專利名稱：用于治療眼新血管疾病的組合治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及眼科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及采用能抑制血小板衍生生長因子(TOGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的試劑的組合治療眼的新血管疾病。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生，又被稱作新生血管形成，包括由現(xiàn)存的血管形成新枝(sprout)，以及它們侵入周圍的組織。一種相關(guān)的過程，血管發(fā)生(vasculogenesis)包括業(yè)已存在于整個(gè)組織中的內(nèi)皮細(xì)胞和成血管細(xì)胞的分化，以及它們隨后連接在一起以便形成血管。血管發(fā)生廣泛出現(xiàn)在發(fā)育期間，并且還出現(xiàn)在創(chuàng)傷愈合期間的健康身體內(nèi)，以便在損傷或傷害之后恢復(fù)血液流向組織。不過，血管發(fā)生也與癌和腫瘤形成相關(guān)。實(shí)際上，腫瘤組織中血管的量是乳腺癌(Weidner 等，(1992) J. Natl. Cancer Inst. 84 :1875-1887)、前列腺癌(Weidner 等,(1993) Am. J. Pathol. 143 :401-409)、腦腫瘤(Li 等,(1994) Lancet344 :82-86)和黑素瘤(Foss 等，(1996)Cancer Res. 56 =2900-2903)的有力的消極預(yù)后指標(biāo)。最近發(fā)現(xiàn)，血管發(fā)生與許多醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的其他疾病狀態(tài)相關(guān)，包括風(fēng)濕病學(xué)、皮膚病學(xué)、心臟病學(xué)和眼科學(xué)。具體地講，不希望的或病理學(xué)組織特異性血管發(fā)生與某些特殊疾病狀態(tài)相關(guān)，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化和銀屑病(參見例如，F(xiàn)an等，(1995)TrendSPharmacol. Sci. 16 :57 ;和 Folkman(1995)Nature Med. I :27)。另外，血管通透性的改變被認(rèn)為在正常和病理學(xué)生理過程中起著作用(Cullinan-Bove等，(1993)Endocrinol. 133 :829 ;Senger 等，(1993) Cancer and Metastasis Reviews 12:303)。盡管血管生成過程在上述每一種疾病中都可能與發(fā)育血管發(fā)生和腫瘤血管發(fā)生共有很多特征，但是各自可能具有由于周圍細(xì)胞的影響產(chǎn)生的特殊的特征。若干眼疾病涉及血管發(fā)生的改變。例如，糖尿病性視網(wǎng)膜病，是導(dǎo)致成年人失明的第三大原因(在美國占失明人數(shù)的幾乎7%)，與廣泛的血管生成事件相關(guān)。非增殖性視網(wǎng)膜病伴隨著視網(wǎng)膜內(nèi)的周細(xì)胞的選擇性喪失，并且它們的喪失導(dǎo)致了相關(guān)毛細(xì)血管的擴(kuò)張，并且導(dǎo)致了血流的增加。在擴(kuò)張的毛細(xì)血管中，內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并且形成外翻，它形成微動(dòng)脈瘤，并且相鄰的毛細(xì)血管被阻塞，從而微動(dòng)脈瘤周圍的視網(wǎng)膜區(qū)域沒有被灌注。最終，支路血管出現(xiàn)在相鄰的微動(dòng)脈瘤區(qū)域之間，并且可以看到具有微動(dòng)脈瘤的早期糖尿病性視網(wǎng)膜病和無灌注的視網(wǎng)膜區(qū)域的臨床圖像。微動(dòng)脈瘤泄漏，并且毛細(xì)血管可能出血，導(dǎo)致滲出物和出血。一旦確定了背景糖尿病性視網(wǎng)膜病的起始階段，所述狀況會(huì)發(fā)展數(shù)年時(shí)間段，發(fā)展成增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病，并且導(dǎo)致大約5%的失明病例。當(dāng)視網(wǎng)膜的某些區(qū)域持續(xù)喪失它們的毛細(xì)血管并變得不能灌注，從而導(dǎo)致在視網(wǎng)膜盤和其他地方出現(xiàn)新血管時(shí)，發(fā)生增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病。這些新血管生長成玻璃體，并且容易出血，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜前出血。在晚期增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病中，大量的玻璃體出血可能填充玻璃體腔的大部分。另外，新血管伴隨著纖維組織增殖，它可能導(dǎo)致牽引視網(wǎng)膜脫離。糖尿病性視網(wǎng)膜病主要與糖尿病的持續(xù)時(shí)間相關(guān)；因此,隨著人群年齡和糖尿病患者生活的更長，糖尿病性視網(wǎng)膜病的流行率將增加。激光治療目前被用于非增殖性和增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病。黃斑區(qū)周圍的泄漏性微動(dòng)脈瘤的病灶激光治療使患有臨床上顯著的黃斑水腫的患者視力的喪失降低了 50%。在增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病中，全視網(wǎng)膜光凝固導(dǎo)致了在整個(gè)視網(wǎng)膜上散布數(shù)千個(gè)微小的灼傷(避開黃斑區(qū))；這種治療能降低失明比例60%。黃斑水腫和增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病的早期治療能預(yù)防95%的患者在五年時(shí)間內(nèi)失明，而晚期治療只能防止50%的患者失明。因此，早期診斷和治療是重要的。涉及新生血管形成的另一種眼疾病是年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)，這是一種影響65歲以上的大約1/10的美國人的疾病。AMD的特征是黃斑，即視網(wǎng)膜中心區(qū)的一系列病理 學(xué)變化，這種變化伴隨著降低的視敏度，特別是影響中心視力。AMD涉及被稱為視網(wǎng)膜色素上皮的單層細(xì)胞，它緊位于感覺視網(wǎng)膜下面。這些細(xì)胞滋養(yǎng)并且支持與它們接觸的視網(wǎng)膜部分，即，包含視色素的感光細(xì)胞。視網(wǎng)膜色素上皮位于玻璃膜上，它是基底膜復(fù)合物，在AMD患者中，它會(huì)增厚并且硬化。新血管可能從下脈絡(luò)膜穿透玻璃膜，它包括豐富的血管床。這些血管可能會(huì)泄漏流體或者在視網(wǎng)膜色素上皮下面出血，并且還可能在視網(wǎng)膜色素上皮和感覺視網(wǎng)膜之間出血。隨后的纖維狀瘢痕形成會(huì)破壞感光細(xì)胞的營養(yǎng)，并且導(dǎo)致這些細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致中央視敏度的喪失。這種類型的年齡相關(guān)性黃斑病變被稱作“潮濕”類型的，這是因?yàn)樾孤┑难芎鸵暰W(wǎng)膜下水腫或血液。潮濕類型只占年齡相關(guān)性黃斑病變病例的10%，但是導(dǎo)致了老年人中90%的病例因?yàn)辄S斑變性而為法定盲?！案稍铩鳖愋偷哪挲g相關(guān)性黃斑病變涉及視網(wǎng)膜色素上皮的分解，以及上面感光細(xì)胞的喪失。干燥類型的病變會(huì)降低視力，但是通常只有20/50-20/100的水平。AMD伴隨著中心視力的失真，使目標(biāo)變大或變小或直線出現(xiàn)扭曲、彎曲或沒有中心段。在潮濕類型的AMD中，在黃斑區(qū)可能注意到感覺視網(wǎng)膜的小的脫離，不過，視網(wǎng)膜下新生血管膜的最終診斷需要熒光素血管造影術(shù)。在所述干燥類型中，玻璃疣可能干擾黃斑區(qū)的色素沉著模式。玻璃疣是視網(wǎng)膜色素上皮的基底膜的贅疣，它能突出進(jìn)入細(xì)胞，從而導(dǎo)致所述細(xì)胞前部膨脹；它們作為年齡相關(guān)性黃斑病變的危險(xiǎn)因素的原因尚不清楚。目前還沒有用于治療干燥類型的年齡相關(guān)性黃斑病變的方法。激光治療被用于潮濕類型的年齡相關(guān)性黃斑病變，并且最初消除了新生血管膜，并且在18個(gè)月時(shí)阻止了大約50%患者的進(jìn)一步視力喪失。不過，到60個(gè)月時(shí)，只有20%的患者仍然有顯著效果。業(yè)已鑒定了血管發(fā)生的多種分子介體，包括堿性和酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF，bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α和β (TGFa，TGFP )、血小板衍生生長因子(TOGF)、血管生成素、血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(F1D-ECGF)、白細(xì)胞介素-8 (IL-8)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。參與血管發(fā)生的其他刺激物包括血管生成素(angiopoietirO-l、Del-1、卵泡抑素(follistatin)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、苗條蛋白、midkine、胎盤生長因子、多效蛋白(PTN)、progranulin、增殖蛋白和腫瘤壞死因子-α (TNF-α)。