具有增強的作用持續(xù)時間的工程化多肽對相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2010年9月28日提交的美國臨時專利申請61/387,391和2010年12月10日提交的美國臨時專利申請61/422,085的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容各通過提述完整并入本文并用于所有目的。發(fā)明背景本申請涉及具有優(yōu)良的作用持續(xù)時間、高效力和/或包括口服施用在內(nèi)的方便的劑量施用方案的化合物及其使用方法。本文中提供了工程化多肽，其中摻入有與生物學活性肽組合的清蛋白結(jié)合域。不希望受任何理論束縛的，認為由于本文中描述的工程化多肽可以結(jié)合清蛋白，因此所述化合物在循環(huán)時可以被扣留(例如結(jié)合至清蛋白)，從而由于例如降低的腎清除率和/或降解導致增加的作用持續(xù)時間。適合于這類治療的疾病包括肥胖癥(obesity)和超重(overweight)、糖尿病(diabetes)、血脂障礙(dyslipidemia)、高脂血(hyperlipidemia)、短腸綜合征(shortbowelsyndrome)、阿耳茨海默(Alzheimer)氏病、脂肪肝病(fattyliverdisease)、帕金森(Parkinson)氏病、心血管疾病(cardiovasculardisease)、以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其它病癥、或其組合。仍然需要開發(fā)可用于上文所描述的代謝疾病、狀況和病癥的多肽。因此，本發(fā)明的一個目的在于提供可用于治療上述狀況的具有延長的半衰期的工程化多肽及其生成和使用方法。本文中引用的每篇專利、專利申請和出版物通過提述據(jù)此完整并入本文并用于所有目的。發(fā)明概述提供了對清蛋白具有結(jié)合親和力和另外的治療效用的工程化多肽。所述化合物是工程化多肽，其包含如本文中限定的能夠結(jié)合清蛋白的清蛋白結(jié)合域(ABD)多肽和與ABD共價連接的激素域(HD)多肽，該HD多肽可以是生物學活性的且能引發(fā)有益的生物學應(yīng)答。任選地，本文中描述的任何ABD或HD多肽可以在工程化多肽中經(jīng)由接頭L(例如如本文中描述的L1)共價鍵合。不希望受任何理論束縛的，認為由于本文中描述的工程化多肽能結(jié)合清蛋白，因此所述化合物在受試者中可以被扣留，從而導致在受試者中增加的作用持續(xù)時間。在第一個方面，提供了如本文中描述的工程化多肽。所述工程化多肽包含如本文中描述的清蛋白結(jié)合域多肽(ABD)和激素域(HD1)。所述激素域包含多肽，該多肽為毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽片段、或毒蜥外泌肽類似物。在另一個方面，提供了用于在需要治療的受試者中治療疾病或病癥的方法。所述方法包括對受試者施用如本文中描述的工程化多肽。在又一個方面，提供了包含與藥學可接受賦形劑組合的本文中描述的工程化多肽化合物的藥物組合物。在又一個方面，是編碼工程化多肽及其中間體的多核苷酸、擁有這類多核苷酸的表達載體、表達這類多核苷酸的宿主細胞、以及用于其表達、合成、翻譯后修飾和分離的手段。本發(fā)明的一個優(yōu)點在于能完全通過重組方法合成所述工程化多肽，從而避免了復雜的或額外的合成或化學步驟和相關(guān)的反應(yīng)性試劑和催化劑。因此，本發(fā)明的多肽的合成能比化學衍生化的、具有延長的作用持續(xù)時間的化合物要便宜得多。除了較長的作用持續(xù)時間(例如，在人受試者中至少一周，盡管若期望的話也可以實現(xiàn)每日一次)外，另一個優(yōu)點是相對小的大小，其可以允許口服遞送以改進病人依從性。本文中披露的化合物在OGTTDOA(針對作用持續(xù)時間的口服葡萄糖耐受性測試)測試中顯示出令人驚訝的功效，其在小鼠中為至少24小時和甚至更長達到2天(這轉(zhuǎn)換到人中為7天或更長)，在糖尿病肥胖(ob/ob)小鼠中有力的血液葡萄糖控制和體重降低，并且提供小鼠中至少2天內(nèi)的劑量依賴性食物攝取減少。在正常大鼠中，皮下和靜脈內(nèi)劑量施用后化合物的暴露持續(xù)數(shù)天(甚至長達4天，這轉(zhuǎn)換到人中為至少1周)?；衔镌谘獫{中且對于血漿蛋白酶是穩(wěn)定的，在結(jié)合至血清清蛋白時是有活性的，且令人驚訝地，如本文中顯示的提供比毒蜥外泌肽-4更高的最大體內(nèi)功效。甚至更令人驚訝地，所述化合物適用于口服遞送。附圖說明圖1A：在OGTTDOA測試中施用化合物15劑量后1天，于強飼前的血液葡萄糖水平(BGL)數(shù)據(jù)直方圖。媒介物均值強飼前葡萄糖：117mg/dL。圖例(從左至右)：媒介物(空心)、2nmol/kg(對角線從左上至右下)；25nmol/kg(對角線從左下至右上)；250nmol/kg(細對角線)。圖1B：30分鐘時血液葡萄糖中的變化。媒介物均值強飼前葡萄糖：117mg/dL。圖例：同圖1A中。*對媒介物對照的p<0.5；ANOVA，鄧奈特氏檢驗(Dunnett’stest)。圖2A：在OGTTDOA測試中施用化合物15劑量后2天，于強飼前的血液葡萄糖水平(BGL)數(shù)據(jù)直方圖。媒介物均值強飼前葡萄糖：135mg/dL。圖例(從左至右)：媒介物(空心)、25nmol/kg(垂直線)；250nmol/kg(對角線)。圖2B：30分鐘時血液葡萄糖中的變化。媒介物均值強飼前葡萄糖：135mg/dL。圖例：同圖2A中。*對媒介物對照的p<0.5；ANOVA，鄧奈特氏檢驗。圖3A：在OGTTDOA測試中施用化合物15和化合物8劑量后1天，于強飼前的血液葡萄糖水平(BGL)數(shù)據(jù)直方圖。媒介物均值強飼前葡萄糖：117mg/dL。圖例(從左至右)：媒介物(空心)；2nmol/kg化合物15(對角線從左上至右下)；25nmol/kg化合物15(對角線從左下至右上)；250nmol/kg化合物15(細對角線);2nmol/kg化合物8(瓦片形);25nmol/kg化合物8(水平線);250nmol/kg化合物8(點形)。圖3B：30分鐘時血液葡萄糖中的變化。媒介物均值強飼前葡萄糖：117mg/dL。圖例：同圖1A中。*對媒介物對照的p<0.5；ANOVA，鄧奈特氏檢驗。圖4：化合物15在HSD喂養(yǎng)的麻醉大鼠中的效果。圖4A：靜脈內(nèi)葡萄糖耐受性測試(IVGTT)后的葡萄糖時間過程。圖例：媒介物(三角形尖頭朝上)；化合物15240nmol/kg(盒狀)。圖4B：描述IVGTT后葡萄糖(AUC,0-60分鐘)的直方圖。圖例：媒介物(左)；化合物15(右)。圖4C：IVGTT后胰島素的時間過程。圖例：如圖4A中。圖4D：描繪胰島素中變化的直方圖(AUC,0-30分鐘)。圖例：如圖4B中。圖4E：sc注射化合物15后體重中變化的時間過程。圖例：如圖4A中。圖4F：sc注射化合物15后每日食物攝取的直方圖。圖例：對每一天，直方圖按從左至右的順序繪出了媒介物和化合物15(240nmol/kg)。*對媒介物對照的p<0.05；鄧奈特氏檢驗。圖5：化合物15在ob/ob小鼠中的效果。圖5A：以250nmol/kg注射化合物15后體重中變化的時間過程(0-10日)。圖例：媒介物(正方形)；化合物15(三角形)。圖5B：如對于圖5A描述的，劑量施用后血液葡萄糖中變化的時間過程。圖例：如圖5A中。圖5C：如對于圖5A描述的，劑量施用后HbA1c中變化的時間過程。圖例：如圖5A中。*對媒介物對照的p<0.5；ANOVA，鄧奈特氏檢驗。圖6：化合物15在ZuckerDiabeticFatty大鼠中的效果。圖6A：在用化合物15處理ZuckerDiabeticFatty大鼠后體重中變化的時間過程。圖6B：在用化合物15處理后血漿葡萄糖(mg/dL)的時間過程。圖例：媒介物(實心盒狀)；化合物15(0.17mg/kg)(三角形尖頭朝上)；化合物15(0.5mg/kg)(三角形尖頭朝下)。圖7：OGTTDOA中的比較。將30分鐘時血液葡萄糖中的變化(%強飼前)作為化合物15,8和10相比于毒蜥外泌肽-4的效果進行評估。圖例：化合物按直方圖的從左至右的次序為：媒介物；化合物152nmol/kg；化合物1525nmol/kg；化合物15250nmol/kg；化合物82nmol/kg；化合物825nmol/kg；化合物8250nmol/kg；化合物1025nmol/kg；化合物10250nmol/kg；毒蜥外泌肽-4250nmol/kg。*對媒介物對照的p<0.5；ANOVA,鄧奈特氏檢驗。圖8：呈現(xiàn)了在5小時時間過程內(nèi)人血漿中剩余的化合物百分比的時間譜。圖例：肽(SEQIDNO:4)(封閉盒狀)；化合物7(空心盒狀)；化合物31(叉形)；化合物15(空心菱形)；GLP-1(7-36)酰胺(封閉菱形)。圖9：施用化合物31劑量后1天，于強飼前的血液葡萄糖水平(BGL)數(shù)據(jù)直方圖。媒介物均值強飼前葡萄糖：126mg/dL。圖例：媒介物(空心)，化合物31(25nmol/kg；封閉)。圖例：同圖1A。*對媒介物對照的p<0.5；ANOVA，鄧奈特氏檢驗。圖10：圖10A顯示了化合物31在正常小鼠中6小時內(nèi)在抑制食物攝取上的效果的時間過程。圖例：媒介物(盒)；化合物311nmol/kg(菱形)；化合物3110nmol/kg(叉形)；化合物3130nmol/kg(圓形)；化合物31100nmol/kg(星形)。圖10B繪出了化合物31在正常小鼠中54小時內(nèi)在抑制食物攝取上的效果的時間過程。圖例(對每一時段從左至右)：媒介物(空心)；[14Leu]毒蜥外泌肽-41nmol/kg(垂直線)；[14Leu]毒蜥外泌肽-410nmol/kg(對角線，左上至右下)；[14Leu]毒蜥外泌肽-430nmol/kg(對角線，左下至右上)；[14Leu]毒蜥外泌肽-4100nmol/kg(細對角線)；化合物311nmol/kg(垂直線)；化合物3110nmol/kg(淺色點)；化合物3130nmol/kg(深色點)；化合物31100nmol/kg(方格形)。圖11：圖11A(化合物15)和圖11B(化合物21)繪出了與利拉魯肽(liraglutide)相比，在血液葡萄糖中變化的時間過程，所有都是每周施用兩次的(BIW)。圖例(圖11A-11B)：媒介物(盒狀)；利拉魯肽250nmol/kgBIW(封閉三角形)；測試化合物25nmol/kgBIW(空心三角形)；測試化合物250nmol/kgBIW(菱形)。圖11C繪出了直方圖，其顯示對于每周兩次施用(BIW)的化合物15和化合物21，與通過連續(xù)皮下輸注(CSI)施用的毒蜥外泌肽-4相比，HbA1c的降低(從基線的%變化)。圖例(從左至右)：媒介物(空心)；化合物1525nmol/kgBIW(細方格形)；化合物15250nmol/kgBIW(點形)；化合物2125nmol/kgBIW(對角交叉)；化合物21250nmol/kgBIW(垂直-水平交叉)；毒蜥外泌肽-47.2nmol/kg/日CSI(深色瓦片形)；毒蜥外泌肽-4100nmol/kg/日CSI(淺色瓦片形)。圖11D繪出了對于每周兩次施用(BIW)的化合物15和化合物21，與通過連續(xù)皮下輸注(CSI)施用的毒蜥外泌肽-4相比，體重中的降低(從基線的%變化)。圖例(從左至右)：如圖11C中。圖12：圖12A-12C繪出了在正常HarlanSprague-Dawley(HSD)大鼠中皮下給藥的例示性工程化多肽化合物15和化合物21的藥動學(PK)概況和生物學活性。圖12A繪出了化合物降低食物攝取的效果。圖12B繪出了化合物降低體重的效果。圖12C繪出了單劑后化合物的PK概況。圖例：媒介物(盒狀)；化合物21(三角形)；化合物15(菱形)。圖13：圖13A-13C繪出了在正常HarlanSprague-Dawley(HSD)大鼠中靜脈內(nèi)給藥的例示性工程化多肽化合物31相比于未綴合的毒蜥外泌肽類似物的藥動學(PK)概況和生物學活性。圖13A繪出了化合物降低食物攝取的效果。圖13B繪出了化合物降低體重的效果。圖13C繪出了單劑后化合物的PK概況。插入：2nmol/kgIV的[14Leu]毒蜥外泌肽-4和2nmol/kgIV的化合物31的時間對PK結(jié)果(pg/mL)的列表。圖例：媒介物(菱形)；[14Leu]毒蜥外泌肽-42nmol/kgIV(盒狀)；化合物312nmol/kgIV(圓形)。圖14：該圖繪出了口服遞送后例示性工程化多肽(化合物15)相比于未綴合的毒蜥外泌肽類似物降低血液葡萄糖的生物學活性時間過程。見實施例18。均值處理前葡萄糖：～623mg/dL。圖例：媒介物(封閉盒)；毒蜥外泌肽-4類似物(空心盒)；化合物15(菱形)。發(fā)明詳述I.定義“肥胖癥”和“超重”指具有比正常預期更大的重量的哺乳動物，并且可以通過例如身體外觀、如本領(lǐng)域中已知的體重指數(shù)(BMI)、腰臀圍比、皮褶厚度、腰圍等來確定。疾病控制和預防中心(CDC)將超重定義為成人具有25至29.9的BMI；并將肥胖定義為成人具有30或更高的BMI。存在用于測定肥胖癥的其它量度。例如，CDC宣稱具有大于1.0的腰臀比的人是超重的。“瘦體重”指無脂肪的體重，即總體重減去身體脂肪重量為瘦體重?？梢酝ㄟ^如本領(lǐng)域中已知的方法如流體靜力學稱量(hydrostaticweighing)、計算機化室(computerizedchamber)、雙能x-射線吸收測量學、皮膚卡尺(skincaliper)、磁共振成象(MRI)和生物電阻抗分析(BIA)來測量瘦體重?！安溉閯游铩敝敢话憔哂熊浢蛎l(fā)，活產(chǎn)其后代，并且用乳喂養(yǎng)其后代的溫血動物。哺乳動物包括人；同伴動物(例如犬、貓)；家畜動物(例如牛、馬、綿羊、豬、山羊)；野生動物等等。在一個實施方案中，所述哺乳動物是雌性。在一個實施方案中，所述哺乳動物是女性。在一個實施方案中，所述哺乳動物是貓或犬。在一個實施方案中，所述哺乳動物是患糖尿病的哺乳動物，例如具有2型糖尿病的人。在一個實施方案中，所述哺乳動物是肥胖的患糖尿病的哺乳動物，例如具有2型糖尿病的肥胖哺乳動物。術(shù)語“受試者”在本文中描述的方法的背景中指哺乳動物。在多肽背景中的“片段”在本文中在習慣的化學意義上指多肽的一部分。例如，片段可以源自親本多肽的一個或多個殘基的N端缺失或C端缺失，和/或片段可以源自親本多肽的一個或多個殘基的內(nèi)部缺失?！捌巍痹诳贵w的背景中指抗體中可以與生物學活性分子連接以調(diào)控溶解度、受試者內(nèi)的分布等的部分。例如，毒蜥外泌肽-4(1-30)描述了毒蜥外泌肽-4的生物學活性片段，其中缺失毒蜥外泌肽C末端“尾部”氨基酸31-39。術(shù)語“親本”在多肽背景中在習慣的意義上指充當修飾，例如插入、缺失和/或取代前的參照結(jié)構(gòu)的多肽。術(shù)語“綴合”在本文中描述的工程化多肽的背景中指組分多肽例如ABD、HD1等之間的共價連接。術(shù)語“融合”在本文中描述的工程化多肽的背景中指組分多肽例如ABD、HD1等之間經(jīng)由肽主鏈末端氨基或羧基官能團中任一或兩者的共價連接?？梢院铣苫蛑亟M制備工程化多肽。通常使用重組生物技術(shù)來進行融合，然而也可以通過化學合成和綴合方法來進行。如用于本文的，“類似物”在多肽的背景中指相對于親本化合物具有氨基酸的插入、缺失和/或取代的化合物。如用于本文的，“類似物序列”在多肽的背景中指相對于親本氨基酸序列(例如野生型序列、天然序列)具有氨基酸的插入、缺失和/或取代的氨基酸序列。類似物可以具有優(yōu)越的穩(wěn)定性、溶解度、效力、半衰期等等。在一些實施方案中，類似物是相對于親本化合物具有至少50%，例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的序列同一性的化合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，類似物具有自插入、缺失、添加和取代中的任意一種或其組合獨立選出的1至5處氨基酸修飾。在本文中的任一個實施方案中，毒蜥外泌肽類似物可以具有自插入、缺失、添加和取代中的任意一種或其組合獨立選出的1至5處氨基酸修飾，并且優(yōu)選地保留相對于親本化合物的至少50%，例如50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%或甚至更高的序列同一性，且甚至更優(yōu)選地相對于親本化合物至少80%,85%,90%,95%,98%或甚至更高的序列同一性，并且優(yōu)選地，所述親本化合物為毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4(1-38)、毒蜥外泌肽-4(1-37)、毒蜥外泌肽-4(1-36)、毒蜥外泌肽-4(1-35)、毒蜥外泌肽-4(1-34)、毒蜥外泌肽-4(1-33)、毒蜥外泌肽-4(1-32)、毒蜥外泌肽-4(1-31)、毒蜥外泌肽-4(1-30)、毒蜥外泌肽-4(1-29)或毒蜥外泌肽-4(1-28)，且最優(yōu)選地，所述親本化合物具有毒蜥外泌肽-4的序列。在一個實施方案中，至少對應(yīng)于毒蜥外泌肽-4的位置1,4,6,7和9的氨基酸是如在天然毒蜥外泌肽-4中的，且進一步地在毒蜥外泌肽-4的位置1,4,6,7和9以外的位置處的1至5個修飾是保守的氨基酸取代。例如，在本文中實施方案的又一個實施方案中，毒蜥外泌肽類似物至少將氨基酸保留為如在毒蜥外泌肽-4的位置3,4,6,5,7,8,9,10,11,13,15,18,19,22,23,25,26和/或30中發(fā)現(xiàn)的，且進一步優(yōu)選地，使得不超過剩余位置中的1至5個被另一種氨基酸取代，最優(yōu)選地被化學保守的氨基酸取代。在本文的所有類似物中，在位置1和/或2處的任意取代或修飾會保留對DPP-IV切割的抗性，而同時保留或改進促胰島素活性，如本領(lǐng)域已知的毒蜥外泌肽-4類似物如脫氨基-組氨酰-毒蜥外泌肽-4的。如本領(lǐng)域中慣用的，術(shù)語“保守的”在氨基酸取代的背景中指保留電荷類型(例如陰離子、陽離子、中性、極性，等等)、疏水性或親水性、體積(bulk)(例如范德華(vanderWaals)接觸等等)和/或功能性(例如羥基、胺、巰氫基等等)特性的取代。術(shù)語“非保守的”指非保守的氨基酸取代?！巴恍浴?、“序列同一性”等在比較兩種或更多種核酸或多肽序列的背景中，指根據(jù)使用本領(lǐng)域中已知的序列比較算法例如BLAST或BLAST2.0測量，相同的或具有規(guī)定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即在比較窗或指定區(qū)里為了最大對應(yīng)性而比較和比對時，在規(guī)定區(qū)域里約50%同一性，優(yōu)選地50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性)的兩種或更多種序列或亞序列。此定義包括具有缺失和/或添加的序列、以及那些具有取代的序列、以及天然存在的(例如多態(tài)性或等位)變體、和人工制備的變體。在優(yōu)選的算法中，如本領(lǐng)域中已知的，解決缺口等。對于序列比較，通常一種序列作用為與測試序列比較的參照序列。當使用序列比較算法時，使測試和參照序列進入計算機中，在必要時指定子序列坐標，并指定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選地，可以使用缺省程序參數(shù)或可以指定備選參數(shù)。然后，序列比較算法基于程序參數(shù)計算測試序列相對于參照序列的百分比序列同一性。可以進行比較序列的最佳比對，例如通過Smith&Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法，通過Needleman&Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443的同源性比對算法，通過Pearson&Lipman,1988,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444的搜索相似性方法，通過這些算法的計算機化實現(xiàn)(WisconsinGenetics軟件包中的GAP,BESTFIT,FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wis.)，或通過手動比對和視覺檢查來進行。參見例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等編1995增刊))。適合于測定百分比序列同一性和序列相似性的算法的優(yōu)選例子包括BLAST和BLAST2.0算法，其記載于Altschul等,1977,Nuci.AcidsRes.25:3389-3402和Altschul等,1990,J.Mol.Biol.215:403-410。如本領(lǐng)域中已知的，使用BLAST和BLAST2.0來測定本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)的百分比序列同一性。用于實施BLAST分析的軟件經(jīng)由國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的網(wǎng)站公開可獲得。此算法牽涉首先通過鑒定詢問序列中長度W的短詞來鑒定高得分序列對(HSP)，所述短詞在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的詞比對時匹配或滿足某一正值的閾值得分T。T稱為相鄰詞得分閾值(Altschul等,同前)。這些初始的相鄰詞命中(hits)作用為啟動搜索以尋找含有它們的較長HSP的種子。將詞命中沿著每條序列以兩個方向延伸，只要可以增加累積比對得分。例如對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(一對匹配殘基的獎勵得分；總是>0)和N(錯配殘基的懲罰得分；總是<0)來計算累積得分。對于氨基酸序列，使用評分矩陣來計算累積得分。在如下情況時停止每個方向的詞命中延伸：累積比對得分從其最大實現(xiàn)值下降數(shù)量X；由于一個或多個負評分殘基比對的積累，累積得分變?yōu)?以下；或達到任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用字長(W)為11，期望值(E)為10，M=5，N=-4和兩條鏈的比較作為缺省。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用字長為3，期望值(E)為10，和BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff&Henikoff,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)比對(B)為50，期望值(E)為10，M=5，N=-4和兩條鏈的比較作為缺省。術(shù)語“約”在數(shù)字值背景中指數(shù)字值的+/-10%。術(shù)語“肽”和“多肽”在本文中所描述的工程化多肽的組分的背景中是同義的。II.化合物在第一個方面，提供了工程化多肽化合物，其序列包含清蛋白結(jié)合域(ABD)多肽序列和至少一種多肽激素域(HD1)序列。術(shù)語“清蛋白結(jié)合域”、“ABD”等指如本文中描述的能夠結(jié)合清蛋白的多肽。術(shù)語“激素域”、“激素域多肽”等指能夠在受試者中引發(fā)生物學應(yīng)答的GP-1受體激動劑多肽。例示性激素域包括但不限于，毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽片段或毒蜥外泌肽類似物。令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽類似物或活性片段可以融合至自鏈球菌菌株G148的細菌蛋白G的清蛋白結(jié)合域衍生的具有非常高親和力的清蛋白結(jié)合域(ABD)，而保留充足的毒蜥外泌肽-4生物學活性且具有延長的作用持續(xù)時間，例如在嚙齒動物中至少為3天且甚至為5天，這轉(zhuǎn)換到人受試者中為至少一周或更長的持續(xù)時間?！白饔贸掷m(xù)時間”在習慣意義中指在治療方案中允許更不頻繁的劑量施用。由此，延長的作用持續(xù)時間會允許不那么頻繁和/或更方便的劑量施用時間表。這是令人驚訝的，部分因為還未徹底證明這類ABD肽是作為治療蛋白載體的有力平臺，它們是相對疏水性的，其可以與附接的治療肽不利地相互作用，且不能作為至少一種肽激素家族的載體。具體地，大鼠胰淀素(amylin)在綴合或融合至本文中描述的ABD時，未在嚙齒類模型中展現(xiàn)出任何顯著的或長效的體內(nèi)活性，而在同樣的嚙齒類模型中發(fā)現(xiàn)各種毒蜥外泌肽-ABD構(gòu)建體是有活性的且具有較長的作用持續(xù)時間。生物學活性組分。涵蓋用在本文中描述的化合物和方法中的生物學活性化合物組分包括瘦蛋白。術(shù)語“生物學活性化合物”等在習慣意義中指可以引發(fā)生物學應(yīng)答的化合物，例如多肽等。毒蜥外泌肽。毒蜥外泌肽是在吉拉毒蜥(Gilamonster)和墨西哥有須蜥蜴(MexicanBeardedLizard)(亞利桑那州和墨西哥北部內(nèi)生的爬行類)的唾液分泌中發(fā)現(xiàn)的肽。毒蜥外泌肽-3存在于珠毒蜥(Helodermahorridum)(墨西哥有須蜥蜴)的唾液分泌中，且毒蜥外泌肽-4存在于鈍尾毒蜥(Helodermasuspectum)(吉拉毒蜥)的唾液分泌中。參見Eng等,1990,J.Biol.Chem.,265:20259-62;Eng等,1992,J.Biol.Chem.,267:7402-7405。毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4的序列分別如下：HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(SEQIDNO:1);HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(SEQIDNO:2)。Hargrove等(RegulatoryPeptides,2007,141:113-119)報告了毒蜥外泌肽-4肽類似物，其為全長C末端酰胺化的毒蜥外泌肽-4肽類似物，相比于天然的毒蜥外泌肽-4在位置14處具有單個核苷酸差異。[14Leu]毒蜥外泌肽-4的序列如下：HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(SEQIDNO:3)。另一種毒蜥外泌肽-4肽類似物是毒蜥外泌肽-4的頭32個氨基酸(在位置14和28處具有氨基酸取代)和接著來自非哺乳動物(蛙)GLP1的C末端的5個氨基酸序列的嵌合體：[Leu14,Gln28]毒蜥外泌肽-4(1-32)-fGLP-1(33-37)。該化合物具有以下序列：HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIIS(SEQIDNO:4)。本領(lǐng)域中還已知毒蜥外泌肽-4的C末端截短的、生物學活性形式，如毒蜥外泌肽-4(1-28)、毒蜥外泌肽-4(1-29)、毒蜥外泌肽-4(1-30)、毒蜥外泌肽-4(1-31)、毒蜥外泌肽-4(1-32)及其酰胺化形式。所有這些毒蜥外泌肽類似物都適合作為本發(fā)明的工程化多肽的組分。如本領(lǐng)域中慣用的，肽化合物名稱中的方括號(即“[]”)指方括號中的殘基或化學特征的取代。例如，[14Leu]毒蜥外泌肽-4、[14Leu]Ex-4等指在位置14處具有亮氨酸的毒蜥外泌肽-4。氨基酸的數(shù)字位置可以由本領(lǐng)域中常規(guī)采用的多種方式中前附或后附數(shù)字指示。例如，術(shù)語14Leu,Leu14,14Leu,Leu14等在指位置14處的亮氨酸時是同義的。理解的是，在一些實施方案中，C末端酰胺或其它C末端加帽模塊可以存在于本文中描述的化合物中。盡管毒蜥外泌肽與胰高血糖素樣肽家族的數(shù)個成員具有一些序列相似性，最高對GLP-1(7-36)NH2(Goke等,1993,J.Biol.Chem.,268:19650-55)[GLP-1(7-37)NH2的序列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQIDNO:5)](有時也稱為"GLP-1"，其具有刺激胰島素從胰β細胞分泌的促胰島素效果)的同源性為53%，但是毒蜥外泌肽不是GLP-1同源物。藥理學研究已經(jīng)報告了毒蜥外泌肽-4可以體外作用于某些胰島素分泌細胞上的GLP-1受體，然而，還已經(jīng)報告了毒蜥外泌肽-4可以作用于不受GLP-1作用的受體。還有，毒蜥外泌肽-4與GLP-1在體內(nèi)共有一些，但并非所有的生物學特性，且其比GLP-1具有顯著更長的作用持續(xù)時間?；谒鼈兊拇僖葝u素活性，已經(jīng)提出了毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4用于治療糖尿病并預防高血糖癥的用途(Eng，美國專利No.5,424,286，通過提述完整并入本文并用于所有目的)，并且實際上，在美國和歐洲已經(jīng)批準了將毒蜥外泌肽-4用作治療2型糖尿病的治療物。實際上，認為毒蜥外泌肽并非像Chen和Drucker(他們從吉拉毒蜥克隆了毒蜥外泌肽基因)報告(J.Biol.Chem.272:4108-15(1997))的是哺乳動物GLP-1的物種同源物。