專利名稱：透明質(zhì)酸/明膠/硫酸軟骨素骨修復(fù)仿生支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物活性材料領(lǐng)域，涉及軟骨組織修復(fù)、填充及組織工程修復(fù)材料，具體涉及ー種透明質(zhì)酸/明膠/硫酸軟骨素骨修復(fù)仿生支架的制備方法。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨是人體中較為特殊的ー種組織，它沒有血管、神經(jīng)和淋巴細(xì)胞，因而自修復(fù)能力很差。目前臨床上傳統(tǒng)的治療方法主要有微骨折術(shù)、軟骨下骨鉆孔術(shù)、軟骨下磨削術(shù)、自體軟骨移植和自體細(xì)胞移植術(shù)等，但是這些方法存在許多不足，且會給病人帶來二次創(chuàng)傷。目前還沒有ー種方法能夠成功的替代損傷部位并達(dá)到軟骨再生的目的。軟骨組織工程是目前研究最熱的ー種方法，是將細(xì)胞、環(huán)境因子、支架材料三者結(jié)合，體外模擬細(xì)胞生存的最佳微環(huán)境，使細(xì)胞活性和表型均能與體內(nèi)情況相似，從而達(dá)到修復(fù)軟骨組織的目的。 在軟骨修復(fù)中，軟骨細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用至關(guān)重要，良好的水凝膠支架材料應(yīng)提供與天然軟骨組織相似的結(jié)構(gòu)和性能。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要由II型膠原蛋白和多糖組成。膠原呈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分布于整個軟骨基質(zhì)中，其主要功能是為軟骨細(xì)胞提供張カ和承受力，為軟骨細(xì)胞的粘附提供基礎(chǔ)，并參與軟骨細(xì)胞表型分化的調(diào)節(jié)。在這類軟骨組織修復(fù)材料中，水凝膠組織工程支架由于與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)具有相似的特性而受到了廣泛的關(guān)注。目前制備水凝膠的方法有物理交聯(lián)法和化學(xué)交聯(lián)法物理交聯(lián)法利用分子間氫鍵作用，離子靜電作用或是親疏水作用等，由于分子間作用力不強(qiáng)，導(dǎo)致物理交聯(lián)法制備的水凝膠不穩(wěn)定，容易水解或是熔融；化學(xué)交聯(lián)法制備的水凝膠結(jié)構(gòu)性能穩(wěn)定，機(jī)械強(qiáng)度較好，但是大部分化學(xué)反應(yīng)需要添加各種有毒的弓I發(fā)劑和交聯(lián)劑。針對這些缺點，近幾年出現(xiàn)了利用快速有效無毒的Diels-Alder點擊化學(xué)反應(yīng)制備水凝膠軟骨組織工程支架的方法。目前，用于軟骨修復(fù)水凝膠的材料包括天然生物材料，如膠原、殼聚糖、透明質(zhì)酸(簡稱HA)、明膠(簡稱G)等，和合成高分子材料，如PLGA、PLA、PCL等兩大類。合成高分子水凝膠力學(xué)性能優(yōu)異，但是由于缺乏細(xì)胞結(jié)合位點和生物相容性而限制其在軟骨修復(fù)上的應(yīng)用；對于天然生物材料，一般較難形成水凝膠體系，且存在降解速率快和力學(xué)性能不能滿足需求等缺點。將天然材料與合成材料進(jìn)行復(fù)合可以在改善力學(xué)性能的同時提高材料的生物相容性，但是與天然的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)相比相差甚遠(yuǎn)。還有ー類通過對膠原進(jìn)行修飾和改性制備水凝膠修復(fù)材料的方法，但是膠原分子量大，不容易與其他物質(zhì)相互鍵合，除了六氟異丙醇幾乎不溶于任何溶剤，而六氟異丙醇毒性強(qiáng)，不適合運用在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。因此要得到膠原溶液很困難，對膠原進(jìn)行修飾和改性更是難上加難，致使其并不適合作為ー種水凝膠材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供ー種透明質(zhì)酸/明膠/硫酸軟骨素骨修復(fù)仿生支架的制備方法，并將其應(yīng)用于軟骨關(guān)節(jié)修復(fù)。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案