另外，血管發(fā)生的控制還可以通過由身體產(chǎn)生的血管發(fā)生的多種負(fù)調(diào)節(jié)劑介導(dǎo)，包括angioarrestin、血管抑素(血纖蛋白溶酶原片段)、抗血管生成抗凝血酶III、軟骨-衍生的抑制劑(⑶I)、⑶59補(bǔ)體片段、內(nèi)皮抑制素(endostatin)(膠原XVIII片段)、纖連蛋白片段、gro-β、肝素酶、肝素多聚己糖片段、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、干擾素α/β/Y、干擾素誘導(dǎo)型蛋白(IP-IO)、白細(xì)胞介素-12、kringle 5 (血纖蛋白溶酶原片段)、金屬蛋白酶抑制劑(HMPs)、2_甲氧雌留二醇、胎盤核糖核酸酶抑制劑、血纖蛋白溶酶原激活物抑制劑、血小板因子-4(PF4)、促乳素16kD片段、增殖蛋白-相關(guān)蛋白(PRP)、類視黃醇、四氫皮質(zhì)醇-S、血小板反應(yīng)蛋白-I (TSP-I)、脈管抑素(vasculostatin)和血管抑制因子(vasostatin) (I丐網(wǎng)蛋白片段)。在上述血管生成調(diào)節(jié)劑中，VEGF似乎作為伴隨著腫瘤生長的異常血管發(fā)生的正調(diào)節(jié)劑發(fā)揮關(guān)鍵作用(綜述參見 Brown 等，(1996) Control of Angiogenesis (Goldberg andRosen, eds. ) Birkhauser, Basel, Thomas (1996) J. Biol. Chem. 271 :603-606)。另外，最近業(yè)已研究了信號(hào)傳導(dǎo)分子的I3DGF家族的TOGF-B成員的作用，因?yàn)樗坪踉谘苤車?xì)胞的形成、擴(kuò)增和正常功能方面發(fā)揮作用，所述血管周圍細(xì)胞有時(shí)被稱作壁細(xì)胞，例如，血管 平滑肌、腎小球膜細(xì)胞和周細(xì)胞。盡管對(duì)與發(fā)育、傷口愈合和腫瘤形成伴隨的血管發(fā)生或新生血管形成的了解較多，但仍然需要確定在血管發(fā)生和眼血管發(fā)生之間是否存在差異。很顯然，盡管伴隨著，例如，心臟上的側(cè)支血管形成的血管發(fā)生可能對(duì)生物有利并且適應(yīng)生物，但伴隨著例如AMD的病理性眼新生血管形成沒有已知的好處，并且通常會(huì)導(dǎo)致失明(有關(guān)綜述參見Campochiaro (2000) J. Cell. Physiol. 184 :301-10)。因此,盡管對(duì)伴隨新生血管形成的分子事件的理解業(yè)已取得了進(jìn)展，但仍然需要利用這些理解去開發(fā)用于治療新血管疾病的其他方法，所述疾病包括眼新血管疾病和諸如與AMD和糖尿病性視網(wǎng)膜病伴隨出現(xiàn)的脈絡(luò)膜新生血管形成的疾病。發(fā)明概述業(yè)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，抗-VEGF和抗-PDGF劑的組合，在治療眼新血管疾病時(shí)能提供協(xié)同治療效果。因此，本發(fā)明特征在于用于治療被診斷患有或有危險(xiǎn)發(fā)展為新血管疾病的患者的方法。該方法包括給所述患者施用抗-VEGF劑和抗-PDGF劑，作為主要或輔助治療。一方面，本發(fā)明提供了用于抑制有所述需要的患者的新血管疾病的方法，其通過同時(shí)或相互間隔約90天之內(nèi)給患者施用TOGF拮抗劑和VEGF拮抗劑來實(shí)現(xiàn)，使用量足以抑制所述患者的新血管疾病。另一方面，本發(fā)明提供了用于治療有所述需要的患者的方法，所述患者被診斷患有或有危險(xiǎn)發(fā)展為新血管疾病，其通過同時(shí)或相互間隔90天之內(nèi)給患者施用TOGF拮抗劑和VEGF拮抗劑來實(shí)現(xiàn)，以足以治療患者的用量施用。在這些方面的特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在相互間隔大約10天內(nèi)施用PDGF拮抗劑和VEGF拮抗劑。在本發(fā)明方法的另一種實(shí)施方案中，所述I3DGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是在相互間隔5天內(nèi)施用的。在本發(fā)明方法的另一種實(shí)施方案中，所述TOGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是在相互間隔約24小時(shí)內(nèi)施用的。在本發(fā)明方法的特定實(shí)施方案中，所述PDGF拮抗劑和所述VEGF拮抗劑是同時(shí)施用的。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用I3DGF拮抗劑，它是TOGF-B拮抗劑。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用VEGF拮抗劑，它是VEGF-A拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用TOGF拮抗劑，它是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體、抗體片段的結(jié)合片段、糖、聚合物或小有機(jī)化合物。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用VEGF拮抗劑，它是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體、抗體片段的結(jié)合片段、糖、聚合物或小有機(jī)化合物。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用VEGF拮抗劑，它是適體，如EYE001適體。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用VEGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用I3DGF拮抗劑，它是適體、抗體或其結(jié)合片段。在另一種具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用TOGF拮抗劑，它是反義寡核苷
酸。 在本發(fā)明這一方面的另一種實(shí)施方案中，所述I3DGF拮抗劑和/或所述VEGF拮抗劑是前藥。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供了用于抑制或治療眼新血管疾病的手段。在某些實(shí)施方案中，適合通過本發(fā)明的方法治療或抑制的眼新血管疾病包括缺血性視網(wǎng)膜病、虹膜新生血管形成、眼內(nèi)新生血管形成、年齡相關(guān)性黃斑變性、角膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新生血管形成、脈絡(luò)膜新生血管形成、糖尿病性視網(wǎng)膜缺血或增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供了用于抑制或治療有所述需要的患者或被診斷患有或有危險(xiǎn)發(fā)展為這種疾病的患者的銀屑病或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的手段。本發(fā)明還提供了包括TOGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的，以及可以藥用的載體的藥用組合物。在這一方面，PDGF和VEGF拮抗劑的使用量都足以抑制所述患者的新血管疾病。在這一方面的一種實(shí)施方案中，所述藥用組合物包括I3DGF拮抗劑，它是TOGF-B拮抗劑。在另一種實(shí)施方案中，所述藥用組合物包括VEGF拮抗劑，它是VEGF-A拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括TOGF拮抗劑，它是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體、抗體片段的結(jié)合片段、糖、聚合物或小有機(jī)化合物。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括VEGF拮抗劑，它是核酸分子、適體、反義RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、環(huán)肽、抗體、抗體片段的結(jié)合片段、糖、聚合物或小有機(jī)化合物。在其他特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括VEGF拮抗劑，它是適體，如EYE001適體。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括VEGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括I3DGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。在另一種具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物包括TOGF拮抗劑，它是反義寡核苷酸。本發(fā)明的藥用組合物可以包括可以藥用的載體，它包括小球體或水凝膠制劑。在另一種實(shí)施方案中，所述TOGF拮抗劑和/或所述VEGF拮抗劑是前藥。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物提供了用于抑制或治療眼新血管疾病的手段。在某些實(shí)施方案中，適合通過本發(fā)明的藥用組合物治療或抑制的眼新血管疾病包括缺血性視網(wǎng)膜病、虹膜新生血管形成、眼內(nèi)新生血管形成、年齡相關(guān)性黃斑變性、角膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新生血管形成、脈絡(luò)膜新生血管形成、糖尿病性視網(wǎng)膜缺血或增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物提供用于在有所述需要的患者，或被診斷患有或有危險(xiǎn)發(fā)展為這種疾病的患者中抑制或治療銀屑病或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的手段。本發(fā)明還提供了包括F1DGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的藥物包(pharmaceuticalpack)。