如下觀察結(jié)果，即吉拉毒蜥還具有分開的胰高血糖素原(自其加工GLP-1)基因，其比毒蜥外泌肽更類似于哺乳動物胰高血糖素原，指示了毒蜥外泌肽不是GLP-1的唯一物種同源物。使用毒蜥外泌肽激動劑來調(diào)節(jié)胃腸能動性的方法記載于美國專利No.6,858,576(即基于1997年8月8日提交的美國申請流水號08/908,867，其為1996年8月8日提交的美國申請流水號08/694,954的部分附加)。使用毒蜥外泌肽激動劑來降低食物攝取的方法記載于美國專利No.6,956,026(即基于1998年1月7日提交的美國申請流水號09/003,869，其要求1997年1月7日提交的美國申請No.60/034,905、1997年8月7日提交的60/055,404、1997年11月14日提交的60/065,442和1997年11月14日提交的60/066,029的權(quán)益)?？捎迷诒疚拿枋龅墓こ袒嚯闹械男碌亩掘嵬饷陔募觿┗衔镄蛄杏涊d于WO99/07404(即1998年8月6日提交的PCT/US98/16387)、WO99/25727(即1998年11月13日提交的PCT/US98/24210)、WO99/25728(即1998年11月13日提交的PCT/US98/24273)、WO99/40788、WO00/41546、和WO00/41548，它們連同其授權(quán)的對應(yīng)美國專利都通過提述并入本文中并用于所有目的。如本領(lǐng)域中已知的用于測定體外和體內(nèi)毒蜥外泌肽活性的方法，包括促胰島素的、食物攝取抑制活性和重量降低活性，記載于本文和上文引用以及本文中記載的其它引用中。某些例示性毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽激動劑、和毒蜥外泌肽類似物激動劑包括：毒蜥外泌肽片段毒蜥外泌肽-4(1-30)(HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnMetGluGluGluAlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGly)；毒蜥外泌肽-4(1-28)，毒蜥外泌肽-4(1-29)，毒蜥外泌肽-4(1-30)，毒蜥外泌肽-4(1-31)和毒蜥外泌肽-4(1-32)。類似物包括在14Met位置(即14Met)處用非氧化的氨基酸如亮氨酸的取代。例子包括[14Leu]毒蜥外泌肽-4，[14Leu]毒蜥外泌肽-4(1-30)，[14Leu]毒蜥外泌肽-4(1-28)和[14Leu,25Phe]毒蜥外泌肽-4。用于本文中描述的工程化多肽的毒蜥外泌肽類似物激動劑包括那些記載于美國專利No.7,223,725(通過提述并入本文中并用于所有目的)的，如具有下式的化合物：Xaa1Xaa2Xaa3GlyXaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17AlaXaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28-Z1；其中Xaa1為His,Arg或Tyr；Xaa2為Ser,Gly,Ala或Thr；Xaa3為Ala,Asp或Glu；Xaa5為Ala或Thr；Xaa6為Ala,Phe,Tyr；Xaa7為Thr或Ser；Xaa8為Ala,Ser或Thr；Xaa9為Asp或Glu；Xaa10為Ala,Leu,Ile,Val,或Met；Xaa11為Ala或Ser；Xaa12為Ala或Lys；Xaa13為Ala或Gln；Xaa14為Ala,Leu,Ile,,Val或Met；Xaa15為Ala或Glu；Xaa16為Ala或Glu；Xaa17為Ala或Glu；Xaa19為Ala或Val；Xaa20為Ala或Arg；Xaa21為Ala或Leu；Xaa22為Ala,Phe,Tyr；Xaa23為Ile,Val,Leu,或Met；Xaa24為Ala,Glu或Asp；Xaa25為Ala,Trp,Phe,Tyr；Xaa26為Ala或Leu；Xaa27為Ala或Lys；Xaa28為Ala或Asn；Z1為-OH,-NH2,Gly-Z2,GlyGly-Z2,GlyGlyXaa31-Z2,GlyGlyXaa31Ser-Z2,GlyGlyXaa31SerSer-Z2,GlyGlyXaa31SerSerGly-Z2,GlyGlyXaa31SerSerGlyAla-Z2,GlyGlyXaa31SerSerGlyAlaXaa36-Z2,GlyGlyXaa31SerSerGlyAlaXaa36Xaa37-Z2或GlyGlyXaa31SerSerGlyAlaXaa36Xaa37Xaa38-Z2；Xaa31,Xaa36,Xaa37和Xaa38獨立地是Pro或不存在；且Z2為-OH或-NH2。在上文所描述的任一種毒蜥外泌肽類似物中，還具體地涵蓋了那些其中進行了將對應(yīng)于Xaa1的組氨酸用以下任意一種替換的：D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、N-α-乙酰-組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、4-咪唑乙酰、脫-氨基-組氨酰(咪唑丙酰)、β-羥基-咪唑丙酰、N-二甲基-組氨酰或β-羧基-咪唑丙酰。本文中還具體地涵蓋了本文中描述的這樣的毒蜥外泌肽類似物，其中進行了將Xaa2處的甘氨酸用以下任一種替換：D-Ala、Val、Leu、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(l-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸、或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸。依照一個實施方案，例示性化合物包括那些具有上式的，其中：Xaa1為His或Arg；Xaa2為Gly或Ala；Xaa3為Asp或Glu；Xaa5為Ala或Thr；Xaa6為Ala或Phe；Xaa7為Thr或Ser；Xaa8為Ala,Ser或Thr；Xaa9為Asp或Glu；Xaa10為Ala,或Leu；Xaa11為Ala或Ser；Xaa12為Ala或Lys；Xaa13為Ala或Gln；Xaa14為Ala或Leu；Xaa15為Ala或Glu；Xaa16為Ala或Glu；Xaa17為Ala或Glu；Xaa19為Ala或Val；Xaa20為Ala或Arg；Xaa21為Ala或Leu；Xaa22為Phe；Xaa23為Ile,Val；Xaa24為Ala,Glu或Asp；Xaa25為Ala,Trp或Phe；Xaa26為Ala或Leu；Xaa27為Ala或Lys；Xaa28為Ala或Asn；Z1為-OH,-NH2,Gly-Z2,GlyGly-Z2,GlyGlyXaa31-Z2,GlyGlyXaa31Ser-Z2,GlyGlyXaa31SerSer-Z2,GlyGlyXaa31SerSerGly-Z2,GlyGlyXaa31SerSerGlyAla-Z2,GlyGlyXaa31SerSerGlyAlaXaa36-Z2,GlyGlyXaa31SerSerGlyAlaXaa36Xaa37-Z2,GlyGlyXaa31SerSerGlyAlaXaa36Xaa37Xaa38-Z2；Xaa31,Xaa36,Xaa37和Xaa38獨立地為Pro或不存在，且Z2為-OH或-NH2；只要Xaa3,Xaa5,Xaa6,Xaa8,Xaa10,Xaa11,Xaa12,Xaa13,Xaa14,Xaa15,Xaa16,Xaa17,Xaa19,Xaa20,Xaa21,Xaa24,Xaa25,Xaa26,Xaa27和Xaa28中不超過3個為Ala。在上文所描述的任一種毒蜥外泌肽類似物中，還具體地涵蓋了那些其中進行了將對應(yīng)于位置Xaa1的組氨酸用以下任一種替換的：D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、N-α-乙酰-組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、4-咪唑乙酰、脫-氨基-組氨酰(咪唑丙酰)、β-羥基-咪唑丙酰、N-二甲基-組氨?；颚?羧基-咪唑丙酰。本文中還具體地涵蓋了本文中描述的這樣的毒蜥外泌肽類似物，其中進行了將Xaa2處的甘氨酸用以下任一種替換：D-Ala、Val、Leu、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(l-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸、或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸。其它例示性化合物包括那些在WO99/25727中列出的、其中被鑒定為化合物2-23的。依照另一個實施方案，提供了這樣的化合物，其中Xaa14為Leu、Ile或Val，更優(yōu)選為Leu，和/或Xaa25為Trp、Phe或Tyr，更優(yōu)選為Trp或Phe。這些化合物會不那么容易受到體外和體內(nèi)以及化合物合成期間的氧化降解。適合用在本發(fā)明的融合多肽中的毒蜥外泌肽類似物的其它例子包括那些記載于2003年3月4日公開的美國專利6528486(通過提述并入本文中并用于所有目的)中的。具體地，毒蜥外泌肽類似物包括那些如下的毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽類似物，其由對毒蜥外泌肽-4具有至少90%同源性、任選地在位置34-39處具有1和5個之間的缺失、和有4-20個氨基酸單元的肽序列的C末端延伸共價結(jié)合至所述毒蜥外泌肽組成，其中所述肽延伸序列中的每個氨基酸單元選自下組：Ala,Leu,Ser,Thr,Tyr,Asn,Gln,Asp,Glu,Lys,Arg,His和Met。更優(yōu)選地，所述延伸為有4-20個氨基酸殘基的肽序列。更優(yōu)選地，所述延伸為有4-20個氨基酸殘基的肽序列，例如在4-15個的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在4-10個的范圍內(nèi)，特別是在4-7個氨基酸殘基的范圍內(nèi)，例如4,5,6,7,8或10個氨基酸殘基，其中優(yōu)選為6個氨基酸殘基。最優(yōu)選地，依照美國專利6528486，所述延伸肽含有至少1個Lys殘基，且甚至更優(yōu)選地，3至7個賴氨酸，且甚至最優(yōu)選地，6個賴氨酸。例如，一種類似物為HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK(SEQIDNO:118)(也稱為([脫-36Pro]毒蜥外泌肽-4(1-39)-Lys6)。其它例示性類似物包括Lys6-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)6(H-Lys6-desPro36毒蜥外泌肽-4(1-39)-Lys6)(SEQIDNO:184)；His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser(H-[des36Pro,37,38Pro]毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2)(SEQIDNO:185)；Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser(H-(Lys)6-[des36Pro,37,38Pro]毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQIDNO:186)；Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser(H-Asn-(Glu)5-[des36Pro,37,38Pro]毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQIDNO:187)；His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)6([des36Pro,37,38Pro]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6)(SEQIDNO:188)；(Lys)6-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)6(H-(Lys)6-[脫36Pro,37,38Pro]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6)(SEQIDNO:189)；和Asp-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)6(Asn-(Glu)5-[des36Pro,37,38Pro]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6)(SEQIDNO:190)。如本領(lǐng)域中習慣的，氨基酸重復可以由列出重復數(shù)目的下標數(shù)字指示；即Lys6、(Lys)6等指六個賴氨?；?SEQIDNO:191)。在上文所描述的任一種毒蜥外泌肽類似物中，具體地涵蓋了那些其中進行了將對應(yīng)于位置1的組氨酸用以下任一種替換的：D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、N-α-乙酰-組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、4-咪唑乙酰、脫-氨基-組氨酰(或咪唑丙酰)、β-羥基-咪唑丙酰、N-二甲基-組氨酰或β-羧基-咪唑丙酰。本文中還具體涵蓋了本文中描述的這樣的毒蜥外泌肽類似物，其中進行了將位置2處的甘氨酸用以下任一種替換：D-Ala、Val、Leu、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(l-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸、或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸。適合用在工程化多肽構(gòu)建體的毒蜥外泌肽類似物的其它例子是那些記載于公開的PCT申請WO2004035623(通過提述并入本文中并用于所有目的)中的，特別是那些由天然存在的氨基酸構(gòu)成的，其描述了尤其在位置13Gln,14Met,25Trp或28Asn處相對于毒蜥外泌肽-4(1-39)的對應(yīng)位置，具有至少1個經(jīng)修飾的氨基酸殘基的毒蜥外泌肽類似物。依照該公開內(nèi)容有另外的這類類似物，其另外包含1-7個氨基酸的C末端延伸，該延伸包含至少1個Lys氨基酸和更優(yōu)選地，至少5個Lys氨基酸單元，如6個或7個Lys氨基酸單元。適合用在工程化多肽構(gòu)建體的毒蜥外泌肽類似物的其它例子是那些記載于公開的PCT申請WO/2010/120476，名為“N-TerminusConformationallyConstrainedGLP-1ReceptorAgonistCompounds”(通過提述并入本文中并用于所有目的)的，其描述了在毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽類似物的N末端部分具有經(jīng)修飾的氨基酸殘基以在該區(qū)創(chuàng)建高β轉(zhuǎn)角屬性的毒蜥外泌肽類似物。例如，類似物設(shè)計為通過創(chuàng)建構(gòu)象受限區(qū)來模擬氨基酸殘基His1Gly2Glu3，包括在His1Gly2Glu3處含有噻唑烷-脯氨酸肽模擬物的毒蜥外泌肽類似物(參見例如其中圖17A-F中描述的化合物)，該噻唑烷-脯氨酸肽模擬物可以用作毒蜥外泌肽-4、利西拉來(lixisenatide)、或本文中描述的其它類似物中的修飾。在本文中描述的任一種毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽類似物和式中，具體涵蓋了那些其中進行了將對應(yīng)于位置1的組氨酸用以下任一種替換的：L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、N-α-乙酰-組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、4-咪唑乙酰、脫-氨基-組氨酰(咪唑丙酰)、β-羥基-咪唑丙酰、N-二甲基-組氨酰或β-羧基-咪唑丙酰。例如，優(yōu)選用于如本文中描述的工程化多肽綴合物的、其中His1位置經(jīng)修飾的毒蜥外泌肽類似物是(4-咪唑乙酰)毒蜥外泌肽-4、(脫-氨基-組氨酰)毒蜥外泌肽-4(或(咪唑丙酰)毒蜥外泌肽-4)、(β-羥基-咪唑丙酰)毒蜥外泌肽-4、(N-二甲基-組胺酰)毒蜥外泌肽-4和(β-羧基-咪唑丙酰)毒蜥外泌肽-4。本文中還具體涵蓋了本文中描述的這樣的毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽類似物，其中進行了將位置2處的甘氨酸用以下任一種替換：D-Ala、Val、Leu、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(l-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸、或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸。上文的任一種毒蜥外泌肽類似物或其活性片段(有或無至ABD的接頭)都適用于本發(fā)明的工程化多肽。清蛋白結(jié)合域(ABD)肽。用在本發(fā)明的清蛋白結(jié)合域(ABD)肽是那些對清蛋白具有可比地高親和力的且衍生于鏈球菌菌株G148的細菌蛋白G的清蛋白結(jié)合域。如此，涵蓋用于本文中描述的工程化多肽的ABD肽包括那些具有如由Jonsson等描述的清蛋白結(jié)合基序的(ProteinEng.Design&Selection,2008,21:515-527)以及其中描述的ABD肽，和還記載于PCT公開申請No.WO2009/016043的那些基序和ABD肽，以及其類似物，特別是那些具有至少85%氨基酸同一性的。在一個實施方案中，所述ABD肽可以包括包含以下氨基酸序列的清蛋白結(jié)合基序(“ABM”)：GVSDX5YKX8X9IX11X12AX14TVEGVX20ALX23X24X25I(SEQIDNO:119)其中，彼此獨立地，X5選自Y和F；X8選自N,R和S；X9選自V,I,L,M,F和Y；X11選自N,S,E和D；X12選自R,K和N；X14選自K和R；X20選自D,N,Q,E,H,S,R和K；X23選自K,I和T；X24選自A,S,T,G,H,L和D；并X25選自H,E和D。優(yōu)選地，ABD肽以至多1x10-6M，且甚至更優(yōu)選地，以至多1x10-9M(更緊密的親和力)的相互作用KD值結(jié)合清蛋白。術(shù)語“KD”指如本領(lǐng)域中慣用的解離常數(shù)。更優(yōu)選地，相互作用KD值為至多1x10-10M，甚至更優(yōu)選地，為至多1x10-11M，然而甚至更優(yōu)選地，為至多1x10-12M，且甚至進一步地為至多1x10-13M。舉例而言，1x10-14M的Kd值的是至多為1x10-13M的相互作用KD值?？梢匀鏟CT公開申請No.WO2009/016043中描述的測定KD值(優(yōu)選對人血清清蛋白)。在一個實施方案中涵蓋了上述類，前提是氨基酸序列并非GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI(SEQIDNO:120)。如本文中和所引用的參考內(nèi)容中顯示的，可以不管氨基酸變化而保留ABD肽的清蛋白結(jié)合能力，只要這類變化保留了ABD肽的足夠的三級結(jié)構(gòu)。這類變化包括例如取代，其中將屬于氨基酸殘基某一功能組(例如疏水、親水、極性的等)的氨基酸殘基交換為來自同一功能組的另一種氨基酸殘基。因此，在ABD肽的一個這類實施方案中，基序X5是Y。在ABD的一個實施方案中，X8選自N和R，且具體地可以是R。在一個實施方案中，X9是L。在一個實施方案中，X11選自N和S，且具體地可以是N。在一個實施方案中，X12選自R和K，如X12為R或X12為K。在一個實施方案中，X14是K。在一個實施方案中，X20選自D,N,Q,E,H,S和R，且具體地可以是E。在一個實施方案中，X23選自K和I，且具體地可以是K。在一個實施方案中，X24選自A,S,T,G,H和L。在一個更特定的實施方案中，X24是L。在一個甚至更特定的實施方案中，“X23X24”是KL。在另一個甚至更特定的實施方案中，“X23X24”是TL。在一個實施方案中，X24選自A,S,T,G和H。在一個更特定的實施方案中，X24選自A,S,T,G和H且X23是I。在一個實施方案中，X25是H。在上文通式內(nèi)的各清蛋白結(jié)合基序的序列包括那些在PCT公開申請No.WO2009/016043(通過提述并入本文并用于所有目的)中披露為SEQIDNO:1-257的。在清蛋白結(jié)合多肽的某些實施方案中，清蛋白結(jié)合基序由選自SEQIDNO:1-257的氨基酸序列組成。在本發(fā)明該方面的一個更特定的實施方案中，所述基序序列選自PCT公開申請No.WO2009/016043的SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:9,SEQIDNO:15,SEQIDNO:25,SEQIDNO:27,SEQIDNO:46,SEQIDNO:49,SEQIDNO:53,SEQIDNO:54,SEQIDNO:55,SEQIDNO:155,SEQIDNO:239,SEQIDNO:240,SEQIDNO:241,SEQIDNO:242,SEQIDNO:243,SEQIDNO:244和SEQIDNO:245。還在本發(fā)明該方面的更特定的實施方案中，所述基序序列選自PCT公開申請No.WO2009/016043的SEQIDNO:3,SEQIDNO:53和SEQIDNO:239。在本文和下文中還描述了含有這些清蛋白結(jié)合基序且由此適合綴合或融合至如本文中描述的激素域的清蛋白結(jié)合多肽，并例示在表1和實施例中。不受理論束縛的，但認為清蛋白結(jié)合基序可以形成三螺旋束蛋白域的部分。舉例而言，基序可以與互連環(huán)基本構(gòu)成或形成三螺旋束蛋白域內(nèi)的兩個α螺旋的部分。因此，在本發(fā)明的具體實施方案中，這類三螺旋束蛋白域選自來自鏈球菌菌株G148的細菌受體蛋白G的三螺旋域的組。在該實施方案的不同變體中，基序形成其一部分的三螺旋束蛋白域選自下組：來自鏈球菌菌株G148的域GA1、域GA2和域GA3，特別是域GA3。在其中基序“形成三螺旋束蛋白域的部分”的本發(fā)明的實施方案中，其被理解為將清蛋白結(jié)合基序的序列“插入”到或“移植”到或“融合”至天然存在的(或原始的)三螺旋束域中，從而該基序替換原始域中類似的結(jié)構(gòu)性基序。舉例而言且不希望受理論束縛的，認為該基序構(gòu)成了三螺旋束的3個螺旋中的2個，并且可以替換任何三螺旋束中的這類2螺旋基序。實施本文中披露的2個基序螺旋對三螺旋束域的2個螺旋的替換，使得不影響多肽的基本結(jié)構(gòu)。也就是說，依照本發(fā)明的該實施方案的多肽主鏈的總體折疊與三螺旋束蛋白域的(其形成一部分)會是實質(zhì)相同的，例如具有相同次序的相同二級結(jié)構(gòu)元件等。由此，如果依照該實施方案的多肽具有與原始域相同的折疊，那么對本文中的工程化多肽有用的基序可以形成三螺旋束域的部分，表明共有基本的結(jié)構(gòu)特性，這些特性例如導致類似的CD光譜。因此，在一個實施方案中，清蛋白結(jié)合域多肽是三螺旋束蛋白域，其包含如上文限定的清蛋白結(jié)合基序和構(gòu)成三螺旋構(gòu)象的剩余部分的其它序列。毒蜥外泌肽或其類似物或活性片段可以融合至這類清蛋白結(jié)合域多肽以創(chuàng)建如本文中描述的工程化多肽。適合綴合或融合至毒蜥外泌肽化合物的清蛋白結(jié)合域多肽可以包含氨基酸序列：LAEAKXaXbAXcXdELXeKY(SEQIDNO:182)，該氨基酸序列共價連接至清蛋白結(jié)合基序(ABM)，該清蛋白結(jié)合基序(ABM)進一步共價連接至氨基酸序列LAALP(SEQIDNO:183)，其中ABM是如本文中限定的清蛋白結(jié)合基序，Xa選自V和E；Xb選自L,E和D；Xc選自N,L和I；Xd選自R和K；且Xe選自D和K。在一些實施方案中，適合綴合或融合至毒蜥外泌肽化合物的清蛋白結(jié)合域多肽是氨基酸序列：LAEAKXaXbAXcXdELXeKY(SEQIDNO:182)，該氨基酸序列共價連接至清蛋白結(jié)合基序(ABM)，該清蛋白結(jié)合基序(ABM)進一步共價連接至氨基酸序列LAALP(SEQIDNO:183)，如上文所描述的。在一些實施方案中，所述清蛋白結(jié)合域多肽包含氨基酸序列LAEAKXaXbAXcXdELXeKYGVSDX5YKX8X9IX11X12AX14TVEGVX20ALX23X24X25ILAALP(SEQIDNO:121)，其中Xa選自V和E；Xb選自L,E和D；Xc選自N,L和I；Xd選自R和K；Xe選自D和K；X5選自Y和F；X8選自N,R和S；X9選自V,I,L,M,F和Y；X11選自N,S,E和D；X12選自R,K和N；X14選自K和R；X20選自D,N,Q,E,H,S,R和K；X23選自K,I和T；X24選自A,S,T,G,H,L和D；且X25選自H,E和D。另外對于ABD序列在本文中的每個實施方案，任選地，C末端脯氨酸(對應(yīng)于上文位置46)可以不存在。任選地，甚至還對于ABD序列的每個實施方案，位置45處的亮氨酸可以存在或不存在?！癆BD序列”是單價或二價的(如合適的)、形成本文中披露的工程化多肽的部分的ABD化合物的序列?！半募に赜?HD1)序列”是單價或二價的(如合適的)、形成本文中披露的工程化多肽的部分的肽激素域(HD1)化合物的序列?！岸掘嵬饷陔男蛄小笔菃蝺r或二價的(如合適的)、形成本文中披露的工程化多肽的部分的毒蜥外泌肽化合物的序列?！岸掘嵬饷陔念愃莆镄蛄小笔菃蝺r或二價的(如合適的)、形成本文中披露的工程化多肽的部分的毒蜥外泌肽類似物化合物的序列?！岸掘嵬饷陔幕钚云涡蛄小笔菃蝺r或二價的(如合適的)、形成本文中披露的工程化多肽的部分的毒蜥外泌肽活性片段化合物的序列?！岸掘嵬饷陔念愃莆锘钚云涡蛄小笔菃蝺r或二價的(如合適的)、形成本文中披露的工程化多肽的部分的毒蜥外泌肽類似物活性片段的序列。“清蛋白結(jié)合基序(ABM)序列”是單價或二價的(如合適的)、形成本文中披露的工程化多肽的部分的ABM的序列。除非另外規(guī)定的，理解當工程化多肽“包含”化合物(例如ABD或HD1)時，該工程化多肽的序列包含該化合物的序列(例如ABD序列或HD1序列)。由于存在清蛋白結(jié)合基序，ABD肽以至多1x10-6M和甚至更優(yōu)選地至多1x10-9M(更緊密的親和力)的相互作用KD值結(jié)合清蛋白。更優(yōu)選地，相互作用KD值為至多1x10-10M，甚至更優(yōu)選地為至多1x10-11M，甚至還更優(yōu)選地為至多1x10-12M，且甚至進一步地為至多1x10-13M。最優(yōu)選地，所述值是針對人血清清蛋白(“HSA”)的親和力。在該清蛋白結(jié)合多肽的一個實施方案中，Xa為V。在該多肽的一個實施方案中，Xb為L。在該多肽的一個實施方案中，Xc為N。在該多肽的一個實施方案中，Xd為R。在該多肽的一個實施方案中，Xe為D。在某些實施方案中，Xa為E。在某些實施方案中，Xb為D。在某些實施方案中，Xc為I。在某些實施方案中，Xd為K。在某些實施方案中，Xa獨立地為E，和/或獨立地Xb為D，和/或獨立地Xc為I，和/或獨立地Xd為K。在某些實施方案中，清蛋白結(jié)合域多肽為LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALP(SEQIDNO:122)。在某些實施方案中，清蛋白結(jié)合域多肽為LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP(SEQIDNO:123)。在某些實施方案中，清蛋白結(jié)合域多肽為LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP(SEQIDNO:124)。適合與如本文中描述的活性激素域肽融合的各清蛋白結(jié)合域多肽的序列記載于Jonsson等(同上)且作為SEQIDNO:258-514記載于PCT公開申請No.WO2009/016043，通過提述并入本文。在下表1中披露了選出的序列。本發(fā)明還涵蓋了與選自SEQIDNO:258-514的序列具有85%或更高同一性的氨基酸序列的清蛋白結(jié)合多肽。在具體的實施方案中，所述清蛋白結(jié)合多肽的序列選自PCT公開申請No.WO2009/016043中的SEQIDNO:259,SEQIDNO:260,SEQIDNO:266,SEQIDNO:272,SEQIDNO:282,SEQIDNO:284,SEQIDNO:303,SEQIDNO:306,SEQIDNO:310,SEQIDNO:311,SEQIDNO:312,SEQIDNO:412,SEQIDNO:496,SEQIDNO:497,SEQIDNO:498,SEQIDNO:499,SEQIDNO:500,SEQIDNO:501和SEQIDNO:502，以及與其具有85%或更高同一性的序列。