CXCL-10抑制劑在制備治療和/或預防肺損傷的藥物中的用途技術領域本發(fā)明涉及CXCL-10抑制劑在制備治療和/或預防哺乳動物包括人肺損傷的藥物中的用途。

背景技術：
CXCL-10（C–X-Cmotifchemokine10，CXC趨化因子10，GeneID:3627;Nucleotide:NM_001565.2;Protein:NP_001556.2）是一種重要的細胞趨化因子，又名干擾素γ誘導的蛋白10kDa（Interferonγ-inducedprotein10kDa，縮寫為IP10）（術語CXCL-10和IP10在本發(fā)明中無差別的使用），微生物(如SARS冠狀病毒、流感病毒等)均可誘導肺泡巨噬細胞、中性粒細胞和支氣管上皮細胞等表達CXCL-10。微生物同時還可以誘導NK細胞、中性粒細胞和單核巨噬細胞表面的CXCR3的表達量上調，而CXCL-10與其受體CXCR3的結合會產(chǎn)生強烈的趨化性，將這些細胞招募到肺部感染部位，殺傷被感染的細胞，防止病毒擴散，同時合成和釋放IFN-γ、TNF-α、GM-CSF等，活化和募集更多的炎癥細胞，產(chǎn)生更多的促炎因子和炎性介質，介導肺部的炎癥反應。所以，微生物誘導的CXCL-10的長期表達是感染誘導病理免疫的重要介質。FabioMarra等人證明PI3K-Akt-p38信號通路在CXCL-10誘導的星形細胞的趨化作用中發(fā)揮重要作用。SARS冠狀病毒感染患者的血漿CXCL-10濃度在病人開始出現(xiàn)發(fā)熱癥狀后的一個星期內會明顯升高，而CXCL-10濃度的升高也與病人不良的預后密切相關；在哮喘的小鼠模型中，在其肺部過表達CXCL-10會導致呼吸道中嗜酸性粒細胞數(shù)目的增加，IL-4的含量升高，CD8+T細胞的招募增多，炎癥加重；CXCR3在哮喘病人呼吸道平滑肌當中的肺肥大細胞表面是表達最豐富的趨化因子受體，而這些病人的支氣管平滑肌細胞中CXCL-10的表達量也明顯上調，從而招募肥大細胞到達肺部。急性肺損傷(acutelunginjury，ALI)是各種直接和間接致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致急性低氧性呼吸功能不全。急性肺損傷以肺容積減少、肺順應性降低、通氣/血流比例失調為病理生理特征，臨床上表現(xiàn)為進行性低氧血癥和呼吸窘迫，肺部影像學上表現(xiàn)為非均一性的滲出性病變，其發(fā)展至嚴重階段（氧合指數(shù)<200）被稱為急性呼吸窘迫綜合征。常見的導致急性肺損傷的因素分直接和間接肺損傷因素，直接肺損傷因素包括例如病毒、細菌和真菌導致的嚴重的肺部感染、胃內容物誤吸、肺挫傷、氧中毒等；間接肺損傷因素包括例如膿毒癥、休克、大量輸血、體外循環(huán)及彌漫性血管內凝血等。肺損傷在臨床上的表現(xiàn)為：（1）急性起病，在直接或間接肺損傷后12---48小時內發(fā)?。唬?）常規(guī)吸氧后低氧血癥難以糾正；（3）肺部體征無特異性，急性期雙肺可聞及濕羅音或呼吸音減低；（4）早期病變以間質性為主，X線胸片常無明顯改變，病情進展后可出肺內實變，表現(xiàn)為雙肺野普遍密度增高，透亮度減低，肺紋理增多+增粗，可見散在斑片狀密度增高陰影；（5）彌漫性肺浸潤影，無心功能不全證據(jù)。肺損傷的臨床診斷標準為：（1）急性起?。唬?）氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）≤200mmHg（（1mmHg=0.133kPa，不管呼氣末正壓（PEEP）水平）；（3）正位X線胸片顯示雙肺均有斑片狀陰影；（4）肺動脈嵌頓壓≤18mmHg，或無左心房壓力增高的臨床證據(jù)，如（PaO2/FiO2≤300mmHg且滿足上述其他標準，可診斷急性肺損傷。流感是一種影響人群極其廣泛的常見病、多發(fā)病，目前流感病毒跨物種感染形勢嚴峻，甲型H1N1流感病毒感染所導致的臨床癥狀，多數(shù)患者較輕，表現(xiàn)為典型的流感樣癥狀，可自然恢復。最常見癥狀包括咳嗽、發(fā)熱、咽喉痛、頭痛及其他不適感。嚴重肺炎患者x線胸片可見多發(fā)性病灶浸潤，可快速進展為ARDS、腎或多器官功能衰竭。甲型流感合并ARDS的發(fā)生率是普通流感的100倍，肺部損壞主要來源于失控的全身免疫反應。與繼發(fā)于病毒性肺炎的ARDS一致，包括彌漫性肺泡損傷、細支氣管和血管周圍淋巴細胞浸潤、增生的氣道改變和梗阻性細支氣管炎。臨床和病理學檢查均提示重癥患者病變主要在呼吸系統(tǒng)。病理學檢查可見重癥患者的肺部出現(xiàn)實變，常伴有出血、滲出、膿腫等病理改變。肺泡腔內可見漿液性或纖維素性滲出，伴有不同程度的透明膜形成，提示有彌漫性的肺組織損傷。目前認為，甲型H1N1流感病毒所致肺組織損傷基本病變和其他類型的流感、SARS和人禽流感重癥病例的肺基本病變相似，均為輕重不等的彌漫性肺組織損傷。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是一種水溶性的糖基化的脂質復合物，是革蘭氏陰性菌外膜中的重要成分，由脂質A、核心多糖和O抗原三部分組成。