專利名稱：訶子用于制備抗真菌藥物及抗真菌藥物增效劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種訶子用于制備抗真菌藥物及抗真菌藥物增效劑的用途。
背景技術(shù)：
訶子為使君子科植物訶子的果實(shí)，味苦、酸、澀，性平，具有斂肺、澀腸、下氣、利咽之功效。中醫(yī)常將訶子用于治療久瀉、久痢、脫肛、喘咳痰嗽、久咳失音等癥?，F(xiàn)代藥理研究顯示，訶子具有抗菌、抗氧化、抗癌、強(qiáng)心、細(xì)胞損傷保護(hù)等藥理作用，雖然亦有訶子體外抗真菌作用的報(bào)道，但未見(jiàn)訶子體內(nèi)治療真菌感染，也未見(jiàn)訶子作為抗真菌藥物增效劑與抗真菌藥物聯(lián)合使用治療真菌病的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種訶子用于制備抗真菌藥物及抗真菌藥物增效劑的用途。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，訶子對(duì)各種臨床真菌菌株如白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平念珠菌、新生隱球菌具有抑制活性。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，訶子的75%乙醇提取物可顯著提高真菌感染小鼠的存活時(shí)間和存活率。當(dāng)抗真菌藥物氟康唑和訶子合用時(shí)，能明顯降低抗真菌藥物的用藥劑量，并增強(qiáng)對(duì)耐藥真菌的抑制作用，使抗真菌藥物恢復(fù)對(duì)耐藥真菌的作用。因此可將訶子用作抗真菌治療及抗真菌藥物的增效劑。本發(fā)明提出一種訶子用于制備抗真菌藥物及抗真菌藥物增效劑的用途，其中所述訶子的藥材原料為使君子科植物訶子的果實(shí)。本發(fā)明中，所述訶子是訶子藥材水提物或乙醇提取物的一種。本發(fā)明中，所述乙醇提取是指用75%乙醇提取。本發(fā)明中，所述真菌包括1)敏感菌株敏感白色念珠菌(SC5314)，近平滑念珠菌 (22019)，新生隱球菌；2)耐藥菌株耐藥白色念珠菌(103)，耐藥熱帶念珠菌，天然耐藥克柔念珠菌(ATCC2340)，天然耐藥光滑念珠菌(ATCC2^1)。本發(fā)明中，所述耐藥菌株是對(duì)氟康唑耐受，敏感菌株是對(duì)氟康唑敏感。本發(fā)明中，所述抗真菌藥物包括1)多烯類藥物如兩性霉素B，甲帕霉素等；2)唑類藥物如氟康唑，咪康唑，酮康唑，伊曲康唑等；3)其他藥物如5-氟胞嘧啶，卡泊芬凈等。本發(fā)明為訶子開(kāi)辟了新的用途，將其用于制備抗真菌藥物及抗真菌藥物的增效劑，不僅為真菌治療提供了新的候選藥物，而且提高了現(xiàn)有藥物的抗真菌作用，在臨床真菌耐藥性日趨普遍、耐藥程度日趨嚴(yán)重的情況下，使抗真菌藥物恢復(fù)對(duì)耐藥真菌的作用，降低了抗真菌藥物的用藥劑量，從而為患者節(jié)省了醫(yī)療費(fèi)用，減少藥物的毒副作用。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中ICR小鼠感染白念珠菌103后的生存曲線圖。在圖1中， 橫坐標(biāo)為感染天數(shù)(d)，縱坐標(biāo)為累積存活率(％)。
具體實(shí)施例方式以下所列實(shí)施例，僅為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1.訶子對(duì)不同臨床真菌株的作用材料和方法
1.試藥
訶子藥材購(gòu)于上海雷允上北區(qū)藥品零售有限公司。氟康唑sigma公司，批號(hào) 460M4707V。二甲亞砜上海世儀生物科技有限公司。各試藥置于-20°C保存。實(shí)驗(yàn)前，將藥物取出置于35°C溫箱融化，充分混勻，分別進(jìn)行藥效學(xué)檢驗(yàn)。2.菌株
臨床株1)白念珠菌，分103、SC5314兩株；2)熱帶念珠菌2718，1株；3)光滑念珠菌ATCC1182，1株；4)克柔念珠菌ATCC2340,1株；5)近平念珠菌ATCC22019,1株；6)新生隱球菌，1株。光滑念珠菌和克柔念珠菌由安徽中醫(yī)學(xué)院汪長(zhǎng)中教授惠贈(zèng)，其余均由上海長(zhǎng)海醫(yī)院真菌室提供，分別采自長(zhǎng)海醫(yī)院不同科室臨床樣本，并經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。所有實(shí)驗(yàn)用菌株均于沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)劃板活化，白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平念珠菌、新生隱球菌等球狀菌于30°C培養(yǎng)2周后，分別挑取單克隆再次劃板活化，取第二次所得單克隆置SDA斜面，用上述方法培養(yǎng)后于4°C保存?zhèn)溆谩?.培養(yǎng)液