在本發(fā)明該方面的更特定的實施方案中，所述清蛋白結(jié)合多肽的序列選自PCT公開申請No.WO2009/016043中的SEQIDNO:260,SEQIDNO:310和SEQIDNO:496及與其具有85%或更高同一性的序列。在另外的實施方案中，所述清蛋白結(jié)合多肽的序列選自PCT公開申請No.WO2009/016043中的SEQIDNO:260,SEQIDNO:270,SEQIDNO:272,SEQIDNO:291,SEQIDNO:294,SEQIDNO:298,SEQIDNO:299,SEQIDNO:300,SEQIDNO:400,SEQIDNO:484,SEQIDNO:485,SEQIDNO:486,SEQIDNO:487,SEQIDNO:488,SEQIDNO:489和SEQIDNO:490，以及與其具有85%或更高同一性的序列。例示性ABD種類包括但不限于，具有下表1和實施例中列出的序列的化合物。亦參見PCT公開申請No.WO2009/016043，其通過提述完整并入本文中并用于所有目的?？捎糜诒疚闹忻枋龅幕衔?、方法和藥物組合物的ABD肽序列可以是本文中披露或本領(lǐng)域中已知的ABD肽序列的片段或類似物，只要其含有清蛋白結(jié)合基序序列并以本文中描述的親和力結(jié)合清蛋白。表1.選出的ABD肽如本文中使用的，術(shù)語“清蛋白結(jié)合”和“對清蛋白的結(jié)合親和力”指多肽的一種特性，其可以例如通過使用表面等離子體共振技術(shù)來進行測試，如在本領(lǐng)域已知的Biacore儀器中。例如，如在下面實施例中描述的，可以在實驗中測試清蛋白結(jié)合親和力，其中將清蛋白或其片段固定化到儀器的傳感器芯片上，并使含有待測試多肽的樣品通過該芯片?；蛘撸瑢⒋郎y試的多肽固定化到儀器的傳感器芯片上，并使含有清蛋白或其片段的樣品通過該芯片。在這方面，清蛋白可以是來自哺乳動物的血清清蛋白，如人血清清蛋白。技術(shù)人員然后會理解通過這類實驗所獲得的結(jié)果建立該多肽對清蛋白的結(jié)合親和力的至少一種定性量度。如果期望定量量度，例如以測定相互作用的KD值，那么還可以使用表面等離子體共振方法。結(jié)合值可以例如在Biacore2000儀器(GEHealthcare)中限定。將清蛋白適當?shù)毓潭ɑ跍y量的傳感器芯片上，并通過系列稀釋來制備要測定其親和力的多肽的樣品并進行注射。然后，可以從結(jié)果計算出KD值，其使用例如由儀器制造商(GEHealthcare)提供的BIAevaluation4.1軟件的1:1Langmuir結(jié)合模型。在一個實施方案中，依照該方面的清蛋白結(jié)合多肽結(jié)合清蛋白，使得相互作用的koff值至多為5x10-5s-1，如至多5x10-6s-1。在本文描述的工程化多肽中使用的ABD的另一個優(yōu)選的實施方案中，工程化多肽的清蛋白結(jié)合多肽部分的氨基酸序列包含選自本文中所描述序列中的任一種的ABD，包括那些來自表1或本文列表中的，且還包括它們的脫-Pro46形式。在一個實施方案中，依照該方面的清蛋白結(jié)合多肽還包含位于本文中限定和例示的ABD序列的N-和/或C末端處的一個或多個另外的氨基酸殘基。這些另外的氨基酸殘基在進一步增強多肽對清蛋白的結(jié)合，及改進所折疊的清蛋白結(jié)合域的構(gòu)象穩(wěn)定性中可能起著作用，但同樣可能很好地用于其它目的，例如涉及多肽的生成、純化、體內(nèi)或體外穩(wěn)定、偶聯(lián)、標記或檢測中的一種或多種、以及其任意組合。這類另外的氨基酸可以包含加入以用于化學偶聯(lián)(例如對HD1)目的的一個或多個氨基酸殘基。由此，例如，位于ABD氨基酸序列的N或C末端處緊接α螺旋之前或之后的氨基酸在一個實施方案中可以影響構(gòu)象穩(wěn)定性。一種促進改善的構(gòu)象穩(wěn)定性的氨基酸殘基的例子是位于如上限定的ABD氨基酸序列的N末端處的絲氨酸殘基。此N末端絲氨酸殘基在一些情況下可以形成規(guī)范的S-X-X-E加帽盒，其通過牽涉絲氨酸側(cè)鏈γ氧和谷氨酸殘基多肽主鏈NH之間的氫鍵鍵合。此N末端加帽可以促進構(gòu)成依照本披露第一個方面的清蛋白結(jié)合多肽的三螺旋域的第一α螺旋的穩(wěn)定。由此，在一個實施方案中，另外的氨基酸包含位于多肽N末端的至少一個絲氨酸殘基。換言之，ABD氨基酸序列前面有1個或多個絲氨酸殘基。在清蛋白結(jié)合多肽的另一個實施方案中，另外的氨基酸包含位于ABD序列N末端的甘氨酸殘基。理解ABD氨基酸序列前面可以有1個、2個、3個、4個或任意合適數(shù)目的氨基酸殘基。由此，ABD氨基酸序列前面可以有單個絲氨酸殘基、單個甘氨酸殘基或兩者的組合，如甘氨酸-絲氨酸(GS)組合或甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸(GSS)組合。一種具有N末端絲氨酸的這類ABD的例子是SLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQIDNO:176)。對應(yīng)的脫-脯氨酸形式會是SLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAAL(SEQIDNO:177)。在又一個實施方案中，另外的氨基酸殘基包含位于本文中限定的ABD多肽N末端處的丙氨酸，或在上文ABD序列的N末端處與絲氨酸組合為丙氨酸-絲氨酸序列。在又一個實施方案中，另外的氨基酸殘基包含位于本文中限定的ABD多肽N末端處的谷氨酸。類似地，可以利用C末端加帽來改進構(gòu)成清蛋白結(jié)合多肽的三螺旋域的第三α螺旋的穩(wěn)定性。存在于上文限定的ABD氨基酸序列的C末端處的C末端脯氨酸殘基可以至少部分起著作為加帽殘基的作用。C末端處脯氨酸殘基后的賴氨酸殘基可以進一步促進清蛋白結(jié)合多肽的第三螺旋的穩(wěn)定性，其通過賴氨酸殘基的ε氨基基團和位于多肽主鏈中賴氨酸前面2個和3個殘基的氨基酸羰基基團(例如上文限定的ABD氨基酸序列的亮氨酸和丙氨酸殘基的羰基基團)之間的氫鍵鍵合。由此，在一個實施方案中，另外的氨基酸包含位于多肽C末端處的賴氨酸殘基。如上文論述的，所述另外的氨基酸可能與清蛋白結(jié)合多肽的生成有關(guān)。具體地，當通過化學肽合成來生成依照第一個方面的清蛋白結(jié)合多肽時，C末端脯氨酸后的一個或多個任選的氨基酸殘基可能提供益處。這類另外的氨基酸殘基可以例如，防止在合成的二肽階段時形成不期望的物質(zhì)如哌嗪二酮(diketopiperazine)。這類氨基酸殘基的一個例子是甘氨酸。由此，在一個實施方案中，另外的氨基酸包含在多肽C末端處的甘氨酸殘基，其如上文所說明的緊接脯氨酸殘基后或緊接另外的賴氨酸和/或甘氨酸殘基后。或者，多肽生成可能受益于ABD氨基酸序列的C末端脯氨酸殘基的酰胺化。在此情況下，C末端脯氨酸包含在羧基碳處的另外的胺基。技術(shù)人員已知用于完成C末端修飾的方法，如通過用于肽合成的不同類型的預制基質(zhì)。在另一個實施方案中，另外的氨基酸殘基包含位于多肽N和/或C末端處的半胱氨酸殘基。這類半胱氨酸殘基可以緊接如本文中限定的ABD氨基酸序列之前和/或之后，或可以緊接如上文描述的任何其它另外的氨基酸殘基之前和/或之后。通過向多肽鏈添加半胱氨酸殘基，可以獲得用于清蛋白結(jié)合多肽的位點定向綴合的巰基?；蛘?，可以以與引入半胱氨酸殘基類似的方式將硒代半胱氨酸殘基引入多肽鏈的C末端，以促進位點特異性綴合(Cheng等,NatProt1:2,2006)。在一個實施方案中，清蛋白結(jié)合多肽包含不超過2個半胱氨酸殘基。在另一個實施方案中，清蛋白結(jié)合多肽包含不超過1個半胱氨酸殘基。在另一個實施方案中，清蛋白結(jié)合多肽的另外的氨基酸殘基包含用于純化或檢測該多肽的“標簽”，如六組氨酰(His6)標簽，或用于與對標簽特異性的和/或要用在純化中的抗體相互作用的“myc”(“c-Myc”)標簽或“FLAG”標簽。技術(shù)人員知道其它備選。例如，在優(yōu)選的工程化多肽實施方案中，ABD包含LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQIDNO:35)，且其N末端延伸的ABD序列形式包含SLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQIDNO:176)和GSLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQIDNO:178)。位置2中的絲氨酸將該序列加帽，使得相比于在該位置中具有甘氨酸或丙氨酸將Tm提高了約2°C。丙氨酸也可以緊接絲氨酸之前，如在ASLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQIDNO:179)中的。還優(yōu)選的是在每一條上文ABD序列中不存在C末端脯氨酸、甘氨酸或兩者的對應(yīng)的多肽。因此，還優(yōu)選其中ABD包含脫-脯氨酸形式的序列，該形式可以改進相比于親本形式LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAAL(SEQIDNO:35)的產(chǎn)量，且其N末端延伸的ABD序列形式包含SLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAAL(SEQIDNO:177)和GSLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAAL(SEQIDNO:180)和ASLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAAL(SEQIDNO:181)。在本文中披露的任一條ABD序列的一個方面，對毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽類似物的接頭是如本文中披露的包含甘氨酸的接頭，例如G,GGG,GGS,GGGS(SEQIDNO:192),TGGGGAS(SEQIDNO:193),TGGGGGAS(SEQIDNO:194)或TGGGGSAS(SEQIDNO:195)。在本文中披露的任一條ABD序列的一個方面，對毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽類似物的C末端的接頭是如本文中披露的包含甘氨酸的接頭，例如G,GGG,GGS,GGGS,TGGGGAS,TGGGGGAS和TGGGGSAS。在本文中描述的工程化多肽，特別是那些其C末端以脯氨酸或其它已知在肽合成期間外消旋的氨基酸結(jié)束的工程化多肽的一個實施方案中，可以向C末端加入甘氨酸以抵消C末端氨基酸殘基的外消旋化帶來的潛在問題?；蛘?，C末端氨基酸可以處于其(α-氨基)酰胺化形式，例如脯氨酸對脯氨酸酰胺，而不是以甘氨酸結(jié)束。然而，如果期望通過重組而不是化學合成來生成酰胺化的多肽，那么可以通過本領(lǐng)域中已知的數(shù)種方法來實施C末端氨基酸的酰胺化，例如使用酰胺化PAM酶。工程化多肽的另一個方面是ABD可以提供難溶或低可溶性毒蜥外泌肽變體的水性溶液中溶解度的增加。該特性可以由ABD自身賦予，或由于工程化多肽在體內(nèi)或體外結(jié)合至高度可溶的清蛋白而來的復合物，該結(jié)合增加了工程化多肽在水性溶液中的溶解度。由此，在另外這一方面的實施方案中，提供了組合物，其包含本身在水中具有不超過1mg/ml、或不超過2mg/ml、或不超過5mg/ml的溶解度的毒蜥外泌肽化合物，其共價偶聯(lián)至清蛋白結(jié)合域作為如本文中描述的融合蛋白或綴合物，其中所述化合物和清蛋白結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物是共價偶聯(lián)的，且工程化多肽的溶解度大于未融合(或未綴合的)的天然毒蜥外泌肽化合物。結(jié)合清蛋白。血清清蛋白是哺乳動物血清中最豐富的蛋白質(zhì)(40g/L；在人中約0.7)，其中它結(jié)合多種分子，包括但不限于脂質(zhì)和膽紅素(PetersT,1985,AdvancesinProteinChemistry37:161)。已經(jīng)觀察到血清清蛋白的半衰期與動物的大小直接成比例，其中例如人血清清蛋白(HSA)具有19天的半衰期且兔血清清蛋白具有約5天的半衰期(McCurdyTR等,J.Lab.Clin.Med.143:115,2004)。人血清清蛋白廣泛分布于體內(nèi)，尤其是在腸和血液區(qū)室中，其中它主要牽涉滲量的維持。結(jié)構(gòu)上地，清蛋白是包含3個同源域和總計584或585個氨基酸的單鏈蛋白質(zhì)(DugaiczykL等,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:71)。清蛋白含有17個二硫鍵和單個反應(yīng)性巰基C34，但缺乏N連接和O連接的碳水化合物模塊(Peters,1985,同上;NicholsonJP等,2000,BrJAnaesth85:599)。缺乏糖基化使得清蛋白的重組表達簡單化。清蛋白的該特性，加上其三維結(jié)構(gòu)為已知的這一事實(參見例如He,XM和Carter,DC,Nature358:2091992)，已經(jīng)使其成為用于重組融合蛋白的有吸引力的候選物。這類融合蛋白一般在單個多肽鏈中組合治療性蛋白(在施用該蛋白本身時其會被從體內(nèi)快速清除)和血漿蛋白(其展現(xiàn)出天然的緩慢清除)(SheffieldWP,Curr.DrugTargetsCardiovacs.Haematol.Disord.1:12001)。這類融合蛋白在需要不那么頻繁的注射和體內(nèi)治療性蛋白的更高水平中可以提供臨床優(yōu)點。然而，本文中的工程化多肽不與清蛋白綴合，而是含有允許對清蛋白的非共價結(jié)合的基序。清蛋白半衰期。已經(jīng)觀察到清蛋白在不同物種中的半衰期一般遵循基于動物重量的異速生長律(allometricscaling)。例如，小鼠、大鼠、兔和人中的半衰期已經(jīng)分別估算為1,1.9,5.6和19天。實際上，冪擬合分析(powerfittinganalysis)(Davies&Morris,1993,Pharm.Res.(N.Y.)10:1093-1095)提供了以下等式：清蛋白半衰期(天)=3.75*體重(kg)0.368。其它實施方案。理解的是，還涵蓋本文中披露的每種多肽包含位于N末端的甲硫氨酸，其符合其天然存在的第一個氨基酸的閱讀框，例如Met-毒蜥外泌肽-4，其為具有添加的N末端甲硫氨酸的毒蜥外泌肽-4。還理解的是在C末端Gly出現(xiàn)在本文中列出的工程化多肽序列中的情況下，該殘基可能在后續(xù)酰胺化期間丟失。一些實施方案是合成中的中間體，例如如那些具有用于如本領(lǐng)域中已知的親和純化的“His標簽”，且任選地可以隨后將其除去以得到適用于治療用途的成熟工程化多肽。在本文中描述的任一種工程化多肽的一些實施方案中，毒蜥外泌肽類似物相對于親本毒蜥外泌肽序列可以具有至少70%，例如70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%或甚至更高的序列同一性。在一些實施方案中，所述親本毒蜥外泌肽是毒蜥外泌肽-4，且毒蜥外泌肽類似物相對于毒蜥外泌肽-4可以具有至少70%，例如70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%或甚至更高的序列同一性。如本領(lǐng)域中已知的，GLP-1(胰高血糖素樣肽1)并非毒蜥外泌肽；且GLP-1的序列被明確從適合于本文中描述的工程化多肽的毒蜥外泌肽序列中排除。在一些實施方案中，提供具有如本文中描述的接頭(例如L1)的化合物，所述接頭將多肽激素域與ABD肽共價連接。在一些實施方案中，第一接頭(L1)在工程化多肽內(nèi)共價連接HD1。在一些實施方案中，L1是鍵。在一些實施方案中，多肽激素域(例如如本文中描述的HD1)可以經(jīng)由肽接頭共價連接至ABD肽。任何接頭都是任選的；即任何接頭都可以簡單地為鍵。當存在時，接頭的化學結(jié)構(gòu)并不重要，因為它主要起著間隔功能。在一個實施方案中，接頭包含由肽鍵連接的1至30個氨基酸。所述氨基酸可以選自20種天然存在的(即生理學上的)氨基酸?；蛘撸梢酝ㄟ^化學合成、翻譯后化學修飾或通過由宿主細胞中的重組表達通過體內(nèi)摻入來摻入非天然的氨基酸。這些氨基酸中的一些可以是糖基化的。在另一個實施方案中，所述1至30個氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、和賴氨酸，以及另外選自天冬氨酸和谷氨酸。在另一個實施方案中，接頭是由多數(shù)無空間位阻的氨基酸構(gòu)成的，所述氨基酸如甘氨酸、丙氨酸和/或絲氨酸?！盁o空間位阻的”在習慣意義中指具有小側(cè)鏈，例如0-2個非氫原子的氨基酸，從而使得相對于具有較大側(cè)鏈的氨基酸例如Leu,Trp,Tyr,Phe等的空間位阻最小化。聚甘氨酸例如(Gly)3,(Gly)4(SEQIDNO:125),(Gly)5(SEQIDNO:126)特別有用，聚丙氨酸、聚(Gly-Ala)、聚(Glyn-Ser)也特別有用。帶電荷的聚甘氨酸可以是有用的，且包含例如聚(Glyn-Glu)(SEQIDNO:127),聚(Glyn-Lys)(SEQIDNO:128),聚(Glyn-Asp)(SEQIDNO:129)和聚(Glyn-Arg)(SEQIDNO:130)基序(其中n可以是1至6)。接頭的其它特定例子是(Gly)3Lys(Gly)4(SEQIDNO:131);(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQIDNO:132);(Gly)3Cys(Gly)4(SEQIDNO:133)；和GlyProAsnGlyGly(SEQIDNO:134)。Gly和Ala的組合以及Gly和Ser的組合特別有用。由此，在另一個實施方案中，肽接頭選自下組：甘氨酸豐富的肽，例如Gly-Gly-Gly；序列[Gly-Ser]n(SEQIDNO:135),[Gly-Gly-Ser]n(SEQIDNO:136),[Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQIDNO:137)和[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQIDNO:138)，其中n為1,2,3,4,5或6，例如[Gly-Gly-Gly-GlySer]3?！案拾彼嶝S富的肽”指包含多個甘氨酸殘基的多肽，優(yōu)選地多數(shù)為甘氨酸殘基，更優(yōu)選地甘氨酸殘基占優(yōu)勢。在某些實施方案中，可以使用帶電荷的接頭。這類帶電荷接頭可以含有相當數(shù)目的酸性殘基(例如Asp,Glu等)，或可以含有相當數(shù)目的堿性殘基(例如Lys,Arg等)，從而使得接頭分別具有低于7或高于7的pI。如技術(shù)人員理解的，在所有其它因素相同的情況下，在給定的接頭中酸性或堿性殘基的相對量越大，接頭的pI會相應(yīng)地更高或更低。這類接頭會賦予本文中披露的工程化多肽以有利特性，如修飾肽pI(等電點)，其可以轉(zhuǎn)而增加這類多肽在特定pH處的溶解度和/或穩(wěn)定性特征，如在生理學pH(例如包含在pH7.2和pH7.6之間)，或在包含這類多肽的藥物組合物中。如本領(lǐng)域中已知的，可以通過在某種組合物中配制來提高肽的溶解度，所述組合物具有比肽的pI高或低至少1個或超過1個pH單位的pH。舉例而言，“酸性接頭”是具有小于7；包含6和7之間；包含5和6之間；包含4和5之間；包含3和4之間；包含2和3之間；或包含1和2之間的pI的接頭。類似地，“堿性接頭”是具有高于7；包含7和8之間；包含8和9之間；包含9和10之間；包含10和11之間；包含11和12之間，或包含12和13之間的pI的接頭。在某些實施方案中，酸性接頭會含有選自下組的序列：[Gly-Glu]n(SEQIDNO:139);[Gly-Gly-Glu]n(SEQIDNO:140);[Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQIDNO:141);[Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQIDNO:142),[Gly-Asp]n(SEQIDNO:143);[Gly-Gly-Asp]n(SEQIDNO:144);[Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQIDNO:145);[Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n(SEQIDNO:146)，其中n是1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更大；例如[Gly-Gly-Glu]6。在某些實施方案中，堿性接頭會含有選自下組的序列：[Gly-Lys]n(SEQIDNO:147);[Gly-Gly-Lys]n(SEQIDNO:148);[Gly-Gly-Gly-Lys]n(SEQIDNO:149);[Gly-Gly-Gly-Gly-Lys]n(SEQIDNO:150),[Gly-Arg]n(SEQIDNO:151);[Gly-Gly-Arg]n(SEQIDNO:152);[Gly-Gly-Gly-Arg]n(SEQIDNO:153);[Gly-Gly-Gly-Gly-Arg]n(SEQIDNO:154)，其中n是1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更大；例如[Gly-Gly-Lys]6。另外，可以制備具有某些結(jié)構(gòu)性基序或特征如α螺旋的接頭。例如，這類接頭可以含有選自下組的序列：[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]n(SEQIDNO:155)，其中n是1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更大；例如[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]3,[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]4,或[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]5。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地測定任何特定接頭序列的螺旋含量。除肽接頭以外的生物相容性接頭可以用于將毒蜥外泌肽的C末端共價附接至ABD或ABM序列的N末端。所述接頭可以是生物相容性聚合物，優(yōu)選地水可溶的，且更優(yōu)選地約50kD至約5000kD，或約50KD至500kD，或約100kD至500kD。例示性的生物相容的水可溶性聚合物接頭是PEG接頭，如-(CH2-CH2-O)n-，其中n使得PEG接頭可以具有100至5000kD，優(yōu)選為100至500kD的分子量。這類接頭可以是-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-O-CH2-CO-，其中n使得PEG接頭可以具有100kD至5000kD，優(yōu)選為10kD至500kD的分子量?？梢允褂闷渌锵嗳菪跃酆衔?，如包括但不限于多糖、聚丙二醇、以及丙烯和乙二醇的共聚物。通常這類接頭在各端可以包含反應(yīng)性基團，其可以是相同或不同的反應(yīng)性基團。這類具有反應(yīng)性基團的接頭是已知的且可獲的。優(yōu)選地，所述反應(yīng)性基團與肽的N末端氨基或C末端羧基是反應(yīng)性的。例如，反應(yīng)性基團可以是丁醛、丙醛、醛、琥珀酰亞胺或馬來酰亞胺模塊，如本領(lǐng)域中已知的。不那么優(yōu)選的是烷基接頭如-NH-(CH2)n-C(O)-，其中n=2-20，且其可以進一步被任何無空間位阻肽功能的基團取代，所述基團如低級烴基(例如C1-C6)、低級?；Ⅺu素、CN和NH2。還應(yīng)當理解的是適合依照本發(fā)明使用的接頭可以具有一種或多種上文和本文所描述的特征和基序。例如，接頭可以包括酸性接頭以及結(jié)構(gòu)性基序如α螺旋。類似地，接頭可以包含堿性接頭和結(jié)構(gòu)性基序如α螺旋。接頭可以包含酸性接頭、堿性接頭和結(jié)構(gòu)性基序如α螺旋。另外，還應(yīng)當理解的是依照本發(fā)明的工程化多肽可以具有超過1種接頭，且這類接頭中每一種都可以具有一種或多種上文所描述的特征。本文中描述的接頭是例示性的，且在本發(fā)明范圍內(nèi)的接頭可以長得多并可以包含其它殘基。在一個實施方案中，明確排除了其中毒蜥外泌肽序列沒有接頭而直接連接至ABD序列的工程化多肽。在一些實施方案中，所述工程化多肽在C末端處包含ABD序列，且在N末端包含HD1序列。在某些優(yōu)選的實施方案中，N末端為毒蜥外泌肽序列、毒蜥外泌肽片段序列或毒蜥外泌肽類似物序列。另外對于包含ABD和HD1的實施方案，所述工程化多肽可以具有結(jié)構(gòu)HD1-ABD。理解的是，在沒有明確指示本文中列出的工程化多肽的N末端和/或C末端的情況下，要從N末端向C末端方向讀取工程化多肽。例如，在HD1具有毒蜥外泌肽化合物或其類似物的序列的情況下，術(shù)語HD1-ABD,HD1-L1-ABD,HD1-ABD等意指，在沒有明確指示N末端和/或C末端的情況下，毒蜥外泌肽序列或其類似物位于工程化多肽的N末端，且ABD位于C末端。相反地，如果明確指示了N末端和/或C末端，那么要依照對末端的明確指示來讀取工程化多肽。例如，術(shù)語HD1C-term-ABD,HD1-L1-ABDN-term等意味著ABD位于工程化多肽的N末端，且HD1位于C末端。在一些實施方案中，本文中描述的工程化多肽對血清清蛋白的親和力不同于單獨的ABD多肽(即在缺乏融合的激素域的情況下)的親和力。為了獲得有效的結(jié)合，所述工程化多肽可以對血清清蛋白具有結(jié)合親和力，從而使解離常數(shù)KD為例如低于約10-6M,10-7M,10-8M,10-9M,10-10M,10-11M,10-12M,10-13M,10-14M或甚至10-15M。在一些實施方案中，該親和力并非是過分緊的，使得工程化多肽可以從清蛋白解離并引發(fā)生物學應(yīng)答，例如結(jié)合至受體如毒蜥外泌肽受體?？梢匀缬涊d于PCT公開申請No.WO2009/016043中的來測量親和力(優(yōu)選地對人血清清蛋白)，該申請通過提述完整并入本文并用于所有目的，包括但不限于測定法和合成方法。在一些實施方案中，本文中描述的工程化多肽優(yōu)于相應(yīng)的化合物，所述化合物具有綴合至激素域的可以延長血漿半衰期的不同模塊(例如PEG或Fc的或清蛋白)。在此背景中，術(shù)語“優(yōu)于”指可以在評估疾病或病癥的治療中權(quán)衡的多種功能特性。例如，本文中描述的工程化多肽可以比具有綴合至激素域的不同模塊的相應(yīng)化合物需要更少的生物學活性(激素域)組分，例如比它少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或甚至更少。對于另外的例子，本文中描述的工程化多肽可以具有更高的效力，例如1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或甚至更高的效力。本文中涵蓋的工程化多肽包括如下表2中列出的化合物。一種優(yōu)選的化合物是化合物31。表2.選出的例示性工程化多肽本文中涵蓋的另外的多肽化合物包括如在下表3A中列出的化合物：表3A.選出的例示性工程化多肽具體涵蓋了其中不存在N末端甲硫氨酸的上文序列的化合物。N末端甲硫氨酸主要為了便于細菌表達而存在。然而，本發(fā)明的工程化肽可以在真核宿主細胞(例如酵母(例如畢赤酵母(Pichia))、哺乳動物、桿狀病毒)或具有翻譯后N末端蛋白水解加工的其它宿主細胞中表達而得到N末端氨基酸，如在期望的激素或ABD序列(即沒有添加的甲硫氨酸或其它前導序列)的天然存在的成熟肽對應(yīng)物中發(fā)現(xiàn)的?；蛘?，用于表達和/或分泌(和甚至純化)的N末端序列可以是一種例如如通過使用蛋白酶如TEV可以翻譯后除去的N末端序列。本文中涵蓋的另外的工程化多肽化合物(具有多種HD1,L1和ABD組分)包含具有本文列表中的任一種工程化多肽(包括在下表3B中披露的那些)的結(jié)構(gòu)的化合物。表3B.選出的例示性工程化多肽III.設(shè)計和生成方法構(gòu)建體的設(shè)計?？梢栽诎被崴缴显O(shè)計本文中描述的工程化多肽。然后，可以使用本領(lǐng)域中已知的多種軟件產(chǎn)品回譯(backtranslate)這些序列，從而例如針對基于期望的表達宿主的蛋白質(zhì)表達、密碼子優(yōu)化、限制性位點內(nèi)容優(yōu)化核苷酸序列。例如，可以針對基于大腸桿菌的蛋白質(zhì)表達和限制性位點內(nèi)容優(yōu)化核苷酸序列。基于感興趣的核苷酸序列，可以為多步PCR提供重疊的寡核苷酸，如本領(lǐng)域中已知的。