其中，革蘭氏陰性菌包括但不限于螺菌屬、彎菌屬、螺桿菌屬，假單胞菌屬、軍團菌屬、奈瑟菌屬、莫拉菌屬產(chǎn)堿桿菌屬、布魯斯菌屬、羅卡利馬體屬、鮑特菌屬、弗郎西斯菌屬，埃希菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、克雷伯菌屬變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬、耶爾森菌屬、弧菌屬、巴氏桿菌屬、嗜血桿菌屬，類桿菌屬、梭桿菌屬，韋榮球菌屬，立克次體屬、考克斯體屬、衣原體屬，密螺旋體屬、疏螺旋體屬、鉤端螺旋體屬等革蘭氏陰性細菌。脂多糖分子量大于10000道爾頓，結構復雜，脂質A（LipidA）為構成內毒素活性的糖脂，以共價鍵連接到雜多糖鏈。人體對細菌內毒素極為敏感，極微量（1-5納克/公斤體重）內毒素就能引起體溫上升，發(fā)熱反應持續(xù)約4小時后逐漸消退。自然感染時，因革蘭氏陰性菌不斷生長繁殖，同時伴有陸續(xù)死亡、釋出內毒素，故發(fā)熱反應將持續(xù)至體內病原菌完全消滅為止。內毒素引起發(fā)熱反應的原因是內毒素作用于體內的巨噬細胞等，使之產(chǎn)生白細胞介素1、白細胞介素6和腫瘤壞死因子α等細胞因子，這些細胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調節(jié)中樞，促使體溫升高發(fā)熱。內毒素血癥臨床癥狀主要取決于宿主對內毒素的抵抗力，癥狀和體征有：發(fā)熱、白細胞數(shù)變化、出血傾向、心力衰竭、腎功能減退、肝臟損傷、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀以及休克等。內毒素可引起組胺、5-羥色胺、前列腺素、激肽等的釋放，導致微循環(huán)擴張，靜脈回流血量減少，血壓下降，組織灌流不足，缺氧及酸中毒等。真菌也同樣可以感染肺組織并導致肺損傷，其主要表現(xiàn)為肺和支氣管的真菌性炎癥或相關病變，也可包括胸膜甚至縱膈。致病性真菌屬原發(fā)性病原菌，常導致免疫功能正常者的原發(fā)性外源性感染，主要有組織胞漿菌、球孢子菌、副球孢子菌、孢子絲菌等。條件致病性真菌或稱機會性真菌，其病原性弱，多在易感宿主引起深部真菌感染，如念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬、毛霉和青霉屬、根霉屬、鐮刀霉屬及肺孢子菌等。酵母多糖（zymosan）是從酵母細胞壁提取的大分子多糖復合物，由蛋白質和碳水化合物組成。酵母屬于真菌，本發(fā)明中所述真菌包括但不限于子囊菌、擔子菌、壺菌、球囊菌、結核菌等。酵母多糖在實驗中可用來誘導炎癥發(fā)生，其誘導的反應主要包括炎癥細胞因子的表達，花生四烯酸的上調，部分蛋白的磷酸化和肌醇磷脂的形成。同時，酵母多糖還可以上調細胞周期蛋白D2的表達量，表明其在巨噬細胞活化和增殖的過程中也起到了作用。脂多糖和酵母多糖聯(lián)合感染可以模擬體內由于敗血癥引起的急性肺損傷。敗血癥（septicemia）系指致病菌或條件致病菌侵入血循環(huán)，并在血中生長繁殖，產(chǎn)生毒素而發(fā)生的急性全身性感染。敗血癥為急性肺損傷的易發(fā)因素之一，敗血癥性肺損傷的一個特征就是多形核中性粒細胞(PMN)在肺微血管內的聚集和激活，引起一系列炎癥反應過程和血管損傷。在這一過程中細菌感染，尤其是革蘭氏陰性菌感染可能是最初炎癥反應的關鍵因素。革蘭氏陰性菌和脂多糖(LPS)進入循環(huán)后產(chǎn)生脂多糖結合蛋白(LBP)，LBP與LPS的磷脂-A一部分結合，血漿中LPS-LBP復合物與單核細胞、巨噬細胞和主要的中性粒細胞上的CD14受體結合，促使特定的炎性因子(如TNF-a、IL-1、IL-6）的編碼基因翻譯。細胞因子分泌到循環(huán)中是導致敗血癥和肺損傷的一系列炎癥反應過程中重要的生化特征，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等，這些細胞因子引起一系列的級聯(lián)反應，參與肺損傷的過程。因此，使用脂多糖和酵母多糖聯(lián)合感染可以模擬敗血癥性肺損傷。1975年Kohler和Milstein首先報道，用細胞雜交技術，使經(jīng)綿羊紅細胞(SRBC)免疫的小鼠的脾細胞與小鼠的骨髓瘤細胞融合，并由此創(chuàng)建了第一個B細胞雜交瘤細胞株，獲得了抗SRBC的單克隆抗體。單克隆抗體的特點在于理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結合的特異性強、便于人為處理和質量控制，并且來源容易。這些優(yōu)點使它一問世就受到高度重視，并廣泛應用于生物學和醫(yī)學研究領域。可將藥物等與單克隆抗體直接交聯(lián)，利用其導向作用，使藥物等定位于特異治療靶位，這不僅提高了療效，還可降低對正常細胞的毒性反應。RNAi(RNAinterference)即RNA干涉，是近年來發(fā)現(xiàn)的在生物體內普遍存在的一種古老的生物學現(xiàn)象，是由雙鏈RNA（dsRNA）介導的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象，它在轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達。