在這一方面的一種實(shí)施方案中，所述藥物包包括TOGF拮抗劑，它是TOGF-B拮抗劑。在這一方面的另一種實(shí)施方案中，所述藥物包包括VEGF拮抗劑，它是VEGF-A拮抗劑。在另一種實(shí)施方案中，所述藥物包的TOGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是分別且以單獨(dú)劑量形式制備的。在另一種實(shí)施方案中，所述藥物包的I3DGF拮抗劑和VEGF拮抗劑是一起制備的。在某些特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物包包括VEGF拮抗劑，它是適體，如EYE001適體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物包包括VEGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物包包括TOGF拮抗劑，它是抗體或其結(jié)合片段。 在其他特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物包包括TOGF拮抗劑，它是反義寡核苷酸。在這一方面的另一種實(shí)施方案中，所述I3DGF拮抗劑和/或所述VEGF拮抗劑是前藥。附圖簡述圖I (A)是人TOGF-B的核酸序列(GenBank編號(hào)X02811) (SEQID NO 1)的示意圖。圖I⑶是人TOGF-B的氨基酸序列(GenBank編號(hào)CAA26579) (SEQ ID NO 2)的示意圖。圖I(C)是人 PDGF-A 的核酸序列(GenBank 編號(hào) X06374) (SEQ ID NO 11)的示意圖。圖I(D)是人 PDGF-A 的多肽序列(GenBank 編號(hào) CAA29677) (SEQ ID NO 12)的示意圖。圖2⑷是人VEGF的核酸序列(GenBank編號(hào)NM_003376) (SEQ ID NO :3)的示意圖。圖2(B)是人 VEGF 多肽氨基酸序列(GenBank 編號(hào) NP_003367) (SEQ ID NO :4)的
示意圖。圖3(A)是人 PDGFR-B 核酸序列(GenBank 編號(hào) NM_002609) (SEQ ID NO :5)的示意圖。圖3(B)是人 I3DGFR-B 多肽序列(GenBank 編號(hào) NP_002600) (SEQ ID NO :6)的示意圖。圖3(C)是人 TOGFR-A 核酸序列(GenBank 編號(hào) NM_006206) (SEQ ID NO :13)的示意圖。圖3(D)是人 PDGFR-A 多肽序列(GenBank 編號(hào) NP_006197) (SEQ ID NO :14)的示意圖。圖4 ⑷是人 VEGFR-I (Flt-I)核酸序列(GenBank 編號(hào) AF063657) (SEQ ID NO 7)的示意圖。圖4(B)是人 VEGFR-I (Flt-I)多肽序列(GenBank編號(hào))(SEQID NO 8)的示意圖。圖4 (C)是人VEGFR-2(KDR/Flk-1)核酸序列(GenBank編號(hào)AF035121) (SEQ ID NO
9)的不意圖。
圖4 (D)是人VEGFR-2(KDR/Flk-1)多肽序列(GenBank編號(hào) AAB88005) (SEQ ID NO
10)的示意圖。圖5是比較對(duì)照處理(cont)、Gleevec處理(抗-PDGF劑)和Macugen 處理(即pegaptanib處理,抗-VEGF劑)的角膜新生血管形成測(cè)定結(jié)果，與用Macugen 和Gleevec的組合處理結(jié)果(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的圖示。圖6㈧是出現(xiàn)在對(duì)照(PEG-處理的)小鼠角膜上的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。圖6(B)是出現(xiàn)在Gleevec-處理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。
圖6(C)是出現(xiàn)在Macugen -處理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。圖6(D)是出現(xiàn)在用Macugen 和Gleevec兩者處理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。圖7(A)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，表示正常的角膜脈管系統(tǒng)不會(huì)受到施用APB5 O3DGFR抗體，抗-PDGF劑)的影響。圖7(B)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，表示正常的角膜脈管系統(tǒng)不受施用Gleevec的影響。圖7(C)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，表示正常的角膜脈管系統(tǒng)不受同時(shí)施用Macugen (Mac)和 Gleevec 的影響。圖7(D)是熒光顯微鏡圖像的照片圖示，表示正常的角膜脈管系統(tǒng)不受施用PEG的影響。圖8是激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管形成測(cè)定結(jié)果的圖示，比較了對(duì)照處理(cont)、Gleevec 處理(抗-PDGF 劑)和 Macugen 處理(即 pegaptanib 處理，抗-VEGF 劑)與用Macugen 和Gleevec組合處理的結(jié)果(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)。圖9是激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管形成測(cè)定結(jié)果的圖示，比較了對(duì)照-處理的(cont)、APB5-處理的(抗-PGFR抗體，它起著抗-PDGF劑的作用)和Macugen處理(即pegaptanib處理,抗-VEGF適體)與用Macugen和APB5 (Mac+APB5)組合處理的結(jié)果。

圖10是視網(wǎng)膜發(fā)育模型結(jié)果的圖示，比較了對(duì)照處理(cont)、ARC-127處理(抗-PDGF 劑)和 Macugen 處理(即 pegaptanib 處理，抗-VEGF 劑)與用 Macugen 和 ARC-127組合處理(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的結(jié)果。圖11是角膜新生血管形成測(cè)定結(jié)果的圖示，比較了對(duì)照處理(cont)、ARC-127處理(抗-PDGF劑)和Macugen處理(即pegaptanib處理，抗-VEGF劑)與用Macugen和ARC-127組合處理(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的結(jié)果。圖12(A)是出現(xiàn)在對(duì)照小鼠角膜中的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。圖12⑶是出現(xiàn)在ARC-127-處理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。圖12(C)是出現(xiàn)在Macugen-處理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。
圖12(D)是出現(xiàn)在用Macugen和ARC-127處理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的熒光顯微鏡圖像的照片圖示。圖13是角膜新生血管形成測(cè)定結(jié)果的圖示，比較了對(duì)照處理(cont)、APB-5處理(抗-PDGF 劑)和 Macugen 處理(即 pegaptanib 處理，抗-VEGF 劑)與用 Macugen 和 APB-5組合處理(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的結(jié)果。圖14是角膜新生血管形成測(cè)定結(jié)果的圖示，比較了對(duì)照處理(cont)、APB-5處理(抗-PDGF 劑)和 Macugen-處理(即 pegaptanib 處理,抗-VEGF 劑)與用 Macugen 和 APB-5組合處理(抗-PDGF/抗-VEGF組合治療)的結(jié)果。發(fā)明詳述在本說明書中所提到的所有文獻(xiàn)、專利和專利申請(qǐng)都被收作本文參考。定義在本文中，以下術(shù)語和短語具有下面所具有的含義。除非另有說明，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所普遍了解的相同含義。“拮抗劑”表示能部分或完全抑制靶分子的活性或產(chǎn)生的試劑。具體地講，術(shù)語“拮抗劑”，在本文中選擇性地使用時(shí)，表示能夠降低H)GF、PDGFR、VEGF或VEGFR基因表達(dá)水平、mRNA水平、蛋白水平或蛋白活性的試劑。拮抗劑的示例性形式包括，例如，蛋白、多肽、肽(如環(huán)肽)、抗體或抗體片段、肽模擬物、核酸分子、反義分子、核酶、適體、RNAi分子和小有機(jī)分子。拮抗劑抑制VEGF/VEGFR和TOGF/PDGFR配體/受體靶的示例性的非限定性機(jī)制包括抑制配體合成和/或穩(wěn)定性(例如，使用靶定配體基因/核酸的反義、核酶或RNAi組合物)、阻斷配體與它的同源受體的結(jié)合(例如，使用抗-配體適體、抗體或可溶性引誘同源受體)、抑制受體合成和/或穩(wěn)定性(例如，使用靶定配體受體基因/核酸的反義、核酶或RNAi組合物)、阻斷受體與它的同源受體的結(jié)合(例如，使用受體抗體)和阻斷受體被它的同源配體的激活(例如，使用受體酪氨酸激酶抑制劑)。另外，所述拮抗劑可以直接或間接抑制IE分子。