專利名稱：一種核酸分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體是涉及ー種核酸分子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
microRNA(簡(jiǎn)寫miRNA)是目前研究最熱門的非編碼小RNA之一，它是ー類長(zhǎng)度約為22bp，由dicer酶從有特定ニ級(jí)結(jié)構(gòu)的前體剪切加工成熟的，通過(guò)與mRNA完全或不完全配對(duì)來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的RNA分子，它屬于非編碼小RNA家族的ー員，在物種之間是保守的。 miRNA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)，繁殖，分化，調(diào)亡等生命過(guò)程。超過(guò)一半的人類miRNA基因在基因組的位置被認(rèn)為與癌癥有關(guān)，如脆性位點(diǎn)，擴(kuò)增相關(guān)的窄位點(diǎn)區(qū)，或者斷裂位點(diǎn)區(qū)。miRNA基因在核內(nèi)由RNA聚合酶II (Pol II)轉(zhuǎn)錄為初級(jí)前體(primary miRNA，簡(jiǎn)寫pri-miRNA)，pri-miRNA含ー個(gè)7甲基鳥(niǎo)嘌呤(7_mG)的帽子和多聚腺苷酸的尾(PolyA)， 這些是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄體的特征，pri-miRNA還包含stem-loop結(jié)構(gòu)，pri_miRNA被 III 類 RNA 酶(RNase 111) Drosha 切割為約 70bp 的前體 miRNA (precursor miRNA，簡(jiǎn)寫 pre-miRNA)，其它側(cè)翼序列被認(rèn)為在核內(nèi)被降解(Lee Y，et al. 2004. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J 23 :4051 4060) 。pre_miRNA 由白 Ran 依賴的核轉(zhuǎn)運(yùn)因子受體export-5(Exp。送至核外，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)由核酸酶RNase III dicer 加工為約 22bp 成熟的 miRNA (He L and Hannon G. 2004. MicroRNAs =Small RNAs with a big roie in the gene regulation. Nature Gnetics 5 :522-532)。成熟的 miRNAs 與一些蛋H 構(gòu)成復(fù)合體，miRISC 調(diào)節(jié)基因的表達(dá)(Mourelators et al.，2002. miRNPs :a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs. Genes Dev. 16(6) :720-728.)。 在復(fù)合體形成過(guò)程中，Dicer剪切產(chǎn)物(約22bp的雙鏈miRNA)變成單鏈，也稱為成熟的 miRNA，另一條鏈迅速消失。miRNA可以抑制mRNA的翻譯，或者通過(guò)脫腺苷酸，脫帽等促進(jìn) mRNA降解，RNA processing body (P_body也稱為GW body)可能在mRNA降解過(guò)程發(fā)揮了作用(BehM-Ansmant J, et al. 2006. microRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 71 :523-530)1969 年 Britten 禾ロ Dabidson(Britten RJ, Davidson EH. 1969. Gene regulation for higher cells :a theory. Science 165(891) :349-357.)年提出設(shè)想從基因組翻譯的活性RNAs分子與調(diào)控DNA序列形成復(fù)合物來(lái)激活ー些蛋白表達(dá)基因。Lee et al (Lee Rし，F(xiàn)einoaum RL, Ambros V. 1993. The し· elegans heterochronic gene lin_4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell,75 (5) :843-54.) /AffM 線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn)ー個(gè)非編碼蛋白的小RNA分子lin_4通過(guò)負(fù)調(diào)控 lin-14蛋白的表達(dá)來(lái)調(diào)控秀麗線蟲(chóng)的發(fā)育，進(jìn)ー步發(fā)現(xiàn)lin4存在22nt和61nt的兩種轉(zhuǎn)錄本且與lin-14蛋白的RNA的3’端非翻譯區(qū)(UTR)有互補(bǔ)配對(duì)序列，并認(rèn)為lin4與lin-14 通過(guò)RNA-RNA相互作用的形式來(lái)調(diào)控蛋白lin-14的表達(dá)。Reinhart et al (Reinhart BJ et al. 2000. The 21—nucleotide let_7 RNA regulates developmental timing inCaenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772) :901-906.)