
(I)雞新城疫病毒La Sota株病毒液的制備將雞新城疫病毒La Sota株接種SPF雞胚，收獲雞胚液作為雞新城疫病毒La Sota株病毒液。具體方法如下
接種取雞新城疫病毒La Sota株，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_4或10_5)，尿囊腔內(nèi)接種9 10日齡SPF雞胚，每胚O. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻蛋。孵育和觀察雞胚接種后，每日照蛋I次，將60小時(shí)以前死亡的雞胚棄去。此后，每Γ8小時(shí)照蛋I次，死亡的雞胚隨時(shí)棄去。當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到96或120小時(shí)，不論死亡與否，全部收回，氣室向上，置于2 8°C冷卻12 24小時(shí)。收獲將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無(wú)菌手術(shù)剝除氣室部位卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黃破裂)，吸取雞胚液作為雞新城疫病毒LaSota株病毒液。在雞新城疫病毒La Sota株病毒液中，加入適宜抗生素(每毫升抗原中青霉素終濃度800單位，鏈霉素終濃度800單位)，每組抽樣測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，紅細(xì)胞凝集價(jià)低于I 512 (微量法)者應(yīng)棄之，同時(shí)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。注意在吸取胚液前，對(duì)每個(gè)雞胚均應(yīng)注意檢查，凡出現(xiàn)腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者，棄去不用。死胚和活胚分別收獲。(2)H9N2亞型禽流感病毒HN03株病毒液的制備將H9N2亞型禽流感病毒HN03株接種SPF雞胚，收獲雞胚液作為H9N2亞型禽流感病毒HN03株病毒液。具體方法如下
接種將H9N2亞型禽流感病毒HN03株用滅菌生理鹽水作I : 5000稀釋，尿囊腔內(nèi)接種9 11日齡SPF雞胚，每胚O. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻蛋。
孵育和觀察雞胚接種后，24小時(shí)內(nèi)照蛋I次，棄去死胚。此后，每4 8小時(shí)照蛋I次。當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到96 120小時(shí)，隨時(shí)收回死亡的雞胚，氣室向上，置2 8°C冷卻4 24小時(shí)。收獲將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無(wú)菌手術(shù)剝除氣室部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黃破裂)，吸取雞胚液作為H9N2亞型禽流感病毒HN03株病毒液。在雞新城疫病毒La Sota株病毒液中，加入適宜抗生素(每毫升抗原中青霉素終濃度800單位，鏈霉素終濃度800單位)，每組抽樣測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，紅細(xì)胞凝集價(jià)低于I 256 (微量法)者棄去，同時(shí)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。注意在吸取胚液前對(duì)每個(gè)雞胚均應(yīng)注意檢查，凡胎兒腐敗、胚液渾濁及有任何污染可疑者，棄去不用。死胚和活胚分別收獲。每若干枚雞胚的胚液分為一組。3.病毒液的濃縮與滅活將雞新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亞型禽流感 病毒HN03株病毒液分別濃縮，然后分別加入β-丙內(nèi)酯獲得滅活病毒液。各滅活病毒液中β -丙內(nèi)酯的體積百分?jǐn)?shù)為O. 04% O. 06%ο所述雞新城疫病毒La Sota株病毒液濃縮至每O. I暈升濃縮后雞新城疫病毒液中病毒含量為3Χ 108_° EID50 3Χ IO9 tlEID5tl ;所述Η9Ν2亞型禽流感病毒ΗΝ03株病毒液濃縮至每O. I毫升濃縮后禽流感Η9病毒液中病毒含量為3XlO8 tl EID5tl 3Χ IO8 5EID5tlt5 —般來(lái)說(shuō)，濃縮至原體積的1/2 1/4，即能達(dá)到要求。(I)病毒液的濃縮
將雞新城疫病毒La Sota株病毒液和Η9Ν2亞型禽流感病毒ΗΝ03株病毒液分別連續(xù)離心澄清(連續(xù)離心轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/秒)，除去病毒液中的大顆粒，使其成為透明或半透明溶液。然后，用病毒超濾濃縮系統(tǒng)(購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，超濾膜孔徑300KD)分別將上述病毒液濾濃至原體積的1/3，獲得濃縮病毒液。用超濾濃縮過(guò)程中產(chǎn)生的濾出廢液接種雞胚，均應(yīng)無(wú)血凝性，且不引起雞胚死亡。(2)病毒液的滅活
將上述兩種濃縮病毒液分別置無(wú)菌滅活罐內(nèi)，加入β -丙內(nèi)酯溶液，隨加隨攪拌，使其充分混合。加完丙內(nèi)酯溶液后用無(wú)菌壓縮空氣將其壓入另一無(wú)菌滅活罐內(nèi)，置4°C下滅活24小時(shí)，期間每隔4小時(shí)攪拌I次，即獲得滅活病毒液。滅活病毒液中β-丙內(nèi)酯的體積百分?jǐn)?shù)為0.05%。從滅活病毒液中取樣進(jìn)行滅活檢驗(yàn)。滅活病毒液置2 8°C保存。4.半成品檢驗(yàn)