透明質(zhì)酸/明膠/硫酸軟骨素骨修復(fù)仿生支架的制備方法，包括如下步驟
(1)在透明質(zhì)酸的2-(N-嗎啡啉)こ磺酸緩沖液中，加入4-(4,6-ニ甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽活化劑后攪拌0. 5^1h,再逐滴加入糠胺，反應(yīng)24 48h，透析3飛天，冷凍干燥得到改性透明質(zhì)酸固體；
(2)在明膠水溶液中加入碳ニ亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺攪拌均勻后，加入呋喃甲酸，反應(yīng)24 48h，透析3飛天，冷凍干燥得到改性明膠固體；
(3)將步驟(I)中得到的改性透明質(zhì)酸固體和步驟(2)中得到的改性明膠固體共同溶解于2-(N-嗎啡啉)こ磺酸緩沖液中得到混合溶液； (4)將雙端基馬來酰亞胺聚こ烯醇溶解于2-(N-嗎啡啉)こ磺酸緩沖液中得到雙端基馬來酰亞胺聚こ烯醇溶液；
(5)將步驟(4)得到的雙端基馬來酰亞胺聚こ烯醇溶液加入步驟(3)得到的混合溶液中，攪拌均勻后，在37飛(TC水浴中進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)直至形成透明的交聯(lián)水凝膠狀態(tài)；
(6)將步驟(5)得到的水凝膠浸泡在硫酸軟骨素鈉鹽的2-(N-嗎啡啉)こ磺酸緩沖液中，加入碳ニ亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺攪拌反應(yīng)24 48h，得到透明質(zhì)酸/明膠/硫酸軟骨素骨修復(fù)仿生支架。步驟(I)中，所述透明質(zhì)酸與2-(N_嗎啡啉)こ磺酸緩沖液的質(zhì)量體積比為
0.2^0. 8% ;所述透明質(zhì)酸、糠胺與4-(4，6- ニ甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽的摩爾比為1:2: (2 6)。步驟(2)中，所述明膠水溶液的濃度為0. 5^1. 5% w/v ;所述碳ニ亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為3:2，且碳ニ亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的總質(zhì)量為明膠質(zhì)量的4/5 ;所述呋喃甲酸與明膠的質(zhì)量比為(廣3) :4。步驟(I)和步驟(2)中，所述透析的截留分子量為14000 ;所述冷凍干燥的步驟為先于-2(T-70°C冷凍24 48h成冰狀，然后繼續(xù)凍干48 72h。步驟(3)中，所述混合溶液中改性透明質(zhì)酸固體的濃度為f 2% w/v,改性明膠固體的濃度為0. 5 I. 5% w/vo所述雙端基馬來酰亞胺聚こ烯醇的質(zhì)量與改性透明質(zhì)酸固體和改性明膠固體的質(zhì)量之和的比值為1:4。步驟(6)中，所述硫酸軟骨素鈉鹽與2-(N_嗎啡啉)こ磺酸緩沖液的質(zhì)量體積比為r3% ;所述碳ニ亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為3:2，且碳ニ亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的總質(zhì)量為硫酸軟骨素鈉鹽質(zhì)量的4/5。所述2-(N-嗎啡啉)こ磺酸緩沖液的濃度為100mmol/L，pH=5. 5。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和有益效果
(1)本發(fā)明采用Diels-Alder點擊化學(xué)反應(yīng)制備復(fù)合水凝膠仿生支架，凝膠化時間短，反應(yīng)條件溫和選擇性高，且無副產(chǎn)物，無需加入任何交聯(lián)劑和引發(fā)劑，保證了水凝膠仿生支架的無毒性和細(xì)胞相容性；