SmallinterferingRNA(siRNA，小干擾RNA)是一種小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAaseⅢ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成。siRNA是siRISC的主要成員，激發(fā)與之互補的目標mRNA的沉默。RNA干涉（RNAi）在實驗室中是一種強大的實驗工具，利用具有同源性的雙鏈RNA（dsRNA）誘導序列特異的目標基因的沉寂，迅速阻斷基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是對特定信使RNA（mRNA）進行降解的指導要素。siRNA是RNAi途徑中的中間產(chǎn)物，是RNAi發(fā)揮效應所必需的因子。RNAi最大以及最終的效果是細胞的代謝過程、生理生化系數(shù)等表型參數(shù)發(fā)生明顯的變化。近來RNAi成功用于構建轉基因動物模型的報道也日益增多，標志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。不僅如此，RNAi技術還將可能成為研究細胞信號傳導通路與基因治療的新途徑。雖然截至目前已經(jīng)具有肺損傷特別是流感導致的肺損傷的治療藥物，但仍然存在對新類型的肺損傷特別是流感導致的肺損傷的治療藥物的需求。

技術實現(xiàn)要素：
因此，本發(fā)明的技術目的在于探究CXCL-10在肺損傷發(fā)生發(fā)展中的作用并探究CXCL-10的抑制劑在制備預防和/或治療肺損傷的藥物中的用途。因此，本發(fā)明的第一方面提供一種CXCL-10的抑制劑在制備治療和/或預防哺乳動物包括人肺損傷的藥物中的用途，其中CXCL-10為CXCL-10蛋白或其核苷酸編碼序列，優(yōu)選地，所述哺乳動物包括人肺損傷由流感病毒感染、細菌感染和/或真菌感染、敗血癥導致，優(yōu)選地，所述哺乳動物包括人肺損傷包括、肺水腫、急性肺損傷和嚴重呼吸系統(tǒng)窘迫綜合癥。優(yōu)選地，所述流感病毒為甲型流感病毒；所述細菌為革蘭氏陰性菌；所述真菌選自酵母菌。優(yōu)選地，所述流感病毒為甲型H1、H3、H5、H7或H9亞型毒株。更優(yōu)選地，所述流感病毒為甲型H1亞型毒株。更優(yōu)選地，所述流感病毒為甲型H1N1流感病毒。最優(yōu)選地，所述流感病毒為甲型H1N1流感病毒BJ501株或PR8株。優(yōu)選地，所述細菌選自螺菌屬、彎菌屬、螺桿菌屬，假單胞菌屬、軍團菌屬、奈瑟菌屬、莫拉菌屬產(chǎn)堿桿菌屬、布魯斯菌屬、羅卡利馬體屬、鮑特菌屬、弗郎西斯菌屬，埃希菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、克雷伯菌屬變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬、耶爾森菌屬、弧菌屬、巴氏桿菌屬、嗜血桿菌屬，類桿菌屬、梭桿菌屬，韋榮球菌屬，立克次體屬、考克斯體屬、衣原體屬，密螺旋體屬、疏螺旋體屬、鉤端螺旋體屬等革蘭氏陰性細菌的一種或多種。更優(yōu)選地，所述細菌選自大腸埃希氏菌。最優(yōu)選地，所述細菌選自大腸桿菌O111：B4。優(yōu)選地，所述真菌為釀酒酵母。優(yōu)選地，所述CXCL-10來源于哺乳動物包括人。更優(yōu)選地，所述CXCL-10的GeneBank編號為GeneID:3627，核苷酸編碼序列如NM_001565.2所示，蛋白質編碼序列如NP_001556.2所示。優(yōu)選地，所述CXCL-10的抑制劑選自特異性抗CXCL-10的抗體、siRNA或特異性抑制哺乳動物包括人CXCL-10表達的化學生物物質。優(yōu)選地，所述特異性抗CXCL-10的抗體選自特異性抗CXCL-10的多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、表面重塑抗體、重構抗體、全人源抗體或其抗原結合部分。更優(yōu)選地，所述特異性抗CXCL-10的抗體為特異性抗CXCL-10的單克隆抗體。優(yōu)選地，所述CXCL-10的抑制劑選自siRNA。更優(yōu)選地，所述siRNA的正義序列如SEQ.ID.NO.1:gauggccuucgauucuggaUU所示，反義序列如SEQ.ID.NO.2:UUguccagaaucgaaggccauc所示。優(yōu)選地，所述藥物的劑型為注射劑、噴霧劑、滴鼻劑、吸入劑、口服劑。本發(fā)明的第二方面涉及一種CXCL-10的抑制劑，其用做治療和/或預防哺乳動物包括人肺損傷的藥物，其中CXCL-10為CXCL-10蛋白或其核苷酸編碼序列。優(yōu)選地，所述哺乳動物包括人肺損傷由流感病毒感染、細菌感染和/或真菌感染、敗血癥導致。優(yōu)選地，所述流感病毒、細菌、真菌、所述CXCL-10或所述CXCL-10的抑制劑如本發(fā)明第一方面所述。本發(fā)明的第三方面涉及一種含有治療有效量的CXCL-10的抑制劑的組合物在制備治療和/或預防哺乳動物包括人肺損傷的藥物中的用途，其中CXCL-10的抑制劑是所述組合物的活性成分，其中CXCL-10為CXCL-10蛋白或其核苷酸編碼序列。優(yōu)選地，所述哺乳動物包括人肺損傷由流感病毒感染、細菌感染和/或真菌感染、敗血癥導致。優(yōu)選地，所述流感病毒、細菌、真菌、所述CXCL-10或所述CXCL-10的抑制劑如本發(fā)明第一方面所述。