(I)無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。(2)病毒含量測(cè)定
雞新城疫病毒La Sota株濃縮病毒液的含量測(cè)定將濃縮病毒液作3倍稀釋后,測(cè)病毒含量。每O. Iml稀釋后的濃縮病毒液中病毒含量為108_° 109_°EID5(I,所以每O. Iml濃縮病毒液中病毒含量為3X108_° EID50 3X IO9 tlEID5tl ;同時(shí)進(jìn)行紅細(xì)胞凝集價(jià)測(cè)定(同實(shí)施例I )，紅細(xì)胞凝集價(jià)為I : 512 1024 (微量法)。H9N2亞型禽流感病毒HN03株濃縮病毒液的含量測(cè)定將濃縮病毒液先作3倍稀釋后，測(cè)病毒含量，每O. Iml稀釋后的濃縮病毒液中病毒含量為108_° IO8 5EID5tl，所以每O. Iml濃縮病毒液中病毒含量為3XlO8 tl EID5tl 3X IO8 5EID5tl ;紅細(xì)胞凝集價(jià)測(cè)定，紅細(xì)胞凝集價(jià)(檢測(cè)方法同實(shí)施例I)為I : 512 1024 (微量法)。(3)滅活檢驗(yàn)
雞新城疫病毒La Sota株滅活病毒液滅活檢驗(yàn)取滅活病毒液，經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚6枚，每胚O. 2ml，置36 37°C孵育，棄去24小時(shí)內(nèi)死亡雞胚，觀察120小時(shí)，雞胚非特異性死亡應(yīng)不超過(guò)I枚。對(duì)所有胚液分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，均應(yīng)不出現(xiàn)血凝，并盲傳I代，測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，均應(yīng)不出現(xiàn)血凝。H9N2亞型禽流感病毒HN03株滅活病毒液滅活檢驗(yàn)取滅活病毒液，經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚6枚，每胚O. 2ml，置36 37°C孵育，棄去24小時(shí)內(nèi)死亡雞胚，觀察120小時(shí)，雞胚非特異性死亡應(yīng)不超過(guò)I枚。對(duì)所有胚液分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，均應(yīng)不出現(xiàn)血凝，并盲傳I代，測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，均應(yīng)不出現(xiàn)血凝。5.雞新城疫和H9N2禽流感二聯(lián)滅活疫苗的制備
每羽份(O. 3ml)雞新城疫和H9N2禽流感二聯(lián)滅活疫苗，雞新城疫病毒La Sota株含量IO8 0EID50 IO9 0EID50, H9N2 亞型禽流感病毒 HN03 株含量 IO8 0EID50 IO8-5EID500(I)油相制備將注射用白油和司本一 80按照體積比為94 6混勻，作為油相。(2)水相制備
將雞新城疫病毒La Sota株滅活病毒液和H9N2亞型禽流感病毒HN03株滅活病毒液等體積混合制備混合病毒液；將混合病毒液與吐溫-80按照體積比96 4混合，充分?jǐn)嚢柚敝镣聹?80完全溶解，即得水相溶液。(3)乳化
將油相和水相按照體積比3 I混合，攪拌均勻獲得雞新城疫和H9N2禽流感二聯(lián)滅活疫苗。具體操作步驟如下將3份油相放入乳化罐內(nèi)，啟動(dòng)乳化罐攪拌機(jī)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相一份，加完后繼續(xù)攪拌l(Tl5min，打開(kāi)均質(zhì)機(jī)進(jìn)出口開(kāi)關(guān),啟動(dòng)均質(zhì)機(jī),使乳化液經(jīng)均質(zhì)機(jī)進(jìn)入另一罐，如此反復(fù)乳化數(shù)次(一般6 8次)，乳化后取IOml疫苗，以3000r/min離心15分鐘，應(yīng)不出現(xiàn)分層現(xiàn)象。實(shí)施例3雞新城疫和H9N2禽流感二聯(lián)滅活疫苗雙倍劑量接種安全試驗(yàn)
按實(shí)施例2制備5批次雞新城疫和H9N2禽流感二聯(lián)滅活疫苗(批號(hào)20100301、20100502、20100603、20110104、20110305)，滅活前雞新城疫病毒 La Sota 株及禽流感(H9亞型)HN03株抗原含量均為108_°EID5Q/0. 3ml/羽份。考察對(duì)象為7日齡SPF雞(購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)和7日齡三黃肉雞(購(gòu)自南京石佛寺養(yǎng)雞場(chǎng))。各批雞購(gòu)回后，適應(yīng)數(shù)天，核實(shí)雞的全身狀況和臨床疾病情況，剔除弱雞，選擇健康雞進(jìn)入試驗(yàn)。對(duì)SPF雞分別雙倍劑量(O. 6ml/只)頸部皮下注射五批雞新城疫和H9N2禽流感二聯(lián)滅活疫苗，每次設(shè)I組不接種，作為對(duì)照；對(duì)三黃肉雞分別雙倍劑量(O. 6ml/只)頸部皮下注射三批雞新城疫和H9N2禽流感二聯(lián)滅活疫苗，每次設(shè)I組不接種，作為對(duì)照。