在本文中，術(shù)語“抗體”意在包括完整的抗體，例如，任何同種型的抗體(IgG、IgA、IgM、IgE等)，并且包括能夠識(shí)別并且還能與脊椎動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物)蛋白、糖類等特異性起反應(yīng)的它們的片段?？贵w可以使用常規(guī)技術(shù)片段化，并且以上述完整抗體相同的方式篩選這些片段的用途。因此，該術(shù)語包括抗體分子的蛋白酶剪切的片段或重組制備的部分，它能夠與某些蛋白選擇性地起反應(yīng)。所述蛋白酶解和/或重組片段的非限定性例子包括Fab、F(ab' )2、Fab'、Fv和單鏈抗體(scFv)，它包括通過肽接頭結(jié)合的V[L]和/或V[H]結(jié)構(gòu)域。所述scFv' s可以共價(jià)或非共價(jià)連接，以便形成具有兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)合位點(diǎn)的抗體。本發(fā)明包括多克隆抗體、單克隆抗體或抗體的其他純化制劑和重組抗體。在這里，術(shù)語“適體”，可以與術(shù)語“核酸配體”互換使用，它表示核酸，所述核酸通過它適應(yīng)特殊的三維構(gòu)象的能力，能結(jié)合靶分子并且對(duì)它具有拮抗作用(即，抑制)。本發(fā)明的靶是I3DGF或VEGF (或它們的同源受體I3DGFR或VEGFR之一)，因此，使用了術(shù)語I3DGF適體或核酸配體或VEGF適體或核酸配體(或I3DGFR適體或核酸配體或VEGFR適體或核酸配體)。所述適體對(duì)靶的抑制可以通過下述方式進(jìn)行靶的結(jié)合，催化性改變靶，以修飾/改變靶或靶的功能活性的方式與靶起反應(yīng)，作為自殺抑制劑與靶共價(jià)附著，促進(jìn)靶和其他分子之間的反應(yīng)。適體可以包括多個(gè)核糖核苷酸單位、脫氧核糖核苷酸單位或這兩種類型核苷酸殘基的混合物。適體還可以包括一個(gè)或多個(gè)修飾過的堿基、糖或磷酸酯主鏈單位，正如在本文中進(jìn)一步描述的。“抗體拮抗劑”表示本文所定義的抗體分子，它能阻斷或顯著減弱靶TOGF或VEGF的一種或多種活性。例如，VEGF抑制抗體可以抑制或減弱VEGF刺激血管發(fā)生的能力。如果兩個(gè)序列的每一個(gè)堿基都匹配，即能夠形成沃森-克里克(Watson Crick)堿基對(duì)，那么一種核苷酸序列就是與另一種核苷酸序列“互補(bǔ)的”。術(shù)語“互補(bǔ)鏈”在這里可以與術(shù)語“互補(bǔ)體”互換使用。核酸鏈的互補(bǔ)體可以是編碼鏈的互補(bǔ)體或非編碼鏈的互補(bǔ)體。短語“保守殘基”或“保守性氨基酸取代”表示基于某些共同特性的氨基酸分組。確定獨(dú)立氨基酸之間的共同特性的功能性途徑是分析同源生物的相應(yīng)蛋白之間的 氨基酸變化的歸一化頻率。根據(jù)所述分析，可以確定氨基酸的組，其中，一組中的氨基酸優(yōu)選能夠彼此交換，因此，它們?cè)趯?duì)總的蛋白結(jié)構(gòu)的影響上最彼此類似(Schulz，G.E.和R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag)。以這種方式石角定的氨基酸組的例子包括(i)帶電荷的組，由Glu和Asp、Lys、Arg和His組成,(ii)帶正電荷的組，由Lys、Arg和His組成，(iii)帶負(fù)電荷的組，同Glu和Asp組成，(iv)芳族組，由 Phe、Tyr 和 Trp 組成，(V)氮環(huán)組，由His和Trp組成，(vi)大的脂族非極性組，由Val、Leu和Ile組成，(vii)略微極性組，由Met和Cys組成，(viii)小殘基組，由 Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln 和 Pro 組成，(ix)脂族組，由 Val、Leu、lie、Met 和 Cys 組成，和(X)小輕基組，由Ser和Thr組成。除上面所列舉的組之外，每一種氨基酸殘基可以形成它自身的組，并且由單獨(dú)的氨基酸形成的組可以簡單地通過本領(lǐng)域常用的氨基酸的單字母和/或三字母的縮寫來表
/Jn ο在本文中，術(shù)語“相互作用”實(shí)際上表示包括分子之間的可檢測(cè)的關(guān)系或結(jié)合(例如，生物化學(xué)相互作用)，如蛋白-蛋白、蛋白-核酸、核酸-核酸和蛋白-小分子或核酸-小分子之間的相互作用。術(shù)語“相互作用的蛋白”表示能夠與目標(biāo)蛋白相互作用、結(jié)合和/或以其他方式結(jié)合的蛋白，例如，PDGF或VEGF蛋白，或它們的相應(yīng)的同源受體。在本文中，與核酸，如DNA或RNA相應(yīng)的術(shù)語“分離的”，表示與存在于所述大分子天然來源中的其他DNAs或RNAs分別分離的分子。類似的，在本文中，與多肽相應(yīng)的術(shù)語“分離的”表示與所述多肽的來源中存在的其他蛋白分離的蛋白分子。在本文中，術(shù)語分離的還表示在通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí)基本上不含細(xì)胞材料、病毒材料或培養(yǎng)基的核酸或肽,或者在通過化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)試劑?！胺蛛x的核酸”表示包括核酸片段，它不是作為片段天然存在的，并且不會(huì)以天然狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)。術(shù)語“分離的”在這里還用于表示多肽，它是從其他細(xì)胞蛋白中分離的，并且表示包括純化的和重組多肽兩者。
在本文中，術(shù)語“標(biāo)記”和“可檢測(cè)標(biāo)記”表示能夠檢測(cè)的分子，包括，但不局限于，放射性同位素、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光部分、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、染料、金屬離子、配體(例如，生物素或半抗原)等。術(shù)語“熒光劑”表示能夠表現(xiàn)出可檢測(cè)范圍的熒光的物質(zhì)或它的部分?？梢栽诒景l(fā)明中使用的標(biāo)記的具體例子包括熒光素、若丹明、丹酰、傘形酮、德克薩斯紅、魯米諾、NADPH、α-β-半乳糖苷酶和辣根過氧化物酶?！盎蛟诩?xì)胞中的表達(dá)水平”表示由所述細(xì)胞中的基因編碼的mRNA，以及前-mRNA新生轉(zhuǎn)錄物，轉(zhuǎn)錄物加工中間物，成熟mRNA和降解產(chǎn)物的水平，以及由所述基因翻譯的蛋白的水平。在本文中，術(shù)語“核酸”表示多核苷酸，如脫氧核糖核酸(DNA)，且如果合適的話，還表示核糖核酸(RNA)。該術(shù)語還應(yīng)當(dāng)被理解成包括由核苷酸類似物制備的RNA或DNA類似物作為等同物，以及在用于所述實(shí)施方案時(shí)，單鏈(有義或反義)和雙鏈多核苷酸、ESTs、染色體、cDNAs、mRNAs和rRNAs是可以被稱作核酸的分子的代表性例子。術(shù)語“寡核苷酸”表示核苷酸或核苷單體的寡聚體或多聚體，它是由天然存在的堿 基糖類和糖間(主鏈)鍵組成的。該術(shù)語還包括修飾過的或取代過的寡聚體，包括非天然存在的單體或它的部分，它們起著類似的作用。取代過的寡聚體的整合是基于多種因素的，包括增強(qiáng)了的細(xì)胞攝取，或增強(qiáng)了的核酸酶抗性，并且是根據(jù)本領(lǐng)域公知方法選擇的。完整的寡核苷酸或者僅是它的一部分可以包括取代過的寡聚體。術(shù)語“百分比同一性”表示兩種氨基酸序列或兩種核苷酸序列之間的序列同一性。同一性可以通過比較在每一種序列上的位置確定，它們可以是為了比較而進(jìn)行比對(duì)的。當(dāng)比較的序列上的相同位置被相同的堿基或氨基酸所占據(jù)時(shí)，所述分子在該位置上是相同的；當(dāng)相同的位點(diǎn)被相同或類似的氨基酸殘基(例如，在空間和/或電子性質(zhì)方面類似)所占據(jù)時(shí)，所述分子可以被稱作在該位置上是同源的(類似的)。同源性、相似性或同一性的百分比表示由比較序列所共有的位置上相同或相似氨基酸的數(shù)目的函數(shù)?？梢允褂酶鞣N比對(duì)算法和 / 或程序，包括 Hidden Markov Model (HMM)、FASTA 和 BLAST。HNiM、FASTA和 BLAST 可以從以下機(jī)構(gòu)獲得the National Center for Biotechnology Information>National Library of Medicine、National Institutes of Health,Bethesda, Md.和 theEuropean Bioinformatic Institute EBI。在一種實(shí)施方案中，兩種序列的百分比同一性可以通過所述GCG程序確定，其缺口權(quán)重為1，例如，對(duì)每一個(gè)氨基酸缺口進(jìn)行加權(quán)，就如同它是兩個(gè)序列之間的單個(gè)氨基酸或核苷酸錯(cuò)配。用于比對(duì)的其他技術(shù)描述于以下文獻(xiàn)中Methods in Enzymology, vol. 266 Computer Methods for Macromolecular SequenceAnalysis(1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace& Co. , San Diego,California,美國。如果需要的話,將允許序列中存在缺口的比對(duì)程序用于比對(duì)所述序列。Smith Waterman是一種類型的允許在序列比對(duì)中存在缺口的算法(參見(1997)Meth. Mol. Biol. 70 :173-187)。同樣，采用 Needleman 和 Wunsch 比對(duì)方法的 GAP程序可用于比對(duì)序列。包括使用HMM的更多的技術(shù)和算法描述于以下文獻(xiàn)中Sequence，Structure, and Databanks A Practical Approach (2000), ed. Oxford UniversityPress, Incorporated and in Bioinformatics !Databases and Systems(1999)ed. KluwerAcademic Publishers。