專利名稱：用于控制外寄生物感染的疫苗組合物的制作方法
用于控制外寄生物感染的疫苗組合物發(fā)明領域
本發(fā)明屬于獸醫(yī)學領域，特別地關于外寄生物感染和其相關病原體的傳播的控制。所述控制通過在疫苗組合物的制備中使用核糖體蛋白PO的肽來實現(xiàn)。包含所述肽的疫苗制劑賦予保護，而在宿主生物中不出現(xiàn)自身免疫的產生?，F(xiàn)有技術
陸生吸血性外寄生物例如蚊子、跳蚤和蜱是傳播引起疾病的傳染因子的媒介。這些疾病中的一些直接影響人類和/或其情感寄托動物，而其他的則在農業(yè)領域中引起巨大的經濟損失。由外寄生物傳播的疾病的例子為瘧疾、利什曼病、登革熱、埃利希菌病和萊姆病。蜱被認為是第二的對于人類的疾病傳播者，僅次于蚊子(Parola P.和Raoult D.,Clin.Microbiol.1nfect.2001，7:80-83)。由蜱傳播的血寄生蟲感染在畜牧業(yè)中引起數(shù)十億美元級別的年損失，其主要影響熱帶和亞熱帶地區(qū)中的牛生產。在這方面最重要的疾病之中，包括無形體病、巴貝蟲病、萊姆病(由布氏疏螺旋體(BorreIia burdogferi )引起)和所謂的東海岸熱(由小泰來蟲(Theileria parva)引起)。
稱為海風的外寄生物(燒足綱(Copepoda),魚風科(Caligidae))是最近30年在鮭魚業(yè)中最廣泛分布的海洋病原體，其在最近15年擴展至其他養(yǎng)殖魚類物種和鮭科的野生群體(Pike，A.W.和 Wadsworth, S.L.，Advances in Parasitology2000, 44:233-337 ；Ragias, V.等人,Aquaculture2004, 242:727-733)。主要的經濟損失由魚風屬(Caligus)和瘡痂魚風屬(Lepeophtheirus)的生物造成。所謂的海風可以在其宿主中引起生理學變化，包括形成應激反應、免疫功能下降、無法進行滲透調節(jié)和死亡，如果不對感染進行治療(Johnson, S.C.等人，Zool Studies2004, 43:8-19)。還存在有一些證據(jù)暗示了，海風可能是用于向魚類傳播由病毒和細菌產生的感染的媒介(Barker, E.D.等人，ParasitologyResearch2009, 105:1173-1177)。
已使用了各種各樣的化學試劑和藥物來控制由蜱和海虱產生的感染?；瘜W殺蟲劑例如脒、有機磷酸鹽、過氧化氫等的使用目前是用于控制這些外寄生物的基本措施。然而，這些物質的密集使用的缺點在于化學殘留污染食品(魚、肉和奶)、損害環(huán)境和外寄生物形成抗性(Shahein Y.E., Vet.1mmunol, and Immunopatho1.2008, 121:281-289 ；Denholm, 1.Pest Manag Sci2002, 58:528-536 ；Bravo, S.等人，Aquaculture2008, 282:7-12 ;Lees 等A , J.Fish Dis.2008,31:947-951)。
從其效力、環(huán)境安全和經濟可持續(xù)性的觀點來看，疫苗接種被認為是用于控制外寄生物感染的有希望的備選方案。已經用基于重組的蛋白Bm86的針對微小扇頭蜱(Rhipicephalus microplus)的商業(yè)疫苗(TickGARD, Hoechst Animal Health, Australia ；和GAVAC,由Heber Biotec, Cuba進行銷售)證明了為此目的使用通過重組脫氧核糖核酸(DNA)技術產生的抗原的可行性。 重組的蛋白Bm86在現(xiàn)場研究中具有有效的結果，當在綜合防治計劃中包括其應用時。在海虱的情況下，在使用蛋白質作為疫苗候選物方面存在有一些進展，正如Caligus rogercresseyi的akirin-2 (其被命名為my32)的情況，并且進行了攻擊試驗，其中得到有希望的結果(專利申請W02008/145074 “Secuenciasdeacidos nucleicos y aminoacidos, y vacuna para el control de infestaciones porectoparasitos en peces，，)。對于增加這些疫苗的效力來說，新的保護性抗原的鑒定是限制性步驟。雖然近來已鑒定了新的蜱蛋白質并且已提出它們作為可能的保護性分子，但僅對其中有限數(shù)目的蛋白質作為通過重組方法產生的抗原在疫苗接種試驗中進行了評價。在海虱(其是以食宿主的粘液、皮膚和血液為生并因此與宿主的免疫系統(tǒng)僅具有有限接觸的外寄生物(Boxaspen, K.1CES Journal of Marine Science2006, 63:1304-1316))的情況下，作為疫苗候選物，調查了在粘附和進食位點處抑制宿主的免疫應答的寄生蟲免疫調節(jié)蛋白(ffikel, S.K.等人，"Arthropod modulation of host immune responses", The Immunologyof Host-Ectoparasitic Arthropod Relationships.編輯:Wikel, S.K.，CAB Int., 1996,第107-130頁)。還研究了其他與卵黃原蛋白相似的分子和用于粘附至宿主的蛋白(Johnson, S.C.等人，Zool Studies2004, 43:8-19 ；Boxaspen, K.1CES Journal of MarineScience2006，63:1304-1316)，但是由于對于鮭魚被海虱感染的機制和病理學知之甚少，鑒定出用于預防和治療該感染的靶標還未獲成功。