可以在本領(lǐng)域中公知的條件下在多重PCR反應(yīng)中使用這些寡核苷酸以建立編碼感興趣蛋白質(zhì)的cDNA。一個例子是1XAmplitaq緩沖液、1.3mMMgCl2、200uMdNTP、4UAmplitaqGold、0.2uM每種引物(AmpliTaqGold,ABI)，循環(huán)參數(shù)為：(94C:30秒、58C:1分鐘、72C:1分鐘)，35個循環(huán)。如本領(lǐng)域中已知的，可以將限制性位點添加至PCR產(chǎn)物的末端以在載體連接中使用。特定的位點可以包括Nde1和Xho1，使得cDNA然后可以在pET45b表達載體(Novagen)中的合適的閱讀框中。通過使用這些位點，可以除去此載體中的任何N端His標簽，因為那樣的話翻譯起始位點會在該標簽的下游。一旦完成表達構(gòu)建物，如本領(lǐng)域中已知的，可以使用例如T7啟動子引物、T7終止子引物和標準ABIBigDyeTermv3.1方案通過測序進行驗證。可以從例如ABI3730DNA分析儀獲得序列信息，并且可以使用VectorNTIv.10軟件(Invitrogen)對其分析?？梢砸阅K方式設(shè)計表達構(gòu)建體，從而可以容易地切出并改變接頭序列，如本領(lǐng)域中已知的?？梢詫⒈绢I(lǐng)域中已知的或本文中描述的蛋白酶識別位點摻入構(gòu)建體中，該構(gòu)建體可用于本文中描述的重組工程化多肽的設(shè)計、構(gòu)建、操作和生成。例示性構(gòu)建體.可用于生成本文中涵蓋的工程化多肽的構(gòu)建體包括編碼下表4中列出的多肽的構(gòu)建體。表4.用于生成工程化多肽的選出的例示性構(gòu)建體通用生成方法?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的生物學、化學和/或重組DNA技術(shù)來制備本文中描述的工程化多肽化合物。例示性方法記載于本文以及美國專利No.6,872,700;WO2007/139941;WO2007/140284;WO2008/082274;WO2009/011544;和美國公開文本No.2007/0238669中，其披露內(nèi)容通過提述完整并入本文并用于所有目的。本文中列出了其它用于制備所述化合物的方法。可以使用標準的固相肽合成技術(shù)，如自動化或半自動化的肽合成儀來制備本文中描述的工程化多肽。簡單且通用地，可以分開制備ABD和治療性激素肽然后將其綴合在一起，或者可以制備為單獨的多肽。由此，清蛋白結(jié)合多肽、治療激素或工程化多肽或者可以通過非生物學肽合成來生成，其使用氨基酸和/或反應(yīng)性側(cè)鏈受保護的氨基酸衍生物，所述非生物學肽合成包括逐步偶聯(lián)所述氨基酸和/或氨基酸衍生物以形成反應(yīng)性側(cè)鏈受保護的依照第一個方面的多肽，從多肽的反應(yīng)性側(cè)鏈除去保護性基團，并在水性溶液中折疊該多肽。如此，使用正常的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸)和經(jīng)預保護的氨基酸衍生物在溶液中或在有機溶劑中的固體支持物上序貫建立多肽序列。當建立完整的多肽序列時，除去保護基，并允許多肽在水性溶液中折疊。依照本披露的各種多肽可逆地折疊，而ABD域可逆地折疊成三螺旋束域(無添加因子)，且因此自發(fā)折疊?？梢酝ㄟ^某方法生成工程化的綴合物，包括依照例如如本文中描述的任意方法(如通過非生物學肽合成)生成清蛋白結(jié)合多肽，并將生成的ABD多肽與本文中限定的治療性激素綴合，本文中的ABD完全可逆地折疊。這是通過圓二色譜分析評估的；一種譜取于20°C，且第二種譜在加熱至90°C接著回到20°C后取。在此規(guī)程中，測定如本領(lǐng)域中已知的Tm并發(fā)現(xiàn)其在變性多肽折疊后不變化。通常，使用這類技術(shù)，將用α-N-氨基甲?；Ｗo的氨基酸和對樹脂上的生長肽鏈附著的氨基酸于RT在惰性溶劑(例如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷等)中在存在偶聯(lián)劑(例如二環(huán)己基碳二亞胺、1-羥基苯并三唑等)的情況下在存在堿(例如二異丙基乙胺等)的情況下偶聯(lián)。使用試劑(例如三氟乙酸、哌啶等)從所得的肽-樹脂除去α-N-氨基甲酰基保護基，并且用下一期望的、要對肽鏈添加的、用N保護的氨基酸重復偶聯(lián)反應(yīng)。合適的N保護基是本領(lǐng)域中公知的，如叔丁基氧羰基(t-butyloxycarbonyl)(tBoc)、芴基甲氧基羰基(fluorenylmethoxycarbonyl)(Fmoc)等。可以從AppliedBiosystemsInc.(FosterCity,CA)購買溶劑、氨基酸衍生物和肽合成儀中使用的4-甲基二苯甲基胺樹脂。對于化學合成，可以對工程化多肽使用固相肽合成，因為一般地，固相合成是一種具有向商業(yè)規(guī)模的卓越可擴縮性的直接方法，且一般與相對長的工程化多肽相容?？梢允褂肗MP/HOBt(選項1)系統(tǒng)和具有加帽的tBoc或Fmoc化學(參見AppliedBiosystemsABI430A肽合成儀用戶手冊，版本1.3B1988年7月1日，第6部分，第49頁-第70頁，AppliedBiosystems,Inc.,FosterCity,CA)用自動肽合成儀(430A型,AppliedBiosystemsInc.,FosterCity,CA)來實施固相肽合成。可以用HF切割Boc-肽-樹脂(-5°C至0°C,1小時)。可以用交替的水和乙酸從樹脂提取肽，并將濾液凍干?？梢砸勒諛藴史椒?例如IntroductiontoCleavageTechniques,AppliedBiosystems,Inc.,1990,第6頁-第12頁)來切割Fmoc-肽樹脂。也可以使用AdvancedChemTech合成儀(MPS350型,Louisville,Ky.)來裝配肽。也可以使用本領(lǐng)域中已知的方法，如Sambrook等,1989,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第2版,ColdSpringHarbor使用重組DNA技術(shù)來制備本文中描述的化合物(毒蜥外泌肽、ABD、接頭、工程化多肽)。可以通過本領(lǐng)域已知的方法來制備非肽化合物。例如，可以使用本領(lǐng)域中已知的方法，如記載于Bartlett等,1986,Biorg.Chem.,14:356-377的方法來制備含有磷酸的氨基酸和含有這類氨基酸的肽?？梢允褂帽绢I(lǐng)域方法或如本文中描述的來綴合化合物。或者，可以通過本領(lǐng)域中公知的重組技術(shù)來生成工程化多肽。參見例如Sambrook等,1989(同上)?？梢詮亩嗪塑账岜磉_通過重組技術(shù)生成的這些工程化多肽?？紤]到密碼子選擇的簡并性，本領(lǐng)域技術(shù)人員會領(lǐng)會編碼這類工程化多肽的多核苷酸(包括DNA和RNA)可以從野生型cDNA(例如毒蜥外泌肽-4)獲得，并且在期望時可以進一步工程化改造以摻入指定的取代。這些多核苷酸序列可以摻入促進mRNA在微生物宿主中的轉(zhuǎn)錄和翻譯的密碼子?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域中公知的方法容易地構(gòu)建這類制造序列。參見例如WO83/04053，其通過提述完整并入本文中并用于所有目的。任選地，上述多核苷酸還可以編碼N端甲硫氨酰基殘基?？捎糜诒景l(fā)明的非肽化合物可以通過本領(lǐng)域中已知的方法來制備。例如，可以使用本領(lǐng)域中已知的方法來制備含有磷酸的氨基酸和含有這類氨基酸的肽。參見例如Bartlett和Landen,1986,Bioorg.Chem.14:356-77?？梢岳枚喾N表達載體/宿主系統(tǒng)以含有并表達工程化多肽編碼序列。這些包括但不限于微生物如用重組噬菌體、質(zhì)?；蛘沉NA表達載體轉(zhuǎn)化的細菌；用酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒表達載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用病毒表達載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)轉(zhuǎn)染或用細菌表達載體(例如Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng)；或動物細胞系統(tǒng)?？捎糜谥亟M蛋白質(zhì)生成的哺乳動物細胞包括但不限于，VERO細胞、HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系、COS細胞(如COS-7)、WI38、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293細胞。用于蛋白質(zhì)重組表達的例示性方案是在本文中描述的和/或本領(lǐng)域中已知的。因而，多核苷酸序列可用于生成新的且有用的病毒和質(zhì)粒DNA載體、新的且有用的經(jīng)轉(zhuǎn)化的和經(jīng)轉(zhuǎn)染的原核和真核宿主細胞(包括培養(yǎng)物中培養(yǎng)的細菌、酵母和哺乳動物細胞)、和新的且有用的方法，該方法用于能夠表達本工程化多肽的這類宿主細胞的培養(yǎng)生長。編碼本文中工程化多肽的多核苷酸序列在工程化多肽的生成不足會得到減輕或其水平升高的需要會得到滿足的情況中可用于基因療法。本發(fā)明還提供了用于本工程化多肽的重組DNA生成的方法。提供了用于從含有編碼工程化多肽的核酸的宿主細胞生成工程化多肽的方法，包括：(a)在促進DNA分子表達的條件下培養(yǎng)含有編碼工程化多肽的多核苷酸的宿主細胞；并(b)獲得工程化多肽。宿主細胞可以是原核或真核的，并且包括細菌、哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、猴細胞、幼倉鼠腎細胞、癌細胞或其它細胞)、酵母細胞和昆蟲細胞。用于表達重組蛋白質(zhì)的哺乳動物宿主系統(tǒng)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢詫λ拗骷毎赀x擇加工表達的蛋白質(zhì)或產(chǎn)生在提供蛋白質(zhì)活性中會有用的某些翻譯后修飾的特定能力。對多肽的這類修飾包括但不限于乙?；Ⅳ然?、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化和?；Ｇ懈畹鞍踪|(zhì)的“前原(prepro)”形式的翻譯后加工對于正確的插入、折疊和/或功能也可能是重要的。不同宿主細胞（如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38，等等）對于這類翻譯后活動具有特異性細胞機器和特征性機制，并且可以對其選擇以確保對引入的外來蛋白質(zhì)的正確修飾和加工?；蛘?，可以采用酵母系統(tǒng)來生成本發(fā)明的工程化多肽。通過PCR擴增工程化多肽DNA的編碼區(qū)。使用含有α交配因子基因的核苷酸1-20的一種引物和與此基因的核苷酸255-235互補的另一種引物在PCR反應(yīng)中從酵母基因組DNA擴增編碼酵母前原α前導序列的DNA(Kurjan和Herskowitz,1982,Cell,30:933-43)。將該前原α前導編碼序列和工程化多肽編碼序列片段連接到含有酵母醇脫氫酶(ADH2)啟動子的質(zhì)粒中，從而使該啟動子指導由融合的前原α因子和成熟的工程化多肽組成的融合蛋白的表達。如由Rose和Broach(Rose&Broach,1990,Meth.Enz.,185:234-79,Goeddel編,AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA)教導的，載體進一步包含在克隆位點下游的ADH2轉(zhuǎn)錄終止子、酵母“2微米”復制起點、酵母leu-2d基因、酵母REP1和REP2基因、大腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因、和大腸桿菌復制起點。β-內(nèi)酰胺酶和leu-2d基因分別提供細菌和酵母中的選擇。leu-2d基因還促進酵母中質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加以誘導更高水平的表達。REP1和REP2基因編碼牽涉質(zhì)粒拷貝數(shù)調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)。使用已知的方法例如醋酸鋰處理(Steams等,1990,.Meth.Enz.185:280-297)，將前段中描述的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到酵母細胞中。當耗盡生長培養(yǎng)基中的葡萄糖后誘導ADH2啟動子(Price等,1987,Gene55:287)。前原α序列實現(xiàn)從細胞分泌融合蛋白。伴隨地，酵母KEX2蛋白從成熟的工程化多肽切割前原序列(Bitter等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:5330-5334)。也可以使用商品化的表達系統(tǒng)，例如畢赤酵母表達系統(tǒng)(Invitrogen,SanDiego,CA)遵循制造商的用法說明書在酵母例如畢赤酵母(Pichia)中重組表達本發(fā)明的工程化多肽。此系統(tǒng)也依賴于前原α序列來指導分泌，但是插入物的轉(zhuǎn)錄在甲醇誘導后由醇氧化酶(AOX1)啟動子驅(qū)動。從酵母生長培養(yǎng)基純化分泌性工程化多肽，其通過例如用于從細菌和哺乳動物細胞上清液純化所述工程化多肽的方法進行?；蛘?，可以將編碼工程化多肽的DNA克隆到桿狀病毒表達載體例如pVL1393(PharMingen,SanDiego,CA)中。然后，依照制造商的指導(PharMingen)或已知的技術(shù)使用此工程化多肽編碼載體來感染例如在sF9無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞，及生成重組蛋白。使用本領(lǐng)域中已知的方法，例如肝素-Sepharose柱(Pharmacia,Piscataway,NewJersey)和序貫分子分篩柱(sequentialmolecularsizingcolumn)(Amicon,Beverly,Massachusetts)從培養(yǎng)基純化并濃縮蛋白質(zhì)，并將其在合適的溶液，例如PBS中重懸。可以使用SDS-PAGE分析來表征蛋白質(zhì)，例如通過顯示確認期望的工程化多肽大小的單一條帶來進行，全氨基酸氨基酸序列分析(例如Proton2090肽測序儀上的Edman測序)，或其N端序列的確認也可以。例如，可以將編碼預測的成熟工程化多肽的DNA序列克隆到含有期望的啟動子和任選地前導序列的質(zhì)粒中(參見例如Better等,1988,Science240:1041-1043)?？梢酝ㄟ^自動化測序確認此構(gòu)建體的序列。然后使用標準方法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株MC1061中，該方法采用CaCl2溫育和熱休克處理細菌(Sambrook等,同上)。在補充有羧芐西林(carbenicillin)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細菌，并通過在合適的培養(yǎng)基中生長誘導表達蛋白質(zhì)的生成。若存在的話，前導序列會影響成熟工程化多肽的分泌，并且在分泌期間被切割。通過本文中描述的方法從細菌培養(yǎng)基純化分泌性重組工程化多肽?；蛘?，可以在昆蟲系統(tǒng)中表達工程化多肽。用于蛋白質(zhì)表達的昆蟲系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在一種這類系統(tǒng)中，將苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核型多角體病毒(AcNPV)用作載體在草地夜蛾細胞中或在粉紋夜蛾(Trichoplusia)幼蟲中表達外來基因。將工程化多肽編碼序列克隆到病毒的非必需區(qū)(如多角體蛋白基因)中，并置于多角體蛋白啟動子的控制下。工程化多肽的成功插入會使得多角體蛋白無活性，并生成缺乏外殼蛋白外殼的重組病毒。然后，使用重組病毒來感染草地夜蛾細胞或粉紋夜蛾幼蟲，其中表達本發(fā)明的工程化多肽(Smith等,1983,J.Virol.46:584;Engelhard等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3224-3227)。在另一個例子中，可以通過PCR擴增編碼工程化多肽的DNA序列，并且將其克隆到合適的載體例如pGEX-3X(Pharmacia,Piscataway,NewJersey)中。pGEX載體設(shè)計為生成融合蛋白，其包含由載體編碼的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和由插入載體克隆位點中的DNA片段編碼的蛋白質(zhì)?？梢陨砂绾线m的切割位點的PCR引物。然后，可以從融合蛋白的GST部分切割重組融合蛋白。將pGEX-3X/工程化多肽構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-1Blue細胞(Stratagene,LaJolla,CA)中，并分離個別轉(zhuǎn)化體，在LB培養(yǎng)基(補充有羧芐西林)中于37°C培養(yǎng)至波長600nm處光密度為0.4，接著在存在0.5mM異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(SigmaChemicalCo.,St.Louis,Missouri)的情況下再溫育4小時。將來自個別轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA純化，并使用自動化測序儀來部分測序以確認正確取向的期望的工程化多肽編碼基因插入物的存在。當預期在細菌中以不溶性包含體生成時，可以如上文描述的或如下純化融合蛋白。通過離心收獲細胞；在0.15MNaCl,10mMTris,pH8,1mMEDTA中清洗；并用0.1mg/mL溶菌酶(SigmaChemicalCo.)于RT處理15分鐘。通過超聲處理使裂解液澄清，并通過以12,000xg離心10分鐘使細胞碎片沉淀。將含有融合蛋白的團粒在50mMTris,pH8,和10mMEDTA中重懸，在50%甘油上成層，并以6000xg離心30分鐘。將團粒在無Mg++和Ca++的標準磷酸鹽緩沖鹽水溶液(PBS)中重懸。通過將重懸的團粒在變性SDS聚丙烯酰胺凝膠中分級來對融合蛋白進一步純化(Sambrook等，見上文)。將凝膠在0.4MKCl中浸泡以顯現(xiàn)蛋白質(zhì)，將該蛋白質(zhì)切出，并在缺少SDS的凝膠運行緩沖液中電洗脫。如果GST/工程化多肽融合蛋白在細菌中以可溶性蛋白質(zhì)生成，那么可以使用GST純化模塊(PharmaciaBiotech)將其純化。融合蛋白可以進行消化以從成熟的工程化多肽切割GST。將消化反應(yīng)(0.5mLPBS中20-40μg融合蛋白，20-30個單位人凝血酶(4000U/mg(Sigma))于RT溫育16-48小時，并在變性SDS-PAGE凝膠上加載以分級反應(yīng)產(chǎn)物。將凝膠在0.4MKCl中浸泡以顯現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶?？梢允褂米詣踊瘻y序儀(AppliedBiosystems473A型,FosterCity,CA)通過部分氨基酸序列分析確認與工程化多肽的預期分子量對應(yīng)的的蛋白質(zhì)條帶的身份。在本發(fā)明工程化多肽的重組表達的特別例示性方法中，可以通過磷酸鈣方法用在pCMV載體(5’CMV啟動子，3’HGH多聚A序列)和pSV2neo(含有neo抗性基因)中含有工程化多肽cDNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動物293細胞。在一個實施方案中，應(yīng)當在轉(zhuǎn)染前用ScaI將載體線性化。類似地，可以使用一種備選的構(gòu)建體，其使用摻有neo基因的類似pCMV載體。從單一細胞克隆選擇穩(wěn)定的細胞系，其通過在含有0.5mg/mLG418(新霉素樣抗生素)的生長培養(yǎng)基中有限稀釋10-14天來進行。通過ELISA或Western印跡針對工程化多肽的表達篩選細胞系，并且擴大高表達細胞系以用于大規(guī)模生長。優(yōu)選的是使用經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞進行長期、高產(chǎn)量的蛋白質(zhì)生成，因此穩(wěn)定表達是期望的。一旦用含有與期望的表達盒一起的選擇標志物的載體轉(zhuǎn)化這類細胞，可以允許細胞在將它們轉(zhuǎn)換到選擇培養(yǎng)基前在富集培養(yǎng)基中生長1-2天。選擇標志物設(shè)計為賦予對選擇的抗性，并且其存在允許成功表達導入序列的細胞的生長和回收?？梢允褂眠m合于細胞的組織培養(yǎng)技術(shù)增殖經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞的抗性塊?？梢允褂迷S多選擇系統(tǒng)來回收已經(jīng)經(jīng)過轉(zhuǎn)化以用于重組蛋白質(zhì)生成的細胞。這類選擇系統(tǒng)包括但不限于分別在tk、hgprt或aprt細胞中的HSV胸苷激酶、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因。還有，可以將抗代謝物抗性用作對以下基因選擇的基礎(chǔ)：dhfr，其賦予對甲氨蝶呤的抗性；gpt，其賦予對霉酚酸的抗性；neo，其賦予對氨基糖苷G418的抗性；also，其賦予對綠磺隆(chlorsulfuron)的抗性；和hygro，其賦予對潮霉素的抗性?？捎玫钠渌蛇x擇基因包括trpB（其允許細胞利用吲哚代替色氨酸），或hisD（其允許細胞利用組氨醇(histinol)代替組氨酸）。為轉(zhuǎn)化體的鑒定給出視覺指示的標志物包括花色素苷、β-葡糖醛酸糖苷酶及其底物、GUS、和螢光素酶及其底物螢光素?？梢允褂米詣踊暮铣珊椭亟M技術(shù)的組合來生成本發(fā)明的工程化多肽。舉例而言，可以合成或重組制備毒蜥外泌肽化合物和ABD的任一種或兩者(以及任選地接頭)，然后使用本領(lǐng)域中已知的方法將其連接在一起，所述方法如“天然化學連接”或其已知變體，其中形成結(jié)合親本化合物的酰胺鍵。參見例如美國專利No.6,326,468，其通過提述并入本文中并用于所有目的?；蛘?，例如，本發(fā)明的工程化多肽可以含有修飾的組合，所述修飾包括缺失、取代、插入和通過PEG化(或其它模塊，例如聚合物、脂肪?；?、C端酰胺化)的衍生化?？梢栽诟麟A段中生成這類工程化多肽。在第一階段，可以通過如描述的重組技術(shù)來生成中間工程化多肽，其含有缺失、取代、插入和其任意組合的修飾。然后，在如本文中描述的任選純化步驟后，經(jīng)由用合適的PEG化試劑(例如來自NeKtarTransformingTherapeutics,SanCarlos,CA)的化學修飾將中間工程化多肽PEG化(或進行其它化學衍生化，例如?；?、C端酰胺化)以產(chǎn)生期望的工程化多肽衍生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員會領(lǐng)會，可以將上文所描述的規(guī)程一般化以適用于含有修飾的組合的工程化多肽，所述修飾選自缺失、取代、插入、衍生化和本領(lǐng)域中公知的且由本發(fā)明涵蓋的其它修飾手段。可以通過使用甘氨酸氨基酸-C末端延伸前體來完成C末端酰胺化，所述前體在例如酵母(例如畢赤酵母)中作為將分泌到培養(yǎng)基中的α-因子融合蛋白合成。純化后，可以通過酶促酰胺化，例如肽基甘氨酸α-酰胺化單加氧酶(PAM)將工程化多肽前體的C末端甘氨酸轉(zhuǎn)化為酰胺。參見例如Cooper等,1989,Biochem.Biophys.Acta,1014:247-258。亦參見美國專利6319685(其通過提述完整并入本文并用于所有目的)，其教導了用于酶促酰胺化的方法，包括來自大鼠的α酰胺化酶，其在α酰胺化酶中為充分純以展現(xiàn)出至少約25mU/mg蛋白的比活性，且足夠免除蛋白水解雜質(zhì)以適合用于從天然來源純化或通過重組DNA技術(shù)生成的底物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的許多方法，包括如本文中描述的方法來純化肽。在一種方法中，使用WatersDeltaPrep3000系統(tǒng)通過RP-HPLC(制備型和分析型)純化肽。可以使用C4、C8或C18制備柱(10μ,2.2X25cm;Vydac,Hesperia,CA)來分離肽，并且可以使用C4、C8或C18分析柱(5μ,0.46X25cm;Vydac)來測定純度?？梢詫⑷軇?A=0.1%TFA/水和B=0.1%TFA/CH3CN)以1.0ml/分鐘的流速投遞至分析柱，以15ml/分鐘投遞制備柱?？梢栽赪atersPicoTag系統(tǒng)上實施氨基酸分析，并使用Maxima程序處理?？梢酝ㄟ^蒸汽相酸水解(115°C,20-24h)將肽水解。可以將水解產(chǎn)物衍生化，并通過標準方法分析(Cohen等,THEPICOTAGMETHOD:AMANUALOFADVANCEDTECHNIQUESFORAMINOACIDANALYSIS,第11頁-第52頁,MilliporeCorporation,Milford,Mass.(1989))?？梢酝ㄟ^M-Scan,Incorporated(WestChester,Pa.)實施快速原子轟擊分析。可以使用碘化銫或碘化銫/甘油來實施質(zhì)量校正。使用飛行時間檢測的等離子體解吸電離分析可以在AppliedBiosystemsBio-Ion20質(zhì)譜儀上實施。工程化多肽表達測定法。用于測定宿主細胞的蛋白質(zhì)表達水平的方法是可用的。在以下典型的方案中例示了可用于測定宿主細胞的蛋白質(zhì)表達水平的規(guī)程。用2ul質(zhì)粒DNA(工程化多核苷酸的表達載體)轉(zhuǎn)化約25μlBL21大腸桿菌細胞?？梢詫⒓毎伆澹⒃?7℃溫育過夜或于室溫(RT)在48小時期間里溫育?？梢赃x出單個菌落，并用于在4ml具有合適抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)起始培養(yǎng)物達約6小時。通過向900ul儲液添加100ul80%無菌甘油來制備甘油儲液，然后可以將其溫和混合并在-80C貯存。對于TCP未誘導的樣品可以取出250μl樣品?？梢杂?μl起始培養(yǎng)物接種等分試樣，例如2ml含有合適抗生素的Magic培養(yǎng)基，然后可以將其于37C以300rpm溫育過夜(長達24小時)。如本領(lǐng)域中已知的，Magic培養(yǎng)基是自身誘導的?；蛘撸梢栽?50ml或125mlThompson燒瓶中用60μl起始培養(yǎng)物接種60ml含有合適抗生素的Magic培養(yǎng)基，然后將其于30C以300rpm溫育過夜(長達24小時)。溫育后，可以從每管取出250μl培養(yǎng)物，并將細胞沉淀。可以將細胞在1ml50mMTrispH8,150mMNaCl中重懸，可以對其添加0.1體積(100ul)POP培養(yǎng)試劑和1μlr-溶菌酶(在r-溶菌酶緩沖液中以1:750稀釋)。可以將混合物充分混合，并于RT溫育至少10分鐘。然后，將制備物以14000xG離心10分鐘?？梢詫⑸锨逡?可溶性級分)取出并保留，并且可以制備樣品以進行凝膠分析(15μl+5μlLDS)?？梢詫⑹Ｓ嗟陌w團粒通過超聲處理在1ml1%SDS中重懸。可以制備樣品以進行凝膠分析(15ul+5μlLDS)。對于未誘導的樣品，可以添加1.0體積POP培養(yǎng)試劑和1μlr-溶菌酶(在r-溶菌酶緩沖液中以1:750稀釋)?？梢詫⑷芤撼浞只旌希⒂赗T溫育至少10分鐘。這些樣品可以不需要離心。然后，可以制備樣品以進行凝膠分析(15ul+5μlLDS)?？梢栽?XMES緩沖液中運行非還原性NU-PAGE凝膠(4-12%)，并用SimplyBlue微波方案染色。可以進行脫色過夜，如本領(lǐng)域中已知的。可以保留凝膠圖像，并進行分析以測定蛋白質(zhì)表達水平。可以如下表達并純化工程化多肽。設(shè)計期望工程化多肽的蛋白質(zhì)序列并使用商業(yè)化軟件回翻為DNA序列以克隆到大腸桿菌表達載體中。以寡核苷酸獲得核酸序列并使用標準PCR擴增技術(shù)連接在一起，或者使用標準限制酶從現(xiàn)有表達構(gòu)建體消化出序列，然后又將其連接在一起。將表達感興趣蛋白質(zhì)的序列置于質(zhì)粒pET45中，其具有用于可誘導表達的T7啟動子。在通過測序驗證了構(gòu)建體后，純化載體DNA并將其轉(zhuǎn)化到表達宿主(通常為BL21(DE3))中。選出單個菌落以在4mlLB培養(yǎng)基中生長起始培養(yǎng)物達～6小時。