本發(fā)明的第四方面涉及一種治療和/或預防哺乳動物包括人肺損傷的方法，其包括給予哺乳動物包括人治療有效量的CXCL-10的抑制劑，其中CXCL-10為CXCL-10蛋白或其核苷酸編碼序列。優(yōu)選地，所述哺乳動物包括人肺損傷由流感病毒感染、細菌感染和/或真菌感染、敗血癥導致。優(yōu)選地，所述流感病毒、細菌、真菌、所述CXCL-10或所述CXCL-10的抑制劑如本發(fā)明第一方面所述。換言之，本發(fā)明利用CXCL-10基因敲除小鼠和CXCL-10下游的PI3K基因敲除小鼠模型以及利用甲型H1N1流感病毒感染小鼠證明CXCL-10在甲型H1N1流感病毒BJ501株或PR8株感染導致的小鼠急性肺組織病理損傷、死亡的過程中發(fā)揮重要作用，針對CXCL-10分子的干預在治療肺損傷，特別是甲型H1N1流感病毒PR8株感染所導致的損傷中，有可能發(fā)揮重要作用。本發(fā)明利用特異性抗CXCL-10的單克隆抗體免疫野生型小鼠后再用甲型H1N1流感病毒感染所述小鼠，結果表明，抗CXCL-10抗體對小鼠在感染甲型H1N1流感病毒PR8株導致的急性肺組織病理損傷中發(fā)揮了重要保護作用。因此，本發(fā)明第一次證明了CXCL-10在甲型流感病理過程中發(fā)揮重要作用且特異性抑制CXCL-10的治療可以阻止或減緩甲型流感病毒感染所造成的嚴重后果。本發(fā)明還利用革蘭氏陰性菌的脂多糖和來自酵母菌的酵母多糖A聯(lián)合感染小鼠，發(fā)現(xiàn)針對CXCL-10分子的干預在治療來自革蘭氏陰性菌的脂多糖和來自釀酒酵母的酵母多糖A聯(lián)合感染所導致的損傷中有可能發(fā)揮重要作用。本發(fā)明利用特異性抗CXCL-10的單克隆抗體免疫野生型小鼠后再用來自大腸桿菌O111：B4的脂多糖和來自釀酒酵母的酵母多糖A聯(lián)合感染所述小鼠，結果表明，抗CXCL-10抗體對小鼠在感染來自大腸桿菌O111：B4的脂多糖和來自釀酒酵母的酵母多糖A的組合物導致的急性肺組織病理損傷中發(fā)揮了重要保護作用。因此，本發(fā)明第一次證明了特異性抑制CXCL-10的治療可以阻止或減緩由來自大腸桿菌O111：B4的脂多糖和來自釀酒酵母的酵母多糖A聯(lián)合感染所造成的嚴重后果。同時，本領域技術人員熟知，當證實CXCL-10在流感病毒感染導致的病理損傷、死亡等過程中發(fā)揮重要的促進作用時，尤其是在用特異性抗CXCL-10的抗體中和掉受試者體內的CXCL-10能保護受治者時，針對CXCL-10以消除或降低其影響的其他技術手段也能起到相同或類似的作用。本領域技術人員熟知，這樣的技術手段包括其他的特異性中和CXCL-10的抗體、特異性沉默CXCL-10表達的RNAi技術和本領域已知的其他能降低或消除CXCL-10表達的化學和/或生物物質。特異性中和CXCL-10的抗體可以是利用CXCL-10免疫哺乳動物后獲得的多克隆抗體、利用雜交瘤技術獲得的單克隆抗體、嵌合抗體、表面重塑抗體、重構抗體、全人源抗體或其抗原結合部分，只要這樣的抗體或其部分保留了抗原結合能力并能中和所述抗原的活性。針對特定靶基因的siRNA的設計是本領域技術人員已知的操作，這樣的序列可能在長度和針對的靶序列的位置上各不相同，但必然能沉默掉CXCL-10基因的表達，這樣的siRNA的一個范例是正義序列如SEQ.ID.NO.1:gauggccuucgauucuggaUU所示，反義序列如SEQ.ID.NO.2:UUguccagaaucgaaggccauc所示的siRNA。同時，本領域技術人員也能利用本領域已知的能降低或沉默CXCL-10表達的其他化學物質或利用本領域已知的技術篩選到的能降低或沉默CXCL-10表達的其他化學物質來降低或沉默CXCL-10的表達，從而實現(xiàn)治療肺損傷，特別是甲流，更特別是甲型H1N1流感的目的。同樣地，包含治療有效量的本發(fā)明所述的CXCL-10抑制劑的組合物也能用于治療甲流，特別是甲型H1N1流感。所述組合物的活性成分是CXCL-10抑制劑，同時也可以包括其他的可以與所述的CXCL-10抑制劑起協(xié)同作用的活性成分。本發(fā)明的組合物還可以包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑等藥用物質。附圖說明圖1：C57BL/6小鼠分別感染病毒滴度為105.5TCID50的甲型H1N1流感病毒BJ501株和相同劑量的雞胚尿囊液后的CXCL-10蛋白在肺組織中的表達量。圖2：野生型C57BL/6小鼠（A圖）和CXCL-10基因敲除小鼠（B圖）感染TCID50為105.5的甲型H1N1流感病毒BJ501株后小鼠肺組織的組織病理檢測結果。圖3：野生型C57BL/6小鼠和CXCL-10基因敲除小鼠感染TCID50為105.5的甲型H1N1流感病毒BJ501株后小鼠肺組織的濕干比檢測結果。圖4：野生型C57BL/6小鼠和CXCL-10基因敲除小鼠感染TCID50為1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠的死亡率曲線。圖5：野生型C57BL/6小鼠和CXCL-10基因敲除小鼠感染TCID50為1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠的體重變化曲線。