無論如何，通過在免疫接種試驗中評價不同疫苗候選物來進行的調查的結果已表明，參與不同生理過程的各種分子的聯(lián)合使用是用于控制外寄生物感染的可行方法。真核生物的核糖體由獨個的核糖體核糖核酸(rRNA)分子和超過80種蛋白質(其組織成大亞基和小亞基)形成。大多數(shù)核糖體蛋白是堿性的(等電點(PD >8.5)，但是也存在有一組酸性蛋白質(pl=3.0-5.0)，其在核糖體的大亞基中形成與莖類似的結構。由于其能夠被磷酸化，因而這些酸性蛋白質被命名為蛋白P (PO、Pl和P2)，其在核糖體的翻譯活性的調節(jié)中起著基本作用(Wojda 1.等人，Acta Bioch.Pol.2002，49:947-957)。蛋白P含有大約17個氨基酸的保守的C-末端區(qū)，其最后六個殘基是高度保守的，這是它們之間以及與其他物種的蛋白P的交叉免疫 反應性的基礎。蛋白PO對于60S核糖體亞基的裝配來說是極其重要的，其中PO與P1、P2、28S rRNA和因子eEF2直接結合。其的缺乏會導致產生缺少60S亞基的核糖體，后者對于蛋白質合成來說是無活性的，從而導致細胞死亡。蛋白P是高度免疫原性的，并且由于其與自身免疫疾病和與癌發(fā)生的關聯(lián)，已在人中廣泛地進行了研究。核糖體蛋白的這些應用已經通過其各自作者的專利而得到了保護。特別地，核糖體蛋白PO是針對各種原生動物和細菌的有希望的疫苗候選物。作為重組抗原(要么使用完整的蛋白質，要么使用由最后11-16個氨基酸組成的C-末端區(qū))，或者通過針對鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、犬新孢子蟲(Neospora caninum) (ZhangH.等人，Mol.Biochem.Parasitol2007, 153:141-148)、克魯茲維蟲(Trypanosoma cruzi)(Skeiky Y.A.等人，J.Tmmunol.1993, 151:5504-5515)、嬰兒利什曼原蟲(LeishmaniainfantumX Iborra S.等人，Infect.1mmunol.2003，71:6562-6572 和 2005，72:5515-5521)以及各種巴貝蟲屬(Babesia)物種(Terkawi Μ.A.等人，Vaccine2007, 25:2027-2035 ;Terkawi Μ.Α.等人，Parasitol.Res.2007，102:35-40)和痕原蟲屬(Plasmodium)物種(Chatterjee S.等人，Infect.1mmunol.2000，68:4312-4318 ;Rajeshwari K.等人，Infect.1mmunol.2004, 72:5515-5521)用裸DNA進行免疫接種，該蛋白質經證明是免疫原性的。在這些試驗的大部分中所獲得的免疫應答的特征在于:高滴度的特異性抗體的產生，該特異性抗體能夠賦予針對感染的主動和被動的保護^淋巴細胞的激活；和作為Thl型應答模式的一部分的Y干擾素(IFNY )的產生。
其作為針對各種細菌和原生動物的免疫原的用途(沒有關于在宿主中的自身免疫性質的反應的報道)歸因于該蛋白質在這些微生物與哺乳動物之間相對較低的氨基酸序列同一'I"生。最引人注目的情況是用由惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum)的核糖體蛋白PO的最后16個氨基酸組成的肽對小鼠進行免疫接種(Rajeshwari K.等人，Infect.1mmunol.2004, 72:5515-5521 )，該肽與小鼠中的該相同蛋白質的C-末端區(qū)具有68%的同一性。然而，該蛋白質或其C-末端區(qū)作為用于控制蜱和海虱感染的免疫原的用途受到在外寄生物與其宿主生物之間就該抗原而言存在的高氨基酸同一性程度的限制。
最近在長角血蝶(Haemaphy sal is longicornis)中用對于該蛋白質的表達的沉默來說特異的干擾RNA來進行的實驗顯示了在蜱的重量增益方面的顯著減少，和由在唾液腺和角質層水平上的結構損害而引起的96%的死亡率；這暗示核糖體蛋白PO對于蜱和可能地其他外寄生物的血液攝取和生存力是必需的(Gong H.等人，Vet.Parasitol.2008，151:268-278)。然而，基于該抗原的疫苗候選物的開發(fā)的缺點在于在脊椎動物與外寄生物(例如蜱和海虱)的所報道的序列之間存在高同一性程度，該同一性在該蛋白質的C-末端區(qū)中是更高的，這可能導致宿主生物中耐受性的誘導或自身抗體應答的產生?！?br> 用于控制由蜱和海虱產生的感染的化學試劑和藥物的密集使用的缺點在于化學殘留污染食品、損害環(huán)境和外寄生物形成抗性。因此，疫苗接種被認為是有希望的備選方案，并且存在鑒定新的疫苗抗原的需要，所述新的疫苗抗原能夠獨自地賦予保護或者可以摻入到現(xiàn)有疫苗中。
發(fā)明說明
本發(fā)明通過提供用于控制外寄生物感染的疫苗組合物而解決了前面提及的問題，所述疫苗組合物包含所述外寄生物的核糖體蛋白PO的肽。首次，根據(jù)在本發(fā)明中所揭示的研究結果，所述組合物包含有在外寄生物和受其侵害的生物之間很少地保守的核糖體蛋白PO的免疫原性區(qū)域作為抗原。在核糖體蛋白PO中鑒定出的該區(qū)域包含在其氨基酸267和301之間。
蛋白PO在所有生物中作為對于細胞生存力來說極其重要的核糖體結構組分的存在，對于使用這些序列以便獲得針對不同外寄生物物種的疫苗候選物來說是一種優(yōu)勢。然而，該蛋白質或其C-末端區(qū)作為用于控制蜱和海虱感染的免疫原的用途受到在外寄生物與其宿主生物之間就該抗原而言存在的高氨基酸同一性程度的限制。
通過鑒定出該蛋白質中高度免疫原性的區(qū)域(其與在這些組的生物之間具有低序列相似性的區(qū)域相一致)，在本發(fā)明中首次成功避免了這種處境。通過生物信息學預測，證明該區(qū)域與該蛋白質的具有低疏水性和高可接近性程度的區(qū)域相一致，這使其成為高度可能被暴露的氨基酸序列。