(2)本發(fā)明通過控制反應(yīng)基團(tuán)的摩爾比，可以制備不同交聯(lián)密度且力學(xué)性能和降解性能可調(diào)控的復(fù)合水凝膠仿生支架；(3)本發(fā)明通過控制交聯(lián)密度，制備的復(fù)合水凝膠仿生支架可以獲得不同尺寸的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而篩選最適合軟骨細(xì)胞生長的孔徑網(wǎng)絡(luò)；
(4)本發(fā)明選用的透明質(zhì)酸、明膠和硫酸軟骨素(簡稱CS)作為材料制備水凝膠，從成分上模擬了膠原蛋白和多糖的天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，為軟骨細(xì)胞的生長和代謝提供了ー個更加相似的微環(huán)境。


圖I為本發(fā)明的透明質(zhì)酸/明膠/硫酸軟骨素骨修復(fù)仿生支架的掃描電鏡圖片。圖2為本發(fā)明實施例I和實施例2制備的兩種不同比例骨修復(fù)仿生支架的應(yīng)カ應(yīng)變曲線圖。圖3為本發(fā)明實施例I和實施例2制備的兩種不同比例骨修復(fù)仿生支架的降解曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)說明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍不限于此。實施例I
(1)在濃度為0.2%的透明質(zhì)酸的2-(N-嗎啡啉)こ磺酸(簡稱MES)緩沖液(透明質(zhì)酸質(zhì)量為0. 5g)中，加入0. 654g 4- (4，6- ニ甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(簡稱DMTMM)，攪拌0. 5h，再逐滴加入220 u L糠胺，反應(yīng)24h，透析3天，冷凍干燥得到改性透明質(zhì)酸固體；
(2)在濃度為0.5%的明膠水溶液IOOml中加入400mg碳ニ亞胺(簡稱EDC)和267mgN-羥基琥珀酰亞胺(簡稱NHS)攪拌均勻后，加入125mg呋喃甲酸，反應(yīng)24h，透析3天，冷凍干燥得到改性明膠固體；
(3)將步驟(I)中得到的改性透明質(zhì)酸固體30mg和步驟(2)中得到的改性明膠固體45mg共同溶解于MES緩沖液中得到混合溶液，二者體積濃度分別為1%和I. 5% ；
(4)將37.5mg的雙端基馬來酰亞胺聚こ烯醇(簡稱MAL-PEG-MAL)溶解于MES緩沖液中得到MAL-PEG-MAL溶液；
(5)將步驟(4)得到的MAL-PEG-MAL溶液加入步驟(3)得到的混合溶液中，攪拌均勻后，在37°C水浴中進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)直至形成透明的交聯(lián)水凝膠狀態(tài)；
(6)將步驟(5)得到的水凝膠浸泡在濃度為1%的硫酸軟骨素鈉鹽(簡稱CS)的MES緩沖液中，加入500mg EDC和330mg NHS并放入搖床中反應(yīng)24h，得到透明質(zhì)酸/明膠/硫酸軟骨素骨修復(fù)仿生支架。圖I為本發(fā)明實施例I制備的透明質(zhì)酸/明膠/硫酸軟骨素骨修復(fù)仿生支架凍干后的掃描電鏡圖譜，可以看出，仿生支架具有相互貫穿的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)絡(luò)尺寸為150 250 u mD實施例2
(I)在濃度為0. 4%的透明質(zhì)酸的MES緩沖液(透明質(zhì)酸質(zhì)量為0. 5g)中，加入I. 38gDMTMM,攪拌lh，再逐滴加入220 u L糠胺，反應(yīng)36h，透析4天，冷凍干燥得到改性透明質(zhì)酸固體；
(2)在濃度為1%的明膠水溶液中加入800mgEDC與533mg NHS攪拌均勻后，加入500mg呋喃甲酸，反應(yīng)36h,透析4天,冷凍干燥得到改性明膠固體；
(3)將步驟(I)中得到的改性透明質(zhì)酸固體45mg和步驟(2)中得到的改性明膠固體105mg共同溶解于3ml的MES緩沖液中得到混合溶液，二者體積濃度分別為I. 5%和3. 5% ；
(4)將75mg的MAL-PEG-MAL溶解于MES緩沖液中得到MAL-PEG-MAL溶液；