通過向900ul儲液加入100ul80%甘油來制備甘油儲液并儲存于-80℃。任選地，保留500μl未誘導的樣品用于凝膠分析。使用60μl起始培養(yǎng)物在125mlThompson瓶中接種60ml培養(yǎng)物(例如MagicMediaTM大腸桿菌表達培養(yǎng)基；Invitrogen,USA;參見Glenn等,J.Biol.Chem.2008,283(19):12717-29)，并于30℃過夜溫育。取出250ul樣品用于分析。通過離心收集成為團粒的細胞，并冷凍用于后續(xù)處理。如下實施細胞提取物的制備和用鎳樹脂的首次通過純化。將大腸桿菌細胞團粒完全重懸于體積等于起始培養(yǎng)物體積的裂解緩沖液(50mMTrisHCl,150mMNaCl,pH8.0)中。然后，使細胞以100psi3次通過微射流儀(microfluidizer)(Microfluidics,MA)。將細胞提取物在16,000xg離心30分鐘以除去碎片。向細胞提取物添加EGTA(150mM儲液)至終濃度為3mMEGTA。然后，將裂解產(chǎn)物施加到已經(jīng)清洗和預平衡的Ni-NTASuperflow柱上。接著在用50mL洗脫緩沖液(25mMTrisHCl,50mMNaCl,250mM咪唑,pH8.0)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)前，用加EGTA的裂解緩沖液(50mMTrisHCl,150mMNaCl,pH8.0,3mMEGTA)清洗結(jié)合至柱的蛋白質(zhì)。His標簽的切割和后續(xù)純化如下。將洗脫的蛋白質(zhì)用Amicon-Ultra15離心濾器裝置(Millipore,USA)濃縮，然后用25mMTrisHCl,pH8.0,50mMNaCl稀釋以準備蛋白酶消化，其將HisTag從期望蛋白質(zhì)的N末端切除。向蛋白質(zhì)溶液加入0.1%β-巰基乙醇和1%TurboTEV蛋白酶(2mg/mL,10,000單位/mg;Excellgen,USA)，將其混合并在室溫溫育達4小時并隨后在4°C過夜。將Ni-NTASuperflow柱(Qiagen,USA)用50mMTrisHCl,100mMNaCl,45mM咪唑,pH8.0預平衡。將TEV消化反應(yīng)物用50mMTrisHCl,150mMNaCl,pH8.0稀釋2倍。將稀釋過的消化反應(yīng)物小心地施加到Ni-NTA柱頂部并收集流經(jīng)物。向該柱加入10mL50mMtrisHCl,100mMNaCl,45mM咪唑,pH8.0以洗脫任何未結(jié)合的蛋白質(zhì)。收集來自柱的洗脫蛋白質(zhì)并合并，然后使用大小排阻層析(2x，用Superdex75HiLoad26/60柱，GEHealthcareBiosciences,USA)進行精制。使用EndoTrapRed(Lonza,Switzerland)依照制造商說明書除去任何剩余的細菌內(nèi)毒素。包含體制備。對于在包含體級分中找到的工程化多肽，以下規(guī)程可以是有益的。對于每50ml培養(yǎng)物，可以將細胞團粒在最少100ml裂解緩沖液中重懸。在添加30ml時，可以使用10ml移液管來重懸，然后再用70ml沖洗管?？梢詫⒅貞业募毎芤阂?00PSI(min)多次運行(例如4次通過)流過微射流儀(microfluidizer)，注意貫穿整個過程將室在冰水中保持?？梢砸?4000xg將流化的漿體離心20分鐘(例如JLA10.5，10,000rpm，使用250mlnalgene瓶)。在用移液管尖端破壞后，可以將包含體團粒在冰上在冰冷的裂解緩沖液中用攪拌棒和攪拌盤于4C重懸1小時。在用移液管尖端破壞后，可以將團粒在蒸餾H2O中用攪拌棒和攪拌盤于4C第二次重懸1小時，接著以14000xg離心15分鐘?？梢詫⑸锨逡喝〕霾壢ァ？梢杂?80C貯存所得物。蛋白質(zhì)純化。如本文中描述的，眾多用于分離表達的多肽的方法是已知的。優(yōu)選分泌的工程化多肽。然而，以下是如若形成包含體的一個例子。可以將包含體團粒在合適體積的溶解緩沖液(8M尿素或8M胍,50mMTris,10mMDTT,pH7.75)中在RT溶解1小時。溶解的團粒可以以27000g離心20分鐘。可以將經(jīng)過濾(例如0.4um)的上清液于RT逐滴轉(zhuǎn)移到適當體積的重折疊緩沖液(50mMTris-HCl,1M尿素,0.8M精氨酸,4mM半胱氨酸,1mM胱胺;pH8)中。然后，可以將所得物在溫和混合的情況下置于4°C過夜或更長?？梢詫悠窛饪s，并在4C環(huán)境中使用GEHealthsciencesAKTAFPLCTM以1-2ml/分鐘在凝膠過濾柱(Superdex7526/60)上運行?？梢詫⒑泻线m蛋白質(zhì)的級分經(jīng)由SDS-PAGE鑒定，合并，并運行通過第二凝膠過濾柱。然后，可以將合并的蛋白質(zhì)在Amicon濾器中濃縮至合適的濃度，并使用例如EndosafePTS閱讀器(CharlesRiver)測定內(nèi)毒素水平，如本領(lǐng)域中已知的。一旦蛋白質(zhì)樣品已經(jīng)通過內(nèi)毒素標準，那么就可以將其無菌過濾，分配成等分試樣，并運行經(jīng)過質(zhì)量控制測定法。質(zhì)量控制測定法可以包括分析型HPLC-SEC、非還原性SDSPAGE和RPHPLC-MS以獲得大致質(zhì)量?？梢栽?xPBS(137mM氯化鈉、2.7mM氯化鉀、4.3mM磷酸二鈉、1.4mM磷酸單鉀，pH7.2)中獲得蛋白質(zhì)，分配成等分試樣，并速凍以于-70C至-80°C貯存。IV.使用和治療疾病的方法適應(yīng)癥。涵蓋通過本文中描述的多肽化合物和方法有益治療的多種疾病和病癥。肥胖癥和超重。肥胖癥及其關(guān)聯(lián)病癥（包括超重）是美國和全世界的常見且嚴重的公共健康問題。上身肥胖癥是2型糖尿病已知的最強的風險因子，并且是心血管疾病的強風險因子。肥胖癥是高血壓、動脈粥樣硬化、充血性心力衰竭、中風、膽囊疾病、骨關(guān)節(jié)炎、睡眠呼吸暫停、生殖病癥如多囊卵巢綜合征、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌、以及全身麻醉并發(fā)癥發(fā)生率增加的公認的風險因子。參見例如Kopelman,2000,Nature404:635-43。肥胖癥縮短壽命，并且攜帶上文所列出的合并癥，以及病癥如感染、靜脈曲張、黑棘皮病、濕疹、運動不耐(exerciseintolerance)、胰島素抗性、高血壓血膽固醇過多、膽石癥、矯形損傷(orthopedicinjury)和血栓栓塞性疾病的嚴重風險。參見例如Rissanen等,1990,Br.Med.J.,301:835-7。肥胖癥也是稱作胰島素抗性綜合征或“綜合征X”和代謝綜合征的一組狀況的風險因子。肥胖癥和關(guān)聯(lián)病癥的全世界醫(yī)學成本是巨大的。認為肥胖癥的發(fā)病機制是多因素的。一個問題是，在肥胖的受試者中，營養(yǎng)利用度和能量消耗不進入平衡，直到存在有過量的脂肪組織。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)控制能量平衡，并協(xié)調(diào)適合于動物代謝狀態(tài)的多種行為的、自主的和內(nèi)分泌的活動。控制這些活動的機制或系統(tǒng)在前腦(例如下丘腦)、后腦(例如腦干)和脊髓間廣泛分布。最終，來自這些系統(tǒng)的代謝(即燃料利用度)和認知(即習得偏愛)信息得到整合，并且開啟(進餐獲取和啟動)或關(guān)閉(進餐終止)參與食欲(食物尋找)和完成(攝食)行為的決定。認為下丘腦主要負責整合這些信號，然后向腦干發(fā)出命令。腦干核控制完成運動控制系統(tǒng)的元件(例如負責咀嚼和吞咽的肌肉)。因而，這些CNS核照字面意義稱為構(gòu)成攝取行為的“最終共同途徑”。神經(jīng)解剖學和藥理學證據(jù)支持能量和營養(yǎng)穩(wěn)態(tài)的信號在前腦核中整合，而且完成運動控制系統(tǒng)駐留于腦干核中，可能在圍繞三叉神經(jīng)運動核的區(qū)域中。在下丘腦和腦干之間有廣泛的交互連接。多種CNS定向性抗肥胖癥治療劑(例如小分子和肽)主要聚焦于駐留于下丘腦中的前腦基質(zhì)和/或駐留于腦干中的后腦基質(zhì)。肥胖癥仍然是一種不太好治療的、慢性的、基本上難治的代謝性病癥。因而，需要可用于受試者中的重量減輕和/或重量維持的新療法。這類療法會對受試者的健康產(chǎn)生深刻的有益效果。糖尿病和心血管疾病。認為糖尿病是一種復雜的慢性疾病，其中糖尿病患者中占所有病例死亡的60%至70%是心血管并發(fā)癥的結(jié)果。糖尿病不僅被視為冠心病風險等同體，而且還鑒定為不利事件的獨立預測物，所述不利事件包括復發(fā)性心肌梗死、充血性心力衰竭、和心血管事件后的死亡。預期采用更緊密的葡萄糖控制和心血管風險因子的攻擊性治療會降低冠心病并發(fā)癥的風險，并且改善糖尿病患者間的總體存活。然而，糖尿病患者比非糖尿病患者以2至3倍更可能經(jīng)歷急性心肌梗死，并且糖尿病患者比非糖尿病患者少活8至13年。了解糖尿病/急性心肌梗死患者的高風險性質(zhì)，美國心臟病學會/美國心臟學會(AmericanCollegeofCardiology/AmericanHeartAssociation,“ACC/AHA”)不穩(wěn)定心絞痛(unstableangina)或非ST-升高心肌梗死(統(tǒng)稱為“ACS”)住院患者管理臨床實踐指南最近認為住院糖尿病患者是一個需要高血糖癥攻擊性管理的特殊群體。具體地，該指南宣稱住院糖尿病/ACS患者的降葡萄糖療法應(yīng)當目標為達到小于10mg/dL的餐前葡萄糖、小于180mg/dL的最大每日目標(maximumdailytarget)、和小于7%的出院后血紅蛋白A1c。在全國性老年ACS患者樣本中，表明糖尿病患者中30天死亡率的增加與醫(yī)院收治后具有較高葡萄糖值的患者一致。參見“DiabeticCoronaryArteryDisease&Intervention,”CoronaryTherapeutics2002,OakBrook,IL,2002年9月20日。有越來越多的證據(jù)的是，醫(yī)院收治后持續(xù)的高血糖而非短暫升高的葡萄糖與嚴重的不利事件相關(guān)。盡管不容易知道患者中高血糖和血管風險的理想度量，但是表現(xiàn)為住院期間的均值葡萄糖值對死亡率最具預測性。在來自美國的超過40家醫(yī)院的ACS患者的不同研究中，發(fā)現(xiàn)與醫(yī)院收治后的隨機葡萄糖值形成對比，持續(xù)性高血糖對住院死亡率更具預測性。參見AcuteCoronarySyndromeSummit:AStateoftheArtApproach,KansasCity,MO,2002年9月21日。與收治后的葡萄糖值相比，在整個住院里葡萄糖控制的對數(shù)回歸模型對死亡率最具預測性。在120mg/dL上葡萄糖每升高10mg/dL，住院期間的死亡風險幾乎增加2倍。在連續(xù)性糖尿病/ACS患者的一個較小分組中，隨著醫(yī)院收治后葡萄糖水平升高，存在有1年時死亡率的分級增加。在醫(yī)院背景中，ACC/AHA指南建議啟動攻擊性胰島素療法以實現(xiàn)住院期間的較低血液葡萄糖。脂質(zhì)調(diào)節(jié)疾病。血脂障礙是血液中正常脂質(zhì)組分受破壞。認為延長的胰島素水平的升高可以導致血脂障礙。高脂血是血液中存在升高或異常水平的脂質(zhì)和/或脂蛋白。脂肪肝病，例如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)指一大批肝病，其范圍為簡單的脂肪肝(脂肪變性(steatosis))，至非酒精性脂肪肝炎(NASH)，至肝硬化(cirrhosis)(不可逆的、進行性肝瘢痕化)。NAFLD的所有階段共同具有肝臟細胞(肝細胞)中的脂肪積累(脂肪浸潤)。另外，不希望受任何理論束縛，認為2型糖尿病中的相對胰島素缺陷、葡萄糖毒性、和通過經(jīng)由門靜脈從腹內(nèi)脂肪組織投遞的升高而增加的肝游離脂肪酸負荷暗示為脂肪肝病癥的可能原因。實際上，已經(jīng)假設(shè)進食行為是驅(qū)動肥胖癥的代謝綜合征及其許多必然結(jié)果(包括NASH)的關(guān)鍵因素。因而，如已經(jīng)在2型糖尿病中證明的，針對減少食物攝取并增加小餐次數(shù)的治療可以有效治療并預防NASH。促進胰島素分泌和體重減少，并延遲胃排空的藥物也有效改善葡萄糖耐受性，并且如此可以改善脂肪肝及其伴隨的高胰島素血癥。如此，毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽類似物激動劑、毒蜥外泌肽衍生物激動劑，特別是毒蜥外泌肽-4的使用可以完全適合作為針對此狀況的治療形式。因而，本文中描述的工程化多肽(其包括毒蜥外泌肽或生物學活性(激素域)肽組分、或其片段或類似物)在治療脂肪肝病癥中可以是有用的。阿耳茨海默氏病。如本領(lǐng)域中已知的，阿耳茨海默氏病(AD)與腦中的斑塊和纏結(jié)(其包括A-β蛋白的失調(diào))有關(guān)。已經(jīng)報告了對神經(jīng)元GLP-1受體的刺激在調(diào)節(jié)神經(jīng)元可塑性和細胞存活中起著重要作用。已經(jīng)報告了GLP-1誘導神經(jīng)突長出并保護培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞中免于興奮中毒性細胞死亡和氧化性損傷。報告了GLP-1和毒蜥外泌肽-4在小鼠大腦中降低淀粉樣-β肽(A-β蛋白)的內(nèi)源性水平并降低神經(jīng)元中的β-淀粉樣前體蛋白(β-APP)的水平。參見例如Perry等,2004,Curr.DrugTargets5(6):565-571。用本文中披露的工程化化合物治療可以為與阿耳茨海默氏病相關(guān)的治療靶物提供益處。帕金森氏病。帕金森氏病(PD)與“原發(fā)性帕金森綜合征(parkinsonism)”(即由于無繼發(fā)性系統(tǒng)起因的神經(jīng)變性過程所導致的孤立的帕金森綜合征)同義。帕金森綜合征的特征在于由多巴胺喪失所導致的震顫、僵硬、和運動遲緩的癥狀。不希望受任何理論束縛的，認為毒蜥外泌肽-4可能通過作為小膠質(zhì)細胞-鈍化因子起作用來充當多巴胺能神經(jīng)元的存活因子，并且表明毒蜥外泌肽-4可能是用于神經(jīng)變性疾病如PD的一種有價值的治療劑。代謝綜合征X。代謝綜合征X的特征為胰島素抗性、血脂障礙、高血壓、和脂肪組織的內(nèi)臟分布，并且在2型糖尿病的病理生理學中起著樞要作用。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了它與NASH、纖維化、和肝損傷高度關(guān)聯(lián)。因而，本文中描述的工程化多肽可用于治療代謝綜合征X。類固醇誘發(fā)的糖尿病。眾所周知，糖皮質(zhì)激素影響碳水化合物代謝。響應(yīng)外源性糖皮質(zhì)激素施用的，在周緣組織中觀察到增加的肝葡萄糖生成和降低的胰島素分泌以及胰島素刺激的葡萄糖攝取。此外，糖皮質(zhì)激素治療改變了胰島素原(P1)/免疫反應(yīng)性胰島素(IRI)比率，如本領(lǐng)域中已知的。在無糖尿病的受試者中由糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的高血糖癥的典型特征包括空腹血糖的最小值提高、餐后高血糖逾常、對外源胰島素的不敏感性、和對二甲雙胍或磺酰脲療法的無響應(yīng)性。因此，本文中描述的工程化多肽(其包含毒蜥外泌肽生物學活性(激素域)肽組分、或其片段或類似物)可以在治療類固醇誘發(fā)的糖尿病中有用。人免疫缺陷病毒(HIV)治療誘發(fā)的糖尿病。在將人免疫缺陷病毒(HIV)-1蛋白酶抑制劑(PI)引入常規(guī)的臨床使用后，很快就出現(xiàn)了將PT使用與高血糖癥的產(chǎn)生關(guān)聯(lián)的報告。盡管用PI治療的約1%至6%的HIV感染受試者會產(chǎn)生糖尿病，但有相當大的比例會產(chǎn)生胰島素抗性和受損的葡萄糖耐受性。因此，本文中描述的工程化多肽(其包含毒蜥外泌肽生物學活性(激素域)肽組分、或其片段或類似物)可以在治療HIV治療誘發(fā)的糖尿病中有用。成人中潛伏的自身免疫性糖尿病(LADA)。認為在診斷為2型糖尿病的患者中有約10%存在進展的自身免疫性糖尿病，亦稱為成人中潛伏的自身免疫性糖尿病(LADA)。LADA患者具有針對胰島細胞細胞質(zhì)抗原或更經(jīng)常地谷氨酸脫羧酶的循環(huán)抗體。這些受試者展現(xiàn)出1型和2型糖尿病兩者的臨床特征屬性。盡管在自身免疫性糖尿病的緩慢進展形式中比快速進展形式更好地保留了胰島素分泌，但LADA受試者中的胰島素分泌傾向于隨時間而衰退。因此，本文中描述的工程化多肽(其包含毒蜥外泌肽生物學活性(激素域)肽組分、或其片段或類似物)可以在治療LADA中有用。無知覺性低血糖癥(HU)。即使僅僅在低血糖癥的單次最近發(fā)作后，也可能發(fā)生防御性葡萄糖反調(diào)節(jié)(counterregulation)。經(jīng)歷重復的低血糖癥發(fā)作的受試者經(jīng)常不能識別通常與低血糖癥相關(guān)的癥狀或即將來臨的胰島素休克(shock)，一種稱為“無知覺性低血糖癥”的疾患。由于患者未意識到他或她的自身狀態(tài)，血糖水平隨后可能會降得如此之低，使得產(chǎn)生嚴重的神經(jīng)學問題，包括昏迷和發(fā)作(seizure)。因此，本文中描述的工程化多肽(其包含毒蜥外泌肽生物學活性(激素域)肽組分、或其片段或類似物)可用于治療HU。限制性肺病。已經(jīng)在肺中局部化了GLP-1受體。毒蜥外泌肽可以經(jīng)由GLP-1受體引發(fā)生物學應(yīng)答。具體地，結(jié)節(jié)病是經(jīng)常牽涉肺的系統(tǒng)性肉芽腫疾病。盡管結(jié)節(jié)病經(jīng)典地被視為限制性肺病，但氣道阻礙在過去若干年中已經(jīng)變成該疾病的公認特征。結(jié)節(jié)病可以在任何水平上影響氣道，且當牽涉包含了小氣道時，其可能類似于更常見的阻礙性氣道疾病，如哮喘和慢性支氣管炎。因此，本文中描述的工程化多肽(其包含毒蜥外泌肽生物學活性(激素域)肽組分、或其片段或類似物)可以在治療限制性肺病中有用，因為這類激素域肽可以改善肺的彈性或延遲剛性。短腸綜合征(SBS)。已經(jīng)報告了毒蜥外泌肽-4對于短腸綜合征的治療有效。參見Kunkel等Neurogastroenterol.Motil.(2011)。SBS是一種嚴重的臨床病癥，其特征在于腹瀉和營養(yǎng)剝奪。由回腸中的L細胞生成的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)調(diào)節(jié)近端腸運輸。當發(fā)生大范圍的回腸切除時，如在SBS中的，GLP-1水平可能是缺陷的。艾塞那肽(Exenatide)改善了患有SBS的患者的營養(yǎng)狀態(tài)和腸癥狀。因此，SBS患者可以用本文中描述的工程化多肽治療。可以實現(xiàn)腸頻率和形態(tài)中的改善并獲得不再與膳食相關(guān)的腸運動。一種另外的優(yōu)點是，可以終止總的胃腸外營養(yǎng)。本文中的這些化合物會在SBS患者的腸習性、營養(yǎng)狀態(tài)和生活質(zhì)量中提供實質(zhì)性改善，并還可以減少對胃腸外營養(yǎng)和小腸移植的需要。因此，在一個方面，提供了用于治療受試者中疾病或病癥的方法。所述受試者需要治療該疾病或病癥。在一些實施方案中，需要治療的受試者是肥胖的。所述疾病或病癥可以是糖尿病、超重、肥胖癥、阿耳茨海默氏病、脂肪肝病、血脂障礙、冠心病、中風、SBS或高脂血、或本文中論述的其它疾病。糖尿病可以包括I型、II型糖尿病、妊娠糖尿病或前驅(qū)糖尿病以及HIV或類固醇誘發(fā)的糖尿病。治療方法包括以能有效治療該疾病或病癥的量對受試者施用如本文中描述的工程化多肽。特別可用于這些疾病的是本文中描述的化合物，其具有降低葡萄糖的活性(例如連接于ABD的毒蜥外泌肽-4或其片段或類似物)、具有減輕體重或降低食物攝取的活性、降低HbA1c、延遲胃排空、降低血漿胰高血糖素和/或腸能動性的益處。在一些實施方案中，所述疾病或病癥是糖尿病、超重或肥胖癥、或血脂障礙或高脂血。所述工程化多肽可以包含ABD和HD1多肽，和任選地接頭K1，其中HD1是毒蜥外泌肽或其片段或類似物。因此，所述工程化多肽可以具有以下一種結(jié)構(gòu)：HD1-ABD或HD1-L1-ABD。在一些實施方案中，所述疾病或病癥是糖尿病、超重、肥胖癥、血脂障礙、阿耳茨海默氏病、脂肪肝病、SBS或高脂血。所述工程化多肽可以包含毒蜥外泌肽或其片段或類似物。因此，所述工程化多肽可以具有以下一種結(jié)構(gòu)：HD1-ABD或HD1-L1-ABD。在一些實施方案中，工程化多肽中的毒蜥外泌肽是毒蜥外泌肽-4。在一些實施方案中，所述毒蜥外泌肽片段是毒蜥外泌肽-4的片段。在一些實施方案中，毒蜥外泌肽類似物與毒蜥外泌肽-4具有至少70%，例如70%,75%,80%,85%,90%,95%或甚至更高的同一性。特別可用于這些疾病的是本文中描述的化合物，其具有降低葡萄糖的活性(例如連接于ABD的毒蜥外泌肽-4或其片段或類似物)、具有減輕體重或降低食物攝取的活性、降低HbA1c、延遲胃排空、降低血漿胰高血糖素和/或腸能動性的益處。在一些實施方案中，所述疾病或病癥是糖尿病、超重、肥胖癥、血脂障礙、阿耳茨海默氏病、脂肪肝病、SBS或高脂血。所述工程化多肽可以包含毒蜥外泌肽或其片段或類似物。因此，所述工程化多肽可以具有以下一種結(jié)構(gòu)：HD1-ABD或HD1-L1-ABD。在一些實施方案中，所述毒蜥外泌肽是毒蜥外泌肽-4。在一些實施方案中，所述毒蜥外泌肽片段是毒蜥外泌肽-4的片段。在一些實施方案中，所述毒蜥外泌肽類似物與毒蜥外泌肽-4具有至少70%，例如70%,75%,80%,85%,90%,95%或甚至更高的同一性。特別可用于這些疾病的是本文中描述的化合物，其具有降低葡萄糖的活性(例如連接于ABD的毒蜥外泌肽-4或其片段或類似物)、具有減輕體重或降低食物攝取的活性、降低HbA1c、延遲胃排空、降低血漿胰高血糖素和/或腸能動性的益處。所述工程化多肽可以僅包含毒蜥外泌肽或其類似物或片段作為激素域。所述疾病或病癥可以是糖尿病、超重、肥胖癥、血脂障礙、阿耳茨海默氏病、脂肪肝病、SBS、高脂血、帕金森氏病或心血管疾病、或本文中描述的其它疾病。所述工程化多肽可以包含毒蜥外泌肽或其片段或類似物。因此，所述工程化多肽可以具有以下一種結(jié)構(gòu)：HD1-ABD或HD1-L1-ABD。在一些實施方案中，所述毒蜥外泌肽為毒蜥外泌肽-4。在一些實施方案中，所述毒蜥外泌肽片段是毒蜥外泌肽-4的片段。在一些實施方案中，所述毒蜥外泌肽類似物與毒蜥外泌肽-4具有至少70%，例如70%,75%,80%,85%,90%,95%或甚至更高的同一性。特別可用于這些疾病的是本文中描述的化合物，其具有降低葡萄糖的活性(例如連接于ABD的毒蜥外泌肽-4或其片段或類似物)、具有減輕體重或降低食物攝取的活性、降低HbA1c、延遲胃排空、降低血漿胰高血糖素和/或腸能動性的益處?？梢杂杀疚闹忻枋龅幕衔锖头椒ㄖ委煹钠渌膊『筒“Y包括類固醇誘發(fā)的糖尿病、HIV治療誘發(fā)的糖尿病、成人中潛伏的自身免疫性糖尿病(LADA)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、無知覺性低血糖癥(HU)、限制性肺病包括結(jié)節(jié)病、和代謝綜合征X。所述工程化多肽可以包含毒蜥外泌肽或其片段或類似物。因此，所述工程化多肽可以具有以下一種結(jié)構(gòu)：HD1-ABD或HD1-L1-ABD。在一些實施方案中，所述毒蜥外泌肽是毒蜥外泌肽-4。在一些實施方案中，所述毒蜥外泌肽片段是毒蜥外泌肽-4的片段。在一些實施方案中，所述毒蜥外泌肽類似物與毒蜥外泌肽-4具有至少70%，例如70%,75%,80%,85%,90%,95%或甚至更高的同一性。特別可用于這些疾病的是本文中描述的化合物，其具有降低葡萄糖的活性(例如連接于ABD的毒蜥外泌肽-4或其片段或類似物)、具有減輕體重或降低食物攝取的活性、延遲胃排空、降低HbA1c、降低血漿胰高血糖素和/或腸能動性的益處。所述工程化多肽可以僅包含毒蜥外泌肽或其類似物或片段作為激素域。所述疾病或病癥可以是糖尿病、超重、肥胖癥、血脂障礙、阿耳茨海默氏病、脂肪肝病、高脂血、帕金森氏病或心血管疾病、或本文中描述的其它疾病?？梢杂杀疚闹忻枋龅幕衔锖头椒ㄖ委煹钠渌膊『筒“Y包括類固醇誘發(fā)的糖尿病、HIV治療誘發(fā)的糖尿病、成人中潛伏的自身免疫性糖尿病(LADA)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、無知覺性低血糖癥(HU)、限制性肺病包括結(jié)節(jié)病、和代謝綜合征X。特別可用于這些疾病的是本文中描述的化合物，其具有降低葡萄糖的活性(例如連接于ABD的毒蜥外泌肽-4或其片段或類似物)。V.測定法用于生成和測定本文中描述的工程化多肽的方法一般是技術(shù)人員可獲的。此外，具體的方法記載于本文以及本文引用的專利公開內(nèi)容和其它引用內(nèi)容中，其通過提述并入以用于此另外目的。GLP-1受體結(jié)合和功能測定法：可以以任何數(shù)目的已知方法來測量GLP-1受體結(jié)合活性。例如，在一種方法中，使用結(jié)合置換測定法來測量結(jié)合活性，其中受體來源是RINm5F細胞膜，且配體是[125I]GLP-1或碘化的毒蜥外泌肽(1-39)或碘化的毒蜥外泌肽(9-39)。將均質(zhì)化的RINm5F細胞膜在20mMHEPES緩沖液中與40,000cpm[125I]GLP-1(或毒蜥外泌肽)示蹤劑、以及各種濃度的測試化合物于23°C溫育2小時，并不斷混合。將反應(yīng)混合物經(jīng)由用0.3%PEI溶液預浸泡的玻璃濾器墊過濾，并用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水漂洗。使用閃爍計數(shù)器測定所結(jié)合計數(shù)。使用GraphPad軟件(GraphPadSoftware,Inc.,SanDiego,CA)來計算結(jié)合親和力?？梢允褂靡阎姆椒ê图毎徒M織來實施功能性GLP-1受體活化的體外測定法。例如，對具有GLP-1受體的細胞的毒蜥外泌肽-4刺激可以誘導腺苷酸環(huán)化酶活化、cAMP合成、膜去極化中的增加、胞內(nèi)鈣升高和葡萄糖誘導的胰島素分泌中的增加。參見例如Holz等,1995,J.Biol.Chem.270(30):17749-57。可以使用利用了rMTC6-23(克隆6)細胞系的基于細胞的測定法，基于生成的cAMP來測定化合物的GLP-1受體激動劑活性。在該生物測定法的一個實施方案中，化合物的GLP-1受體激動劑活性通過與用6-23(克隆6)細胞的基于細胞的測定法中cAMP生成的相關(guān)性來定量測定。該基于細胞的測定法使用活的6-23(克隆6)細胞。所述6-23(克隆6)細胞可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心作為No.CRL-1607TM和從歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心作為ECACCNo.87042206獲得。在另一個實施方案中，所述基于細胞的測定法是均相時間分辨(homogeneoustime-resolved)熒光測定法()。試劑盒是從CisbioInternational(Bedford,Mass.)商業(yè)可獲的。使用試劑盒的方法是本領(lǐng)域中已知的且該試劑盒一般包含指導手冊，例如關(guān)于如何準備樣品、標準物、校正曲線并進行實驗。基于細胞的均相時間分辨熒光測定法記載于美國專利No.5,527,684(其公開內(nèi)容通過提述并入本文中)和可從CisbioProductCenter獲得的文件訪問No.62AM4PEBrev02(2007年8月)。參見www.htrf.com/products/gper/camp/，其公開內(nèi)容通過提述并入本文中。在一種優(yōu)選的方法中，生物測定法在使用了cAMPdynamic21,000測定試劑盒(可從Cisbio以目錄No.62AM4PEB獲得)的基于細胞的測定法中使用了大鼠甲狀腺癌6-23(克隆6)細胞。按照試劑盒中的說明書來準備標準物和校正?？梢栽谟谢驔]有清蛋白的情況下實施測定法?？梢允褂靡阎椒▉磉M行針對活性和作用持續(xù)時間以及藥動學的體內(nèi)測定法。例如，可以使用口服葡萄糖耐受測試(OGTT)來實施持續(xù)時間，其在口服施用葡萄糖之前的期望的時間點上對受試者施用藥物(以測量藥物作用持續(xù)時間；OGTTDOA)，并測量葡萄糖血液水平(例如在小鼠中容易地進行)。還可以使用靜脈內(nèi)葡萄糖耐受測試(IVGTT)來測量活性和持續(xù)時間，其中在IV施用葡萄糖之前的期望的時間點上對受試者施用藥物(IVGTTDOA)，并測量血糖水平(例如可以在大鼠中容易地進行)。優(yōu)選的工程化化合物在單次藥物劑量施用后在血糖上具有的期望效果為至少24小時持續(xù)時間，優(yōu)選地，在單劑藥物后為至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、和至少1周的持續(xù)時間。例如，在緊接基線樣品后t=0時，將測試多肽皮下注射到NIH/Swiss雌性小鼠中。在期望的時間段，如第1天內(nèi)的t=2、4和8小時取血液樣品，然后每天如此直至第5天或直至第7天或更長。