從微小扇頭蝶和血紅扇頭蝶(R.sanguineus)的幼蟲以及Caligus rogercresseyi的成年海虱的總RNA開始，通過反轉錄產生互補DNA。從這些互補DNA和特異的寡核苷酸開始，通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增出編碼這些蜱(SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2)和該海虱的核糖體蛋白PO的核苷酸序列。
相應于外寄生物血紅扇頭蜱和微小扇頭蜱的蛋白PO的多肽序列在它們之間是相同的，并且被指定為SEQ ID N0.3。該序列和C.rogercresseyi的PO的序列與其宿主生物的PO具有大于70%的序列同一性，其中對于構成被描述為該蛋白質中最具免疫原性的區(qū)域的C-末端區(qū)的最后16個氨基酸來說序列同一性更加高。在包含在氨基酸267和301之間的區(qū)域(SEQ ID N0.4，微小扇頭蜱的蛋白PO中的相應肽[pPO] ；SEQ ID N0.6，肩突硬蜱(Ixodesscapularis)的蛋白 PO 中的相應月太[pPOIs] ；SEQ ID N0.8,克氏魚風(Caligus clemensi)的蛋白PO中的相應肽[pPOCc] ；SEQ ID N0.9，鮭瘡痂魚虱(L.salmonis)的蛋白PO中的相應肽[pPOLs];和 SEQ ID N0.10，C.rogercresseyi 的蛋白 PO 中的相應肽[pPOCr])中，在所有情況下都檢測到具有較小氨基酸序列相似性的區(qū)域，其同時具有結果是暴露的和是免疫原性的可能性。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，所述疫苗組合物包含具有標識為SEQ IDN0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9 或 SEQ ID N0.10 的氨基酸序列的肽，這些序列的片段，或者展示出與這些序列的至少70%同一性的肽或多肽。本發(fā)明還涉及那些疫苗組合物，其中所指明的PO的肽與用于增加其免疫原性或增強其保護效應的其他分子相融合、相綴合或進行共施用。在這些分子中，包括載體蛋白和免疫增強劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子選自由下列組成的組:血藍蛋白、T細胞表位、形成病毒樣顆粒的蛋白質、微小扇頭蝶的蛋白Bm86、血紅扇頭蝶的蛋白Rs86和C.rogercresseyi或鮭瘡痂魚風的蛋白my32。具有35至36個氨基酸、標識為SEQ ID N0.4、6、9和10的肽，以及它們的具有20個氨基酸的片段，通過化學合成來獲得，并將其綴合至大匙孔帽貝(Megathura crenulata)的血藍蛋白(匙孔蟲戚血藍蛋白，KLH)以增強其免疫原性。用所述綴合物，采用在受控條件下的攻擊進行了免疫接種實驗， 以便評價其保護能力。分別在兔和牛中針對血紅扇頭蜱和微小扇頭蜱檢驗了肽pPO (SEQ ID N0.4)，在兔中針對肩突硬蜱評價了 pPOIs (SEQ IDN0.6)。至于肽pPOLs和pPOCr (分別為SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10)，分別針對鮭瘡痂魚風和C.rogercresseyi進行了評價,兩者都在大西洋鮭(Salmo salar)中。用含有蛋白質綴合物(pPO-KLH)和佐劑Montanide888的疫苗制劑對兔和牛進行的免疫接種，在兩種情況下都能夠誘導強有力的針對該肽的特異性體液免疫應答。在所使用的實驗動物中沒有觀察到自身免疫性質的應答出現(xiàn)的跡象，所述自身免疫性質的應答由針對肽PPO而產生的抗體對于這些哺乳動物的蛋白PO的識別和反應性引起。這通過在兔腎細胞系RK-13中的“體外”交叉反應性試驗(其使用在小鼠中獲得的針對該肽的超免疫血清)得到確認。用綴合物ρΡΟ-KLH進行的疫苗接種誘導出針對血紅扇頭蜱和微小扇頭蜱的保護，其中在這兩個蜱物種中都引起了結構損害和對于生物學參數(shù)的影響。此外，針對肩突硬蜱獲得了類似的結果，在用與血藍蛋白相綴合的該蜱的蛋白PO的合成肽(pPOIs)進行免疫接種后。用綴合物pPOLs-KLH和pP0Cr_KLH對鮭魚進行的疫苗接種誘導出針對由這兩個海虱物種引起的感染的保護，這通過“寄生蟲數(shù)目/魚”的顯著降低而得到證明。此外，還進行了使用通過重組方法獲得的pPO和pPOCr的免疫接種實驗，所述pPO和pPOCr在同一個遺傳構建物中融合至破傷風毒素和麻疹病毒融合蛋白(MVF)的T表位。作為用這些嵌合抗原進行的免疫接種實驗的結果，對于海虱的情況，發(fā)現(xiàn)相比與KLH相綴合的抗原而言，與非種系選擇性T表位相融合顯著地改善了保護。還將PPO融合至兔出血病病毒(RHDV)的病毒樣顆粒(VLP)，并且進一步證明當將該肽融合至抗原Bm86時，該肽的保護效應得到增強。這可能歸因于針對這兩種免疫原所產生的抗體的聯(lián)合效應，和/或歸因于這樣的事實，即在蜱的腸水平上由針對抗原Bm86的抗體所引起的結構損傷促進了針對核糖體蛋白PO的肽的特異性抗體的作用。至于PPOCr，將其在另一個遺傳構建物中融合至蛋白my32，并且在該情況下，獲得了在對于C.rogercresseyi的傷害方面最突出的效應,據(jù)推測可能通過所述兩種抗原的獨個的特異性效應的增強。以這種方式，在本發(fā)明中證明，基于肽pPO的疫苗組合物對于控制外寄生物(例如蜱和海虱)感染是有效的。