圖6：野生型C57BL/6小鼠（A圖）和CXCL-10基因敲除小鼠（B圖）感染TCID50為1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠肺組織的組織病理檢測結果。圖7：野生型C57BL/6小鼠和CXCL-10基因敲除小鼠感染TCID50為1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠肺組織的濕干比檢測結果。圖8：野生型C57BL/6小鼠和PI3K基因敲除小鼠感染TCID50為1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠的死亡率曲線。圖9：野生型C57BL/6小鼠和PI3K基因敲除小鼠感染TCID50為1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠的體重變化曲線。圖10：野生型C57BL/6小鼠和PI3K基因敲除小鼠感染TCID50為1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠肺組織的濕干比檢測結果。圖11：野生型C57BL/6小鼠經(jīng)靜脈注射PBS、抗體對照或抗CXCL-10單克隆抗體后，感染病毒滴度為1.33×104TCID50的甲型H1N1流感病毒PR8株后的死亡率曲線。圖12：野生型C57BL/6小鼠在靜脈注射了雞胚尿囊液、PBS、抗體對照、抗CXCL-10單克隆抗體后，感染甲型H1N1流感病毒PR8株后小鼠肺組織的濕干比測定結果。圖13A-D：野生型C57BL/6小鼠感染滴度為1.33×104TCID50的甲型H1N1流感病毒PR8株后，靜脈注射雞胚尿囊液、PBS、抗體對照和抗CXCL-10單克隆抗體后小鼠的肺組織病理檢測結果。圖14A-E：野生型C57BL/6小鼠感染來自大腸桿菌O111：B4的脂多糖并于1小時后再次感染來自釀酒酵母的酵母多糖A或相同時間點給予溶劑對照后，分別在感染前12小時，感染前1小時，感染后8小時靜脈給予抗CXCL-10抗體或對照抗體。在感染第24小時后，取小鼠肺組織進行肺組織病理檢測。每組4只小鼠。具體實施方式下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發(fā)明，本領域技術人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。下述實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。實施例實施例1甲型H1N1流感病毒BJ501株感染引起小鼠肺組織CXCL-10蛋白表達升高實驗材料：1)主要實驗儀器：三級生物安全實驗室、三級生物安全柜、動物飼養(yǎng)柜、小鼠飼養(yǎng)籠、小動物手術器械、無菌注射器、移液器、移液管、Bio-PlexMouseCytokine23-PlexArray試劑盒等。2)主要實驗試劑：1%（W/V）戊巴比妥鈉溶液、病毒稀釋液、消毒劑（2.5%碘酒和75%酒精）等。3)病毒：甲型H1N1流感病毒BJ501株http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=648856&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock&lin=s。4)實驗動物：SPF級野生型(WT)C57BL/6小鼠（4周齡）：購于軍科院動物所，CXCL-10基因敲除小鼠（B6背景，購自美國JacksonLaboratory，貨號是006087）。實驗方法：1)分組：雞胚尿囊液對照組、BJ501病毒實驗組；2)安全固定小鼠，用1mL無菌注射器腹腔注射1%（W/V）戊巴比妥鈉溶液麻醉；3)保持麻醉小鼠頭部向上向后傾斜姿勢，使其鼻腔向上，便于病毒穩(wěn)定進入呼吸道。用移液管每側鼻孔各滴入10μL甲型H1N1流感病毒BJ501株病毒液（滴度為105TCID50）感染，感染病毒滴度為105.5TCID50/只，每組感染4只小鼠；4)保持小鼠此體位15秒，使病毒進入呼吸道。將小鼠置于鼠籠內，待其恢復清醒后，給予水及食物；5)肺灌洗液炎癥因子測定實驗于染病毒后24小時后進行，用腹腔注射過量麻醉劑的方法使小鼠死亡；6)將小鼠固定于小動物手術臺，移除胸部皮膚及骨骼，將氣管剪一小口，利用1毫升移液槍從開口處向小鼠注射800微升PBS緩沖液，反復吸取三次后將肺灌洗液吸出；7)利用Bio-PlexMouseCytokine23-Plex試劑盒對肺灌洗液進行CXCL-10蛋白表達量的測定；8)利用GraphPadPrism5軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。實驗結果：如圖1所示，感染滴度為105.5TCID50/只的BJ501株甲型H1N1流感病毒的小鼠肺組織CXCL-10蛋白的表達量顯著高于對照組。*P<0.05。此結果說明，CXCL-10在甲型H1N1流感病毒BJ501株感染導致小鼠死亡的過程中發(fā)揮重要作用，針對CXCL-10分子的干預在治療甲型H1N1流感病毒BJ501株感染所導致的損傷中，有可能發(fā)揮重要作用。