發(fā)現(xiàn)另一非編碼小 RNA 分子 let-7通過(guò)調(diào)控1 in-41蛋白R(shí)NA分子的3，UTR來(lái)調(diào)控蛋白的1 in-41的表達(dá)從而調(diào)控秀麗線蟲(chóng)的發(fā)育。2001年Bartel，TuSChl，Ambr0S三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)大量類似的非編碼小RNA調(diào)控分子，并將其統(tǒng)稱為microRNA(簡(jiǎn)稱miRNA)，并不再使用stRNA(small temporal RNA) S—^^ (Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, Bartel DP. 2001. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science 294 858-862 ；Lagos-Quintana Μ,Rauhut R,Lendeckel W,Tuschl Τ. 2001. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science(New York, NY 294:853-858.； Lee RC, Ambros V. 2001. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science 294(5543) :862-864.)miRNA 統(tǒng)ー收錄在英國(guó) Sanger 中心的 miRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www.sanger.ac.ck/)，目前在該數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)的人類(Homo sapiens)的 miRNA 為 1921 條，小鼠(Mus musculus)的為 1157，大鼠(Rattus norvegicus)的為 680 條(Griffiths-Jones S, Saini HK, van Dongen S, Enright AJ. 2008. miRBase :tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res 36 :D154_158)。研究表明，microRNAs作為重要的效應(yīng)分子參與了細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子 p53 和 p65 調(diào)控的相關(guān)的 microRNAs 已有相關(guān)報(bào)道(Bhaumik, D.，Scott, G. K.，Schokrpur, S. , Patil, C.K., Campisi, J. , and Benz, C. C. (2008). Expression of microRNA-146 suppresses NF-kappaB activity with reduction oi metastatic potential m breast cancer ceils. Oncogene 27,5643-5647. Song, B. ， Wang, Y. ， Kudo, K. ， Gavin, E. J. ， Xi, Y. G. , and Ju, J. F. (2008). miR-192 Regulates Dihydrofolate Reductase and Cellular Proliferation through the p53_microRNA Circuit. Clinical Cancer Research 14, 8080-8086.)，然而對(duì)介導(dǎo)p53和p65互作的microRNAs尚未見(jiàn)報(bào)道。NF-κΒ轉(zhuǎn)錄因子在炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞増殖凋亡等過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。 NF-k B家族是ー類含有RHD結(jié)構(gòu)域的蛋白，成員包括NFkBl、NFkB2(p52/pl00)、c-Rel、RelB 以及RELA(即p65)，其中p65作為最重要的成員參與了細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及腫瘤的發(fā)生。研究表明，在炎癥反應(yīng)中激活NF-k B有助于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展(Karin，Μ. (2006). Nuclear factor-kappa B in cancer development and progression. Nature 441,431—436),在月市癌模型中發(fā)現(xiàn)，肺癌的發(fā)生需要NF-kB的活性錯(cuò)誤！未找到引用源。。除此之外，在癌癥化療及放療中常常會(huì)導(dǎo)致非經(jīng)典通路NF-kB的激活，從而引發(fā)癌癥治療的耐藥性錯(cuò)誤！未找到引用源。。直被認(rèn)為是一個(gè)癌癥治療及預(yù)防的靶標(biāo)分子(Li，F(xiàn).，and Sethi, G. (2010). Targeting transcription ιactor NF-KappaB to overcome chemoresistance ana radioresistance in cancer therapy. Biochim Biophys Acta 1805，167-180)錯(cuò)誤！未找到引用源。，p65調(diào)節(jié)機(jī)理的闡述在癌癥治療中具有重要的意義。脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，縮寫為DNA)是ー種長(zhǎng)鏈脫氧核苷酸聚合物，4種主要的組成核苷酸包括脫氧腺嘌呤核苷酸(dA)，脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(dG)，脫氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)，脫氧胞嘧啶核苷酸(dC)；核糖核酸(Ribonucleicacid，縮寫為RNA)是一種長(zhǎng)鏈核苷酸聚合物，4種主要組成核酸包括腺嘌呤核苷酸(A)，鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(G)，尿嘧啶核苷酸(U)，胞嘧啶核苷酸(C). DNA與RNA在堿基組成上的主要區(qū)別是DNA用的是dA、dT、 dG、dC，而RNA用的是A、U、C、G，其中dA，dC，dG分別比A，C，G堿基在核糖2位上少ー個(gè)羥基-OH.DNA或者RNA的組成分子核苷酸又是由三部分組成的堿基，核糖，磷酸。其中的 核糖一般是五碳糖，堿基與核糖結(jié)合組成核苷。核糖2位碳原子連有羥基(-0H)的是核糖， 沒(méi)有羥基的就是脫氧核糖。核苷酸之間通過(guò)核糖5位的磷酸集団與3位的羥基縮合形成磷 酸ニ脂鍵將核苷酸連在一起形成短鏈的寡核酸或者長(zhǎng)鏈的DNA或者RNA，鏈的兩端分別稱 做5 ‘端、3，端。在分子生物學(xué)應(yīng)用中應(yīng)用較多的是短鏈的寡核酸，其堿基，核糖，磷酸可以分別被 修飾或集團(tuán)替換，在提高核苷酸的穩(wěn)定性的同吋，不影響該核苷酸發(fā)揮生物學(xué)功能。自然存 在的RNA形式及常見(jiàn)的修飾方法見(jiàn)下圖。
權(quán)利要求
1.ー種核酸分子，其特征在于，其堿基組成為SEQ ID NO. 1、或SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2、或 SEQ ID NO. 3、或 SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 9。
2.—種核酸分子，其特征在于，其堿基組成為SEQ ID NO. 1、或SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2、或SEQ ID NO. 3、或SEQ ID NO. 4，且含有修飾的核苷酸類似物，該修飾的核苷酸類似物為糖基修飾或磷酸骨架修飾或堿基修飾或末端修飾的核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在干，所述核苷酸類似物是糖基修飾的核糖核苷酸，核糖核苷酸的2，-羥基被置換為H、OR、R、鹵素、SH、SRI、NH2、NHR、NR2或CN，其中R是C1-C20的烷基、烯基、共軛基、或炔基，所述鹵素是F、Cl、Br或I。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在干，所述核苷酸類似物是糖基修飾的核糖核苷酸，核糖被置換為核糖類似物結(jié)構(gòu)為^,ΟμΝΗ^-Α,，其中含有該結(jié)構(gòu)的包括雙環(huán)或多環(huán)核糖，無(wú)環(huán)核糖，或肽核苷酸，其中X是F、Cl、Br或I。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在干，所述修飾核苷酸類似物是含有修飾的非天然堿基的核苷酸，其堿基結(jié)構(gòu)為CVmO^N^S^X^，其中含有該結(jié)構(gòu)的包括嘌呤堿基類似物、嘧啶堿基類似物、化學(xué)或光交聯(lián)基團(tuán)，其中X是F、Cl、Br或I。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在干，所述末端修飾飾的核苷酸的結(jié)構(gòu)為 CmcAJN^S^X^，其中含有該結(jié)構(gòu)的包括膽固醇、生物素、膽酸、葉酸、維生素、或熒光分子，其中X是F、Cl、Br或I。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的核酸分子在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，所述腫瘤為肺癌、肝癌、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸直腸
9.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的核酸分子作為腫瘤診斷標(biāo)記物的應(yīng)用。
10.一種治療腫瘤的藥用組合物，其活性成包括有權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種核酸分子，其堿基組成為SEQ ID NO.1、或SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、或SEQ ID NO.3、或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.9，或其堿基組成為SEQ ID NO.1、或SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、或SEQ ID NO.3、或SEQ ID NO.4，且含有修飾的核苷酸類似物，該修飾的核苷酸類似物為糖基修飾或磷酸骨架修飾或堿基修飾或末端修飾的核苷酸。用該核酸分子制備得到的抗腫瘤的藥用組合物可以用于肺癌診斷及預(yù)后的判斷。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102533770SQ20121007171
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者馮世鵬, 尹夢(mèng)回, 張必良, 王瑋 申請(qǐng)人:廣州市銳博生物科技有限公司