專利名稱：膠原粉末和/或膠原衍生物粉末及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過將由膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物構(gòu)成的平均粒徑I 1，000 μ m的粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑后進(jìn)行干燥而得到的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末及其制造方法。
背景技術(shù)：
膠原具有3根多肽鏈纏繞成螺旋的結(jié)構(gòu)，約300nm的多個(gè)膠原分子通過每個(gè)錯(cuò)開67nm而凝聚(會(huì)合)從而形成長(zhǎng)膠原纖維。膠原是形成魚、豬、牛等的原皮、腱、骨等的主要蛋白質(zhì)，但在生物體內(nèi)所含的大部分在水中是不溶性的。盡管膠原是不溶性的，但是生物體成分從而具有安全性良好、由于在動(dòng)物之間相同性高因而難以引起免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。因此，正在研究在食品、醫(yī)藥品、化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用，正在開發(fā)各種可溶化方法、可溶化膠原的利用方法。作為可溶化膠原，除了將在動(dòng)物的皮、骨等原料中所含的微量可溶性膠原通過稀酸提取而得到的膠原以外，還有添加蛋白酶等酶來(lái)可溶化而得到的膠原(專利文獻(xiàn)I)、添加堿來(lái)可溶化而得到的膠原(專利文獻(xiàn)2)等。另一方面，水溶性膠原由于含水分量多，在透明的溶液化狀態(tài)下的熱改性溫度低，因而也有提高了熱改性溫度的膠原(專利文獻(xiàn)3)。在化妝品的配方中所采用的pH范圍內(nèi)具有等電點(diǎn)的膠原的水不溶性凝聚體(會(huì)合體)，由于是乳白色且不均勻等理由，認(rèn)為不適于作為化妝品原料，但發(fā)現(xiàn)將具有PH5.5 8.5的等電點(diǎn)的膠原水溶液調(diào)整至其等電點(diǎn)付近的PH而得到的凝聚體的熱改性溫度顯著提高，這樣的凝聚體就可以作為化妝品原料來(lái)使用。實(shí)施例中，在等電點(diǎn)為PH約7.0的膠原溶液中添加最終濃度為5質(zhì)量％的氯化鈉來(lái)進(jìn)行鹽析，將所得的膠原沉淀物由鹽酸溶解，之后由氫氧化鈉中和，從而得到凝聚體的分散物。未改性的膠原是具有特有的三重螺旋結(jié)構(gòu)的棒狀分子，其水溶液耐熱性低，經(jīng)過熱處理容易破壞膠原的螺旋結(jié)構(gòu)。上述專利文獻(xiàn)3中，使用所得的未改性膠原來(lái)評(píng)價(jià)人皮膚表皮細(xì)胞的接著性，明膠的情況下30分鐘培養(yǎng)后的接著性全無(wú)，3小時(shí)培養(yǎng)后是能夠觀察到一點(diǎn)接著性的程度，但在使用未改性膠原的情況下，30分鐘培養(yǎng)后觀察到顯著的接著性。未改性的膠原溶液在常溫下也有改性的可能性，關(guān)于保管需要冷藏等溫度管理。鑒于這樣的膠原的保存性，有使用干燥膠原的方法(專利文獻(xiàn)4)。制造方法為，將膠原溶液由噴嘴吐出到揮發(fā)性的親水性有機(jī)溶劑介質(zhì)中，生成絲狀物或膜狀物，將該絲狀物等干燥，進(jìn)行細(xì)切或粉碎得到粒狀或粉狀的膠原干燥物。記載了如下要點(diǎn)，即吐出至所述親水性有機(jī)溶劑介質(zhì)中的膠原溶液的膠原濃度為3 10質(zhì)量％、由噴嘴的吐出速度為I 30m/min是合適的。此外，還有源自魚皮的膠原衍生物的干燥物(專利文獻(xiàn)5)。為了降低源自魚的膠原的臭氣，特征為將有機(jī)溶劑處理和離心分離處理進(jìn)行組合，進(jìn)而調(diào)制作為膠原的酰基化膠原等的膠原衍生物。實(shí)施例2中，在對(duì)魚皮進(jìn)行有機(jī)溶劑處理和離心分離處理后，通過醋酸酸性而將膠原可溶化，通過鹽析而得到膠原沉淀物，將其凍結(jié)干燥而得到膠原干燥物。此夕卜，實(shí)施例4中，對(duì)魚皮進(jìn)行有機(jī)溶劑處理和離心分離處理，在沉淀物中添加氫氧化鈉，攪拌一夜，離心分離后，在沉淀中加入檸檬酸水溶液并提取膠原，添加檸檬酸鈉使膠原沉淀，在該膠原沉淀物中添加氫氧化鈉溶液，調(diào)整至PH10，與琥珀酸酐發(fā)生作用來(lái)得到琥珀化膠原，然后通過鹽酸酸性使琥珀化膠原沉淀，將所得的沉淀凍結(jié)干燥，得到膠原干燥物。此外，膠原因處理方法不同而等電點(diǎn)各異，在酸性條件下進(jìn)行可溶化的膠原的等電點(diǎn)存在于pH7 9.5，因此，在pH5以上溶解性變差，生成沉淀凝集，鑒于此，還有將膠原酯化而提高水溶性的方法(專利文獻(xiàn)6)。專利文獻(xiàn)6中，預(yù)先在動(dòng)物組織的狀態(tài)下進(jìn)行膠原的酯化反應(yīng)，然后進(jìn)行酯化膠原的提取操作。由此，可以以簡(jiǎn)單的工序低價(jià)地制造酯化膠原。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:日本特公昭44-1175號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:日本特公昭46-15033號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3:日本特開2000-128764號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4:日本特開平6-228505號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5:日本特開2000-256398號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6:日本特開平8-27192號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