1) RPMI 1640液體培養(yǎng)液
RPMI1640 (Gibco BRL)10 g,NaHCO3 2.0 g，嗎啡啉丙磺酸(Sigma)34.5 g(0. 165 Μ),加三蒸水900 ml溶解，1 N NaOH調(diào)pH至7. 0 (25°C )，三蒸水定容至1000 ml，0. 22Mm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后于4°C保存?zhèn)溆谩?)沙堡葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基(SDA)
蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂18 g，加三蒸水900 ml溶解，加入2 mg/ml氯霉素水溶液50 ml，調(diào)整pH至7.0，以三蒸水定容至1000 ml，高壓滅菌(121°C，15min)后于4°C保存?zhèn)溆谩? ) YEPD 培養(yǎng)液
酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加三蒸水900 ml溶解，加入2 mg/ml氯霉素水溶液50 ml，三蒸水定容至1000 ml，高壓滅菌(121°C，15min)后于4°C保存?zhèn)溆谩?.儀器設(shè)備
Multiskan MK3型酶標(biāo)檢測(cè)儀(芬蘭Labsystems產(chǎn)品)隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)THZ - 82A臺(tái)式恒溫振蕩器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)Sff-CT-IF型超凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)5.訶子提取物的制備將訶子果實(shí)粉碎后，過(guò)60目篩，以1 :20比例，用75%乙醇，85°C回流提取池，溶液紗布過(guò)濾后，50°C減壓回收乙醇，再于50°C烘箱烘干，粉碎成粉末，用DMSO溶解，配成濃度0. 5g/ ml (按生藥量計(jì)算)，分裝后于-20°C保存?zhèn)溆谩?.菌液制備
實(shí)驗(yàn)前，用接種圈從4°C保存的SDA培養(yǎng)基上分別挑取白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平念珠菌、新生隱球菌各球狀菌少量，分別接種至1 ml YEPD培養(yǎng)液， 于30°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)，活化16 h，使真菌處于指數(shù)生長(zhǎng)期后期。然后將各菌液分別加至1 mlYEPD培養(yǎng)液中，用上述方法再次活化，培養(yǎng)16 h，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以RPMI 1640培養(yǎng)液分別調(diào)整各菌液濃度至1 X IO3 5X 103CFU/ml。7.藥敏板制備
各菌株分別取無(wú)菌96孔板一塊，于每排1號(hào)孔加RPMI 1640液體培養(yǎng)基ΙΟΟμΙ作空白對(duì)照；3 12號(hào)孔各加上述新鮮配制的菌液ΙΟΟμΙ ；2號(hào)孔加菌液198μ1 ；12號(hào)孔不含藥物， 只加菌液ΙΟΟμΙ作陽(yáng)性生長(zhǎng)對(duì)照。在每排的2號(hào)孔加母液濃度為0. 5g/ml的訶子或氟康唑各 2μ1。對(duì)2 11號(hào)孔進(jìn)行10級(jí)倍比稀釋，使各孔的最終訶子藥物濃度分別為5000、 2500、1250、625、312. 5,156. 25,78. 125,39. 06,19. 53,9. 76μδ/πι1,氟康唑的藥物濃度分別為 64、32、16、8、4、2、1、0· 5、0· 25、0· 125Pg/ml。各孔中 DMSO 含量均低于 1%。將各藥敏板于30°C恒溫箱培養(yǎng)。8. MIC80 值判定
