專利名稱：他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3復合物在制備治療肝癌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg 3在制備治療肝癌藥物中的應用。
背景技術：
肝癌是江蘇省的高發(fā)腫瘤，進展迅速，其發(fā)病率、死亡率均較高。除可切除的小型肝癌患者的5年存活率達到80 90%外，不能手術的肝癌患者自癥狀發(fā)作后的平均存活時間只有3 4個月。目前肝癌治療仍以手術切除為主，然而能夠施行完全肝癌切除手術患者比例不到肝癌總例數(shù)的10%，其余90%肝癌患者不能手術切除肝癌，或即便能手術切除肝癌，80%的病人在術后兩年內(nèi)復發(fā)。許多臨床病理因素影響其愈后，并可作為肝癌的愈后因子。其中Survivin已被報道是預測肝癌復發(fā)的一種有用指標；磷酸化Akt (p-Akt)過度表達常常與肝癌預后不良密切相關。研究發(fā)現(xiàn)survivin、p-Akt異常表達是肝癌手術后復發(fā)的危險因子，且兩者可作為肝癌復發(fā)的獨立的危險因子。因此，有這些危險因素的肝癌病人，術后要考慮給予輔助治療。肝癌藥物輔助治療及術后治療成了一個重要方法。目前常用的化療藥物有阿霉素、氟尿嘧啶、順鉬等進行靜脈或肝動脈輸注或栓塞化療，然而由于肝癌時肝臟已經(jīng)受到嚴重損害，導致具體治療選擇受到很大制約，而且這些療法不僅毒性嚴重，且通常也無明顯疾病緩解或延長生命效果。靶向治療藥物sorafenib具有抗腫瘤血管形成和抗細胞增殖作用，因副作用輕，能延長病人的生存而受腫瘤關注，但因其價格昂貴，限制了其在臨床使用。因此，迫切需要有效、低毒及價廉的藥物，為肝癌的治療提供一個新措施。近年來國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中存在雌激素受體，雌激素通過雌激素受體介導的信號通路來誘導基因轉(zhuǎn)錄，從而誘導肝癌的發(fā)生。原發(fā)性肝癌組織雌激素受體表達的陽性率與肝癌的分期有關，提示早期的肝癌可能更大程度上依賴雌激素，為肝癌的內(nèi)分泌治療提供了理論依據(jù)。他莫昔芬是一種非留體抗雌激素藥物，因其療效好，副作用輕，價格低廉已廣泛用于雌激素受體陽性的各期乳腺癌的治療。其抗腫瘤作用是通過雌激素受體依賴和非雌激素受體依賴的機制誘導乳腺癌細胞凋亡。目前，在肝癌研究中也發(fā)現(xiàn)，他莫昔芬除了通過與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮作用外，還通過調(diào)節(jié)蛋白激酶C活性、氧化應激、鈣內(nèi)流機制發(fā)揮作用。新近研究發(fā)現(xiàn)他莫昔芬通過下調(diào)端粒酶活性誘導肝癌細胞凋亡。臨床隨機對照研究結(jié)果顯示，晚期、無法進行手術切除的肝癌患者，口服他莫昔芬能夠延長病人生存且無明顯毒副反應，初步顯示出他莫昔芬在肝癌治療中良好的應用前景。因此，在晚期肝癌或肝癌術后患者中值得推廣使用。目前文獻報道在臨床應用一般為他莫昔芬，或他莫昔芬和雷帕霉素聯(lián)用，但實際臨床經(jīng)驗獲知患者在使用上述藥物時，仍然發(fā)現(xiàn)療效增效不大，且特別是患者為手術切除肝癌的患者，復發(fā)率較高，且術后愈合緩慢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3復合物在制備治療肝癌藥物中的應用治療肝癌的新方案。人參皂苷Rg3 ;本發(fā)明的技術方案為
他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3在制備治療肝癌藥物中的應用。按重量分數(shù)計所述的復合物由人參皂苷Rg3 1-2份，他莫昔芬1-2份，雷帕霉素0. 01-0. 02份構(gòu)成。有益效果
I、他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3治療肝癌時，能增加肝癌細胞對化療的敏感性。他莫昔芬通過抑制Akt的活性誘導乳腺上皮細胞凋亡，而當Akt通路激活后則誘導乳腺癌細胞產(chǎn)生對他莫昔芬的耐藥。三者聯(lián)用，能協(xié)同誘導腫瘤細胞凋亡。同時人參皂苷Rg3能夠抑制腫瘤細胞VEGF的表達，從而抑制腫瘤血管的形成；還能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，干擾內(nèi)皮細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用，從而阻斷腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移，提高手術治療的徹底性，減少術后復發(fā)轉(zhuǎn)移的幾率，能夠提高腫瘤病人的自身免疫力，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，并降低腫瘤病人放化療后的毒副作用。2、本發(fā)明通過復方組配的復合物治療肝癌，發(fā)揮各種藥物的協(xié)同作用，同時降低單個藥物副作用，其組方療效顯著。