因此，基于pPO的組合物對于控制與所述外寄生物相關的病原體的傳播也是有用的。該疫苗在藥學上可接受的佐劑中包含免疫學有效量的抗原，借助于其可以控制這些病原體的感染。如已經表示的，該疫苗中的抗原由這些外寄生物的核糖體蛋白PO的肽構成，該肽包含在所述蛋白質的氨基酸267和301之間，其相應于在所述外寄生物的該蛋白質的氨基酸序列中與其各自宿主生物中該蛋白質的相同區(qū)域具有最小相似性的區(qū)域。所述肽通過重組方法或化學合成來獲得。還可以通過重組方法來獲得包含肽PPO的融合多肽。如該技術領域中的專業(yè)人員已知的，為了通過重組方法來獲得所述抗原，可以使用在酵母、細菌、植物、昆蟲幼蟲、昆蟲細胞或哺乳動物細胞中的表達系統(tǒng)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述疫苗組合物另外可以包含疫苗佐劑。在本發(fā)明的背景下，評價了包含油性類型的佐劑的疫苗制劑。然而，作為佐劑，尤其可以使用鋁鹽、月旨質體囊泡、與免疫系統(tǒng)有關的分子(例如細胞因子)。可以以非常不同的方式來施用本發(fā)明的組合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過注射來施用所述組合物。在另一個實施方案中，借助于飼料制劑來進行施用。在向魚類施用所述組合物的情況下，可以借助于浸浴來施用這些組合物。本發(fā)明的目標還為 用于控制外寄生物感染的疫苗組合物，其包含編碼所述外寄生物的核糖體蛋白PO的肽的核酸，該肽相應于該蛋白質的氨基酸267和301之間的區(qū)域；并且通過用裸DNA進行免疫接種而產生針對所述肽的免疫應答。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述肽具有標識為 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9 或 SEQ IDN0.10的氨基酸序列，或者是這些序列的片段，或者是展示出與這些序列的至少70%同一性的肽或多肽。此外，本發(fā)明還涉及包含在外寄生物的核糖體蛋白PO的氨基酸267和301之間的區(qū)域在制備用于控制由這些寄生蟲引起的感染或與之相關的病原體的傳播的疫苗組合物中的用途。在一個實施方案中，所述肽具有標識為SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ IDN0.8,SEQ ID N0.9或SEQ ID N0.10的氨基酸序列，或者是這些序列的片段，或者是展示出與這些序列的至少70%同一性的肽或多肽。附圖簡述

圖1.在微小扇頭蜱和血紅扇頭蜱的核糖體蛋白PO中存在的氨基酸殘基的可接近性程度的預測。相應于定義為SEQ ID N0.4的序列的區(qū)域用圓圈標出。圖2.通過ELISA來檢測的抗-PO肽的特異性IgG抗體的應答，在用綴合物pP0_KLH進行免疫接種的BALB/c小鼠的血清中。數(shù)據(jù)表示為抗體平均滴度的倒數(shù)，所述抗體平均滴度被確定為具有大于陰性血清的光密度(OD)平均值的三倍數(shù)的OD平均值的最后血清稀釋度。標準偏差通過正向的誤差條來表示。在第O天，對于任何動物未檢測到抗體滴度。
圖3.用針對PO而在小鼠中產生的多克隆抗體，通過Western印跡法分析的在兔細胞系RK-13中扇頭蜱屬(Rhipic印halus)蜱的核糖體蛋白PO的表達圖式。1.分子量標準；2.用質粒pAdTrack-PORs轉染的RK-13細胞的裂解物，在還原條件下；3.用質粒PAdTrack-PORs轉染的RK-13細胞的裂解物，在非還原條件下；4.未轉染的RK-13細胞的裂解物，在還原條件下；5.用質粒pAdTrack-PORs轉染的RK-13細胞的裂解物在還原條件下在十二烷基硫酸鈉存在下在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳(SDS-PAGE)。
圖4.通過ELISA來檢測的抗-KLH、抗-PO肽和抗_Bm86的IgG抗體的應答，在用這些抗原進行免疫接種的兔的血清中(實施例6)。數(shù)據(jù)表示為抗體平均滴度的倒數(shù)，所述抗體平均滴度被確定為具有大于根據(jù)相應情況的陰性對照組的OD平均值的三倍數(shù)的OD平均值的最后血清稀釋度。標準偏差通過正向的誤差條來表示。在該試驗的第O天，對于任何組未檢測到針對所述抗原的特異性抗體滴度。
圖5.在實施例6的經免疫接種的兔中血紅扇頭蜱的幼蟲、若蟲和成蟲的回收率。數(shù)據(jù)表示為在不同實驗組中回收的幼蟲、若蟲和成蟲的百分比的平均值。組的標準偏差通過正向的誤差條來表示。在該圖中，用不同的字母指出了在實驗組之間存在的統(tǒng)計學上顯著的差異(AN0VA和Bonferroni多重比較檢驗[p〈0.01]。為了該分析，事先將比率數(shù)據(jù)轉換為其平方根的反正弦)。
圖6.從在實施例6的不同實驗組上飼養(yǎng)的幼蟲開始，血紅扇頭蜱的剛蛻皮的若蟲。(A)陰性對照組；(B)用Bm86進行免疫接種的組；(C)用綴合物ρΡΟ-KLH進行免疫接種的組；和(D)從在用pPO-KLH進行免疫接種的兔上飼養(yǎng)的幼蟲開始，蛻皮的死亡若蟲的外觀。
圖7.從在實施例6中進行免疫接種的兔上飼養(yǎng)的飽血雌蜱(teleoginas)開始，血紅扇頭蜱的卵孵化百分比。數(shù)據(jù)表示為平均值/組。每個組的標準偏差通過正向的誤差條來表示。統(tǒng)計學上顯著的差異通過星號來指示(ANOVA和Bonfeironi多重比較檢驗(ρ〈0.05))。
圖8.相應 于用與不同的免疫增強劑分子相融合的該肽的變體進行免疫接種的兔，抗-PO肽的IgG抗體的應答(A)，以及血紅扇頭蜱的幼蟲、若蟲和成蟲的存活率(B)。標準偏差通過正向的誤差條來表不。