在30°C恒溫箱中，念珠菌培養(yǎng)對(duì)h，新生隱球菌培養(yǎng)72h，用酶標(biāo)分析儀于630 nm測(cè)各孔OD值。與陽(yáng)性對(duì)照孔比，以O(shè)D值下降80%以上的最低濃度孔中的藥物濃度為MIC8tl (真菌生長(zhǎng)80%被抑制時(shí)的藥物濃度)。當(dāng)藥物的MIC8tl值超過(guò)測(cè)定濃度范圍時(shí)，按以下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)如以氟康唑?yàn)槔?，MIC8tl值高于最高濃度64Pg/ml時(shí)，計(jì)為“>64Pg/ml ” ； MIC8tl值為最低濃度或在最低濃度以下時(shí)，不作區(qū)別，均計(jì)為“彡0. 125Pg/ml”。上述實(shí)驗(yàn)均平行操作2到3次，當(dāng)MIC8tl值能準(zhǔn)確重復(fù)或只差一個(gè)濃度時(shí)才被接受，并以較高濃度作為MIC8tl值；當(dāng)MIC8q值相差兩個(gè)濃度以上時(shí)，則需重新實(shí)驗(yàn)，直到符合要求為止。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1
表1訶子對(duì)7株臨床真菌的MIC8tl值(μ g/ml)
權(quán)利要求
1.訶子用于制備抗真菌藥物及抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于所述訶子的藥材原料為使君子科植物訶子的果實(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的訶子用于制備抗真菌藥物及抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于，所述的訶子是訶子藥材水提物或乙醇提取物的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的訶子用于制備抗真菌藥物及抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于，所述的乙醇提取是指用75%乙醇提取。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的訶子用于制備抗真菌藥物及抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于，所述的抗真菌藥物及抗真菌藥物增效劑所涉及的真菌為敏感菌株或耐藥菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的訶子用于制備抗真菌藥物及抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于，所述的耐藥菌株是對(duì)氟康唑耐受，敏感菌株是對(duì)氟康唑敏感。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的訶子用于制備抗真菌藥物及抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于，所述的抗真菌藥物包括多烯類藥物、唑類藥物、5-氟胞嘧啶或卡泊芬凈。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種訶子用于制備抗真菌藥物及抗真菌藥物增效劑的新用途。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，訶子對(duì)真菌感染有較好的治療效果，并能使抗真菌藥物氟康唑恢復(fù)對(duì)耐藥真菌的作用，因此訶子可用作抗真菌治療及抗真菌藥物的增效劑。本發(fā)明為訶子開(kāi)辟了新的用途，將其用于抗真菌藥物及抗真菌藥物的增效劑，不僅為真菌治療提供了新的候選藥物，而且提高了現(xiàn)有藥物的抗真菌作用，在臨床真菌耐藥性日趨普遍、耐藥程度日趨嚴(yán)重的情況下，使抗真菌藥物恢復(fù)對(duì)耐藥真菌的作用，降低了抗真菌藥物的用藥劑量，從而為患者節(jié)省了醫(yī)療費(fèi)用，減少藥物的毒副作用。
文檔編號(hào)A61K36/185GK102552348SQ20121002480
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月6日
發(fā)明者劉偉, 姜遠(yuǎn)英, 安毛毛, 張軍東, 慎慧, 陳思敏 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)