接種后觀察14天內(nèi)是否出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身反應(yīng)，接種后14天、28天各隨機(jī)抽取試驗(yàn)雞5 10只，剖檢注射部位，檢查疫苗的吸收情況。結(jié)果用雙倍劑量雞新城疫和H9N2禽流感二聯(lián)滅活疫苗對(duì)7日齡SPF雞和7日齡三黃肉雞進(jìn)行接種。接種后14日內(nèi)，未觀察到臨床異常，采食、飲水正常，健康情況良好，未發(fā)現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身反應(yīng)，具體見(jiàn)表I。接種后14天，各組取5 10只雞剖檢注射部位，80%以上肉眼可見(jiàn)少量粟粒樣大小顆粒未吸收完全；注射后28天剖檢，70%以上疫苗已基本吸收，注射部位未見(jiàn)由疫苗接種引起的異常反應(yīng)，具體見(jiàn)表2。因此，雞新城疫和H9N2禽流感二聯(lián)滅活疫苗雙倍劑量接種是安全的。表I雙倍劑量接種雞新城疫和H9N2禽流感二聯(lián)滅活疫苗后14天內(nèi)臨床觀察結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于含有雞新城疫病毒LaSota株和禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/ (H9N2)株；所述禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株縮寫為H9N2亞型禽流感病毒HN03株，保藏號(hào)為CGMCC NO :6258。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于所述雞新城疫病毒La Sota株和H9N2亞型禽流感病毒HN03株的含量比為2: I 3。
3.一種制備權(quán)利要求I所述雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于包括如下步驟 (1)病毒液的制備將雞新城疫病毒LaSota株和H9N2亞型禽流感病毒HN03株分別接種SPF雞胚，分別收獲雞胚液，作為雞新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亞型禽流感病毒HN03株病毒液； (2)病毒液的濃縮與滅活將雞新城疫病毒LaSota株病毒液和H9N2亞型禽流感病毒HN03株病毒液分別濃縮，然后分別加入￠-丙內(nèi)酯獲得雞新城疫病毒La Sota株滅活病毒液和H9N2亞型禽流感病毒HN03株滅活病毒液； (3)水相制備將雞新城疫病毒LaSota株滅活病毒液和H9N2亞型禽流感病毒HN03株滅活病毒液混合，獲得混合病毒液；將混合病毒液與吐溫-80混合，制得水相； (4)油相制備將注射用白油和司本一80混勻，作為油相； (5)乳化將水相和油相混合均勻，即得雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于步驟(2)中,所述雞新城疫病毒LaSota株病毒液濃縮至每0. I暈升濃縮后雞新城疫病毒液中病毒含量為3X 108_° EID50 3X IO9 ciEID5tl ;所述H9N2亞型禽流感病毒HN03株病毒液濃縮至每0. I毫升濃縮后禽流感H9病毒液中病毒含量為3XlO8 tl EID5tl 3X 108 5EID5Q。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于所述步驟(2)中各滅活病毒液中P -丙內(nèi)酯的體積百分?jǐn)?shù)為0. 04% 0. 06%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于步驟(3)中所述混合病毒液中雞新城疫病毒LaSota株滅活病毒液與H9N2亞型禽流感病毒HN03株滅活病毒液的體積比為2:1 3。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于步驟(3)中所述混合病毒液與吐溫-80混合的體積比為96 4。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于步驟(4)中所述注射用白油和司本一80混合的體積比為94 6。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于步驟(5)所述水相和油相混合的體積比為1:3。
全文摘要
本發(fā)明提供雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法，涉及生物工程領(lǐng)域。所述二聯(lián)滅活疫苗，含有雞新城疫病毒LaSota株和禽流感病毒A/chicken/HeNan/03/2009/(H9N2)株。制備所述疫苗的方法病毒液的制備、濃縮與滅活，水相制備，油相制備，乳化，即得二聯(lián)滅活疫苗。本發(fā)明雞新城疫和H9N2亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗，免疫原性好，產(chǎn)生的抗體水平高，不僅能夠抵抗同源病毒攻毒，而且能夠抵抗2011年以來(lái)新流行的H9N2亞型禽流感病毒SH01、H9N2亞型禽流感病毒JX02攻毒；該二聯(lián)滅活疫苗能夠產(chǎn)生高水平的抗體，持續(xù)期長(zhǎng)；其制備方法簡(jiǎn)單，安全。
文檔編號(hào)A61P31/16GK102805864SQ20121032077
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月3日
發(fā)明者于漾, 揭鴻英, 朱亞露, 何家惠, 鄧碧華, 張小飛, 艾玉春, 劉志凌, 顧巍巍 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院