圖9.在巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)MP36株的破裂沉淀物中嵌合蛋白Bm86_pP0的表達圖式的通過Western印跡法的分析,其中使用針對肽pPO (A)和針對蛋白Bm86 (B)而產生的超免疫血清。對于這兩種情況，泳道1.在還原條件下的破裂沉淀物，泳道2.在非還原條件下的破裂沉淀物，泳道3.通過用酶PNGase F進行消化而去糖基化的蛋白質。
圖10.通過ELISA來檢測的抗-PO肽和抗_Bm86的IgG抗體的應答，在獨個地用這些抗原、聯(lián)合地用這些抗原或者用嵌合蛋白Bm86-pP0進行免疫接種的牛的血清中。數(shù)據(jù)表示為抗體平均滴度的倒數(shù)，所述抗體平均滴度被確定為具有大于陰性對照組的OD平均值的三倍數(shù)的OD平均值的最后血清稀釋度。標準偏差通過正向的誤差條來表示。在該試驗開始時，對于任何組未檢測到抗體滴度。
圖11.在實施例8中進行免疫接種的牛上飼養(yǎng)的微小扇頭蜱的飽血雌蜱和卵的重量平均值。在該圖中，通過不同的字母指出了在實驗組之間存在的統(tǒng)計學上顯著的差異，以及相對于陰性對照組而言實驗組中的每一個組的統(tǒng)計學上顯著的差異(ANOVA和Newman-Keuls 多重比較檢驗[ρ〈0.05])。圖12.通過ELISA來檢測的抗-pPO I s的IgG抗體的應答，在用該抗原進行免疫接種并隨后用肩突硬蜱進行攻擊的兔的血清中。數(shù)據(jù)表示為抗體平均滴度的倒數(shù)，所述抗體平均滴度被確定為具有大于陰性對照組的OD平均值的三倍數(shù)的OD平均值的最后血清稀釋度。標準偏差通過正向的誤差條來表示。在該試驗的第O天，對于任何組未檢測到抗體滴度。圖13.在用綴合物pPOIs-KLH進行免疫接種的兔中肩突硬蜱的生物學參數(shù)的表現(xiàn)。顯示了幼蟲的生存力以及若蟲和成蟲的回收率(A)，以及卵的孵化百分比(B)。數(shù)據(jù)表示為平均值/組。標準偏差通過正向的誤差條來表示。在該圖中，用星號來指出相比于陰性對照組而言存在的統(tǒng)計學上顯著的差異(AN0VA和Bonferroni多重比較檢驗[p〈0.05])。所提出的解決方案的優(yōu)點:在本發(fā)明中證明了疫苗制劑(其含有包含在不同外寄生物的核糖體蛋白PO的氨基酸267和301之間的肽)針對微小扇頭蜱、血紅扇頭蜱和肩突硬蜱這些蜱以及稱為海虱的外寄生物(鮭瘡痂魚風和C.rogercresseyi)的保護能力，而沒有與宿主生物的該蛋白質的交叉反應的出現(xiàn)。在所有免疫接種中，以與免疫增強劑分子相綴合或相融合的形式來施用pPO,以改善動物的免疫應答。在蜱 的情況下，與蛋白Bm86相融合或與之相聯(lián)合的該肽(或其片段)的應用誘導了比當獨個地使用時由所述抗原所引起的那種更大程度的對于這些節(jié)肢動物的生存力和生物學參數(shù)的損害。因此，作為綜合防治計劃的一部分來應用該嵌合蛋白或者它們的聯(lián)合，可以導致由這些或其他蜱物種引起的感染的更大的控制，以及由其傳播的血寄生蟲疾病的發(fā)病率的降低。在海虱的情況下，當將pPOCr融合至非種系選擇性T表位和蛋白my32時，觀察到對于它們的最大損害。在大多數(shù)節(jié)肢動物物種與海虱之間所述肽的高氨基酸保守程度以及該序列與哺乳動物和魚類的所述蛋白質的相應片段的低同一性，使得核糖體蛋白PO的該肽(或其片段)成為用于開發(fā)針對外寄生物的疫苗的抗原。實施方式的詳細描述/實施例實施例1.編碼微小扇頭蝶、血紅扇頭蝶和C.rogercresseyi的核糖體蛋白PO的核苷酸序列的擴增和克隆從微小扇頭蝶和血紅扇頭蝶的幼蟲以及C.rogercresseyi的成蟲的總RNA開始，通過反轉錄反應獲得互補DNA。所述反應遵照在“Reverse Transcription System”試劑盒(Promega, USA#A3500)中所描述的指導來進行。從所獲得的互補DNA開始，通過聚合酶鏈反應(PCR)來擴增出編碼微小扇頭蜱和血紅扇頭蜱的核糖體蛋白PO的核苷酸序列(SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2)以及C.rogercresseyi的PO的序列。作為用于蝶的PCR的引物，使用從在 Genebank 基因庫(http:1Iwm.ncb1.nlm.nih.gov/Genbank/)中對于長角血賊的 PO所報道的登錄號為EU048401的核苷酸序列開始設計出的合成寡核苷酸:“ IH向”寡核苷酸:5，ATGGTCAGGGAGGACAAGACCACCTGG3，“反向”寡核苷酸:5’CTAGTCGAAGAGTCCGAAGCCCATGTCG3’ 。
作為用于從C.rogercresseyi的cDNA開始的擴增的引物,使用從在Genebank基因庫中對于蝶(長角血蝶和肩突硬蝶)和昆蟲(黑腹果蜆(Drosophila melanogaster)、五帶淡色庫蚊(Culex quinquefasciatus)和埃及伊蚊(Aedes aegypti))的不同物種的PO所報道的核苷酸序列開始設計出的簡并合成寡核苷酸:
“ IH向”寡核苷酸:
F15’ ATGGGCAAGAACAC(C/G)ATGAT(C/G)CGCAA(G/A)GC3’
F25’ ATGG(T/G)(T/C)AGGGAG(G/A)ACAA(G/A)(A/G)C (C/A/T)
(G/A) C (C/G) TGGAA3’
“反向”寡核苷酸:
Rl5’ TC (G/A) AA (A/C/G) AG (G/A/T) C (C/T) GAA (T/G/A) CCCAT (A/G) TC (A/G) TC3’。