另一種檢索策略使用了 MPSRCH軟件，該軟件在MASPAR計(jì)算機(jī)上運(yùn)行。MPSRCH使用Smith-Watermnan算法在大量并行計(jì)算機(jī)上對(duì)序列進(jìn)行評(píng)分。這種方法改善了挑選關(guān)系較遠(yuǎn)的匹配的能力，并且特別能耐受小的缺口和核苷酸序列錯(cuò)誤。可以將核酸編碼的氨基酸序列用于檢索蛋白和DNA數(shù)據(jù)庫。具有獨(dú)立序列的數(shù)據(jù)庫描述于以下文獻(xiàn)中Methods in Enzymology, ed. Doolittle,同上。數(shù)據(jù)庫包括 Genbank、EMBL 和日本的DNA 數(shù)據(jù)庫(DDBJ)?！巴耆ヅ涞摹痹诒硎倦p鏈體時(shí)，表示由形成所述雙鏈體的多核苷酸或寡核苷酸鏈彼此形成了雙鏈結(jié)構(gòu)，以便在每一條鏈上的每一個(gè)核苷酸都與另一條鏈上的核苷酸發(fā)生了沃森-克里克堿基配對(duì)。該術(shù)語還可以包含可以應(yīng)用的核苷類似物的配對(duì)，如脫氧肌苷、具有2-氨基嘌呤堿基的核苷等。靶多核苷酸和寡核苷酸或多核苷酸之間的雙鏈體的錯(cuò)配表示所述雙鏈體上的一對(duì)核苷酸不能進(jìn)行沃森-克里克結(jié)合。在提到三鏈體時(shí)，該術(shù)語表示三鏈體由完全配對(duì)的雙鏈體和第三條鏈組成，其中，每一個(gè)核苷酸都與完全匹配的雙鏈體上的堿基對(duì)發(fā)生了 Hoogsteen或反向Hoogsteen結(jié)合。術(shù)語“RNA干擾”、“RNAi”或“siRNA”都表示通過將一個(gè)或多個(gè)雙鏈RNAs導(dǎo)入靶細(xì)胞中來減弱基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)的任何方法，所述RNA與目標(biāo)基因同源(特別是與目標(biāo)基因，例如，PDGF或VEGF的信使RNA同源)。 多態(tài)變體還可以包括“單核苷酸多態(tài)性”(SNPs)，其中，所述多核苷酸序列有一個(gè)堿基的改變(例如，在I3DGF或VEGF中的一個(gè)堿基的改變)。SNPs的存在可以是，例如，某些群體、疾病狀態(tài)或出現(xiàn)疾病狀態(tài)的傾向的指標(biāo)。異常“特征(profile) ”，例如，腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)表示因?yàn)榧膊顟B(tài)而改變的細(xì)胞的各種成分的含量。細(xì)胞成分包括RNA水平、蛋白豐度水平或蛋白活性水平。在這里，術(shù)語“蛋白”可以與術(shù)語“肽”和“多肽”互換使用。術(shù)語“重組蛋白”表示通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的本發(fā)明的的蛋白，其中，一般將編碼表達(dá)的蛋白或RNA的DNA插入合適的表達(dá)載體，該表達(dá)載體又被用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以便產(chǎn)生異源蛋白或RNA。另外，短語“源于”，在關(guān)于編碼重組蛋白的重組基因時(shí)，是指在“重組蛋白”的含義內(nèi)，包括具有天然蛋白的氨基酸序列，或與它類似的通過突變產(chǎn)生的氨基酸序列的蛋白，所述突變包括天然存在的蛋白的取代和缺失。在本文中，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”表示核酸序列(編碼例如，靶核酸之一，或它的反義轉(zhuǎn)錄物)，業(yè)已將所述核酸序列導(dǎo)入了細(xì)胞。對(duì)于導(dǎo)入了它的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞來說，轉(zhuǎn)基因可以是部分或完全異源的，即，外源的，或者與導(dǎo)入了它的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞的內(nèi)源基因同源，不過，它們被設(shè)計(jì)成或已經(jīng)以這樣的方式插入所述動(dòng)物的基因組，以便改變插入了它的細(xì)胞的基因組(例如，它被插入的位置不同于天然基因的位置，或者它的插入導(dǎo)致了敲除)。轉(zhuǎn)基因還能夠以附加體的形式存在于細(xì)胞中。轉(zhuǎn)基因可以包括一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，以及任何其他核酸，如內(nèi)含子，它們可能是所選核酸的最佳表達(dá)所必需的。“新血管疾病”表示以改變了的或不受調(diào)控的血管發(fā)生為特征的疾病，其中伴隨著致癌性或致瘤性轉(zhuǎn)化的疾病，即，癌癥除外。新血管疾病的例子包括銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和眼新血管疾病，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病和年齡相關(guān)性黃斑變性。在本文中，術(shù)語“新生血管形成”和“血管發(fā)生”可以互換使用。新生血管形成和血管發(fā)生表示產(chǎn)生新血管進(jìn)入細(xì)胞、組織或器官。血管發(fā)生的控制通常在某些疾病狀態(tài)中發(fā)生改變，并且，在很多場(chǎng)合下，與所述疾病相關(guān)的病理學(xué)損傷與改變了的、不受調(diào)控的或不受控制的血管發(fā)生相關(guān)。持久的、不受調(diào)控的血管發(fā)生出現(xiàn)在多種疾病狀態(tài)中，包括以內(nèi)皮細(xì)胞異常生長為特征的疾病，并且支持在這些狀況中出現(xiàn)的病理學(xué)損傷，包括血管的泄漏和通透性?！把坌卵芗膊　笔且曰颊哐壑懈淖兞说幕虿皇苷{(diào)控的血管發(fā)生為特征的疾病。實(shí)例性的眼新血管疾病包括視神經(jīng)盤新生血管形成、虹膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新生血管形成、脈絡(luò)膜新生血管形成、角膜新生血管形成、玻璃體新生血管形成、綠內(nèi)障、血管翳、翼狀胬肉、黃斑水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性黃斑水腫、血管原性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜變性、葡萄膜炎、視網(wǎng)膜炎性疾病和增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變。術(shù)語“治療”受試者的新血管疾病或“治療”患有新血管疾病的受試者表示讓所述受試者接受藥物治療，例如，施用藥物，以便減弱新血管疾病的至少一種癥狀。因此，在本文中，術(shù)語“治療”意在包括治愈和改善新血管狀況或疾病的至少一種癥狀。因此，在本文中，“治療”包括施用或開處藥用組合物，用于治療或預(yù)防眼新血管疾病?！盎颊摺北硎救魏蝿?dòng)物。術(shù)語“動(dòng)物”包括哺乳動(dòng)物，包括，但不局限于人和其他靈長類。該術(shù)語還包括家畜，如牛、豬、羊、馬、狗和貓。 “roGF”或“血小板衍生生長因子”表示能影響血管發(fā)生或血管生成過程的哺乳動(dòng)物血小板衍生生長因子。在本文中，術(shù)語“roGF”包括TOGF的各種亞型，包括roGF-B (參見圖I(A)和(B))和PDGF-A(參見圖I(C)和(D))。另外，在本文中，術(shù)語“PDGF”表示TOGF-相關(guān)的血管生成因子，如I3DGF-C和TOGF-D，它們通過同源TOGF受體起作用，刺激血管發(fā)生或血管生成過程。具體地講，術(shù)語“PDGF”表示生長因子種類的任何成員，它能夠⑴與諸如PDGFR-B (參見圖3 (A)和(B))或PDGFR-A (參見圖3 (C)和(D))的PDGF受體結(jié)合；(ii)激活與VEGF受體相關(guān)的酪氨酸激酶活性；和(iii)從而影響血管發(fā)生或血管生成過程。在本文中，術(shù)語“TOGF” 一般表示生長因子種類的以下成員，它能通過結(jié)合并且激活反應(yīng)性細(xì)胞類型上的血小板衍生生長因子細(xì)胞表面受體(即，PDGFR)來誘導(dǎo)DNA合成和有絲分裂發(fā)生。TOGFs能實(shí)現(xiàn)的特殊生物學(xué)作用包括，例如定向細(xì)胞遷移(趨化性)和細(xì)胞激活；磷脂酶激活；增強(qiáng)了的磷脂酰肌醇周轉(zhuǎn)和前列腺素代謝；刺激反應(yīng)性細(xì)胞的膠原和膠原酶合成；改變細(xì)胞代謝活性，包括基質(zhì)合成，細(xì)胞因子產(chǎn)生，和脂蛋白吸收；在缺少I3DGF受體的細(xì)胞中增殖性反應(yīng)的間接誘導(dǎo)；和有效的血管收縮活性。術(shù)語“TOGF”表示包括“TOGF”多肽及其相應(yīng)的“TOGF”編碼基因或核酸。"PDGF-A"表示TOGF的A鏈多肽及其相應(yīng)的編碼基因或核酸?！癏)GF-B”表示TOGF的B鏈多肽及其相應(yīng)的編碼基因或核酸?！癡EGF”或“血管內(nèi)皮生長因子”表示能影響血管發(fā)生或血管生成過程的哺乳動(dòng)物血管內(nèi)皮生長因子。在本文中，術(shù)語“VEGF”包括VEGF的各種亞型(又被稱作血管通透因子(VPF)和VEGF-A)(參見圖2(A)和(B))，它們是通過例如，VEGF-A/VPF基因的可變剪接產(chǎn)生的，包括VEGF121、VEGF165和VEGF189。另外，在本文中，術(shù)語“VEGF”表示VEGF-相關(guān)的血管生成因子，如PIGF (胎盤生長因子)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E，它們通過同源VEFG受體起作用，刺激血管發(fā)生或血管生成過程。具體地講，術(shù)語“VEGF”表示生長因子種類的任何成員，它能⑴與諸如 VEGFR-I (Flt-I)(參見圖 4(A)和(B))、VEGFR-2 (KDR/Flk-Ι)(參見圖4 (C)和(D))或VEGFR-3 (FLT-4)的VEGF受體結(jié)合；(ii)激活與VEGF受體相關(guān)的酪氨酸激酶活性；和(iii)從而影響血管發(fā)生或血管生成過程。術(shù)語“VEGF”意在包括“VEGF”多肽及其相應(yīng)的“VEGF”編碼基因或核酸。