(5)將步驟(4)得到的MAL-PEG-MAL溶液加入步驟(3)得到的混合溶液中，攪拌均勻后，在45°C水浴中進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)直至形成透明的交聯(lián)水凝膠狀態(tài)；
(6)將步驟(5)得到的水凝膠浸泡在濃度為2%的CS的MES緩沖液中，加入IgEDC與660 mg NHS并放入搖床中反應(yīng)24h，得到透明質(zhì)酸/明膠/硫酸軟骨素骨修復(fù)仿生支架。圖2為本發(fā)明實施例I和實施例2制備的兩種不同比例骨修復(fù)仿生支架的應(yīng)カ應(yīng)變曲線圖，可以看出，本發(fā)明制備的復(fù)合水凝膠仿生支架的壓縮模量最大可達(dá)1278Pa，明顯高于其他方法制備的明膠和透明質(zhì)酸復(fù)合水凝膠的力學(xué)性能。圖3為本發(fā)明實施例I和實施例2制備的兩種不同比例骨修復(fù)仿生支架的降解曲線圖，可以看出，在PBS緩沖液中，本發(fā)明制備的不同比例的水凝膠仿生支架在21天內(nèi)都不發(fā)生降解現(xiàn)象；盡管在透明質(zhì)酸酶溶液中，水凝膠會發(fā)生酶解現(xiàn)象，但是與傳統(tǒng)的水凝膠相比降解速率明顯下降。說明本發(fā)明制備的復(fù)合水凝膠仿生支架具有良好的抗降解性能。實施例3
(1)在濃度為0.8%的透明質(zhì)酸的MES緩沖液(透明質(zhì)酸質(zhì)量為0. 5g)中，加入2. 02gDMTMM,攪拌lh，再逐滴加入220 u L糠胺，反應(yīng)48h，透析5天，冷凍干燥得到改性透明質(zhì)酸固體；
(2)在濃度為I.5%的明膠水溶液中加入I. 2g EDC與0. 8g NHS攪拌均勻后，加入I. Ig呋喃甲酸，反應(yīng)48h,透析5天，冷凍干燥得到改性明膠固體；
(3)將步驟(I)中得到的改性透明質(zhì)酸固體60mg和步驟(2)中得到的改性明膠固體165mg共同溶解于MES中得到混合溶液，二者體積濃度分別為2%和5. 5% ；
(4)將150mg的MAL-PEG-MAL溶解于MES緩沖液中得到MAL-PEG-MAL溶液；
(5)將步驟(4)得到的MAL-PEG-MAL溶液加入步驟(3)得到的混合溶液中，攪拌均勻后，在50°C水浴中進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)直至形成透明的交聯(lián)水凝膠狀態(tài)；
(6)將步驟(5)得到的水凝膠浸泡在濃度為3%的CS的MES緩沖液中，加入I.5g EDC與Ig NHS并放入搖床中反應(yīng)24h，得到透明質(zhì)酸/明膠/硫酸軟骨素骨修復(fù)仿生支架。
權(quán)利要求
1.透明質(zhì)酸/明膠/硫酸軟骨素骨修復(fù)仿生支架的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)在透明質(zhì)酸的2-(N-嗎啡啉)こ磺酸緩沖液中，加入4-(4,6-ニ甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽活化劑后攪拌0. 5^1h,再逐滴加入糠胺，反應(yīng)24 48h，透析3飛天，冷凍干燥得到改性透明質(zhì)酸固體； (2)在明膠水溶液中加入碳ニ亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺攪拌均勻后，加入呋喃甲酸，反應(yīng)24 48h，透析3飛天，冷凍干燥得到改性明膠固體； (3)將步驟(I)中得到的改性透明質(zhì)酸固體和步驟(2)中得到的改性明膠固體共同溶解于2-(N-嗎啡啉)こ磺酸緩沖液中得到混合溶液； (4)將雙端基馬來酰亞胺聚こ烯醇溶解于2-(N-嗎啡啉)こ磺酸緩沖液中得到雙端基馬來酰亞胺聚こ烯醇溶液； (5)將步驟(4)得到的雙端基馬來酰亞胺聚こ烯醇溶液加入步驟(3)得到的混合溶液中，攪拌均勻后，在37飛(TC水浴中進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)直至形成透明的交聯(lián)水凝膠狀態(tài)； (6)將步驟(5)得到的水凝膠浸泡在硫酸軟骨素鈉鹽的2-(N-嗎啡啉)こ磺酸緩沖液中，加入碳ニ亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺攪拌反應(yīng)24 48h后，得到透明質(zhì)酸/明膠/硫酸軟骨素軟骨修復(fù)仿生支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述透明質(zhì)酸與2-(N-嗎啡啉)こ磺酸緩沖液的質(zhì)量體積比為0. 