實施例2CXCL-10-缺陷小鼠中甲型H1N1流感病毒BJ501株感染引起的急性肺損傷得以減輕實驗材料：1)主要實驗儀器：三級生物安全實驗室、三級生物安全柜、動物飼養(yǎng)柜、小鼠飼養(yǎng)籠、小動物手術器械、無菌注射器、移液器、移液管等。2)主要實驗試劑：1%（W/V）戊巴比妥鈉溶液、病毒稀釋液、消毒劑（2.5%碘酒和75%酒精）等。3)病毒：甲型H1N1流感病毒BJ501株http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=648856&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock&lin=s。4)實驗動物：SPF級野生型(WT)C57BL/6小鼠（4周齡）：購于軍科院動物所，CXCL-10基因敲除小鼠（B6背景，購自美國JacksonLaboratory，貨號是006087）。實驗方法：1)分組：野生型對照組、CXCL-10基因敲出小鼠實驗組；2)安全固定小鼠，用1mL無菌注射器腹腔注射1%（W/V）戊巴比妥鈉溶液麻醉；3)保持麻醉小鼠頭部向上向后傾斜姿勢，使其鼻腔向上，便于病毒穩(wěn)定進入呼吸道。用移液管每側鼻孔各滴入10μL甲型H1N1流感病毒BJ501株病毒液（滴度為105TCID50）感染，感染病毒滴度為105.5TCID50/只，每組感染10只小鼠；4)保持小鼠此體位15秒，使病毒進入呼吸道。將小鼠置于鼠籠內，待其恢復清醒后，給予水及食物；5)肺組織病理切片實驗于感染病毒后第5d進行，用腹腔注射過量麻醉劑的方法使小鼠死亡；6)將小鼠固定于小動物手術臺，移除胸部皮膚及骨骼，暴露胸腔，將小鼠肺臟連同心臟同時取出，用無菌PBS洗去表面血液，置于多聚甲醛固定液中室溫固定48h；7)固定后的樣品由病理實驗室進行包埋、切片、HE染色等處理；8)病理切片置于顯微鏡下觀察，并記錄；9)肺組織濕干比實驗于感染病毒后第5d進行，用腹腔注射過量麻醉劑的方法使小鼠死亡；10)將小鼠固定于小動物手術臺，移除胸部皮膚及骨骼，暴露胸腔，將小鼠完整肺臟取出，去除表面血液及多余結締組織，稱量并記錄肺臟濕重；11)肺臟置于55℃高溫組織干燥器中干烤，24h后取出，待溫度降至室溫進行肺臟干重的稱量并記錄；12)計算小鼠肺臟濕重/干重比值(Wet/dryratio)，進行統(tǒng)計分析。實驗結果：圖2中（×200倍，HE染色）病理照片顯示：感染滴度為105.5TCID50的甲型H1N1流感病毒BJ501株后，野生型C57BL/6小鼠肺組織中出現(xiàn)嚴重的病理損傷（圖2的A圖）。肺組織正常結構被破壞，肺組織紋理紊亂，伴隨出血、炎性滲出及大量紅細胞、炎癥細胞浸潤等病理損傷。但是，感染相同滴度病毒的CXCL-10基因敲除小鼠肺組織未見顯著病理損傷，無顯著的出血、滲出或者炎癥細胞浸潤等病理變化，肺組織紋理清晰，結構完整（圖2的B圖）。上述結果說明，CXCL-10對小鼠在感染甲型H1N1流感病毒BJ501株導致的急性肺組織病理損傷中發(fā)揮了重要作用。檢測小鼠肺臟濕干比可以反映小鼠發(fā)生急性肺水腫的程度。從圖3中也可見，4周齡野生型小鼠在感染甲型H1N1流感病毒BJ501后，其肺臟濕干比相比CXCL-10基因敲除小鼠顯著降低，說明CXCL-10的敲除可以顯著緩解甲型H1N1流感病毒BJ501株感染后小鼠的肺臟水腫。*P<0.05。此結果進一步說明，CXCL-10分子在甲型H1N1流感病毒BJ501株感染導致小鼠發(fā)生急性肺組織損傷的病理過程中發(fā)揮了重要作用。實施例3CXCL-10-缺陷小鼠中甲型H1N1流感病毒PR8株感染引起的急性肺損傷得以減輕本實施例實驗材料和實驗方法等同實施例2基本相同，實驗材料區(qū)別在于含有甲型H1N1流感病毒PR8株，不含有甲型H1N1流感病毒BJ501株，實驗方法區(qū)別在于使用甲型H1N1流感病毒PR8株代替甲型H1N1流感病毒BJ501株進行感染，感染前和感染后每天都記錄每組小鼠死亡/存活只數(shù)以及體重變化情況，連續(xù)觀察14d，24h內發(fā)生死亡的小鼠為非特異性死亡，在進行死亡率統(tǒng)計時不予計算在內，用GraphPadPrism5軟件統(tǒng)計小鼠死亡率及體重變化情況。實驗結果：野生型C57BL/6小鼠和CXCL-10基因敲除小鼠感染病毒滴度為1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后的死亡率結果以及體重變化結果，如圖4、圖5所示。感染相同滴度的PR8株甲型H1N1流感病毒后，野生型C57BL/6小鼠死亡率明顯高于CXCL-10基因敲除小鼠（圖4）。*P<0.05。體重變化（降低）結果與死亡率結果一致（圖5）。***P<0.001此結果說明，CXCL-10在甲型H1N1流感病毒PR8株感染導致小鼠死亡的過程中發(fā)揮重要作用，針對CXCL-10分子的干預在治療甲型H1N1流感病毒PR8株感染所導致的損傷中，有可能發(fā)揮重要作用。圖6中（×200倍，HE染色）病理照片顯示：感染滴度為1.33×104TCID50的甲型H1N1流感病毒PR8株后，野生型C57BL/6小鼠肺組織中出現(xiàn)嚴重的病理損傷（圖6的A圖）。肺組織正常結構被破壞，肺組織紋理紊亂，伴隨出血、炎性滲出及大量紅細胞、炎癥細胞浸潤等病理損傷。