附圖I為不同藥物對survivin、p-Akt陽性表達患者的生存時間,其中A組觀察組；B組單藥治療組；C組三藥聯(lián)合治療組。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素人參皂苷Rg3復合物以下簡稱復合物，且所述的復合物由人參皂苷Rg3 l_2g，他莫昔芬l-2g，雷帕霉素 0. 01-0. 02mg 構(gòu)成。實施例I
I.試劑RPMI-1640培養(yǎng)基為美國GIBCOL BRL公司產(chǎn)品；鼠抗survivin、p70s6kThr389單克隆抗體購自Cell signal公司；二抗HRP標記抗鼠lgG、化學發(fā)光(ECL)底物購自Santa Cruz公司；他莫昔芬,雷帕霉素、人參阜苷Rg3皆購自Sigma公司，海腎突光素酶質(zhì)粒pRL-CMV購自Promega公司。質(zhì)粒pLUC編碼螢火蟲熒光素酶基因和survivin啟動子序列由美國北卡羅里大學Xun博士惠贈。2.細胞培養(yǎng)人肝癌IfepG2細胞株常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中，內(nèi)加10%小牛血清、人青霉素(濃度100 U/ml)和鏈霉素(濃度100 u g/ml)，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵育箱內(nèi)貼壁生長3 4代后，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。3.分組將對數(shù)生長期細胞制成單個細胞懸液，以每孔I X IO4個細胞接種到6孔板，每孔加100 u I, 37°C、5%C02濕度培養(yǎng)箱中24h后，第二天分別加入含有20 u M他莫昔芬、IOnM雷帕霉素(在20 ii M他莫昔芬前I小時)，IOnM復合物，同時設立陰性對照，即陽性對照組為20 y M他吳昔分、IOnM雷帕霉素(在20 y M他吳昔分如I小時)。
4.四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法實驗將對數(shù)生長期細胞制成單個細胞懸液，以每孔2 X IO3個細胞接種到96孔板，每孔加100 μ I, 37°C、5%C02濕度培養(yǎng)箱中24h后，分別加入含有不同濃度他莫昔芬、雷帕霉素、復合物的培養(yǎng)液100 μ 1，每個樣本不同濃度設平行的3個孔，對照組加不含樣本的培養(yǎng)液100μ 1，再放入培養(yǎng)箱中孵育24 72 h。每孔加入用無血清1640按5mg/ml新鮮配制的MTT溶液20 μ I。繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μ I 二甲亞砜，振蕩lOmin，測定490nm波長上各孔A值。實驗結(jié)果
復合物以濃度依賴方式減少H印G2細胞增殖，與對照藥組比較，復合物濃度達到20 μ M時，細胞增殖活性下降至50%。復合物濃度在10 μ M時，細胞增殖活性下降與G0/G1期細胞比例增加有關。5.流式細胞儀檢測細胞凋亡將各組細胞用胰酶消化后收集，水平離心5min，PBS洗2遍，離心棄上清，加入Iml 70%預冷乙醇中，吹打均勻，4°C固定12h以上。PBS洗滌去乙醇，1500rpm, 5min,棄上清,共洗2遍。Iml PBS重懸細胞,調(diào)節(jié)細胞濃度達104/ml個，加入PI染液11111，41冰箱，染色30-601^11。離心，洗去PI染液，加少許PBS，上流式細胞儀進行檢測。RT-PCR:采用Invitrogen公司的Trizol試劑，按照操作步驟提取細胞中的總RNA0以此RNA為模板，加入2. 5mol/L oligo (dT) 16和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，在37 °C水浴Ih,95°C維持滅活5 min,合成cDNA,合成的cDNA用于RT-PCR。survivin:上游引物5’ -GGCTCTTTCTCTGTCCAGTT-3’，下游引物 5’ -ACCACCGCATCTCTACATTC-3’。Western blot試驗各組細胞經(jīng)冰PBS洗2次,加裂解液,冰上裂解IOmin,離心取上清。采用BCA蛋白質(zhì)定量法測定蛋白質(zhì)濃度，電泳前加2 X SDS緩沖液，10CTC水浴lOmin，60μ g蛋白進行12% SDS-聚烯酰胺凝膠電泳；蛋白分離后，電泳轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，室溫封閉Ih, 一抗(鼠抗survivin ；p70s6k Thr389) 4°C過夜,二抗室溫lh,米用ECL顯影，暗室壓片。實驗結(jié)果RT-PCR和Western法檢測了 20 μ M復合物，處理H印G2細胞48小時后survivin mRNA和蛋白表達水平,結(jié)果顯示survivin mRNA和蛋白表達水平均降低。