用(LifeScan,Inc.,aJohnson&JohnsonCompany,Milpitas,CA)測量血糖。對于活性持續(xù)時間(DOA)的測定，如對于藥物的葡萄糖控制活性，可以在藥物施用后的期望點上實施OGTT或IVGTT。還可以測量體重、以及食物攝取、或其它藥理學或藥動學參數(shù)。例如，使雌性NIH/Swiss小鼠(8-20周齡)分組居住，有12:12小時的光照:黑暗周期，于0600開燈。除非如記載的，水和標準的球形小鼠食品飲食是隨意可用的。在實驗當天早上，將動物分為實驗組并在約0630小時時開始禁食。在典型研究中，n=2籠，有3只小鼠/籠。在時間=0分鐘時，取血糖樣品，緊接著立即將媒介物或化合物以范圍從約1nmol/kg至25nmol/kg的量腹膜內(nèi)注射?？梢栽趩蝿┖笥?0,60,120,180和240分鐘時測量血糖并每日如此達1周或更長。在該實驗的變體中，在更長的時段如14或28天內(nèi)每日一次或甚至每周一次地提供劑量。通過將在測量的時間點例如60分鐘或1天時的血糖除以時間=0分鐘時的血糖來計算百分比(%)治療前。通過ANOVA來鑒定顯著的處理效果(p<0.05)。當存在顯著差異時，使用鄧奈特氏檢驗(v.4.01,GraphPadSoftwareInc.,SanDiego,CA)將測試均值與對照均值進行比較。可以用(LifeScan,Inc.,aJohnson&JohnsonCompany,Milpitas,CA)測量血糖。*對媒介物對照的p<0.05；ANOVA，鄧奈特氏檢驗。還可以測量其它參數(shù)。針對食物攝取抑制的體內(nèi)測定法：對于工程化多肽，可以以各種已知的方法來測試其持續(xù)時間和食欲抑制程度以及其在體重降低上的持續(xù)時間和影響程度。例如，可以測試所述多肽在小鼠食物攝取測定法中的食欲抑制以及其在飲食誘發(fā)的肥胖(DIO)小鼠的體重增加上的影響。下文描述了這類測定法的實驗方案。例如，使雌性NIH/Swiss小鼠(8-24周齡)成組居住，有12:12小時光照：黑暗周期，并在0600開燈。除非如記載的，水和標準的球形小鼠食品飲食是隨意可用的。動物禁食開始于實驗前一天，約1500小時時。在實驗當天早上，將動物分為實驗組。在典型的研究中，為n=4籠，有3只小鼠/籠。在時間=0分鐘，對所有動物進行媒介物或測試化合物的腹膜內(nèi)注射，通常以范圍從約2nmol/kg至75nmol/kg的量，并立即給予預先稱重的標準食品量(10-15g)。在各時間，通常為30,60,和120分鐘或更長時取出食物并稱重(如每日地)以測定消耗的食物的量(Morley,Flood等,1994,Am.J.Physiol.267:R178-R184)。通過從最初在時間=0時提供的食物重量減去在例如30或60分鐘時間點時剩余的食物的重量來計算食物攝取。顯著的治療效果由ANOVA鑒定(p<0.05)。在存在顯著差異的情況下，使用鄧奈特氏檢驗(Prismv.2.01,GraphPadSoftwareInc.,SanDiego,Calif.)將測試均值與對照均值進行比較。還可以測量體重。體重、脂肪重分配、和瘦體重測定法：還可以如下實施對體重和相關(guān)影響的測定法。在Sprague-Dawley大鼠中的飲食誘發(fā)的肥胖癥(DIO)是研究肥胖和能量內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的一種有價值的模型。這些大鼠是從一種(SD)BR)大鼠系產(chǎn)生的，該大鼠系在有相對高的脂肪和能量的飲食時傾向于變得肥胖。參見例如，Levin,1994,Am.J.Physiol.267:R527-R535,Levin等,1997,Am.J.Physiol.273:R725-R730。DIO雄性大鼠從CharlesRiverLaboratories,Inc.(Wilmington,MA)獲得。使大鼠在鞋盒狀籠中于22°C、以12/12小時光照黑暗周期分開居住。以中度高脂肪飲食隨意維持大鼠(32%kcal來自脂肪；ResearchDietsD1226B)。這些動物通常達到約500g的均值體重。使LevinDIO大鼠在7天時適應(yīng)于籠居環(huán)境。在適應(yīng)的3晚期間，動物接受媒介物的單次腹膜內(nèi)(IP)注射。在測試日黑暗周期開始時，對大鼠施用化合物或媒介物(例如10%DMSO)的單次IP注射。貫穿研究的整個過程中，通過自動化食物攝取測量系統(tǒng)(BioDAQ,ResearchDiets)以5秒時間間隔來測量食物攝取。每晚記錄體重。在藥物處理之前或之后可以使用NMR(EchoMedicalSystems,Houston,TX)來測量身體組成。對于身體組成的測量，將大鼠短暫置于(～1分鐘)通風良好的樹脂玻璃管中，然后將其插入到專門的嚙齒動物NMR機器中。這使得能夠計算出脂肪和干的瘦組織的實際克數(shù)的變化(例如處理后身體脂肪的克數(shù)-基線處的身體脂肪的克數(shù)=身體脂肪克數(shù)的變化)和脂肪和干的瘦組織的%身體組成中的變化(例如%處理后身體脂肪-%基線處身體脂肪=%身體脂肪中的變化)。所有數(shù)據(jù)都呈現(xiàn)為均值±SEM。將方差分析(ANOVA)和事后檢驗用于檢驗組差異。P值<0.05視為顯著的。使用針對Windows的4(GraphPadSoftware,Inc.,SanDiego,CA)來實施統(tǒng)計學分析和繪圖。圖和結(jié)果通常呈現(xiàn)為百分比體重、身體脂肪中的經(jīng)媒介物校正的變化和身體蛋白質(zhì)中的變化。VI.藥物組合物在一個方面，提供了包含與藥學可接受賦形劑(例如載體)組合的本文中描述的化合物的藥物組合物。如本文中使用的，術(shù)語“藥學可接受載體”指藥用賦形劑，例如適合于腸或胃腸外應(yīng)用的藥學、生理學可接受的有機或無機載體物質(zhì)，其不與活性劑有害地起反應(yīng)。合適的藥學可接受載體包括水、鹽溶液(例如林格(Ringer)氏溶液等)、醇、油、明膠、和碳水化合物如乳糖、直鏈淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、和聚乙烯吡咯烷?？梢詫⑦@類制劑滅菌，并且在期望時與不與本發(fā)明的化合物有害地起反應(yīng)的輔助劑如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖劑、染料、和/或芳香物質(zhì)等混合。在另一個方面，提供了藥物組合物，其包含了如本文中描述的工程化多肽與藥學可接受賦形劑的組合。在一個實施方案中，所述藥物組合物是口服藥物組合物，如本文中描述的。在一些實施方案中，所述藥物組合物是長效藥物組合物。術(shù)語“長效”在藥物組合物施用的背景中指作用持續(xù)時間。因此，可以以例如1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1個月或甚至更長的時間間隔施用長效藥物組合物。在一個實施方案中，施用為每日兩次的。在一個優(yōu)選的實施方案中，施用為每日一次的。在一個更優(yōu)選的實施方案中，施用為每周一次的。在一些實施方案中，所述工程化多肽選自本文中表2、3A和3B中列出的工程化多肽。在一些實施方案中，所述工程化多肽選自本文中表2和3A中列出的工程化多肽。在一些實施方案中，所述工程化多肽選自本文中表2中列出的工程化多肽。A.配制劑可以對受試者單獨地或者可以共施用本文中描述的工程化多肽。共施用意為包括單獨或組合地(超過一種化合物)同時或序貫施用化合物。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了可以用包括瘦蛋白(例如美曲普汀)和胰淀素(例如普蘭林肽(pramlintide))的聯(lián)合療法有益地治療肥胖癥。參見例如美國公開的申請No.2008/0207512。因此，本文中描述的、包含ABD和毒蜥外泌肽化合物的、可用于治療例如肥胖癥和超重的工程化多肽可以單獨施用以實現(xiàn)這類治療，或者與瘦蛋白或瘦蛋白激動劑(例如美曲普汀)和/或胰淀素或胰淀素激動劑(例如普蘭林肽)共施用。在一些實施方案中，本文中描述的配制劑和方法還提供了將毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽類似物或毒蜥外泌肽類似物激動劑工程化多肽與一種或多種抗糖尿病劑共施用，所述抗糖尿病劑如抗高血糖劑，例如胰島素(包括常規(guī)的、短效的、長效的和基礎(chǔ)胰島素)、胰淀素、普蘭林肽、二甲雙胍和噻唑烷二酮類(thiazolidinediones)(包括羅西格列酮(rosiglitazone)和吡格列酮(pioglitazone))。在一些實施方案中，本文中描述的配制劑和方法進一步提供了與一種或多種膽固醇和/或甘油三酯降低劑共施用毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽類似物或毒蜥外泌肽類似物激動劑工程化多肽。例示性藥劑包括HMGCoA還原酶抑制劑(例如阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)、羅蘇伐他汀(rosuvastatin)、辛伐他汀(simvastatin))；膽汁螯合劑(例如考來維侖(colesevelam)、考來烯胺(cholestyramine)、考來替泊(colestipol))；貝特類(fibrates)(例如非諾貝特(fenofibrate)、氯貝丁酯(clofibrate)、吉非貝齊(gemfibrozil))；依澤替米貝(ezetimibe)、煙堿酸、普羅布考(probucol)、洛伐他汀/煙酸(niacin)組合；阿托伐他汀/氨氯地平(amlodipine)組合；和辛伐他汀/依澤替米貝組合。本披露提供了用作藥物(即在療法中使用)的組合物，因為所述毒蜥外泌肽化合物是有治療活性的化合物，并且令人驚訝地在融合至ABD時保留活性。本文中還具體地涵蓋并例示了包含工程化多肽(液體或干劑形式)和任選地至少一種藥學可接受載體和/或賦形劑的組合物。所述組合物能夠在體內(nèi)或體外結(jié)合清蛋白。在某些情況下，在活的生物體以外形成組合物與清蛋白的復合物，即向組合物加入外源性清蛋白可能是有益的。這類組合物可以是凍干的，只要制劑適合在環(huán)境溫度儲存。由此，本披露還提供了如上文限定的組合物，其進一步包含清蛋白如人血清白蛋白，且其任選地處于干劑形式。可以通過分開施用毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽激動劑、或毒蜥外泌肽類似物激動劑工程化多肽和第二藥劑，或通過施用包含毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽激動劑、或毒蜥外泌肽類似物激動劑工程化多肽和第二藥劑的單一的藥物制劑來實現(xiàn)共施用。第二藥劑的合適的劑量方案一般是本領(lǐng)域中已知的。在期望時，所述制備物還可以與如本領(lǐng)域中已知的其它活性物質(zhì)(例如以減低代謝性降解)或其它治療活性劑共施用?？梢詫⒈疚闹忻枋龅亩掘嵬饷陔墓こ袒嚯呐c其它活性抗糖尿病劑或抗肥胖劑(如瘦蛋白或瘦蛋白激動劑和胰淀素或胰淀素激動劑化合物，例如包括達瓦林肽(davalintide)及其類似物的胰淀素)一起施用。胰淀素。胰淀素是由胰腺β細胞合成的肽激素，其響應(yīng)營養(yǎng)物攝取而與胰島素共分泌。胰淀素的序列在哺乳動物物種間高度保守，其與降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、降鈣素、垂體中間葉激素、和腎上腺髓質(zhì)素具有結(jié)構(gòu)相似性，如本領(lǐng)域中已知的。胰淀素的葡萄糖調(diào)節(jié)作用補充胰島素的葡萄糖調(diào)節(jié)作用，其通過經(jīng)由抑制營養(yǎng)物刺激的胰高血糖素分泌調(diào)節(jié)循環(huán)中葡萄糖出現(xiàn)的速率，并減緩胃排空來實現(xiàn)。在用胰島素治療的糖尿病患者中，普蘭林肽(人胰淀素的一種合成的且等效的類似物)通過抑制不適當?shù)厣叩牟秃笠雀哐撬胤置诓⒀泳徫概趴諄斫档筒秃笃咸烟瞧?excursion)。大鼠胰淀素、人胰淀素和普蘭林肽的序列如下：KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQIDNO:6);KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY(SEQIDNO:7);KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQIDNO:8)。達瓦林肽。達瓦林肽，也稱為“AC-2307”，是一種可用于治療多種疾病適應(yīng)癥的有力的胰淀素激動劑。參見WO2006/083254和WO2007/114838，每篇通過提述完整并入本文中并用于所有目的。達瓦林肽是一種嵌合肽，其具有胰淀素或降鈣素及其類似物的N端環(huán)區(qū)、降鈣素或其類似物的α-螺旋區(qū)的至少一部分的α-螺旋區(qū)或具有胰淀素α-螺旋區(qū)和降鈣素α-螺旋區(qū)或其類似物的一部分的α-螺旋區(qū)、和胰淀素或降鈣素的C端尾部區(qū)。人降鈣素、鮭魚降鈣素和達瓦林肽的序列如下：CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP(SEQIDNO:9);CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP(SEQIDNO:10);KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY(SEQIDNO:11)。不希望受任何理論束縛，認為胰淀素和達瓦林肽及其片段和類似物可要求C端酰胺化來引發(fā)完全的生物學應(yīng)答。理解的是，可以在C端酰胺化胰淀素化合物，如本文中描述的那些胰淀素化合物，其包括胰淀素和/或達瓦林肽及其片段和類似物?！耙鹊硭丶觿┗衔铩卑ㄌ烊坏囊鹊硭仉?、胰淀素類似物肽、和其它具有胰淀素激動劑活性的化合物(例如小分子)?！耙鹊硭丶觿┗衔铩笨梢宰蕴烊粊碓囱苌梢允呛铣傻?，或可以自重組DNA技術(shù)衍生。胰淀素激動劑化合物具有胰淀素激動劑受體結(jié)合活性，并且可以包含氨基酸(例如天然的、非天然的或其組合)，肽模擬物，化學模塊等。使用胰淀素受體結(jié)合測定法或通過在比目魚肌測定法中測量胰淀素激動劑活性，熟練技術(shù)人員會識別胰淀素激動劑化合物。在一個實施方案中，胰淀素激動劑化合物在胰淀素受體結(jié)合測定法中會具有約200nM或更低、約100nM或更低、或約50nM或更低的IC50，所述胰淀素受體結(jié)合測定法諸如在本文、美國專利No.5,686,411、和美國公開文本No.2008/0176804(其公開內(nèi)容通過提述完整并入本文并用于所有目的)中描述的胰淀素受體結(jié)合測定法。在一個實施方案中，胰淀素激動劑化合物在比目魚肌測定法(如在本文中和美國專利No.5,686,411中記載的)中會具有約20nM或更低、約15nM或更低、約10nM或更低、或約5nM或更低的EC50。在一個實施方案中，胰淀素激動劑化合物與25,28,29Pro-人胰淀素具有至少90%或100%序列同一性。在一個實施方案中，胰淀素激動劑化合物是胰淀素(例如人胰淀素、大鼠胰淀素等)和降鈣素(例如人降鈣素、鮭魚降鈣素等)的肽嵌合物。合適的且例示性的胰淀素激動劑化合物還記載于美國公開文本No.2008/0274952中，其公開內(nèi)容通過提述完整并入本文并用于所有目的。當與另一種活性劑共施用時，可以同時或連續(xù)地施用一起或分開配制的化合物。由于本文中的工程化化合物固有就是長效的，因此它們適用于每日一次、每周或更長時間一次的施用。因此，在例如以每周一次施用毒蜥外泌肽工程化多肽劑量期間，另一種藥劑可以按需要的以1劑或多劑施用，例如每日一次、每日兩次、每周一次。已經(jīng)報告了其它藥劑如胰淀素化合物的單次或多次使用制劑。例如，已經(jīng)配制并成功施用了以每日一次、兩次和三次給藥來治療糖尿病和肥胖癥的普蘭林肽。這些藥用化合物可以與藥學可接受載體或稀釋劑以及任何其它已知的佐劑和賦形劑一起配制，其依照常規(guī)技術(shù)如那些披露于E.W.Martin的Remington'sPharmaceuticalSciences中的常規(guī)技術(shù)進行。亦參見Wang等(1988)J.ofParenteralSci.andTech.,TechnicalReportNo.10,Supp.42:2S。一般而言，可以將工程化多肽配制成穩(wěn)定的、安全的藥物組合物以對患者施用。涵蓋在本發(fā)明方法中使用的藥物配制劑可以包含約0.01至1.0%（w/v)，在某些情況下0.05至1.0%的工程化多肽、約0.02至0.5%(w/v)的乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽或谷氨酸鹽緩沖物(其允許最終組合物的pH為約3.0至約7.0)；約1.0至10%(w/v)的碳水化合物或多元醇張力調(diào)節(jié)劑，以及任選地，約0.005至1.0%(w/v)的選自下組的防腐劑：間甲酚、苯甲醇、對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯以及酚。如果配制的肽要包含在多次使用產(chǎn)品中，那么一般包含這類防腐劑。在一個具體的實施方案中，本工程化多肽的藥用配制劑可以含有一定濃度范圍的化合物，例如在這些實施方案中在約0.01%至約98%w/w之間、或在約1至約98%w/w之間、或優(yōu)選地在80%-90%w/w之間、或優(yōu)選地在約0.01%至約50%w/w之間、或更優(yōu)選地在約10%至約25%w/w之間。可以使用足量的注射用水來獲得期望的溶液濃度。若期望的話，也可以存在其它張力調(diào)節(jié)劑如氯化鈉以及其它已知的賦形劑。在一些情況下，這類賦形劑可用于維持化合物的總體張力?？梢砸愿鞣N濃度將賦形劑包含在目前描述的配制劑中。例如，可以以下列濃度范圍包含賦形劑：約0.02%至約20%w/w，優(yōu)選地約0.02%和0.5%w/w之間，約0.02%至約10%w/v，或約1%至約20%w/w。另外，與目前制劑自身類似，可以以固態(tài)(包括粉末的)、液態(tài)、半固態(tài)或凝膠形式包含賦形劑。藥用配制劑可以以各種形式，例如固體、液體、半固體或液體構(gòu)成。如本文中使用的，術(shù)語“固體”意指涵蓋此術(shù)語的所有正常使用，例如，粉末或凍干配制劑。目前描述的配制劑可以是凍干的。術(shù)語緩沖劑、緩沖溶液和緩沖的溶液在提及氫離子濃度或pH使用時，指系統(tǒng)(特別是水性溶液)在添加酸或堿后、或用溶劑稀釋后對抗pH變化的能力。緩沖溶液(其在添加酸或堿時經(jīng)歷較小的pH變化)的特征在于，存在弱酸和該弱酸的鹽、或弱堿或該弱堿的鹽。前一種系統(tǒng)的一個例子是醋酸和醋酸鈉。只要添加的水合氫離子和氫氧根離子的量不超過緩沖系統(tǒng)將其中和的能力，pH的變化就是略微的。如本文中描述的，多種液體媒介物適合用于工程化多肽的配制劑，例如水或水性/有機溶劑混合物或懸浮液。通過將配制劑的pH維持在通過本領(lǐng)域中已知的方法確定的范圍中來增強如本文中描述的那樣使用的工程化多肽配制劑的穩(wěn)定性。在某些實施方案中，將配制劑的pH維持在約3.5至5.0或約3.5至6.5，在一些實施方案中約3.7至4.3或約3.8至4.2的范圍中。在一些實施方案中，pH可以為約4.0、約5.0、約6.0、約7.0、約8.0、約9.0或甚至更高。在一些實施方案中，pH可以在生理學范圍pH6-8，優(yōu)選地pH7-7.6中。在某些實施方案中，具有工程化多肽的緩沖液是醋酸鹽緩沖液(優(yōu)選地，最終配制劑濃度為約1-5至約60mM)、磷酸鹽緩沖液(優(yōu)選地，最終配制劑濃度為約1-5至約30mM)或谷氨酸鹽緩沖液(優(yōu)選地，最終配制劑濃度為約1-5至約60mM)。在一些實施方案中，緩沖劑是醋酸鹽(優(yōu)選地，最終配制劑濃度為約5至約30mM)。配制劑中可以包含穩(wěn)定劑，但是并非是必要需要的。然而，如果包含的話，可用在本發(fā)明的實踐中的穩(wěn)定劑是碳水化合物或多元醇?？捎迷诒景l(fā)明實踐中的合適穩(wěn)定劑是約1.0至10%(w/v)碳水化合物或多元醇。多元醇和碳水化合物在其主鏈中具有相同特征，即-CHOH-CHOH-，其負責穩(wěn)定化蛋白質(zhì)。多元醇包括諸如山梨糖醇、甘露醇、甘油和聚乙二醇(PEG)等化合物。這些化合物是直鏈分子。在另一方面，碳水化合物如甘露糖、核糖、蔗糖、果糖、海藻糖、麥芽糖、肌醇和乳糖是可以含有酮或醛基團的環(huán)狀分子。已經(jīng)證明了這兩類化合物在使蛋白質(zhì)穩(wěn)定化免于通過升高的溫度及通過冷凍-融化或冷凍-干燥過程引起的變性中是有效的。合適的碳水化合物包括：半乳糖、阿拉伯糖、乳糖或?qū)μ悄虿』颊邲]有不利影響的任何其它碳水化合物，即該碳水化合物沒有代謝為在血液中形成大得不可接受的濃度的葡萄糖。適合于糖尿病的這類碳水化合物是本領(lǐng)域中公知的。蔗糖和果糖適合于在非糖尿病應(yīng)用(例如治療肥胖癥)中與化合物一起使用。在某些實施方案中，如果包含穩(wěn)定劑，那么用多元醇如山梨糖醇、甘露醇、肌醇、甘油、木糖醇和聚丙二醇/聚乙二醇共聚物以及具有分子量200,400,1450,3350,4000,6000,8000和甚至更高的各種聚乙二醇(PEG)使化合物穩(wěn)定化。在一些實施方案中，甘露醇是優(yōu)選的多元醇。本發(fā)明的凍干配制劑的另一個有用的特征在于，用用來維持其穩(wěn)定性的相同配制劑組分維持本文中描述的凍干配制劑的張力。在一些實施方案中，甘露醇是優(yōu)選的用于此目的的多元醇。美國藥典(USP)宣稱必須向包含在多劑量容器中的制劑添加抑制細菌或抑制真菌濃度的抗微生物劑。它們在使用時必須以足夠的濃度存在，從而阻止在用皮下針和注射器、或使用其它侵入性投遞手段(如筆型注射器)取出內(nèi)容物的部分時疏忽引入到制劑中的微生物的增殖。必須評估抗微生物劑以確保與配方的所有其它組分的相容性，并且應(yīng)當在總配方中評估其活性以確保在一種配制劑中有效的特定藥劑在另一種中不是無效的。不罕見的是，發(fā)現(xiàn)一種特定的抗微生物劑在一種配制劑中會是有效的，但是在另一種配制劑中不是有效的。防腐劑在常見的藥學意義中是阻止或抑制微生物生長并且可以為此目的添加到藥物配制劑以避免隨之發(fā)生微生物對配制劑的酸敗的物質(zhì)。盡管防腐劑的量不大，不過其可以影響肽的總體穩(wěn)定性。盡管用在藥物組合物中的防腐劑可以在0.005至1.0%(w/v)的范圍內(nèi)，在一些實施方案中單獨的或與其它防腐劑組合的每種防腐劑的范圍為：苯甲醇(0.1-1.0%)、或間甲酚(0.1-0.6%)、或酚(0.1-0.8%)或?qū)αu基苯甲酸甲酯(0.05-0.25%)和乙酯或丙酯或丁酯(0.005%-0.03%)的組合。羥基苯甲酸酯類是對羥基苯甲酸的低級烷基酯。在Remington'sPharmaceuticalSciences(同上)中列出了每種防腐劑的詳細描述。當處于液體形式時，工程化多肽可能沒有吸附到玻璃容器中的玻璃上的趨勢，因此可能不需要表面活性劑來進一步穩(wěn)定化藥物配制劑。然而，對于處于液體形式時確實具有這類趨勢的化合物，應(yīng)當在其配制劑中使用表面活性劑。然后，可以將這些配制劑凍干。表面活性劑經(jīng)常因疏水性破壞及通過鹽橋分離兩者而引起蛋白質(zhì)的變性。相對低濃度的表面活性劑可以施加有力的變性活性，這是由于表面活性劑模塊與蛋白質(zhì)上反應(yīng)性位點之間的強相互作用。然而，對此相互作用的審慎使用能使蛋白質(zhì)穩(wěn)定化而免于界面或表面變性。任選地，能進一步穩(wěn)定化工程化多肽的表面活性劑可以以占總配制劑的約0.001至0.3%(w/v)的范圍存在，且包括聚山梨酯80(即聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯)、(即3-[(3-膽氨丙基)二甲基銨基]1-丙烷磺酸鹽)、(例如35，其為(聚氧乙烯(23)月桂醚)、泊洛沙姆(poloxamer)、或另一種非離子型表面活性劑。還可以期望添加氯化鈉或其它鹽以調(diào)節(jié)藥物配制劑的張力，這取決于選擇的張力調(diào)節(jié)劑。然而，這是任選的，并且取決于選擇的具體配制劑。優(yōu)選地，胃腸外配制劑可以是等張的或?qū)嵸|(zhì)性等張的。優(yōu)選的用于胃腸外產(chǎn)品的媒介物是水?？梢酝ㄟ^蒸餾或反滲透來制備具有適合胃腸外施用的質(zhì)量的水。注射用水是優(yōu)選用在藥物配制劑中的水性媒介物。有可能的是，其它成分可以存在于藥物配制劑中。這類其它成分可以包括例如濕潤劑、乳化劑、油、抗氧劑、膨脹劑、張力修飾劑、螯合劑、金屬離子、油質(zhì)媒介物、蛋白質(zhì)(例如人血清清蛋白、明膠或蛋白質(zhì))和兩性離子(例如氨基酸如甜菜堿、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、賴氨酸和組氨酸)。另外，聚合物溶液或與聚合物的混合物提供肽受控釋放的機會。當然，這類其它成分不應(yīng)當不利地影響本發(fā)明的藥物配制劑的總體穩(wěn)定性。容器也是注射配制劑的組成部分，并且可以視為組件，因為沒有完全惰性或不以某種方式影響其含有的液體的容器，特別若液體是水性的話。因此，具體注射液的容器選擇必須基于容器以及溶液組成、和其會進行的處理的考慮。如果必要的話，也可以通過使用硼硅酸鹽玻璃，例如WheatonI型硼硅酸鹽玻璃#33(WheatonI型-33)或其等同物(WheatonGlassCo.)使肽對小瓶玻璃表面的吸附最小化。對于制造可接受的類似硼硅酸鹽玻璃小瓶和藥筒(cartridge)的其它供應(yīng)商包括KimbelGlassCo.,WestCo.,BunderGlasGMBH和FormaVitrum?？梢酝ㄟ^在存在5%甘露醇和0.02%Tween80的情況下在WheatonI型-33硼硅酸鹽血清小瓶中配制并凍干至化合物終濃度為0.1mg/ml和10mg/ml使化合物的生物學和化學特性穩(wěn)定化。對于要通過注射投遞的配制劑，為了允許將針從皮下注射器導入多劑量小瓶中并在取出針時就提供再密封，優(yōu)選地，將每個小瓶的開口端用由鋁帶適當固定的橡皮塞閉合物密封?？梢詫⒉Ａ∑康娜尤鏦est4416/50,4416/50(以特氟綸(Teflon)為表面)和4406/40、Abbott5139或任何等同的塞子用作注射用藥物的閉合物。對于包含肽性抗肥胖癥藥劑的配制劑，這些塞子與肽以及配制劑其它組分是相容的。發(fā)明人還已發(fā)現(xiàn)，這些塞子在使用患者使用模式測試時通過了塞子完整性測試，例如塞子可以經(jīng)受至少100次注射。或者，可以將肽凍干入小瓶、注射器或藥筒中以用于隨后的重建?？梢詫⒈景l(fā)明的液體配制劑填充到1或2室的藥筒、或1或2室的注射器中。上文所描述的藥物配制劑的每種組分是本領(lǐng)域中已知的，且記載于PHARMACEUTICALDOSAGEFORMS:PARENTERALMEDICATIONS,第1卷,第2版,Avis等編,MercelDekker,NewYork,N.Y.1992，其通過提述完整并入本文。上述液體配制劑的制造過程一般牽涉混合、無菌過濾和填充步驟?；旌弦?guī)程牽涉以特定次序(防腐劑，接著是穩(wěn)定劑/張力劑、緩沖劑和肽)溶解成分或同時溶解。備選的配制劑(例如非胃腸外)可以不需要滅菌。然而，如果滅菌是期望或必需的話，可以在開發(fā)本發(fā)明的肽藥物配制劑中使用任何合適的滅菌方法。典型的滅菌方法包括過濾、蒸汽(濕熱)、干熱、氣體(例如環(huán)氧乙烷、甲醛、二氧化氯、環(huán)氧丙烷、β-丙內(nèi)酯(propiolactone)、臭氧、三氯硝基甲烷(chloropicrin)、過氧乙酸甲基溴等)、暴露于輻射源、和無菌操作。過濾是本發(fā)明液體配制劑滅菌的優(yōu)選方法。無菌過濾牽涉過濾通過0.45um和0.22um(1或2)，其可以串聯(lián)連接。過濾后，將溶液填充到合適的小瓶或容器中。在某些實施方案中，將本文中描述的工程化多肽對受試者外部施用。在一些實施方案中，本發(fā)明的液體藥物配制劑意圖用于胃腸外施用。合適的施用途徑包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)等等。在一些實施方案中，皮下施用途徑是優(yōu)選的。在某些實施方案中，粘膜投遞也是優(yōu)選的。這些途徑包括但不限于口服、鼻、舌下、肺部和含服途徑，其可以包括液體、半固體或固體形式的肽的施用。對于包含工程化多肽的配制劑，經(jīng)由這些途徑的施用可以由于與胃腸外投遞相比降低的生物利用度而需要實質(zhì)上更多的化合物來獲得期望的生物學效果。另外，可以通過形成聚合的微囊劑、基質(zhì)、溶液、植入物和裝置，并胃腸外施用它們或通過手術(shù)手段來實現(xiàn)胃腸外受控釋放投遞。受控釋放配制劑的例子記載于美國專利No.6,368,630,6,379,704,和5,766,627中，其通過提述并入本文。這些劑量形式由于有些肽在聚合物基質(zhì)或裝置中包載而可以具有較低的生物利用度。參見例如美國專利No.6,379,704,6,379,703,和6,296,842，每篇通過提述完整并入本文并用于所有目的?？梢砸詣┝繂挝恍问教峁┧龌衔?