但是，感染相同滴度病毒的CXCL-10基因敲除小鼠肺組織未見顯著病理損傷，無顯著的出血、滲出或者炎癥細胞浸潤等病理變化，肺組織紋理清晰，結構完整（圖6的B圖）。上述結果說明，CXCL-10對小鼠在感染甲型H1N1流感病毒PR8株導致的急性肺組織病理損傷中發(fā)揮了重要作用。檢測小鼠肺臟濕干比可以反映小鼠發(fā)生急性肺水腫的程度。從圖7中也可見，4周齡野生型小鼠在感染甲型H1N1流感病毒PR8后，其肺臟濕干比相比CXCL-10基因敲除小鼠顯著降低，說明CXCL-10的敲除可以極顯著緩解甲型H1N1流感病毒PR8株感染后小鼠的肺臟水腫。***P<0.001。此結果進一步說明，CXCL-10分子在甲型H1N1流感病毒PR8株感染導致小鼠發(fā)生急性肺組織損傷的病理過程中發(fā)揮了重要作用。實施例4PI3K-缺陷小鼠中甲型H1N1流感病毒PR8株感染引起的急性肺損傷得以減輕本實施例實驗材料和實驗方法等同實施例3基本相同，實驗材料區(qū)別在于含有PI3K-缺陷小鼠（獲自奧地利科學院分子生物技術研究所（InstituteofMolecularBiotechnologyoftheAustrianAcademyofSciences）），不含有CXCL-10-缺陷小鼠，實驗方法區(qū)別在于使用甲型H1N1流感病毒PR8株感染PI3K-缺陷小鼠。野生型C57BL/6小鼠和PI3K基因敲除小鼠感染病毒滴度為1.33×104的甲型H1N1流感病毒PR8株后的死亡率結果以及體重變化結果，如圖8、圖9所示。感染相同滴度的PR8株甲型H1N1流感病毒后，野生型C57BL/6小鼠死亡率明顯高于PI3K基因敲除小鼠（圖8）。**P<0.01。體重變化（降低）結果與死亡率結果一致（圖9）。***P<0.001。此結果說明，PI3K在甲型H1N1流感病毒PR8株感染導致小鼠死亡的過程中發(fā)揮重要作用。檢測小鼠肺臟濕干比可以反映小鼠發(fā)生急性肺水腫的程度。從圖10中也可見，4周齡野生型小鼠在感染甲型H1N1流感病毒PR8后，其肺臟濕干比相比PI3K基因敲除小鼠顯著降低，說明PI3K的敲除可以顯著緩解甲型H1N1流感病毒PR8株感染后小鼠的肺臟水腫。*P<0.05。PI3K-Akt-p38通路已被證實位于CXCL-10下游，在CXCL-10誘導的趨化性中發(fā)揮重要作用，此結果進一步證明CXCL-10分子在甲型H1N1流感病毒PR8株感染導致小鼠發(fā)生急性肺組織損傷的病理過程中發(fā)揮了重要作用。實施例5抗CXCL-10單克隆抗體可以使甲型H1N1流感病毒PR8株感染引起的急性肺損傷得以減輕實驗材料：1)主要實驗儀器：三級生物安全實驗室、三級生物安全柜、動物飼養(yǎng)柜、小鼠飼養(yǎng)籠、小動物手術器械、無菌注射器、移液器、移液管等。2)主要實驗試劑：1%（W/V）戊巴比妥鈉溶液、病毒稀釋液、消毒劑（2.5%碘酒和75%酒精）等。3)實驗動物：SPF級野生型(WT)C57BL/6小鼠（4周齡）：購于軍科院動物所。實驗方法：1)分組：病毒溶劑（雞胚尿囊液）對照組、抗體溶劑（PBS）對照組、同型抗體對照組和抗CXCL-10單克隆抗體治療組；2)感染前1天，給抗CXCL-10單克隆抗體治療組的小鼠靜脈注射0.5mg/ml的抗CXCL-10單克隆抗體100ul，給同型抗體對照組和抗體溶劑對照組分別注射相同劑量的同型對照抗體和PBS。3)安全固定小鼠，用1mL無菌注射器腹腔注射1%（W/V）戊巴比妥鈉溶液麻醉；4)保持麻醉小鼠頭部向上向后傾斜姿勢，使其鼻腔向上，便于病毒穩(wěn)定進入呼吸道。用移液管每側鼻孔各滴入10μL甲型H1N1流感病毒PR8株病毒液（滴度為1.33×104TCID50）感染，感染病毒滴度為1.33×104TCID50/只，每組感染10只小鼠；5)保持小鼠此體位15秒，使病毒進入呼吸道。將小鼠置于鼠籠內，待其恢復清醒后，給予水及食物；6)感染后1天和3天，各重復步驟2一次。7)感染后觀察，24h內發(fā)生死亡的小鼠為非特異性死亡，在進行死亡率統(tǒng)計時不予計算在內；8)存活率和體重變化實驗連續(xù)觀察14d，每天記錄每組小鼠死亡/存活只數(shù)以及體重變化情況；9)用GraphPadPrism5軟件統(tǒng)計小鼠死亡率及體重變化情況；10)肺組織病理切片實驗于感染病毒后第5d進行，用腹腔注射過量麻醉劑的方法使小鼠死亡；11)將小鼠固定于小動物手術臺，移除胸部皮膚及骨骼，暴露胸腔，將小鼠肺臟連同心臟同時取出，用無菌PBS洗去表面血液，置于多聚甲醛固定液中室溫固定48h；12)固定后的樣品由病理實驗室進行包埋、切片、HE染色等處理；13)病理切片置于顯微鏡下觀察，并記錄；14)肺組織濕干比實驗于感染病毒后第5d進行，用腹腔注射過量麻醉劑的方法使小鼠死亡；15)將小鼠固定于小動物手術臺，移除胸部皮膚及骨骼，暴露胸腔，將小鼠完整肺臟取出，去除表面血液及多余結締組織，稱量并記錄肺臟濕重；16)肺臟置于55℃高溫組織干燥器中干烤，24h后取出，待溫度降至室溫進行肺臟干重的稱量并記錄；17)計算小鼠肺臟濕重/干重比值(Wet/dryratio)，進行統(tǒng)計分析；實驗結果：野生型C57BL/6小鼠經(jīng)靜脈注射PBS、抗體對照或抗CXCL-10單克隆抗體后，感染病毒滴度為1.33×104TCID50的甲型H1N1流感病毒PR8株后的死亡率結果，如圖11所示。