作為與蜱的互補DNA的反應的結果，在兩種情況下都獲得了大約957bp的DNA條帶，將其克隆入商業(yè)載體pGEM-Teasy (Promega, USA)中以對其進行測序。在從C.rogercresseyi的互補DNA開始進行PCR反應的情況下,對于寡核苷酸組合F1-R1,獲得了大約780bp的DNA條帶，和對于寡核苷酸組合F2-R1，獲得了大約960bp的條帶。在這兩種情況下，將所述條帶克隆入商業(yè)載體pGEM-TEasy (Promega, USA)中以對其進行測序。
實施例2.生物信息學分析
通過使用程序BlastX和ClustalW (http://www.eb1.ac.uk/)來進行氨基酸序列同一性的分析。從由蜱的互補DNA擴增出的DNA序列開始推導出的具有318個氨基酸的序列在它們之間是相同的(SEQ ID N0.3)，并且相對于長角血蜱和肩突硬蜱的核糖體蛋白PO的序列(Genebank，登錄號DQ066213)而言，分別具有95%和93%的同一性。該序列還分別與從包括在彩飾花蝶(Amblyoma variegatum)的數(shù)據(jù)庫的TC533中的部分閱讀框開始推導出的多肽序列具有96%的同一'丨生,和與從在非洲扇頭蝶(R.appendiculatus)和微小扇頭蝶的ESTs數(shù)據(jù)庫的TC1424和TC9038中所包含的兩個開放閱讀框開始推導出的多肽序列具有 99% 的同一件(http: //compbi0.dfc1.harvard, edu/index, html )。
相應于血紅扇頭蜱和微小扇頭蜱的蛋白PO的多肽序列(被命名為SEQ ID N0.3)還與牛的PO (家牛(Bos taurus), Genebank登錄號AAX09097)具有70%的序列同一性,其中對于構成被描述為該蛋白質中最具免疫原性的區(qū)域的C-末端區(qū)的最后16個氨基酸來說具有87%的序列同一性。該序列還與犬的蛋白PO (家犬(Canis familiar is), Genebank登錄號XM535894)具有71%的序列同一性。
在從C.rogercresseyi的互補DNA序列開始推導出的PO的氨基酸序列的情況下，觀察到與對于其他海虱物種(例如克氏魚虱 和鮭瘡痂魚虱)所報道的序列的高同一性百分比。像在蜱和其宿主的情況下一樣，在海虱的PO與大西洋鮭的PO (Genebank登錄號ACI70184)之間存在高的序列同一性。
在這些外寄生物的PO與其宿主生物的PO之間存在的高序列同一性使得使用該分子作為用于控制其感染的疫苗抗原是非常危險的，因為可能產生針對宿主的該蛋白質的自身免疫。對于使用在所有這些生物中高度保守的C-末端區(qū)(最后11-16個氨基酸)來說，該危險性增加。
與哺乳動物的蛋白PO的序列具有較小序列相似性的所述兩個蜱物種的蛋白PO的區(qū)域包含在氨基酸267和301之間(SEQ ID N0.4)。誦討俥用在網站http: //www.ca.expasy.0rR/sprot/中所包括的生物信息學工具,證實所述蛋白質的該區(qū)域與具有低疏水性的區(qū)域相一致，其高度可能在所述蛋白質中被暴露(圖1)。隨后，評價了該肽的免疫原性能力以及其作為用于控制由這些或其他蜱物種引起的感染的疫苗抗原的效用。通過翻譯編碼Caligus rogercresseyi的蛋白PO的克隆出的基因的序列,在包含在氨基酸267和301之間的相同區(qū)域中鑒定出與大西洋鮭的PO具有低同源性的類似的肽(SEQ ID N0.10, pPOCr)ο此外，還在對于克氏魚虱(Genebank登錄號AC014779)和鮭瘡痂魚虱(Genebank，登錄號AC012290)所報道的蛋白PO中鑒定出具有較低氨基酸相似性的相同區(qū)域(SEQ ID N0.8 和 9，pPOCc 和 pPOLs)。實施例3.肽的合成和與KLH的綴合通過化學合成來獲得定義為SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10的肽以及所述肽的具有20個氨基酸的片段，并且通過使用HPLC系統(tǒng)的反相色譜法(反相高壓液相色譜法)進行純化。獲得了 15毫克的每種合成肽，具有99.3%的純度。通過質譜法驗證了每種肽的分子質量。為了增強所述肽的免疫原性能力，將其與蛋白KLH相融合。通過可溶性碳二亞胺方法來進行所述合成肽與KLH的綴合。它們的連接通過使用琥珀酸酐作為間隔試劑來進行。綴合物的分開通過凝膠過濾層析來進行。通過雙金雞寧酸方法來估計每種綴合物的最終濃度。

實施例4.針對微小扇頭蜱和血紅扇頭蜱的核糖體蛋白PO的肽(pPO)的小鼠超免疫血清的獲得使用六只體重為18至22g的六周齡的雄性Balb/c小鼠,它們在第0、14、21和28天通過皮下途徑用250 μ g的在弗氏佐劑中的綴合物ρΡΟ-KLH (等價于125 μ g肽和125 μ gKLH)進行免疫接種。在第0、7、14、21、40和65天進行血液抽取。在第65天對動物進行放血，并且通過在3500rpm下離心10分鐘來獲得血清。通過間接ELISA來監(jiān)測抗體動力學。為了包被平板,使用I μ g/孔的pPO，并且用稀釋度為1:15000的與辣根過氧化物酶相綴合的抗-小鼠IgG來進行檢測。使用含有在