用帶有158bp的survivin核啟動子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞后,再用他莫昔芬處理,與對照相比，survivin啟動子的活性急劇下降，結(jié)果提示復合物誘導細胞凋亡，且優(yōu)于單個藥物。8.轉(zhuǎn)染于轉(zhuǎn)染前一天將細胞接種到24孔板培養(yǎng)，實驗當天細胞生長面積達70%，每個孔加400ng pLUC-sur，2ng海腎熒光素酶質(zhì)粒pRL -CMV，以空質(zhì)粒pcDNA3 . I為對照，按照Lipofectamine轉(zhuǎn)染說明操作，轉(zhuǎn)染至!fepG2細胞。轉(zhuǎn)染24小時后棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌后，分別加入無血清培養(yǎng)液I. 0ml，分別加入他莫昔芬、雷帕霉素，對照組加入等體積的無菌超純水，繼續(xù)培養(yǎng)6h，收集細胞，清洗細胞，每孔加入100 μ I雙熒光素酶檢測試劑盒中的細胞裂解液，進行細胞裂解收集。取20 μ I細胞裂解產(chǎn)物，進行目的報告基因熒火蟲熒光素酶及內(nèi)對照海腎素熒光素酶檢測，計算熒火蟲熒光素酶的表達值與內(nèi)對照腎素熒光素酶表達值的比值。實驗結(jié)果HepG2細胞用復合物處理后，與對照相比，雷帕霉素單獨使用減少細胞生長20%, survivin單獨使用減少細胞生長45%,聯(lián)合用藥使用減少細胞生長近65%,顯示出復合物在抑制細胞增殖中有協(xié)同作用。、
實施例2
他莫昔芬抑制腫瘤生長在乳腺癌及肝癌的實驗中已取得了明顯的療效，他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3能增強其細胞毒性藥物的效果。因此他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3聯(lián)合治療，將為肝癌治療提供一種高效、低毒、價廉的手段。我們已在臨床開展檢 測肝癌術后組織標本中survivin、p-Akt> ER表達100余例，對survivin、p-Akt陽性表達患者在門診隨訪過程中部分應用莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素人參阜苷Rg3、他莫昔芬單藥治療和對照觀察隨訪，至少2個以上療程。結(jié)果顯示與單藥治療組和觀察組(對照組未給藥)相比，三藥聯(lián)合治療組(莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3復合物由人參皂苷Rg3 1-2份，他莫昔芬1-2份，雷帕霉素0. 01-0. 02份構(gòu)成)具有協(xié)同作用，能夠延長肝癌患者緩解及生存時間，價格低廉且無明顯不良反應，值得在臨床進一步推廣。具體為病案號為465289，465529，465309，466861,466546，466247，467585，468199，469578，470655，0476917，0478973。
權利要求
1.他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3復合物在制備治療肝癌藥物中的應用，其中按重量分數(shù)計所述的復合物由人參皂苷Rg3 1-2份，他莫昔芬1-2份，雷帕霉素0. 01-0. 02 份構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明涉及他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3在制備治療肝癌藥物中的應用。他莫昔芬聯(lián)合雷帕霉素、人參皂苷Rg3治療肝癌時，能增加肝癌細胞對化療的敏感性。他莫昔芬通過抑制Akt的活性誘導乳腺上皮細胞凋亡，而當Akt通路激活后則誘導乳腺癌細胞產(chǎn)生對他莫昔芬的耐藥。三者聯(lián)用，能協(xié)同誘導腫瘤細胞凋亡。同時人參皂苷Rg3能夠抑制腫瘤細胞VEGF的表達，從而抑制腫瘤血管的形成；還能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，干擾內(nèi)皮細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用，從而阻斷腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移，提高手術治療的徹底性，減少術后復發(fā)轉(zhuǎn)移的幾率，能夠提高腫瘤病人的自身免疫力，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，并降低腫瘤病人放化療后的毒副作用。
文檔編號A61P35/00GK102626416SQ20121014395
公開日2012年8月8日 申請日期2012年5月11日 優(yōu)先權日2012年5月11日
發(fā)明者朱蔚友, 束永前, 王同杉, 郭人花, 金時代, 陳小鋒 申請人:江蘇省人民醫(yī)院