2^0. 8% ;所述透明質(zhì)酸、糠胺與4-(4，6- ニ甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽的摩爾比為1:2: (2飛)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述明膠水溶液的濃度為0. 5^1. 5% w/v ;所述碳ニ亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為3:2，且碳ニ亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的總質(zhì)量為明膠質(zhì)量的4/5 ;所述呋喃甲酸與明膠的質(zhì)量比為(廣3) :4。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)和步驟(2)中，所述透析的截留分子量為14000 ;所述冷凍干燥的步驟為先于-2(T-70°C冷凍24 48h成冰狀，然后繼續(xù)凍干48 72h。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述混合溶液中改性透明質(zhì)酸固體的濃度為廣2% w/v，改性明膠固體的濃度為0. 5^1. 5% w/v。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述雙端基馬來酰亞胺聚こ烯醇的質(zhì)量與改性透明質(zhì)酸固體和改性明膠固體的質(zhì)量之和的比值為1:2 2: I。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟(6)中，所述硫酸軟骨素鈉鹽與2-(N-嗎啡啉)こ磺酸緩沖液的質(zhì)量體積比為f 3% ;所述碳ニ亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為3:2，且碳ニ亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的總質(zhì)量為硫酸軟骨素鈉鹽質(zhì)量的4/5。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述2-(N-嗎啡啉)こ磺酸緩沖液的濃度為 10Ommol/T,, pH=5. 5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種透明質(zhì)酸/明膠/硫酸軟骨素軟骨修復(fù)仿生支架的制備方法，包括如下步驟在透明質(zhì)酸的MES緩沖液中，加入活化劑和糠胺，得到改性透明質(zhì)酸固體，在明膠水溶液中加入EDC/NHS，再加入呋喃甲酸，得到改性明膠固體，將二者溶于MES緩沖液中得到混合溶液；將MAL-PEG-MAL溶于MES緩沖液，再加入混合溶液中，37℃水浴進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)形成透明的交聯(lián)水凝膠；將水凝膠浸泡在硫酸軟骨素鈉鹽的MES緩沖液中，加入EDC/NHS攪拌反應(yīng)，得到軟骨修復(fù)仿生支架。本發(fā)明制備的仿生支架具有相互貫穿的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有優(yōu)良的生物相容性和生物活性，以及更好的抗壓強(qiáng)度、抗?jié)⑸⑿院徒到庑阅?，制備工藝簡單易操作?br> 文檔編號A61L27/22GK102772823SQ20121025900
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月25日
發(fā)明者余鳳, 張青, 曹曉東, 曾蕾, 陳曉峰 申請人:華南理工大學(xué)