感染相同滴度的PR8株甲型H1N1流感病毒后，靜脈注射PBS和靜脈注射抗體對照的小鼠死亡率都明顯高于靜脈注射抗CXCL-10單克隆抗體的小鼠（圖11）。*P<0.05。此結果說明，CXCL-10在甲型H1N1流感病毒PR8株感染導致小鼠死亡的過程中發(fā)揮重要作用，針對CXCL-10分子的干預在治療甲型H1N1流感病毒PR8株感染所導致的損傷中，有可能發(fā)揮重要作用。檢測小鼠肺臟濕干比，可以反映小鼠發(fā)生急性肺水腫的程度。從圖12中可見，4周齡野生型C57BL/6小鼠在靜脈注射了抗CXCL-10單克隆抗體后，感染甲型H1N1流感病毒PR8株，其肺臟濕干比相比抗體對照治療組小鼠顯著降低，說明抗CXCL-10抗體可以顯著緩解甲型H1N1流感病毒PR8株感染后小鼠的肺臟水腫。*P<0.05。此結果進一步說明，CXCL-10分子在甲型H1N1流感病毒PR8株感染導致小鼠發(fā)生急性肺組織損傷的病理過程中發(fā)揮了重要作用。圖13A-D中（×200倍，HE染色）病理照片顯示：感染滴度為1.33×104TCID50的甲型H1N1流感病毒PR8株后，靜脈注射病毒溶劑對照（雞胚尿囊液）和靜脈注射抗體溶劑（PBS）以及對照抗體的4周齡的野生型C57BL/6小鼠肺組織中出現(xiàn)嚴重的病理損傷（分別如圖13A、圖13B和圖13C所示）。肺組織正常結構被破壞，肺組織紋理紊亂，伴隨出血、炎性滲出及大量紅細胞、炎癥細胞浸潤等病理損傷。感染相同滴度病毒靜脈注射抗CXCL-10單克隆抗體的小鼠肺組織未見顯著病理損傷，無顯著的出血、滲出或者炎癥細胞浸潤等病理變化，肺組織紋理清晰，結構完整（圖13D）。雞胚尿囊液組小鼠肺組織也未見顯著病理損傷。結果說明，抗CXCL-10抗體對小鼠在感染甲型H1N1流感病毒PR8株導致的急性肺組織病理損傷中發(fā)揮了重要保護作用。實施例6抗CXCL-10單克隆抗體可以緩解由來自大腸桿菌O111：B4的脂多糖和來自釀酒酵母的酵母多糖A聯(lián)合感染后小鼠的肺組織病理損傷實驗材料：1)主要實驗儀器：SPF級動物房、SPF級生物安全柜、SPF級動物飼養(yǎng)柜、SPF級小鼠飼養(yǎng)籠、小動物手術器械、高溫組織干燥器、無菌注射器、移液器、移液管等。2)主要實驗試劑：抗CXCL-10單克隆抗體（AbM50009-1-PU，購自北京華大蛋白質研發(fā)中心有限公司）、抗體對照（AbM59538-10-PU，購自北京華大蛋白質研發(fā)中心有限公司）、1%（W/V）戊巴比妥鈉溶液、病毒稀釋液、無菌PBS、消毒劑（2.5%碘酒和75%酒精）等。3)脂多糖(LPS)：L2630，購于Sigma；酵母多糖(ZymosanA)：Z4250，購于Sigma。4)實驗動物：SPF級野生型BALB/c小鼠（4周齡）：購于維通利華實驗動物技術有限公司。實驗方法：1)分組：脂多糖和酵母多糖溶劑空白對照組、脂多糖和酵母多糖溶劑+同型抗體對照組、脂多糖和酵母多糖溶劑+抗CXCL-10單克隆抗體組、脂多糖和酵母多糖組+同型抗體對照組、脂多糖和酵母多糖+抗CXCL-10單克隆抗體組；2)小鼠靜脈注射抗體對照或抗CXCL-10單克隆抗體，每只小鼠每次靜脈注射50微克，共注射3次，分別為感染前12小時，1小時和感染后8小時；3)安全固定小鼠，用1mL無菌注射器腹腔注射1%（W/V）戊巴比妥鈉溶液麻醉；4)保持麻醉小鼠頭部向上向后傾斜姿勢，使其鼻腔向上。用酒精消毒頸部，用剪刀剪開頸部皮膚，分離氣管，用注射器注入50微升含100微克脂多糖的PBS緩沖液，每組感染4只小鼠；5)保持小鼠此體位5分鐘，使脂多糖進入呼吸道。將小鼠置于鼠籠內，待其恢復清醒后，給予水及食物；6)給予脂多糖1小時后，按照操作3中方法麻醉小鼠，保持麻醉小鼠頭部向上向后傾斜姿勢，使其鼻腔向上。用酒精消毒頸部，分離氣管，用注射器注入50微升含60微克酵母多糖的PBS緩沖液，每組感染4只小鼠；7)保持小鼠此體位5分鐘，使脂多糖進入呼吸道。將小鼠置于鼠籠內，待其恢復清醒后，給予水及食物；8)感染病毒后24小時，用腹腔注射過量麻醉劑的方法使小鼠死亡；9)將小鼠固定于小動物手術臺，移除胸部皮膚及骨骼，暴露胸腔，將小鼠肺臟連同心臟同時取出，用無菌PBS洗去表面血液，置于甲醛固定液中室溫固定48h；10)固定后的樣品由病理實驗室進行包埋、切片、HE染色等處理；11)病理切片置于顯微鏡下觀察，并記錄。實驗結果：圖14A-E中（×200倍，HE染色）病理照片顯示：脂多糖和酵母多糖溶劑空白對照組、脂多糖和酵母多糖溶劑+同型抗體對照組、脂多糖和酵母多糖溶劑+抗CXCL-10單克隆抗體組的小鼠肺組織未見顯著病理損傷，無顯著的出血、滲出或者炎癥細胞浸潤等病理變化，肺組織紋理清晰，結構完整（分別如圖14A、圖14B和圖14C所示），感染來自大腸桿菌O111：B4的脂多糖和來自釀酒酵母的酵母多糖A后，靜脈注射抗體對照的4周齡的野生型C57BL/6小鼠肺組織中出現(xiàn)嚴重的病理損傷（圖14D）。肺組織正常結構被破壞，肺組織紋理紊亂，伴隨出血、炎性滲出及大量紅細胞、炎癥細胞浸潤等病理損傷。感染相同滴度病毒靜脈注射抗CXCL-10單克隆抗體的小鼠肺組織未見顯著病理損傷，無顯著的出血、滲出或者炎癥細胞浸潤等病理變化，肺組織紋理清晰，結構完整（圖14E）。結果說明，抗CXCL-10抗體對小鼠在感染來自大腸桿菌O111：B4的脂多糖和來自釀酒酵母的酵母多糖A聯(lián)合導致的急性肺組織病理損傷中發(fā)揮了重要保護作用。