0.1M檸檬酸、0.2M NaH2PO4 (pH5.0)和0.015%過氧化氫中的0.4mg/mL鄰苯二胺的底物溶液來進行揭示。用2.5M H2SO4來終止反應。抗體滴度被建立為最大稀釋度的倒數(shù)，在該最大稀釋度下，所考慮的血清的OD的平均值為陰性對照血清的OD的平均值的三倍。從該實驗的第14天開始，經免疫接種的動物顯示出針對所述肽的特異性抗體的滴度，其在第65天對于所述動物中的兩只達到了 1:10240 (圖2)。在表達和“體外”交叉反應性試驗中，使用包含等量的從六只用綴合物ρΡΟ-KLH進行免疫接種的小鼠獲得的超免疫血清的混合物作為多克隆抗體。實施例5.扇頭蜱屬蜱的核糖體蛋白PO在細胞系RK-13中的表達以及“體外”交叉反應性試驗將編碼血紅扇頭蜱的核糖體蛋白PO的DNA序列(SEQ ID N0.2)克隆到質粒pAdTrack-CMV (9.2kb)中，在人巨細胞病毒的即時/早期啟動子/增強子(pCMVITh)和猿猴空泡病毒SV40的晚期終止/多腺苷酸化信號的控制之下。該載體在其序列中包含編碼綠色熒光蛋白(GFP)的報道基因和賦予對于卡那霉素的抗性的基因(He T.C.等人，Proc NatlAcad Sci USA.1998,95:2509-2514)。使用所得到的質粒轉染兔腎細胞系RK-13。按照制造商的指導，使用lipofectamine (Invitrogen, USA)來進行所述轉染。在24小時后,通過在光學顯微鏡下(使用紫外光和40X的放大倍數(shù))觀察GFP的表達來驗證轉染效率。
在48小時后，進行細胞裂解，并且使所獲得的細胞提取物經歷在10%聚丙烯酰胺凝膠上的電泳(SDS-PAGE),其中使用還原和變性條件，根據(jù)Laemmli (LaemmliU.K.，Naturel970, 227:680-685)所描述的技術。
使用在小鼠中獲得的針對所述肽的多克隆血清(稀釋度1:3000)作為一抗和使用與過氧化物酶相綴合的抗-小鼠IgG (以稀釋度1:10000)作為二抗，通過Western印跡法來分析扇頭蜱屬蜱的核糖體蛋白PO的表達圖式(圖3)。在相應于用所述質粒轉染的細胞的樣品中，檢測到大約35kDa的具有對于蛋白PO所預期的大小的單一條帶。在非還原條件下進行走樣的樣品中類似條帶的存在表明，該肽在所述蛋白質的三維結構中是暴露的。在相應于陰性對照樣品(未轉染的兔細胞RK-13)的泳道中未檢測到任何條帶，這表明在小鼠中針對扇頭蜱屬蜱的蛋白PO的具有35個氨基酸的肽而產生的抗體不能識別在兔的蛋白PO中的相應肽，從而證明在蜱的該免疫原性肽與兔的核糖體蛋白PO中的相應肽之間不存在交叉反應性。
實施例6.扇頭蜱屬蜱的肽pPO的免疫原性以及其針對血紅扇頭蜱感染的保護能力的測定
進行評價微小扇頭蜱和血紅扇頭蜱的核糖體蛋白PO的肽作為針對血紅扇頭蜱的疫苗抗原的效用。為此，將20只體重超過2.5kg的12至14周齡的雄性白色新西蘭兔隨機分成三個實驗組，其中對于pPO-KLH組和Bm86組，每組7只兔子，和對于用KLH進行免疫接種的陰性對照組，每組6只兔子。將包含在IX PBS中的免疫原佐以Montanide888VG(制備成在礦物油中10%)，以60/40的免疫原/佐劑比例。如下來分配實驗組:
Hl:在第O、21、36和60天，以500 μ g/動物(等價于250 μ g肽/動物)的劑量用綴合物pPO-KLH通過皮下途徑進行免疫接種；
組2 (陰件對照):在第O、21、36和60天，以250 μ g/動物的劑量用KLH通過皮下途徑進行免疫接種；
組3(陽性對照):在第O和28天，以100 μ g/動物的劑量用微小扇頭蜱的蛋白Bm86通過皮下途徑進行免疫接種。
該試驗持續(xù)120天的時間。在第0、14、21、28、36、59、73和87天，在動物中取血清樣品以測量抗體應答。在整個試驗期間每天觀察動物的一般行為和體溫。在該實驗的第72天，放置三個小室/動物，并且在第73天，用血紅扇頭蜱的大約250只幼蟲、100只若蟲和50只新成蟲(20只雄蜱和30只雌蜱)感染每只動物。在第75和120天之間，進行蜱的收集、計數(shù)、稱重和蛻皮分析。將收集的幼蟲和若蟲維持在處于28°C的培養(yǎng)箱中，具有80%的相對濕度和12:12小時(光照:黑暗)的光周期。在相同條件下將飽血雌蜱(吸飽血的雌蜱)維持在固定不動的獨個塑料平板中直至產卵。
在任何動物中沒有觀察到正常行為的改變，也沒有觀察到發(fā)熱。通過與前面所描述的類似的間接ELISA研究了針對所述免疫原中的每一種所產生的體液應答，其中用I μ g/孔的每種抗原來包被 平板，并且在該情況下使用以1:10000稀釋度的與過氧化物酶相綴合的抗-兔IgG抗體(SIGMA)。從每個組中的獨個值來確定抗體滴度的平均值。針對Bm86的特異性滴度僅在用Bm86進行免疫接種的組3的動物中獲得。針對PO的肽(pPO)的特異性滴度僅在用綴合物ρΡΟ-KLH進行免疫接種的動物的組I中獲得，而針對KLH的特異性滴度在用綴合物ρΡΟ-KLH和用單獨的KLH進行免疫接種的組I和組2中獲得(圖4)。為了研究所述免疫原對于血紅扇頭蜱的效應，分析了其各種生物學參數(shù)的表現(xiàn)。在幼蟲、若蟲和成蟲中，分析了平均進食時間和回收率。在幼蟲和若蟲的情況下，還分析了蛻皮和所獲得的后期蜱感染首次用于實驗的動物的能力。在成蟲的情況下，還研究了吸飽血的雌蜱的重量、卵的重量和孵化百分比。根據(jù)先前所描述的(Bennett G.F.等人，ACarologial974，16:52-61)來計算至卵的轉化效率指數(shù)，例如轉化成卵的雌蜱的重量百分比。一般地，用Bm86進行免疫接種的組的幼蟲、若蟲和新成蟲比在對照動物和用PO肽進行疫苗接種的動物上的相同階段蜱花費更多的時間來進食。通過ANOVA和Bonferroni多重比較檢驗(P〈0.01)比較了所述三個組之間幼蟲、若蟲和新成蟲的回收率值。在幼蟲和若蟲的情況下，作為相對于幼蟲和蛻皮的若蟲的量而言能夠感染首次用于實驗的動物的下一階段蜱的最終量，分析了存活率或生存力。對于新成蟲，作為在溫育后能夠存活且具有產卵能力的蜱的最終數(shù)目，測量了存活率。幼蟲回收率的平均值在實驗組之間未顯示出統(tǒng)計學上顯著的差異。