“roGF拮抗劑”表示能夠部分或完全減弱，或抑制roGF活性或產(chǎn)生的試劑。roGF拮抗劑能夠直接或間接減少或抑制特殊的roGF，如roGF-B。另外，與上述“拮抗劑”的定義一致的“roGF拮抗劑”可以包括能夠作用于roGF配體或它的同源受體，從而減弱或抑制PDGF-相關(guān)的受體信號(hào)的試劑。因此，所述“PDGF拮抗劑”的例子包括，例如靶定I3DGF核酸的反義、核酶或RNAi組合物；抗-PDGF適體、抗-PDGF抗體或可溶性I3DGF受體誘餌，其能防止TOGF與它的同源受體結(jié)合；靶定同源I3DGF受體(TOGFR)核酸的反義、核酶或RNAi組合物；抗-PDGFR適體或抗-PDGFR抗體，其能結(jié)合同源I3DGFR受體；和TOGFR酪氨酸激酶抑制劑?！癡EGF拮抗劑”表示能部分或完全減弱或抑制VEGF活性或產(chǎn)生的試劑。VEGF拮抗劑能夠直接或間接減弱或抑制特殊的VEGF，如VEGF165。另外，與上述“拮抗劑”定義一致的“VEGF拮抗劑”可以包括能夠作用于VEGF配體或它的同源受體，從而減弱或抑制VEGF-相關(guān)的受體信號(hào)的試劑。因此，所述“VEGF拮抗劑”的例子包括，例如靶定VEGF核酸的反義、核酶或RNAi組合物；抗-VEGF適體、抗-VEGF抗體或可溶性VEGF受體誘餌，其能防止VEGF與它的同源受體結(jié)合；靶定同源VEGF受體(VEGFR)核酸的反義、核酶或RNAi組合物；能結(jié) 合同源VEGFR受體的抗-VEGFR適體或抗-VEGFR抗體；和VEGFR酪氨酸激酶抑制劑。“足以抑制新血管疾病的量”表示在本發(fā)明組合中用于治療或預(yù)防新形成疾病或它的癥狀所必需的拮抗劑的有效量。用于實(shí)施本發(fā)明用來治療性治療由新血管疾病導(dǎo)致或造成所述新血管疾病的狀況的活性拮抗劑的“有效量”根據(jù)施用方式、新血管疾病的解剖學(xué)部位、患者的年齡、體重和一般健康狀況而改變。最后，醫(yī)生或獸醫(yī)決定合適的量和劑量方案。所述量被稱作足以抑制新血管疾病的量。通過以下詳細(xì)說明和權(quán)利要求書，可以了解本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。多肽X的“變體”表示具有肽X的氨基酸序列的多肽，其中，有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了改變。所述變體可以具有“保守性”改變，其中，取代的氨基酸具有類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性(例如，用異亮氨酸取代亮氨酸)。更罕見的是，變體可能具有“非保守性”改變(例如，用色氨酸取代甘氨酸)。類似的微小變化還可以包括氨基酸缺失或插入，或這兩者。決定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或缺失而又不消除生物學(xué)或免疫學(xué)活性的指南可以使用本領(lǐng)域所熟知的計(jì)算機(jī)程序發(fā)現(xiàn)，例如，LASERGENE軟件(DNASTAR)。術(shù)語“變體”，在用于表示多核苷酸序列時(shí)，可以包括與基因或它的編碼序列相關(guān)的多核苷酸序列。該定義還可以包括，例如，“等位基因的”、“剪接”、“物種”或“多態(tài)”變體。剪接變體可以與參考分子具有顯著同一性。不過，由于在mRNA加工期間外顯子的可變剪接，一般具有更多或更小數(shù)目的多核苷酸。相應(yīng)的多肽可以具有額外的功能結(jié)構(gòu)域，或者缺少所述結(jié)構(gòu)域。物種變體是在物種之間不同的多核苷酸序列。一般，所得到的多肽彼此具有顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體是特定物種的個(gè)體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。術(shù)語“載體”表示能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與它連接的其他核酸的核酸分子。一種類型的有用的載體是附加體，即，能夠進(jìn)行染色體外復(fù)制的核酸。有用的載體是能夠自主復(fù)制和/或表達(dá)與它連接的核酸的載體。能夠指導(dǎo)可操作地與它連接的基因的表達(dá)的載體在本文中被稱作“表達(dá)載體”。一般，可用于重組DNA技術(shù)中的表達(dá)載體通常是“質(zhì)?！毙问降?，它一般表示環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，在它們的載體形式中，它們不與染色體結(jié)合。在本說明書中，“質(zhì)粒”和“載體”可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常使用的形式。不過，本發(fā)明意在包括這樣的其他形式的表達(dá)載體，它們發(fā)揮等同的功能，并且它們隨后為本領(lǐng)域所公知。組合治療本發(fā)明部分基于VEGF和TOGF活性的特殊抑制作用，其中使用合適的生長因子拮抗劑作為有效的治療手段，用于治療患有新血管疾病的患者。I3DGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的組合施用，提供了治療眼新血管疾病的比單獨(dú)施用任意一種拮抗劑更高的治療益處。鑒于證明這兩種因子在刺激視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)的血管發(fā)生方面沒有表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用的研究，抗-VEGF和抗-PDGF劑的組合作用是出乎意料的(參見Castellon等，(2001) Exp.Eye Res. 74 :523-35)。PDGF和VEGF是新血管在身體，特別是在眼中生長的重要刺激物。為了抑制I3DGF和VEGF生物學(xué)活性而進(jìn)行的組合治療提供了用于治療或預(yù)防新血管疾病的方法。因此，本發(fā)明涉及使用組合治療抑制新血管疾病的方法和組合物。具體地講，本發(fā) 明利用在血管細(xì)胞中起作用的兩種不同的細(xì)胞間通訊信號(hào)傳導(dǎo)途徑，即roGF和VEGF信號(hào)傳導(dǎo)，作為新血管疾病，如眼新血管疾病的治療靶。這種組合方法特別可用于治療任何數(shù)目的以眼新生血管形成的發(fā)展為標(biāo)志的眼科學(xué)疾病或病癥，包括，但不局限于，視神經(jīng)盤新生血管形成、虹膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新生血管形成、脈絡(luò)膜新生血管形成、角膜新生血管形成、玻璃體新生血管形成、綠內(nèi)障、血管翳、翼狀胬肉、黃斑水腫、糖尿病性黃斑水腫、血管原性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜變性、黃斑變性、葡萄膜炎、視網(wǎng)膜炎性疾病和增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變。所述組合治療，由抑制I3DGF(如TOGF-B)和VEGF(如VEGF-Α)信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑組成，與單獨(dú)使用這兩種治療相比，產(chǎn)生了增強(qiáng)了的治療功效。盡管在下面討論的例子，描述了單一 I3DGF拮抗劑和單一 VEGF拮抗劑的組合，但可以理解的是，多種拮抗劑的組合可能是所需的。根據(jù)本發(fā)明的抗-PDGF和抗-VEGF組合治療可以單獨(dú)進(jìn)行，或者與其他治療組合進(jìn)行，并且可以在家庭、醫(yī)務(wù)室、診所、醫(yī)院門診室或醫(yī)院提供。治療一般在醫(yī)院開始，從而醫(yī)生能夠密切觀察治療效果，并且進(jìn)行任何需要的調(diào)整。組合治療持續(xù)時(shí)間取決于接受治療的新血管疾病的類型、患者的年齡和狀況、患者疾病的階段和類型以及患者對(duì)治療的反應(yīng)。另外，有發(fā)展為新血管疾病的較大風(fēng)險(xiǎn)的人(例如，糖尿病患者)可以接受治療，以抑制或延緩癥狀的發(fā)作。本發(fā)明所提供的一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)是，將roGF拮抗劑和VEGF拮抗劑的組合用于治療新血管疾病，使得能夠施用低劑量的每一種拮抗劑，和較少的總的活性拮抗劑，因此以較低的毒性和副作用以及低成本提供了相似的功效。所述組合的每一種成分的施用劑量和頻率可以獨(dú)立地控制。例如,一種拮抗劑可以每天施用三次，而第二種拮抗劑可以每天施用一次。組合治療能夠以斷斷續(xù)續(xù)的循環(huán)形式提供，它包括靜止時(shí)間段，以便患者身體有機(jī)會(huì)從任何尚無法預(yù)料的副作用中恢復(fù)。所述拮抗劑還可以一起制備，以便一次施用能夠送遞兩種拮抗劑。PDGF和VEGF拮抗劑靶PDGF最初是從血小板裂解物分離的，并且被確定為存在于血清而不是血漿中的主要生長促進(jìn)活性。首先顯示roGF的促有絲分裂活性作用在結(jié)締組織細(xì)胞上，如成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，并且存在于培養(yǎng)物中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中。業(yè)已鑒定了兩種同源roGF同工型，PDGF A和B，它們是由獨(dú)立的基因(位于7號(hào)和22號(hào)染色體上)編碼的。來自血小板的最主要的種類是AB異源二聚體，盡管所有三種可能的二聚體(AA、AB和BB)都是天然存在的。在翻譯之后，PDGF 二聚體被加工成大約30kDa的分泌蛋白。