，該劑量單位形式含有在一劑或多劑中會有效的工程化多肽量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會公認的，工程化多肽的有效量會隨許多因素而變化，包括受試者的年齡和重量、受試者的身體狀況、待治療的狀況、和本領(lǐng)域中已知的其它因素。工程化多肽的有效量還會隨施用的具體組合而變化。如本文中描述的，聯(lián)合施用工程化多肽可以允許任何施用的工程化多肽的降低量成為有效量。施用可以通過口服途徑，包括跨細胞、旁細胞或受體介導的途徑。不希望受任何理論束縛的，含有如本文中描述的毒蜥外泌肽的工程化多肽是可口服利用的，部分是由于它們大小相對較小且對于腸酶相對穩(wěn)定。已經(jīng)報告了由吸收/滲透增強劑打開的腸細胞之間的緊密接口寬少于20nm。參見例如Chao等,1998,J.DrugTargeting,6:37-43。因此，如本文中描述的足夠小(例如低于10kD或15kD)的工程化多肽可以通過腸壁并結(jié)合入口系統(tǒng)中的清蛋白，由此進入循環(huán)。本發(fā)明工程化多肽的口服施用可以是每日兩次、每日一次、每隔一日一次、每三天一次、每周一次、每兩周一次、每三周一次或甚至每月一次。可以使用適合用于其它肽的口服遞送系統(tǒng)。在一個實施方案中，口服施用系統(tǒng)可以具有相對快的攝取概況，例如從1至4小時，在此情況中工程化多肽所固有的長作用持續(xù)時間可以提供延長的期望的作用持續(xù)時間，如每天一次或每周一次施用。作用持續(xù)時間可以例如通過對ABD及其對清蛋白的親和力的選擇來進行選擇。盡管不希望受任何理論束縛的，認為對清蛋白的更高的親和力會得到更長的循環(huán)時間，從而提供更長的作用持續(xù)時間?？梢允褂靡阎捏w外和體內(nèi)方法來測試口服遞送。例如，可以用含有工程化多肽(與或不與滲透/吸收增強劑和/或蛋白酶抑制劑一起配制)的溶液口服強喂小鼠，從而測試口服可用度和任何加入的賦形劑的影響。在遞送后可以隨時間測量藥效(治療效果)和藥動學(藥物特性)的任意一種或兩者，如藥物血漿水平、急性或持續(xù)的葡萄糖和/或HbA1c降低、胰島素血漿水平、食物攝取抑制或體重減輕。B.有效劑量本文中提供的藥物組合物包括如下的組合物，其中以治療有效量，即以有效實現(xiàn)其意圖目的的量含有活性成分。對具體應(yīng)用有效的實際量會取決于所治療的狀況，等等。例如，當在治療糖尿病的方法中施用時，這類組合物會含有有效實現(xiàn)期望結(jié)果(例如降低受試者中的空腹血液葡萄糖)的活性成分量。當在治療肥胖癥的方法中施用時，這類組合物會含有有效實現(xiàn)期望結(jié)果(例如降低體重)的活性成分量。施用的化合物的劑量和頻率(單劑或多劑)可以隨著多種因素而變化，包括施用途徑；接受者的體格、年齡、性別、健康、體重、體重指數(shù)、和飲食；所治療疾病癥狀的性質(zhì)和程度(例如響應(yīng)本文中描述的化合物的疾病；空腹血糖)；存在其它疾病或其它健康相關(guān)問題；同時治療的種類；和來自任何疾病或治療方案的并發(fā)癥。可以與本發(fā)明的方法和化合物聯(lián)合使用其它治療方案或藥劑?？梢詮膭游锬Ｐ椭写_定人用的治療有效量。例如，可以將人用劑量配制為達到已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在動物中有效的濃度。可以通過監(jiān)測一種或多種生理學參數(shù)，包括但不限于血液葡萄糖和體重，并將該劑量向上或向下調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)人用劑量，如上文所描述的且本領(lǐng)域中已知的。劑量可以隨患者要求和所采用的化合物而變化。在本發(fā)明的背景中，對患者施用的劑量應(yīng)當足以隨時間影響患者中的有益治療響應(yīng)。劑量大小也會通過任何不利副作用的存在、性質(zhì)和程度來確定。一般地，治療以較小的劑量啟動，該劑量小于化合物的最佳劑量。此后，將劑量增加較小的增量，直到達到各情形下的最佳效果。在本發(fā)明的一個實施方案中，劑量范圍是0.001%至10%w/v。在另一個實施方案中，劑量范圍是0.1%至5%w/v。然而，考慮到本文中工程化多肽的延長的半衰期，藥物化合物的典型劑量可以含有從下限為每天約1ug,5ug,10ug,50ug,100ug至150ug，到上限為每周約達50ug、達100ug、達150ug、達200ug或甚至達300ug?？梢砸苑珠_的單位劑量并以期望的間期，例如每日一次或每周一次地遞送劑量。可以個別調(diào)節(jié)劑量量和時間間隔以提供對所治療的特定臨床適應(yīng)癥有效的施用化合物的水平。這會提供與個體疾病狀態(tài)的嚴重性匹配的治療方案。利用本文中提供的教導，可以計劃有效的預防性或治療性處理方案，其不引起實質(zhì)性毒性，但是對于治療特定患者表明的臨床癥狀卻是完全有效的。此計劃應(yīng)當牽涉活性化合物的認真選擇，其通過考慮下列因素如化合物效力、相對生物利用度、患者體重、不利副作用的存在和嚴重性、優(yōu)選的施用模式、和所選藥劑的毒性概況來進行。本發(fā)明的工程化多肽的令人驚訝的節(jié)省劑量特性，連同其長得令人驚訝的血漿半衰期和藥理學作用持續(xù)時間，提供了優(yōu)越的藥劑。在含有毒蜥外泌肽的工程化多肽的情況中還令人驚訝地是其口服可用度。所述優(yōu)越的特性包括節(jié)省劑量，其允許更低的劑量施用，由此產(chǎn)生更少的或不那么嚴重的副作用和改善的商品成本，和/或用于每日一次或每周一次施用的更節(jié)省成本和更簡單的制劑，這是單獨的親本化合物目前所不能實現(xiàn)的。C.毒性特定化合物的毒性和治療效果之間的比率是其治療指數(shù)，并且可以表示為LD50(在50%群體中致命的化合物量)和ED50(在50%群體中有效的化合物量)之間的比率。優(yōu)選展現(xiàn)出高治療指數(shù)的化合物。從細胞培養(yǎng)測定法和/或動物研究中獲得的治療指數(shù)數(shù)據(jù)可以用于制定人用的劑量范圍。優(yōu)選地，這類化合物的劑量位于包括具有很少毒性或無毒性的ED50的血漿濃度范圍內(nèi)。劑量可以隨采用的劑量形式和利用的施用途徑而在此范圍內(nèi)變化。參見例如Fingl等，于：THEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS,第1章,第l頁,1975。確切的配制劑、施用途徑和劑量可以由各個臨床醫(yī)師根據(jù)患者狀況和使用化合物的特定方法進行選擇。不希望受任何理論束縛的，認為如本文中描述的ABD清蛋白結(jié)合域與激素域的融合可以提供降低的免疫原性，如由相對于無ABD融合的激素域的免疫應(yīng)答中的降低所鑒定出的。參見例如WO2009/016043，通過提述完整并入本文并用于所有目的。VII.實施例可用在下面實施例中的肽包括：HaPGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP；HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQIDNO:164)；HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQIDNO:165)；HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGSLKNAKEDAIAELKKAGITSDFYFNAVNKAKTVEEVNALKNEILKALP(化合物22)(SEQIDNO:168)；H(Aib)QGTFTSDYSKYLDEQAAKEFIAWLMNTYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQIDNO:171)；HSQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFIAWLMNTYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQIDNO:172)；HSQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFIAWLMNTGGGSYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQIDNO:173)；HaPGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSTGGGGSASLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(化合物14)，和[[Lys27#]HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS][LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP-GGG-#](化合物30)。如本領(lǐng)域中習慣的，小寫單字母氨基酸縮寫(例如“a”)指示D-氨基酸(例如D-Ala)。在側(cè)鏈連接的肽化合物的命名中，方括號(“[]”)指示分開的片段而交叉排線(“#”)指示連接位置。實施例1：毒蜥外泌肽類似物-ABD工程化多肽的純化方法。初始生成例示性化合物15(SEQIDNO:163)，其具有納入了如本領(lǐng)域中已知的His6(SEQIDNO:49)“標簽”的N末端延伸，序列為：MAHHHHHHVGTGSNENLYFQHGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKQGGPSKEIISTGGGGSASLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQIDNO:50)。細胞提取物制備。為了制備細胞提取物，將來自50mL細胞培養(yǎng)物的細胞團粒徹底重懸于60mL裂解緩沖液(50mMTrisHCl,150mMNaCl,pH8.0)中。使重懸的細胞以100PSI運行通過微射流儀(Microfluidics,MA)三次。將細胞提取物以16,000xg離心30分鐘以除去碎片。向細胞提取物加入EGTA(150mM儲液)至終濃度為3mM。Ni-NTA層析。將10mlNi-NTAsuperflow的50%懸浮液堆積到15mL空柱。用10mL水、50mL裂解緩沖液和20mL有3mMEGTA的裂解緩沖液(50mMTrisHCl,150mMNaCl,pH8.0,3mMEGTA)清洗該柱。將細胞提取物小心地施加到Ni-NTA柱的頂部，并收集流經(jīng)物。用30mL有EGTA的裂解緩沖液(50mMTrisHCl,150mMNaCl,pH8.0,3mMEGTA)來清洗該柱。將10mL洗脫緩沖液(25mMTrisHCl,50mMNaCl,250mM咪唑,pH8.0)施加到柱頂部，并收集洗脫級分(2mL/級分)。實施SDS-PAGE來檢查流經(jīng)物和每一級分。合并含有經(jīng)His標記的化合物的級分。TEV蛋白酶消化。將His6標記的化合物用25mMTrisHCl,50mMNaCl,pH8.0稀釋3倍。添加β-巰基乙醇(0.1%)和2%TurboTEV蛋白酶(2mg/mL,10,000單位/mg,Accelagen)，并將所得物混合并于RT溫育2小時和于4°C過夜。用Ni-NTA除去切割的His標簽和TurboTEV。將6mlNi-NTAsuperflow的50%懸浮液堆積到15mL空柱。用20mL水和20mL50mMTrisHCl,100mMNaCl,45mM咪唑,pH8.0清洗該柱。將TEV消化反應(yīng)物用50mMTrisHCl,150mMNaCl,pH8.0稀釋2倍。將稀釋的消化反應(yīng)物小心地添加到Ni-NTA柱頂部，并收集流經(jīng)物。將10mL50mMTrisHCl,100mMNaCl,45mM咪唑,pH8.0添加到柱以洗脫任何未結(jié)合的蛋白質(zhì)。收集流經(jīng)物并合并。第一大小排阻層析(SEC)。用0.2um濾器過濾Ni-NTA流經(jīng)物。用390mLPBS預平衡Superdex75HiLoad26/60柱。將過濾的流經(jīng)物用樣品泵注射到HiLoad26/60柱。用1.5CVPBS洗脫蛋白質(zhì)，并合并單體峰。第二大小排阻層析。用0.2um濾器過濾第一SEC合并物。用390mLPBS預平衡Superdex75HiLoad26/60柱。將過濾的流經(jīng)物用樣品泵注射到HiLoad26/60柱。用1.5CVPBS洗脫蛋白質(zhì)，并合并單體峰。第三大小排阻層析。用0.2um濾器過濾第二SEC合并物。用390mLPBS預平衡Superdex75HiLoad26/60柱。將過濾的流經(jīng)物用樣品泵注射到HiLoad26/60柱。用1.5CVPBS洗脫蛋白質(zhì)，并合并單體峰。用EndoTrapRed除去殘余內(nèi)毒素。第三SEC合并物仍然含有～20EU/mg內(nèi)毒素，其通過使用EndoTrapRed除去。簡言之，將0.5mL凝膠漿料活化，其通過向漿料加入1mL再生緩沖液并通過溫和晃動管約5秒來進行混合。離心并吸出上清液。將此步驟再重復兩次。加入1mL平衡緩沖液，并通過溫和晃動管約5秒來進行混合。離心并吸出上清液。將此步驟再重復兩次。將蛋白樣品(5.5mL)加入到樹脂并在RT溫育90分鐘，在溫育時伴隨著管的溫和搖動或旋轉(zhuǎn)。將所得物以1200xg離心5分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中。結(jié)果。在所采用的條件下，最終純化的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠上作為約6kD蛋白移動。LC-MS顯示分子量正確，為9827道爾頓。從50mL細胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)產(chǎn)量是3.3mg。實施例2：毒蜥外泌肽-ABD工程化多肽的活性本發(fā)明的毒蜥外泌肽-ABD工程化多肽在體外細胞活化測定法中保留了充分的毒蜥外泌肽活性。另外，當以單劑施用給哺乳動物時，工程化多肽與毒蜥外泌肽-4相比對于降血糖和體重降低提供了急劇改進的作用持續(xù)時間。令人驚訝地，在嚙齒動物模型中作用持續(xù)時間可以延伸至至少1天，甚至至少4天，和甚至至少7天或更長，這轉(zhuǎn)換到人受試者中為至少1周的作用持續(xù)時間，由此適合每日兩次、每日一次、每周三次、每周兩次或甚至每周一次的施用?？梢允褂帽磉_GLP-1受體的細胞系來測定本文中披露的化合物的功能活性。參見例如美國專利申請公開US20110097751A1，通過提述并入用于此測定方法。在本實施例中，使用內(nèi)源性表達GLP-1R的細胞來測定功能活性，并將cAMP誘導檢測為毒蜥外泌肽活性的量度。使用HTRF測定試劑盒(CisbioInternational(Bedford,Mass.))。該生物測定法在基于細胞的測定法中使用大鼠甲狀腺癌6-23(克隆6)細胞，使用cAMPdynamic21,000測定試劑盒，其可從Cisbio以目錄號62AM4PEB獲得。按照試劑盒中的說明書來準備標準物和校正。以384孔形式使用基于細胞的HTRF(CisBio)cAMP測定試劑盒進行化合物處理30分鐘后，測量cAMP的累積。相對于用10uM福斯高林(forskolin)(腺苷酸環(huán)化酶的構(gòu)成型激活因子)的細胞處理測定肽的功效，并通過使用擬合至4參數(shù)模型的非線性回歸分析的濃度-響應(yīng)曲線分析來測定肽的效力(EC50)。在下表5中提供了針對效力(EC50)的GLP-1受體功能活性(cAMP誘導)的結(jié)果，其中值被標準化至毒蜥外泌肽-4標準物。ABD域未結(jié)合或活化GLP-1受體。表5.GLP-1R功能活性實施例3：OGTTDOA活性研究了施用各種量的化合物15的肽化合物后1天在葡萄糖強飼(1.5k/kg右旋糖)前和葡萄糖強飼后30分鐘時在血糖上的影響，結(jié)果顯示于圖1A-1B?；衔?1在25nmol/kg在給藥后24小時還顯示出活性，如圖9中顯示的。以圖中指示的劑量對禁食4小時的NIH/Swiss小鼠施用藥物。豎條代表均值±sd。在t=-1日時IP注射肽。在t=0對禁食4小時的NIH/Swiss雌鼠進行葡萄糖強飼(1.5g/kg)。用(LifeScan,Inc.,aJohnson&JohnsonCompany,Milpitas,CA)測量血糖。*對媒介物對照的p<0.05；ANOVA，鄧奈特氏檢驗。此OGTTDOA指示藥物活性在其施用后至少24小時存在。在t-24小時(葡萄糖測定法前1天)給藥時，毒蜥外泌肽-4(未綴合的)在此測定法中無效，即使以更高的劑量也是如此。實施例4：OGTTDOA活性研究了施用各種量的化合物15后2天在葡萄糖強飼(1.5k/kg右旋糖)前和30分鐘時在血糖上的影響，結(jié)果顯示于圖2A-2B。以圖中指示的劑量對禁食4小時的NIH/Swiss小鼠施用藥物。此OGTTDOA指示藥物活性在其施用后至少48小時存在。實施例5：OGTTDOA活性進行了化合物15和8在血糖上影響的比較，結(jié)果描述于圖3A-3B。以圖中指示的劑量對禁食4小時的NIH/Swiss小鼠施用藥物。此OGTTDOA指示藥物活性在其施用后至少24小時存在。實施例6：化合物15對HSD喂養(yǎng)的麻醉大鼠的影響研究了給藥后5天，用化合物15(240nmol/kg)的處理在SpragueDawley喂養(yǎng)的麻醉大鼠中的影響。圖4A中繪出了IVGTT后血漿葡萄糖的時間過程。積分的(AUC0-60)葡萄糖水平描繪在圖4B的直方圖中。在圖4C中繪出了測試受試者中在胰島素水平中的變化的時間過程。積分的胰島素水平(AUC0-30)描繪在圖4D中。在圖4E中繪出了測試受試者的體重變化(自基線的%變化)的時間過程。圖4F中提供了測試受試者的每日食物攝取的直方圖描述。此IVGTTDOA指示藥物活性在其施用后至少5天存在，特別對于在體重和每日食物攝取上的影響而言。實施例7：化合物15在ob/ob小鼠中的影響研究了劑量施用后化合物15在ob/ob小鼠中對體重、葡萄糖和HbA1c的影響的時間過程。如圖5A中描繪的，在用250nmol/kg化合物15處理時出現(xiàn)顯著體重降低。圖5B-5C中描繪了葡萄糖(%處理前)和HbA1c中(%處理前)的變化。點代表均值±s.d.(標準偏差)。在天數(shù)=0時，在未禁食的雄性ob/ob小鼠中收集基線樣品后立即sc注射化合物15。除非另外指出的，本文中描述的血糖測量采用了裝置(LifeScan,Inc.Miliptas,CA)。化合物21也顯示出體重降低和HbA1c降低。實施例8：化合物15在ZuckerDiabeticFatty(ZDF)大鼠中的活性為了評估本文中描述的例示性化合物的聯(lián)合的降低體重和葡萄糖的功效，研究了化合物15在～14周齡的雄性ZDF大鼠中的劑量依賴性效果?；€葡萄糖為426mg/dL，且基線體重為431g。組大小n=8。圖6A描繪了處理后體重中變化(%經(jīng)媒介物校正)的時間過程。圖6B描繪了血漿葡萄糖的時間過程。實施例9：化合物15,8和10在OGTTDOA(作用持續(xù)時間)上的活性研究了化合物15,8和10在30分鐘時在血糖變化(%強飼前)上的影響，如圖7中描繪的。在此圖中，豎條代表均值±s.d。在t=-1日時IP注射測試化合物。在t=0時對禁食4小時的NIH/Swiss雌鼠施用葡萄糖強飼(1.5g/kg)。如本文中描述的測量血糖。此OGTTDOA指示藥物活性在其施用后至少24小時存在。實施例10：化合物在24小時處的OGTTDOA(作用持續(xù)時間)上的活性如上文描述的研究了本文中披露的化合物在30分鐘時在血糖變化(%強飼前)上的影響。在t=-1日時以25nmol/kgIP注射測試化合物。在t=0時對禁食4小時的NIH/Swiss雌鼠施用葡萄糖強飼(1.5g/kg)。如本文中描述的測量血糖。此OGTTDOA指示藥物活性在其施用后至少24小時存在。在下表6中呈現(xiàn)結(jié)果?；衔?0(連接賴氨酸27的)和化合物32沒有產(chǎn)生葡萄糖降低，指示著在這些條件下于24小時處不存在。毒蜥外泌肽-4(未綴合)在此測定法中在t-24小時施用時是無效的，即使以更高的劑量也如此。在位置3處有脯氨酸的化合物14在體外功能測定法中基本無活性，且在降葡萄糖OGTT測定法中無活性(且可能是增加重量的)(數(shù)據(jù)未顯示)。具有清蛋白結(jié)合序列(來自大消化鏈球菌(P.magnus)的PAB蛋白)的化合物22在上文測定法中具有極小(如果有的話)的重量降低(3%)。具有截短的ABD的化合物19和化合物20仍保持體外活性，但持續(xù)時間縮短，其在OGTTDOA測定法中分別具有6%和8%的葡萄糖降低。表6.OGTT中劑量施用后24小時處的葡萄糖降低描述相比于媒介物的%葡萄糖降低化合物5-28化合物6-18化合物15-21化合物8-21化合物10-22化合物21-23化合物23-23化合物24-17描述相比于媒介物的%葡萄糖降低化合物31-22化合物33-19實施例11.血清清蛋白結(jié)合可以通過實施任意數(shù)目的方法來表征工程化多肽化合物對清蛋白的結(jié)合，所述方法包括本文中描述的Biacore。在此實施例中，用BioRadProteOnXPR36系統(tǒng)(Bio-RadLaboratories,HerculesCA,USA;ProteOnXPR36蛋白質(zhì)相互作用陣列系統(tǒng),目錄號#176-0100)進行結(jié)合測量，其于25℃使用GLC傳感器芯片。對于胺偶聯(lián)，將GLC芯片活化5分鐘，其使用從起始的儲液在水中稀釋30倍的磺基-NHS/EDC1:1混合物，如下文顯示的。將每份清蛋白樣品都在10mM醋酸鈉pH5.0中稀釋為25ug/ml，并于分開的傳感器表面上注射5分鐘。然后將每一表面用1M乙醇胺pH8.5封閉。將每種清蛋白以2000-5000共振單位的密度偶聯(lián)。測試工程化多肽的結(jié)合，其將5nM用作3倍稀釋系列中的最高濃度。運行緩沖液含有10mMHEPESpH7.4,150mMNaCl,3mMEDTA和0.005%tween-20。所有樣品都使用3倍稀釋的系列進行測試。一式兩份地測試每個濃度系列。監(jiān)測最高濃度的解離相達3小時。對工程化多肽測量的相對KD呈現(xiàn)在下表7中。結(jié)果顯示清蛋白結(jié)合多肽以高親和力與血清清蛋白結(jié)合。括號中的數(shù)字代表最后有效數(shù)字中的標準偏差。如從下表看到的，融合至清蛋白結(jié)合域SEQIDNO:35的毒蜥外泌肽多肽保留了對來自各物種的血清清蛋白(特別是人血清清蛋白)的非常高的親和力，即使在與未綴合的ABD肽本身相比的情況下。表7化合物人SA犬SA猴SA小鼠SA大鼠SASEQIDNO:3516(4)pM201(2)pM123(1)pM1.24(1)nM18(5)pM化合物1568pM513pM91pM1.25nM200pM化合物2185pM397pM78pM1.33nM16pM實施例12.存在血清清蛋白時的活性證明了在存在血清清蛋白時對工程化多肽化合物體外活性的表征?？梢栽诖嬖诤筒淮嬖谇宓鞍?，特別是人血清清蛋白的情況下實施測定法。上文數(shù)據(jù)是在存在約0.1%牛血清清蛋白(BSA)的情況下測定的。下表呈現(xiàn)了上文描述的受體活化(cAMP誘導)測定法的功能活性，但是是在存在來自各種物種的血清清蛋白的情況下的。如可以看到的，令人驚訝地，即使當化合物結(jié)合至血清清蛋白如人血清清蛋白時，盡管存在較大的血清清蛋白，其可能有空間位阻且甚至在清蛋白結(jié)合所得化合物的表觀斯托克氏(Stoke’s)半徑中產(chǎn)生變化，然而工程化多肽保留GLP-1受體激動劑活性。鑒于ABD和工程化多肽對一些物種的血清清蛋白(例如人血清清蛋白)的皮摩爾級親和力，認為工程化多肽有效地、完全地結(jié)合至此測定法中存在的清蛋白(且由此也在體內(nèi)在循環(huán)血液中)。由于化合物結(jié)合至清蛋白的極高的親和力(如上文)且血液中存在高濃度的血清清蛋白，因此預期該化合物在體內(nèi)基本上會以結(jié)合狀態(tài)存在，但令人驚訝地提供充足的毒蜥外泌肽功能(如本文中證明的)。表8實施例13.化合物對人血漿和人血漿酶是穩(wěn)定的檢查化合物對人血漿和人細胞膜蛋白酶的穩(wěn)定性。如下實施代表性肽在人血漿中的穩(wěn)定性。以充分體積制備人血漿中10μg/ml化合物，從而對于時間段(5小時)，從0時間點開始每10分鐘就取出100μL樣品。在向人血漿加入化合物后，溫和地混合樣品并將100μL混合物樣品轉(zhuǎn)移到微離心管中以代表0時間點。將剩余樣品置于37°C培養(yǎng)箱中，以600RPM混合60分鐘。以10分鐘為間期，取出100μl混合物樣品并轉(zhuǎn)移到單獨的微離心管中。在0時間點時且在每個10分鐘間期將100μL樣品轉(zhuǎn)移后，提取每份收集的樣品，其通過緩慢加入100μl冷的0.2%甲酸:乙腈，同時混合。在加入乙腈溶液后，將樣品高速渦旋混合達15秒。將提取的樣品存儲于-20°C達至少20分鐘，然后在5°C以11,000×g離心10分鐘。將每份樣品的上清液轉(zhuǎn)移到新的微離心管中，再次離心，并最終轉(zhuǎn)移用于LC/MS分析。在AgilentHLPC(LC/MS1200)上使用在含有0.1%三氟乙酸的水中梯度5-95%的乙腈進行樣品分析。表9呈現(xiàn)了標準化到標準物(100%)后的結(jié)果。圖8呈現(xiàn)了在5小時時間過程中保留在人血漿中的化合物百分比的時間概況。表9.如下實施代表性肽在人腎刷狀緣膜(brushbordermembrane)(KBBM)測定法中的相對穩(wěn)定性。人腎刷狀緣膜蛋白提取物富含各種肽酶。將5μL(約7微克/mL蛋白質(zhì))蛋白提取制備物(hKBBMP)用625μLHEPES緩沖液(25mM,pH7.4)在有O環(huán)封口的聚丙烯微離心管中稀釋以避免溶劑揮發(fā)。在單獨的小瓶中，制備肽儲液(在50%乙腈于水中為300μM)并將70μL此溶液加入到上文hKBBMP溶液中。通過手動晃動來溫和地混合溶液，從而使得最終肽濃度為30μM。然后將此溶液100μL等分試樣到6個不同的管中，并在1個管中加入200μL酶終止溶液(50%乙腈于水中，有0.1%TFA)。將此管用于測量時間t=0分鐘時的初始肽濃度，而使用水浴將所有其它5個管在37℃溫育。在1、2、3、4和5小時的間期時，取出每個管并用200μL終止溶液結(jié)束。最終，將所有6個管以1800xg離心10分鐘以除去任何沉淀的蛋白質(zhì)。將上清液(10μL)轉(zhuǎn)移到HPLC自動取樣器中，并通過使用選擇的離子計數(shù)方法(selectedioncountmethod)來測量AUC。每份樣品都以一式三份運行，并計算平均AUC以用于數(shù)據(jù)分析。在有大檢測器的AgilentHPLC上用有0.1%TFA梯度的乙腈實施樣品分析。使用5軟件，繪出從酶促消化的時間t=0至5小時所剩余的親本肽的百分數(shù)。該數(shù)據(jù)報告為每種肽對陽性對照的相對肽穩(wěn)定性。如記載的，以n=6運行樣品，且CV在20%以內(nèi)。在表10中呈現(xiàn)了來自hKBBM穩(wěn)定性測定法的結(jié)果。表10.實施例14.缺乏空泡形成對于一些藥物如一些聚乙二醇化蛋白質(zhì)，可能在近曲小管襯里的上皮細胞的細胞質(zhì)中形成不期望的空泡，這是一種不期望的毒性度量。本申請的工程化清蛋白結(jié)合化合物不形成腎空泡。每天在熄燈前3小時，對C57BL6雌鼠(n=2籠，3只小鼠/籠)稱重。在第0-6日，稱重后立即給小鼠皮下注射測試化合物。在第7天殺死小鼠并將腎用于組織病理學。腎皮質(zhì)管上皮細胞的細胞質(zhì)空泡形成的嚴重度得分如下：得分1=最小(8-15%)；2=溫和(16-35%)；3=中度(36-60%)；4=顯著(>60%)。已知導致空泡形成的陽性對照化合物得分為3。ABD多肽本身得分為0?；衔?5得分為0。實施例15.對正常小鼠中抑制食物攝取的影響測定了測試化合物在抑制正常小鼠的食物攝取上的影響的時間過程。如圖10A中繪出的，在用化合物31處理6小時內(nèi)出現(xiàn)了劑量依賴性的顯著的體重降低。圖10B顯示了單劑化合物后在正常小鼠中持續(xù)至少54小時的劑量依賴性的、持續(xù)的食物攝取抑制。毒蜥外泌肽類似物的效果在24小時內(nèi)消失。最高劑量的化合物31甚至在3天時仍然顯著抑制食物攝取。點代表n=4籠(3只小鼠/籠)的均值±sd。在t=0時IP注射肽。在注射后立即引入食物，并在t=30,60,120,180,240,300,360min,24h,30h,48h和54h時測量消耗的量。*對媒介物對照的p<0.05；ANOVA，鄧奈特氏檢驗。ED50對于化合物31為～10nmol/kg且對于[Leu14]毒蜥外泌肽-4為2nmol/kg。實施例16：毒蜥外泌肽-清蛋白結(jié)合域多肽在糖尿病ob/ob小鼠中的影響為了證明本文中描述的毒蜥外泌肽-清蛋白結(jié)合域工程化多肽的長期暴露在葡萄糖降低、HbA1c降低、和體重降低上的影響，用化合物15和化合物21處理糖尿病ob/ob小鼠。研究給藥后測試化合物在ob/ob小鼠中在體重、葡萄糖降低和HbA1c降低上的影響的時間過程，將4周時的值呈現(xiàn)于圖11A,11B,11C和11D。圖11A(化合物15)和11B(化合物21)繪出了相比于利拉魯肽在血糖中的變化，所有都是每周兩次(BIW)給藥的。圖11C繪出了相比于通過連續(xù)皮下輸注(CSI)給藥的毒蜥外泌肽-4，每周兩次(BIW)給藥的化合物15和化合物21的HbA1c降低(從基線處的%變化)。