在若蟲回收率的情況下，盡管有回收到更少的在用ρΡΟ-KLH和用Bm86進行免疫接種的組上飼養(yǎng)的若蟲的傾向，但相對于用KLH進行免疫接種的對照組而言不存在統(tǒng)計學上顯著的差異。在成蟲的情況下，關于用抗原PPO進行疫苗接種的組，回收率顯示出相對于陰性對照組和用Bm86進行疫苗接種的組而言統(tǒng)計學上顯著的差異(圖5)。相對于在對照組上所收集的而言，觀察到在從在用所述兩種抗原進行疫苗接種的組中飼養(yǎng)的幼蟲開始的剛蛻皮的若蟲的生存力和外觀方面的嚴重損害。在用pPO-KLH進行疫苗接種的組中，觀察到剛蛻皮的若蟲(其具有明顯的形態(tài)學損害)的高死亡率，相對于陰性對照組和用Bm86進行疫苗接種的組而言，在用pPO-KLH進行疫苗接種的組中存在有該參數(shù)的統(tǒng)計學上顯著的差異。還有在用Bm86進行疫苗接種的組和陰性對照組之間在生存力方面的顯著差異(圖6)。在表I中顯示了每個實驗組中的死亡率百分比。表1.從在所述三個實驗組中飼養(yǎng)的幼蟲開始的剛蛻皮的若蟲的死亡率百分Ito不同的字母意味著經轉換的數(shù)據(jù)的通過ANOVA和隨后`的Bonferroni多重比較檢驗(P〈0.001)而獲得的統(tǒng)計學上顯著的差異。
權利要求
1.用于控制外寄生物感染的疫苗組合物，其包含所述外寄生物的核糖體蛋白PO的肽，該肽相應于該蛋白質的氨基酸267和301之間的區(qū)域。
2.根據(jù)權利要求1的組合物，其中所述肽具有標識為SEQID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQID N0.8、SEQ ID N0.9或SEQ ID N0.10的氨基酸序列，或者是這些序列的片段，或者是展示出與這些序列的至少70%同一性的肽或多肽。
3.根據(jù)權利要求1和2的組合物，其中將所述肽與用于增加其免疫原性或增強其保護效應的其他分子相融合、相綴合或進行共施用。
4.根據(jù)權利要求3的組合物，其中所述分子選自由下列組成的組:血藍蛋白、來自破傷風毒素或麻疹病毒融合蛋白的T細胞表位、形成兔出血病病毒的病毒樣顆粒的蛋白質、微小扇頭蝶的蛋白Bm86、血紅扇頭蝶的蛋白Rs86和C.rogercresseyi或鮭瘡痂魚風的蛋白my320
5.根據(jù)權利要求1的組合物，其特征在于，所述組合物對于控制蜱和/或海虱感染和/或其相關病原體的傳播來說是有效的。
6.根據(jù)權利要求1和2的組合物，其中所述肽通過重組方法或化學合成來獲得。
7.根據(jù)權利要求6的組合物，其中通過重組方法的所述肽的獲得借助于在酵母、細菌、植物、昆蟲幼蟲、昆蟲細胞或哺乳動物細胞中的表達系統(tǒng)來實現(xiàn)。
8.根據(jù)權利要求1的組合物,其另外還包含疫苗佐劑。
9.根據(jù)權利要求1和2的組合物，其特征在于，所述組合物通過下列方式來進行施用:通過在0.001-25 μ g肽/g經疫苗接種的動物的體重這樣的范圍內實施注射；借助于在0.01-300 μ g肽/g飼料這樣的范圍內的飼料制劑；或者借助于在0.0l-1Omg肽/L水這樣的范圍內的用于魚類的浸浴。
10.用于控制外寄生物感染的疫苗組合物，其包含編碼所述外寄生物的核糖體蛋白PO的肽的核酸，該肽相應于該蛋白質的氨基酸267和301之間的區(qū)域；并且通過用裸DNA進行免疫接種而產生針對所述肽的免疫應答。
11.根據(jù)權利要求10的組合物，其中所述肽具有標識為SEQID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9或SEQ ID N0.10的氨基酸序列，或者是這些序列的片段，或者是展示出與這些序列的至少70%同一性的肽或多肽。
12.外寄生物的核糖體蛋白PO的肽在制備用于控制外寄生物感染或與之相關的病原體的傳播的疫苗組合物中的用途，該肽相應于該蛋白質的氨基酸267和301之間的區(qū)域。
13.根據(jù)權利要求12的用途，其中所述肽具有標識為SEQID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQID N0.8、SEQ ID N0.9或SEQ ID N0.10的氨基酸序列，或者是這些序列的片段，或者是展示出與這些序列的至少70%同一性的肽或多肽。
14.根據(jù)權利要求12的用途，其中所述疫苗組合物通過下列方式來進行施用:通過在0.001-25μ g肽/g經疫苗接種的動物的體重這樣的范圍內實施注射；借助于在.0.01-300 μ g肽/g飼料這樣的范圍內的飼料制劑；或者借助于在0.0l-1Omg肽/L水這樣的范圍內的用于魚類的浸浴。
全文摘要
本發(fā)明涉及核糖體蛋白P0的肽在制備疫苗組合物中的用途，所述疫苗組合物用于控制外寄生物感染和因此其相關病原體的傳播。所述肽位于蛋白P0的氨基酸267和301之間，并且可以通過重組方法或借助化學合成來獲得?？梢詫⑺鲭娜诤现凛d體蛋白或肽，或者融合至免疫增強劑并包含在油性制劑中。包含所述肽的疫苗制劑賦予針對蜱和稱為“海虱”的外寄生物的保護，而在宿主生物中不出現(xiàn)自身免疫的產生。在所述蜱中，可以提及微小扇頭蜱(Rhipicephalus microplus)、血紅扇頭蜱(Rhipicephalus sanguineus)和肩突硬蜱(Ixodes scapularis)這些物種，和在所述海虱中，包括魚虱屬(Caligus)和瘡痂魚虱屬(Lepeophtheirus)的那些。
文檔編號A61K39/00GK103153336SQ201180049619
公開日2013年6月12日 申請日期2011年9月26日 優(yōu)先權日2010年9月28日
發(fā)明者A·羅德里格斯馬龍, E·費爾南德斯迪亞斯, M·P·埃斯特拉達加西亞, Y·卡普里奧岡薩雷斯 申請人:遺傳工程與生物技術中心