業(yè)已鑒定了以高親和力結(jié)合I3DGF的兩種細(xì)胞表面蛋白，α和β (Heldin等，(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78 :3664 ；ffilliams 等，(1981)Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 79 5867)。這兩個(gè)種類都包括五個(gè)免疫球蛋白-樣細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是由激酶插入結(jié)構(gòu)域隔開的。在過去幾年中，業(yè)已闡明了三種TOGF同工型對(duì)三種受體二聚體(α/α、α/β和β/β)的特異性。α -受體同源二聚體能以高的親和力結(jié)合所有三種TOGF同工型，β -受體同源二聚體只能以高的親和力結(jié)合TOGF BB,而結(jié)合TOGF AB的親和力低大約10倍，并且α / β -受體異源二聚體能夠以高親和力結(jié)合PDGF BB和PDGF AB(ffestermark&Heldin(1993)Acta Oncologica 32:101)。所述特異性模式似乎是由于A-鏈只能結(jié)合α-受體，而B-鏈能以高親和力結(jié)合α和β_受體亞基兩者的能力造成的?？偟膩碚f，本發(fā)明提供了能夠抑制一種或多種I3DGF活性的試劑。這些TOGF-抑制齊U，或roGF拮抗劑能夠作用于一種或多種形式的所述roGF配體。血小板衍生生長因子包括A-鏈(roGF-Α)和B-鏈(roGF-B)的同源或異源二聚體，它們通過結(jié)合兩種相關(guān)的受體 酪氨酸激酶，[α ]-受體(H)GFR- [ α ])和[β ]-受體(TOGFR- [ β ])并且使其二聚化發(fā)揮作用。另外，業(yè)已鑒定了所述I3DGFR復(fù)合物的兩種新的蛋白酶激活配體，PDGF-C和TOGF-D (參見 Li 等，(2000)Nat. Cell. Biol. 2 :302-9 ；Bergsten 等，(2001)Nat. Cell. Biol. 3 :512-6 ；和 Uutele 等，(2001) Circulation 103:2242-47)。由于所述 PDGFRs 的不同的配體結(jié)合特異性，已知 PDGFR-[ α ] [α ]能結(jié)合 PDGF-AA、PDGF-BB, PDGF-AB 和 PDGF-CC ； PDGFR-[β ][β ]能結(jié)合 PDGF-BB 和 PDGF-DD ;而 PDGFR-[ α ] [β ]能結(jié)合 PDGF_AB、PDGF-BB、PDGF_CC 和PDGF-DD (參見 Betsholtz 等，(2001)BioEssays 23:494-507)。VEGF是分泌的二硫鍵連接的同源二聚體，它能選擇性地刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移，并且產(chǎn)生基質(zhì)降解酶(Conn 等，(1990)Proc. Natl. AcacL Sci. (USA) 87 1323-1327) ；Ferrara 和 Henzel(1989)Biochem. Biophys. Res. Commun. 161 :851-858)；Pepper 等，(1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181 :902-906 ；Unemori 等，(1992)J. Cell. Physiol. 153 :557-562)，它們都是形成新血管所需要的過程。VEGF以四種形式(VEGF-121、VEGF-165、VEGF-189, VEGF-206)存在，這是由于VEGF基因的可變剪接產(chǎn)生的(Houck 等,(1991)Mol-Endocrinol. 5 :1806-1814 ;Tischer 等，(1991) J. Biol.Chem. 266 11947-11954)。兩種較小的形式是可擴(kuò)散的，而較大的兩種形式保持主要位于細(xì)胞膜上，這是它們對(duì)肝素高親和力的結(jié)果。VEGF-165還能與肝素結(jié)合，并且是最豐富的形式。VEGF-121，即不能與肝素結(jié)合的唯一形式，似乎對(duì)VEGF受體具有較低的親和力(Gitay-Goren 等，(1996) J. Biol. Chem. 271 =5519-5523)以及較低的促有絲分裂效力(Keyt等，(1996)J. Biol. Chem. 271 :7788-7795)。VEGF的生物學(xué)作用是由兩種酪氨酸激酶受體(Flt-I和Flk-1/KDR)介導(dǎo)的，它們的表達(dá)在很大程度上局限于內(nèi)皮來源的細(xì)胞(deVries 等，(1992) Science 255 :989-991 ;Millauer 等，(1993)Cell 72 :835-846 ；Terman等，(1991)0nCOgene 6:519-524)。盡管兩種功能性受體的表達(dá)都是高親和力結(jié)合所必需的，但內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的趨化性和促有絲分裂信號(hào)傳導(dǎo)似乎主要是通過KDR受體進(jìn)行的(Park等，(1994) J. Biol. Chem. 269 :25646-25654 ；Seetharam 等，(1995) Oncogene 10:135-147;Waltenberger 等，(1994) J. Biol. Chem. 26988-26995)。最近業(yè)已在缺少 VEGF 基因的單個(gè)等位基因(Carmeliet 等，(1996)Nature 380 :435-439 ;Ferrara 等，(1996)Nature 380 439-442)或 Flt-I 的兩個(gè)等位基因(Fong 等，(1995)Nature 376 :66-70)或 Flk-I 基因(Shalaby等，(1995) Nature 376 :62-66)的小鼠體內(nèi)證實(shí)了 VEGF和VEGF受體對(duì)血管發(fā)育的重要性。在每一種場(chǎng)合下，都發(fā)現(xiàn)血管形成的明顯的異常導(dǎo)致了胚胎致死?，F(xiàn)在已知由組織缺氧誘導(dǎo)的補(bǔ)償性血管生成是通過VEGF介導(dǎo)的(Levy等，(1996)J. Biol. Chem. 2746-2753) ;Shweiki 等，(1992)Nature 359:843-845)。在人類中所做的研究業(yè)已表明，在血管生成性視網(wǎng)膜疾病的玻璃體中存在高濃度的VEGF，但是在無活性的或非-新生血管形成疾病狀態(tài)中不存在所述高濃度的VEGF。在實(shí)驗(yàn)黃斑下手術(shù)之后切斷的人類脈絡(luò)膜組織同樣表現(xiàn)出高的VEGF水平。除了是唯一的已知內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原之外，VEGF是血管生成生長因子中獨(dú)特的，表現(xiàn)在它在誘導(dǎo)血管對(duì)大分子的通透性瞬時(shí)增加的能力方面(因此，它的最初 的和替代的名稱是血管通透因子，VPF)(參見Dvorak等，(1979) J. Immunol. 122 :166-174 ；Senger 等，(1983) Science 219 :983-985 ;Senger 等，(1986) Cancer Res. 46 :5629-5632)。增加了的血管通透性和所導(dǎo)致的血漿蛋白在血管外間隙的沉積，有助于通過提供內(nèi)皮細(xì)胞遷移的臨時(shí)基質(zhì)形成新血管(Dvorak等，(1995) Am. J. Pathol. 146 =1029-1039)。通透性過高確實(shí)是新血管的特有特征，包括與腫瘤相關(guān)的血管。PDGF 和 VEGF 桔杭劑概要本發(fā)明提供了一起用于新血管疾病的組合治療的TOGF和VEGF的拮抗劑(即，抑制劑)。特異性TOGF拮抗劑和VEGF拮抗劑為本領(lǐng)域所公知，并且簡單地描述于以下部分?，F(xiàn)在或者已經(jīng)是技術(shù)人員能夠得到的其他TOGF拮抗劑和VEGF拮抗劑包括抗體、適體、反義寡聚體、核酶和RNAi組合物，它們能夠通過本領(lǐng)域的常規(guī)實(shí)踐結(jié)合本說明書的教導(dǎo)和指導(dǎo)鑒定和生產(chǎn)，包括在下面進(jìn)一步提供的部分。
I3DGF 拮抗劑一般，H)GF(例如，PDGF-B)的抑制可以通過多種方式實(shí)現(xiàn)。例如，可以獲得能抑制roGF的活性或產(chǎn)生的多種roGF拮抗劑，并且可將其用于本發(fā)明的方法。示例性的roGF拮抗劑包括I3DGF的核酸配體或適體，如在下文中所描述的。另外，所述I3DGF拮抗劑可以是，例如，抗-PDGF抗體或抗體片段。因此，通過抑制它與受體的結(jié)合可以使所述TOGF分子失活。另外，能在核酸水平上抑制I3DGF表達(dá)的諸如反義RNA、核酶和RNAi分子的核酸分子可用作本發(fā)明的拮抗劑。其他TOGF拮抗劑包括肽、蛋白、環(huán)肽或小有機(jī)化合物。另外，通過破壞它的下游信號(hào)傳導(dǎo)，能夠抑制TOGF的信號(hào)傳導(dǎo)活性，例如，通過使用多種小分子酪氨酸激酶抑制性拮抗劑，包括下面所描述的拮抗劑。化合物或試劑起著I3DGF拮抗劑作用的能力可以按照本領(lǐng)域已知的方法確定，且另外，可以參見以下文獻(xiàn)，例如，Dai等，(2001)Genes&Dev. 15 :1913-25 ;Zippel，等，(1989) Eur. J. Cell Biol. 50(2) :428-34 ;和 Zwiller,等，(1991)0ncogene6 :219-21.本發(fā)明還包括本領(lǐng)域所公知的TOGF拮抗劑，以及下文所支持的，以及屬于普通技術(shù)人員知識(shí)范圍內(nèi)的任何和所有等同試劑。例如，抗roGF的抑制性抗體為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于美國專利號(hào) 5，976，534,5, 833，986,5, 817，310,5, 882，644,5, 662，904、5，620，687、5，468，468和PCT W02003/025019中的那些，所述文獻(xiàn)內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。