圖11D繪出了相比于通過連續(xù)皮下輸注(CSI)給藥的毒蜥外泌肽-4，每周兩次(BIW)給藥的化合物15和化合物21的體重降低(從基線處的%變化)。令人驚訝地，如從圖11A和11B看到的，對于長期暴露時的葡萄糖降低，每種化合物在等摩爾給藥都優(yōu)于利拉魯肽。而且，在與利拉魯肽等摩爾給藥時，化合物15和化合物21每種都比利拉魯肽[N-ε-(γ-Glu(N-α-十六?；?)-Lys26,Arg34]-GLP-1-(7-37)-酸(一種長效清蛋白結(jié)合GLP-1衍生物)在降低HbA1c和降低體重中更有效(數(shù)據(jù)未顯示)。在每周兩次腹膜內(nèi)(IP)提供25和250nmol/kg的每種化合物達28天的情況下，如圖11C中繪出的，處理后出現(xiàn)顯著的HbA1c降低，且在圖11D中，處理后出現(xiàn)顯著的體重降低。點代表均值±s.d.(標準偏差)。在天數(shù)=0時，在未禁食的雄性ob/ob小鼠中收集基線樣品后立即IP注射每種測試化合物。對25nmol/kgbiw(每周兩次)劑量所觀察到的效果大于對通過連續(xù)輸注(CSI)以～7.2nmol/kg/d給藥(已知該劑量提供毒蜥外泌肽-4的最大功效)的毒蜥外泌肽-4所觀察到的。由此在可比的等摩爾劑量，化合物15和化合物21超過了毒蜥外泌肽-4的最大有效劑量的降糖和降體重效果。在250nmol/kg時，化合物15顯著高于且化合物21為2倍有效于毒蜥外泌肽-4的最大有效劑量。除非另外指出的，本文中描述的血糖測量采用了裝置(LifeScan,Inc.Miliptas,CA)。令人驚訝地，盡管相比于如上文所觀察到的未綴合的毒蜥外泌肽-4的體外效力降低，但本文中披露的融合至清蛋白結(jié)合多肽的毒蜥外泌肽的急性(6小時內(nèi))體內(nèi)活性在最大功效方面類似于未綴合的毒蜥外泌肽的，且在效力方面(例如ED50)僅稍低(數(shù)倍)，如在通過小鼠中的食物攝取的降低測量時(數(shù)據(jù)未顯示)。甚至更令人驚訝地，長期暴露的效果顯示本文中披露的融合至清蛋白結(jié)合多肽的毒蜥外泌肽與毒蜥外泌肽-4(連續(xù)輸注)一樣有力且甚至具有更大的效力，但能夠提供更大的最大效果。此外，根據(jù)對小鼠或大鼠清蛋白的非常高的親和力和低解離速率，所有的工程化化合物在體內(nèi)測定法(以及體外測定法)中都有效結(jié)合至清蛋白。由此，工程化多肽甚至在結(jié)合至清蛋白時也保留GLP-1R功能活性。這是令人驚訝地，部分因為已經(jīng)報告了清蛋白化合物例如利拉魯肽僅在從清蛋白解離時為顯著活性的。而且其他人已經(jīng)報告了需要從其所綴合的清蛋白結(jié)合肽蛋白水解移出毒蜥外泌肽，從而獲得毒蜥外泌肽功能。因此，如本文中顯示的體內(nèi)活性甚至是更令人驚嘆的。實施例17：工程化多肽在體內(nèi)的長持續(xù)時間和作用為了進一步證明本文中描述的工程化多肽的長半衰期和長活性持續(xù)時間，使用大鼠測定了藥動學(PK)和藥效學(PD)特性。呈現(xiàn)了在正常的HarlanSprague-Dawley(HSD)大鼠中皮下施用的例示性工程化多肽化合物15和化合物21的藥動學概況和生物學活性。在t=0時將重組工程化化合物化合物21和化合物15以25nmol/kg皮下注射到正常的HSD大鼠中。在t=1小時、3小時、6小時、24小時、48小時、72小時、96小時和168小時時經(jīng)由尾部出血從喂養(yǎng)的HSD雄性大鼠中收集血液。每日測量食物和身體重量。圖12A繪出了化合物15和化合物21減少食物攝取的影響。圖12B繪出了化合物15和化合物21降低體重的影響。圖12C繪出了單劑后化合物15和化合物21的PK概況。點代表均值±sd。對兩種例示性工程化多肽都觀察到至少長達7天的暴露。在大鼠中通過此皮下遞送，化合物15具有54小時的表觀半衰期，化合物21具有61小時的表觀半衰期。通過異速生長律且考慮到工程化多肽對人清蛋白的強親和力，在人受試者中預期至少一樣長且甚至更長的物理學和生物學活性持續(xù)時間。因此，化合物可用于至少每日兩次(例如早上和晚上)、至少每日一次、每周兩次、和甚至每周一次的施用，特別是在人受試者中。呈現(xiàn)了在正常的HarlanSprague-Dawley(HSD)大鼠中靜脈內(nèi)施用的例示性工程化多肽的藥動學概況和生物學活性。在t=0時將重組工程化化合物化合物31以2nmol/kg靜脈內(nèi)注射到正常的HSD大鼠中。在t=1小時、3小時、6小時、24小時、48小時、72小時、96小時和168小時時經(jīng)由尾部出血從喂養(yǎng)的HSD雄性大鼠中收集血液。每日測量食物和身體重量。圖13A繪出了化合物31減少食物攝取的影響。圖13B繪出了化合物31降低體重的影響。圖13C繪出了單劑IV后化合物31的PK概況。半衰期估算為約至少14小時，點代表均值±sd。甚至以這些相對較低的劑量時，對此例示性工程化多肽都觀察到長達7天的暴露。通過異速生長律且考慮到工程化多肽對人清蛋白的強親和力，在人受試者中預期至少一樣長且甚至更長的物理學和生物學活性持續(xù)時間。因此，化合物可用于至少每日兩次(例如早上和晚上)、至少每日一次、每周兩次、和甚至每周一次的施用，特別是在人受試者中。實施例18：口服遞送工程化多肽實現(xiàn)系統(tǒng)性分布使用代表性工程化化合物來研究口服遞送及腸攝取。用240nmol/kg的下列化合物對糖尿病db/db小鼠口服(通過強飼入口)給藥：毒蜥外泌肽類似物[Leu14,Gln28]毒蜥外泌肽-4-(1-32)-fGLP-1-(33-37)酸和化合物15。數(shù)據(jù)顯示工程化肽是口服生物可用的，甚至在沒有可以增強遞送和攝取的其它特定賦形劑的情況下在配制物PBS/丙二醇(50:50)中。與毒蜥外泌肽類似物相比，超過毒蜥外泌肽類似物分子量兩倍的化合物15(都以1mg/kg的劑量)在相同配制物中也是口服生物可用的。結(jié)果指示在口服施用時兩種化合物都有活性，且在一定條件下測試到120分鐘時是等同有效的。結(jié)果呈現(xiàn)在圖14中。點代表均值+/-sd。在取了基線樣品后，立即在t=0時通過強飼經(jīng)口施用肽。小鼠是禁食2小時的db/db小鼠。因此，本文中呈現(xiàn)的化合物可用于至少每日兩次(例如早上和晚上)、至少每日一次、每周三次、每周兩次、和甚至每周一次的口服施用，特別是在人受試者中。VIII.實施方案實施方案1.一種工程化多肽，其包含：清蛋白結(jié)合域多肽(ABD)序列和選自毒蜥外泌肽序列、毒蜥外泌肽類似物序列、毒蜥外泌肽活性片段序列或毒蜥外泌肽類似物活性片段序列的第一肽激素域(HD1)序列。實施方案2.依照實施方案1的工程化多肽，其進一步包含共價連接所述ABD序列和所述HD1序列的第一接頭(L1)。實施方案3.依照實施方案1至2中任一項的工程化多肽，其中所述工程化多肽包含所述ABD序列作為C末端模塊和所述HD1序列作為N末端模塊。實施方案4.依照實施方案3的工程化多肽，其具有結(jié)構(gòu)：HD1-ABD。實施方案5.依照實施方案3的工程化多肽，其具有結(jié)構(gòu)HD1-L1-ABD。實施方案6.依照實施方案1至5中任一項的工程化多肽，其中所述HD1序列由所述毒蜥外泌肽序列或所述毒蜥外泌肽類似物序列組成。實施方案7.依照實施方案6的工程化多肽，其中所述毒蜥外泌肽序列是毒蜥外泌肽-4序列。實施方案8.依照實施方案6的工程化多肽，其中所述毒蜥外泌肽活性片段序列是毒蜥外泌肽-4(1-28)、毒蜥外泌肽-4(1-29)、毒蜥外泌肽-4(1-30)、毒蜥外泌肽-4(1-31)或毒蜥外泌肽-4(1-32)(SEQIDNO:2)的序列。實施方案9.依照實施方案6的工程化多肽，其中所述毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽類似物的序列包含選自下組的序列：(SEQIDNO:3),(SEQIDNO:4),(SEQIDNO:2),(SEQIDNO:111),(SEQIDNO:112),(SEQIDNO:113),(SEQIDNO:114),(SEQIDNO:115),(SEQIDNO:116),(SEQIDNO:117),和(SEQIDNO:118)。實施方案10.依照實施方案1至9中任一項的工程化多肽，其中所述毒蜥外泌肽類似物序列與毒蜥外泌肽-4序列或與選自由任意一條以下序列組成的組的毒蜥外泌肽類似物序列具有至少70%同一性：(SEQIDNO:3),(SEQIDNO:4),(SEQIDNO:2),(SEQIDNO:111),(SEQIDNO:112),(SEQIDNO:113),(SEQIDNO:114),(SEQIDNO:115),(SEQIDNO:116),(SEQIDNO:117),和(SEQIDNO:118)。實施方案11.依照實施方案1至10中任一項的工程化多肽，其中相對于毒蜥外泌肽-4序列或具有選自下組的序列的毒蜥外泌肽類似物，所述毒蜥外泌肽類似物序列包含1至5處氨基酸修飾：(SEQIDNO:3),(SEQIDNO:4),(SEQIDNO:2),(SEQIDNO:111),(SEQIDNO:112),(SEQIDNO:113),(SEQIDNO:114),(SEQIDNO:115),(SEQIDNO:116),(SEQIDNO:117),和(SEQIDNO:118)，所述修飾獨立地選自插入、缺失、添加和取代的任意一種或組合。實施方案12.依照實施方案1至11中任一項的工程化多肽，其中所述ABD序列包含清蛋白結(jié)合基序(ABM)序列。實施方案13.依照實施方案1至11中任一項的工程化多肽，其中所述ABD序列包含由以下氨基酸序列組成的清蛋白結(jié)合基序(ABM)序列：GVSDX5YKX8X9IX11X12AX14TVEGVX20ALX23X24X25I(SEQIDNO:119)其中，X5選自Y和F；X8選自N,R和S；X9選自V,I,L,M,F和Y；X11選自N,S,E和D；X12選自R,K和N；X14選自K和R；X20選自D,N,Q,E,H,S,R和K；X23選自K,I和T；X24選自A,S,T,G,H,L和D；且X25選自H,E和D。實施方案14.依照實施方案1至13中任一項的工程化多肽，其中所述ABD序列包含不由氨基酸序列GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI(SEQIDNO:120)組成的清蛋白結(jié)合基序(ABM)序列。實施方案15.依照實施方案1至14中任一項的工程化多肽，其中所述ABD序列包含以下氨基酸序列：LAEAKXaXbAXcXdELXeKY(SEQIDNO:182)，該氨基酸序列共價連接至清蛋白結(jié)合基序(ABM)序列，該清蛋白結(jié)合基序(ABM)序列進一步共價連接至氨基酸序列LAALP(SEQIDNO:183)，其中Xa選自V和E；Xb選自L,E和D；Xc選自N,L和I；Xd選自R和K；且Xe選自D和K。實施方案16.依照實施方案1至15中任一項的工程化多肽，其中所述ABD序列包含以下氨基酸序列：LAEAKXaXbAXcXdELXeKYGVSDX5YKX8X9IX11X12AX14TVEGVX20ALX23X24X25ILAALP(SEQIDNO:121)其中Xa選自V和E；Xb選自L,E和D；Xc選自N,L和I；Xd選自R和K；Xe選自D和K；X5選自Y和F；X8選自N,R和S；X9選自V,I,L,M,F和Y；X11選自N,S,E和D；X12選自R,K和N；X14選自K和R；X20選自D,N,Q,E,H,S,R和K；X23選自K,I和T；X24選自A,S,T,G,H,L和D；且X25選自H,E和D。實施方案17.依照實施方案16的工程化多肽，其中在所述ABD序列中不存在C末端脯氨酸。實施方案18.依照實施方案16至17中任一項的工程化多肽，其中在所述ABD序列中位置45處的亮氨酸不存在。實施方案19.依照實施方案16至18中任一項的工程化多肽，其中所述ABD序列還包含選自A,AS,G或GS的N末端添加。實施方案20.依照實施方案16的工程化多肽，其中所述ABD序列包含氨基酸序列LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP(SEQIDNO:35)。實施方案21.依照實施方案16的工程化多肽，其中所述ABD序列選自下組的序列：(SEQIDNO:23),(SEQIDNO:24),(SEQIDNO:25),(SEQIDNO:26),(SEQIDNO:27),(SEQIDNO:28),(SEQIDNO:29),(SEQIDNO:30),(SEQIDNO:31),(SEQIDNO:32),(SEQIDNO:33),(SEQIDNO:34),(SEQIDNO:35),(SEQIDNO:122),(SEQIDNO:123)和(SEQIDNO:124)。實施方案22.依照實施方案1至11中任一項的工程化多肽，其中所述ABD的序列與具有選自下組序列的ABD的序列具有至少85%同一性：(SEQIDNO:23),(SEQIDNO:24),(SEQIDNO:25),(SEQIDNO:26),(SEQIDNO:27),(SEQIDNO:28),(SEQIDNO:29),(SEQIDNO:30),(SEQIDNO:31),(SEQIDNO:32),(SEQIDNO:33),(SEQIDNO:34),(SEQIDNO:35),(SEQIDNO:122),(SEQIDNO:123)和(SEQIDNO:124)。實施方案23.依照實施方案16至22中任一項的工程化多肽，其中在所述ABD序列中不存在C末端脯氨酸。實施方案24.依照實施方案16至23中任一項的工程化多肽，其中在所述ABD序列中在位置45處不存在亮氨酸。實施方案25.依照實施方案2至24中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1是1至30個氨基酸的肽接頭。實施方案26.依照實施方案2至25中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1選自20種天然存在的氨基酸。實施方案27.依照實施方案2至25中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1包含非天然的氨基酸，其通過化學合成、翻譯后化學修飾或通過宿主細胞中的重組表達通過體內(nèi)摻入來摻入。實施方案28.依照實施方案2至27中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。實施方案29.依照實施方案2至28中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1包含的多數(shù)氨基酸是無空間位阻的。實施方案30.依照實施方案2至29中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1包含聚甘氨酸、聚丙氨酸、聚(Gly-Ala)、或聚(Gly-Ser)。實施方案31.依照實施方案30的工程化多肽，其中所述接頭L1包含序列(Gly)3,(Gly)4(SEQIDNO:196)或(Gly)5(SEQIDNO:197)。實施方案32.依照實施方案2至29中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1包含序列(Gly)3Lys(Gly)4(SEQIDNO:131);(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQIDNO:132);(Gly)3Cys(Gly)4(SEQIDNO:133);或GlyProAsnGlyGly(SEQIDNO:134)。實施方案33.依照實施方案2至32中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1包含Gly和Ala的組合。實施方案34.依照實施方案2至32中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1包含Gly和Ser的組合。實施方案35.依照實施方案2至34中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1選自由富含甘氨酸的肽組成的組。實施方案36.依照實施方案2至35中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1包含N末端TG二肽。實施方案37.依照實施方案2至36中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1包含C末端AS二肽。實施方案38.依照實施方案2至37中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1包含N末端TG二肽和C末端AS二肽。實施方案39.依照實施方案2至38中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1包含選自下組的序列：TG-(GGGS)1(SEQIDNO:198),TG-(GGGS)2(SEQIDNO:199),TG-(GGGS)3(SEQIDNO:200),TG-(GGGS)4(SEQIDNO:201),TG-(GGGS)5(SEQIDNO:202),(GGGS)1-AS(SEQIDNO:203),(GGGS)2-AS(SEQIDNO:204),(GGGS)3-AS(SEQIDNO:205),(GGGS)4-AS(SEQIDNO:206),(GGGS)5-AS(SEQIDNO:207),TG-(GGGS)1-AS(SEQIDNO:208),TG-(GGGS)2-AS(SEQIDNO:209),TG-(GGGS)3-AS(SEQIDNO:210),TG-(GGGS)4-AS(SEQIDNO:211),和TG-(GGGS)5-AS(SEQIDNO:212)。實施方案40.依照實施方案39中任一項的工程化多肽，其中所述接頭L1中TG二肽或AS二肽不存在或被一對選自T,A,S和G的氨基酸替換。實施方案41.依照實施方案1至40中任一項的工程化多肽，其以小于約10-6mol/L的解離常數(shù)結(jié)合血清清蛋白。實施方案42.依照實施方案41的工程化多肽，其以小于約10-9mol/L的解離常數(shù)結(jié)合血清清蛋白。實施方案43.依照實施方案42的工程化多肽，其以小于約10-12mol/L的解離常數(shù)結(jié)合血清清蛋白。實施方案44.依照實施方案1至43中任一項的工程化多肽，其中所述多肽具有至少1天的作用持續(xù)時間。實施方案45.依照實施方案44的工程化多肽，其中所述多肽具有至少3天的作用持續(xù)時間。實施方案46.依照實施方案45的工程化多肽，其中所述多肽具有至少6天的作用持續(xù)時間。實施方案47.依照實施方案1至46中任一項的工程化多肽，其中所述多肽在人受試者中具有至少6天的作用持續(xù)時間。實施方案48.依照實施方案1至47中任一項的工程化多肽，其包含：(SEQIDNO:40),(SEQIDNO:41),(SEQIDNO:42),(SEQIDNO:43),(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:163),(SEQIDNO:99),(SEQIDNO:169),(SEQIDNO:170),(SEQIDNO:95),(SEQIDNO:97),(SEQIDNO:96),(SEQIDNO:55),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:62),(SEQIDNO:67),(SEQIDNO:166),(SEQIDNO:167),(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:52),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:54),(SEQIDNO:55),(SEQIDNO:56),(SEQIDNO:57),(SEQIDNO:58),(SEQIDNO:59),(SEQIDNO:60),(SEQIDNO:61),(SEQIDNO:62),(SEQIDNO:63),(SEQIDNO:64),(SEQIDNO:65),(SEQIDNO:66),(SEQIDNO:67),(SEQIDNO:68),(SEQIDNO:70),(SEQIDNO:71),(SEQIDNO:72),(SEQIDNO:73),(SEQIDNO:74),(SEQIDNO:75),(SEQIDNO:76),(SEQIDNO:77),(SEQIDNO:78),(SEQIDNO:79),(SEQIDNO:80),(SEQIDNO:81),(SEQIDNO:82),(SEQIDNO:83),(SEQIDNO:84),(SEQIDNO:85),(SEQIDNO:86),(SEQIDNO:87),(SEQIDNO:88),(SEQIDNO:89),(SEQIDNO:90),(SEQIDNO:91),(SEQIDNO:92),(SEQIDNO:93),(SEQIDNO:94),(SEQIDNO:95),(SEQIDNO:96),(SEQIDNO:97),(SEQIDNO:98),(SEQIDNO:99),(SEQIDNO:100)(SEQIDNO:101),(SEQIDNO:102),(SEQIDNO:103),(SEQIDNO:104),(SEQIDNO:105),(SEQIDNO:106),(SEQIDNO:107),(SEQIDNO:108)或(SEQIDNO:109)。實施方案49.依照實施方案1至47中任一項的工程化多肽，其包含：(SEQIDNO:40),(SEQIDNO:41),(SEQIDNO:42),(SEQIDNO:43),(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:163),(SEQIDNO:99),(SEQIDNO:169),(SEQIDNO:170),(SEQIDNO:95),(SEQIDNO:97),(SEQIDNO:96),(SEQIDNO:55),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:62),(SEQIDNO:67),(SEQIDNO:166)或(SEQIDNO:167)。實施方案50.依照實施方案1至47中任一項的工程化多肽，其包含：(SEQIDNO:40),(SEQIDNO:41),(SEQIDNO:42),(SEQIDNO:43),(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:163),(SEQIDNO:99),(SEQIDNO:169),(SEQIDNO:170),(SEQIDNO:95),(SEQIDNO:97),(SEQIDNO:96)或(SEQIDNO:55)。實施方案51.一種用于治療受試者中的疾病或病癥的方法，包括將依照實施方案1-50中任意一項的工程化多肽以有效治療所述疾病或病癥的量施用給有此需要的受試者。實施方案52.依照實施方案51的方法，其中所述疾病或病癥為糖尿病、超重、肥胖癥、阿耳茨海默氏病、短腸綜合征、脂肪肝病、血脂障礙、冠心病、中風、高脂血、或帕金森氏病。實施方案53.依照實施方案52的方法，其中所述疾病或病癥為糖尿病、超重、肥胖癥、短腸綜合征、或帕金森氏病。實施方案54.依照實施方案53的方法，其中所述疾病或病癥為I型糖尿病、II型糖尿病或前驅(qū)糖尿病。實施方案55.依照實施方案52的方法，其中所述疾病或病癥為II型糖尿病。實施方案56.依照實施方案52的方法，其中所述疾病或病癥為血脂障礙或高脂血。實施方案57.依照實施方案52的方法，其中所述有此類治療需要的受試者是肥胖的。實施方案58.一種藥物組合物，其包含依照實施方案1-50中任一項的工程化多肽和藥學可接受賦形劑。實施方案59.依照實施方案58的藥物組合物，其中所述藥物組合物是口服藥物組合物。實施方案60.依照實施方案58至59中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是持續(xù)釋放的或長效的藥物組合物。實施方案61.依照實施方案58至60中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是每日一次的藥物組合物。實施方案62.依照實施方案58至60中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是每日兩次的藥物組合物。實施方案63.依照實施方案58至60中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是每周一次的藥物組合物。實施方案64.實施方案58至63中任一項的藥物組合物，其用于治療受試者中的疾病或病癥。實施方案65.實施方案64的藥物組合物，其中所述疾病或病癥為糖尿病、超重、肥胖癥、阿耳茨海默氏病、脂肪肝病、短腸綜合征、血脂障礙、冠心病、中風、高脂血、或帕金森氏病。實施方案66.實施方案65的藥物組合物，其中所述疾病或病癥為糖尿病、超重、肥胖癥、短腸綜合征、或帕金森氏病。實施方案67.實施方案66的藥物組合物，其中所述疾病或病癥為I型糖尿病、II型糖尿病或前驅(qū)糖尿病。實施方案68.實施方案1至67中任一項的工程化多肽或藥物組合物，其中所述工程化多肽或藥物組合物提供每周一次的施用。實施方案69.實施方案1至67中任一項的工程化多肽或藥物組合物，其中所述工程化多肽或藥物組合物提供每日一次的施用。實施方案70.實施方案1至67中任一項的工程化多肽或藥物組合物，其中所述工程化多肽或藥物組合物提供每日兩次的施用。實施方案71.實施方案58至70中任一項的藥物組合物，其中所述工程化多肽包含：(SEQIDNO:40),(SEQIDNO:41),(SEQIDNO:42),(SEQIDNO:43),(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:163),(SEQIDNO:99),(SEQIDNO:169),(SEQIDNO:170),(SEQIDNO:95),(SEQIDNO:97),(SEQIDNO:96),(SEQIDNO:55),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:62),(SEQIDNO:67),(SEQIDNO:166),(SEQIDNO:167),(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:52),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:54),(SEQIDNO:55),(SEQIDNO:56),(SEQIDNO:57),(SEQIDNO:58),(SEQIDNO:59),(SEQIDNO:60),(SEQIDNO:61),(SEQIDNO:62),(SEQIDNO:63),(SEQIDNO:64),(SEQIDNO:65),(SEQIDNO:66),(SEQIDNO:67),(SEQIDNO:68),(SEQIDNO:70),(SEQIDNO:71),(SEQIDNO:72),(SEQIDNO:73),(SEQIDNO:74),(SEQIDNO:75),(SEQIDNO:76),(SEQIDNO:77),(SEQIDNO:78),(SEQIDNO:79),(SEQIDNO:80),(SEQIDNO:81),(SEQIDNO:82),(SEQIDNO:83),(SEQIDNO:84),(SEQIDNO:85),(SEQIDNO:86),(SEQIDNO:87),(SEQIDNO:88),(SEQIDNO:89),(SEQIDNO:90),(SEQIDNO:91),(SEQIDNO:92),(SEQIDNO:93),(SEQIDNO:94),(SEQIDNO:95),(SEQIDNO:96),(SEQIDNO:97),(SEQIDNO:98),(SEQIDNO:99),(SEQIDNO:100)(SEQIDNO:101),(SEQIDNO:102),(SEQIDNO:103),(SEQIDNO:104),(SEQIDNO:105),(SEQIDNO:106),(SEQIDNO:107),(SEQIDNO:108)或(SEQIDNO:109)。實施方案72.實施方案58至71中任一項的藥物組合物，其中所述工程化多肽包含：(SEQIDNO:40),(SEQIDNO:41),(SEQIDNO:42),(SEQIDNO:43),(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:163),(SEQIDNO:99),(SEQIDNO:169),(SEQIDNO:170),(SEQIDNO:95),(SEQIDNO:97),(SEQIDNO:96),(SEQIDNO:55),(SEQIDNO:53),(SEQIDNO:62),(SEQIDNO:67),(SEQIDNO:166)或(SEQIDNO:167)。實施方案73.實施方案58至71中任一項的藥物組合物，其中所述工程化多肽包含：(SEQIDNO:40),(SEQIDNO:41),(SEQIDNO:42),(SEQIDNO:43),(SEQIDNO:51),(SEQIDNO:163),(SEQIDNO:99),(SEQIDNO:169),(SEQIDNO:170),(SEQIDNO:95),(SEQIDNO:97),(SEQIDNO:96)或(SEQIDNO:55)。實施方案74.實施方案58至67中任一項的藥物組合物，其中所述工程化多肽包含(SEQIDNO:95)的序列。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3