另外，本發(fā)明包括N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，它是I3DGF拮抗劑，例如公開于美國專利號(hào) 5，521，184 和 W02003/013541、W02003/078404、W02003/099771、W02003/015282和W02004/05282中的那些，所述文獻(xiàn)被以全文形式收作本文參考。能阻斷PDGF作用的小分子為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于美國專利號(hào)6，528，526 (H)GFR酪氨酸激酶抑制劑)、6，524，347 (H)GFR酪氨酸激酶抑制劑)、6，482，834 O3DGFR酪氨酸激酶抑制劑)、6，472，391 O3DGFR酪氨酸激酶抑制劑)、6，696，434、6，331，555,6, 251，905,6, 245，760,6, 207，667,5, 990，141,5, 700，822,5, 618，837 和5，731，326中的那些，所述文獻(xiàn)內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。能阻斷TOGF作用的蛋白和多肽為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于美國專利號(hào)6，350, 731 (PDGF肽類似物)、5，952，304中的那些，所述文獻(xiàn)內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。能抑制EGF和/或TOGF受體酪氨酸激酶的雙單-和雙環(huán)芳基和雜芳基化合物為 本領(lǐng)域所公知，例如，描述于例如美國專利號(hào)5，476，851,5, 480，883,5, 656，643,5, 795，889和6，057，320中的那些，所述文獻(xiàn)內(nèi)容被以全文形式收作本文參考。用于抑制TOGF的反義寡核苷酸為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于美國專利號(hào)5，869，462和5，821，234中的那些，每一份文獻(xiàn)的內(nèi)容都以全文形式收作本文參考。用于抑制I3DGF的適體(又被稱作核酸配體)為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于例如美國專利號(hào) 6，582，918,6, 229，002,6, 207，816,5, 668，264,5, 674，685 和 5，723，594 中的那些，每一份文獻(xiàn)的內(nèi)容都以全文形式收作本文參考。本領(lǐng)域所公知的用于抑制TOGF的其他化合物包括，描述于美國專利號(hào)5，238，950、5，418，135、5，674，892、5，693，610、5，700，822、5，700，823、5，728，726、5，795，910、5，817，310、5，872，218、5，932，580、5，932，602、5，958，959、5，990，141、6，358，954,6, 537，988和6，673，798中的那些，每一份文獻(xiàn)的內(nèi)容都以全文形式收作本文參考。VEGF 拮抗劑VEGF(例如，VEGF-Α)的抑制是通過多種方式實(shí)現(xiàn)的。例如，能抑制VEGF活性或產(chǎn)生的多種VEGF拮抗劑，包括核酸分子，如適體、反義RNA、核酶、RNAi分子和VEGF抗體可以獲得，并且能夠用于本發(fā)明的方法中。示例性的VEGF拮抗劑包括VEGF的核酸配體或適體，正如下文所描述的。對(duì)VEGF-A的特別有用的拮抗劑是EYE001 (以前稱為NX1838)，它是修飾過的、PEG化的適體，它能以高的和特異性親和力結(jié)合主要的可溶性人VEGF同工型(參見，美國專利號(hào)6，011，020 ;6，051，698 ;和6，147，204)。所述適體能夠以與針對(duì)VEGF的高親和力抗體類似的方式結(jié)合并且使VEGF失活。另一種有用的VEGF適體是EYE001，它是非-PEG化的形式的。另外，所述VEGF拮抗劑可以是，例如，抗-VEGF抗體或抗體片段。因此，通過抑制它與受體結(jié)合使VEGF分子失活。另外，能在核酸水平上抑制VEGF表達(dá)或RNA穩(wěn)定性的諸如反義RNA、核酶和RNAi分子的核酸分子可用作本發(fā)明的方法和組合物中的拮抗劑。其他VEGF拮抗劑包括肽、蛋白、環(huán)肽和小有機(jī)化合物。例如，能結(jié)合VEGF受體而又無伴隨的信號(hào)傳導(dǎo)活性的可溶性截短形式的VEGF也可用作拮抗劑。另外，VEGF的信號(hào)傳導(dǎo)活性可以通過破壞它的下游信號(hào)傳導(dǎo)抑制，例如，通過使用多種拮抗劑，包括VEGF受體酪氨酸激酶活性的小分子抑制劑，正如下文所進(jìn)一步描述的。
化合物或試劑起著VEGF拮抗劑作用的能力，可以按照本領(lǐng)域所熟知的多種標(biāo)準(zhǔn)方法確定。例如，VEGF的生物學(xué)活性之一是通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合來增強(qiáng)血管通透性。所述相互作用導(dǎo)致了緊密的內(nèi)皮連接的松弛，其后果是造成血管流體的泄漏。通過VEGF誘導(dǎo)的血管泄漏可以在體內(nèi)測(cè)量，其通過跟蹤由于皮內(nèi)注射VEGF導(dǎo)致的伊文思藍(lán)染料從豚鼠脈管系統(tǒng)的泄漏來進(jìn)行(Dvorak等，in Vascular PermeabilityFactor/Vascular Endothelial Growth Factor, Microvascular Hyperpermeability, andAngiogenesisJP (1995) Am. J. Pathol. 146 :1029)。類似地，可以將所述測(cè)定方法用于測(cè)量拮抗劑阻斷VEGF的這種生物學(xué)活性的能力。在血管通透性測(cè)定的有用的例子中，VEGF165 (20-30nM)與EYEOOl (30ηΜ_1 μ Μ)或候選VEGF拮抗劑離體(ex vivo)預(yù)混合，并且隨后通過皮內(nèi)注射施用到豚鼠背部的剔毛的皮膚中。在注射之后30分鐘，按照標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)注射部位周圍的伊文思藍(lán)染料泄漏進(jìn)行定量，其通過使用計(jì)算機(jī)化的形態(tài)度量分析系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。能抑制VEGF-誘導(dǎo)的指示染料從脈管系統(tǒng)中泄漏的化合物被認(rèn)為是本發(fā)明的方法和組合物的有用拮抗劑。用于確定化合物是否是VEGF拮抗劑的另一種測(cè)定方法是所謂的角膜血管發(fā)生測(cè) 定。在該測(cè)定方法中，將含有VEGF165 (3pmol)的methacyrate聚合物沉淀植入大鼠的角膜基質(zhì)中，以誘導(dǎo)血管生長進(jìn)入正常的無血管角膜。然后將候選VEGF拮抗劑通過靜脈內(nèi)途徑施用到大鼠體內(nèi)，劑量為lmg/kg、3mg/kg和10mg/kg,每天一次或兩次,施用5天時(shí)間。在治療時(shí)間段結(jié)束時(shí)，對(duì)所有個(gè)體的角膜進(jìn)行顯微照相。新血管在角膜組織中發(fā)育的程度，以及候選化合物對(duì)它們的抑制作用，隨后通過顯微照片的標(biāo)準(zhǔn)化形態(tài)度量分析進(jìn)行定量。與用磷酸緩沖鹽水(PBS)處理相比，能抑制角膜中VEGF-依賴型血管發(fā)生的化合物被認(rèn)為是本發(fā)明的方法和組合物的有用的拮抗劑。還使用早熟性視網(wǎng)膜病的小鼠模型鑒定了候選VEGF拮抗劑。在一個(gè)有用的例子中，分別將9、8、8、7和7只小鼠同窩崽放置在室內(nèi)空氣中或者增加含氧量，并且通過腹膜內(nèi)用磷酸緩沖鹽水(PBS)或候選VEGF拮抗劑進(jìn)行處理(例如，以lmg/kg、3mg/kg或10mg/kg/天進(jìn)行處理)。然后通過在來自所有處理過的和對(duì)照小鼠的每只眼的20個(gè)組織學(xué)切片中進(jìn)行顯微鏡鑒定和新血管芽計(jì)數(shù)來估計(jì)測(cè)定終點(diǎn)，即新毛細(xì)血管通過角膜的內(nèi)界膜長出到玻璃體液中。相對(duì)未處理過的對(duì)照而言處理過的小鼠的視網(wǎng)膜新脈管系統(tǒng)的減少被確定為鑒定有用的VEGF拮抗劑。在另一種示例性的篩選測(cè)定方法中，使用體內(nèi)人類腫瘤異種移植測(cè)定鑒定候選VEGF拮抗劑。在這種篩選測(cè)定中，在植入裸鼠中的人類腫瘤異種移植物(A673橫紋肌肉瘤和Wilms腫瘤)中檢測(cè)候選VEGF拮抗劑的體內(nèi)功效。然后用候選VEGF拮抗劑處理小鼠(例如，10mg/kg，每天腹膜內(nèi)施用一次，然后發(fā)展為確定的腫瘤(200mg))。用對(duì)照試劑處理對(duì)照組。被確定為相對(duì)對(duì)照而言能抑制A673橫紋肌肉瘤生長和Wilms腫瘤的候選化合物被認(rèn)為是本發(fā)明的方法和組合物的有用的拮抗劑。測(cè)定VEGF拮抗劑活性的其他方法為本領(lǐng)域所公知，并且在下文進(jìn)一步描述。本發(fā)明還包括本領(lǐng)域所公知的VEGF拮抗劑，以及下面所支持的那些，和普通技術(shù)人員知識(shí)范圍內(nèi)的任何和所有等同試劑。例如，針對(duì)VEGF的抑制抗體為本領(lǐng)域所公知，例如，描述于美國專利號(hào) 6，524，583,6, 451，764 (VRP 抗體)、6，448，077,6, 416，758、6，403, 088 (針對(duì) VEGF-C)、6，383，484 (針對(duì) VEGF-D)、6，342，221 (抗-VEGF 抗體)、6，342，219,6, 331，301 (VEGF-B 抗體)和 5，730，977，和 PCT
發(fā)明者D·施馬, P·卡利亞斯, A·P·亞當(dāng)米斯 申請(qǐng)人:奧普索特克公司