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發(fā)明所要解決的課題由于維持三重螺旋結(jié)構(gòu)的未改性的膠原的保濕性良好且對(duì)于人皮膚表皮細(xì)胞的接著性良好，因此是化妝品配比、醫(yī)療用的用途開發(fā)所要求的化合物。但是，溶解于溶液的膠原的熱改性溫度低，即使在常溫也會(huì)改性，需要冷藏保存。即，將維持了三重螺旋結(jié)構(gòu)的膠原在溶解的狀態(tài)下混合的膠原化妝品，為了防止膠原的改性，需要在冰箱等中保存，使用上不便利。此外，由于膠原在等電點(diǎn)容易析出，如果因細(xì)菌感染等溶解液的PH變動(dòng)則溶液變得白濁，或因析出而易于發(fā)生堵塞等。因此，希望開發(fā)在溶解時(shí)構(gòu)成三重螺旋結(jié)構(gòu)的未改性的膠原粉末的制造方法。另一方面，由于膠原會(huì)因微量水分而膨潤(rùn)，因此不易于制造粉末。在上述專利文獻(xiàn)4記載的方法中，為了得到干燥膠原，將可溶化膠原溶液在有機(jī)溶劑中吐出而纖維化，但纖維化的操作極為復(fù)雜。此外，專利文獻(xiàn)5雖然對(duì)膠原進(jìn)行凍結(jié)干燥而得到膠原干燥物，但處理時(shí)間長(zhǎng)，所需的必要的干燥能量大。進(jìn)一步，膠原本身是保濕性良好的化合物。如上述專利文獻(xiàn)6的比較例I所示，記載了:嘗試將端膠原(atelocollagen)進(jìn)行鹽析而得到的膠原的沉淀物由乙醇洗凈，但由于膠原纖維中浸入了含有食鹽的水而無(wú)法除去。這樣的話，在膠原的干燥中，需要凍結(jié)干燥、噴霧干燥等技術(shù)，制造工序、裝置變得復(fù)雜。因此，希望開發(fā)出不需復(fù)雜工序、簡(jiǎn)便地調(diào)制膠原粉末的方法。另一方面，未改性膠原，如上述專利文獻(xiàn)3所示，具有細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的接著性方面良好等活性。因此，即使是膠原粉末，在將其溶解時(shí)，也需要維持三重螺旋結(jié)構(gòu)。例如，有經(jīng)過加壓噴嘴從塔頂供給含有目標(biāo)成分的溶液，輸送熱風(fēng)來(lái)造粒的方法等，但膠原易于熱改性，這樣的方法來(lái)造粒也很困難。因此，希望開發(fā)出制造工序簡(jiǎn)易、制造能量少、溶解時(shí)能構(gòu)成三重螺旋結(jié)構(gòu)的未改性的膠原粉末的制造方法。進(jìn)一步，本來(lái)可溶性膠原具有依存于提取方法的等電點(diǎn)，可溶性膠原在等電點(diǎn)的溶解性低。因此，使用中性化妝水等來(lái)溶解干燥膠原是困難的。因此，在用于化妝品用途時(shí)，希望有在一般化妝品的PH5.5 8.5能快速溶解的膠原粉末。對(duì)于將膠原粉末化的需求，不限于天然的膠原，對(duì)于膠原衍生物也同樣。鑒于上述現(xiàn)狀，本發(fā)明的目標(biāo)在于提供微細(xì)的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末。此外，本發(fā)明的目標(biāo)在于提供能夠簡(jiǎn)便地調(diào)制的未改性的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的制造方法。解決課題的手段本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果對(duì)膠原溶液進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，在溶液中膠原凝聚而沉淀，但如果在攪拌膠原溶液的同時(shí)進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，可以得到由比通常更短徑的平均粒徑I
I,000 μ m的膠原沉淀物構(gòu)成的粗膠原沉淀物；如果將所述粗膠原沉淀物的濃度調(diào)節(jié)到12 50質(zhì)量％，將其分散于親水性有機(jī)溶劑中，則可有效地對(duì)膠原沉淀物進(jìn)行脫水而分離取出固形物，通過風(fēng)干而成為膠原粉末；通過使用短徑的粗膠原沉淀物，可以進(jìn)行有效地脫水和干燥，其結(jié)果，可以制造短徑的膠原粉末；由上述方法所得的膠原粉末在110°C的高溫也不改性，耐熱性良好；如果將該粉末溶解，膠原在溶液中呈現(xiàn)三重螺旋結(jié)構(gòu)，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供膠原粉末和/或膠原衍生物粉末，通過將含有12 50質(zhì)量％的平均粒徑I 1，000 μ m的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑，分離固形物，進(jìn)行干燥而獲得。進(jìn)而，本發(fā)明提供膠原粉末和/或膠原衍生物粉末制造方法，特征在于，將含有膠原和/或膠原衍生物的溶液，在控制膠原和/或膠原衍生物的凝聚的同時(shí)在PH3.5 10進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，得到平均粒徑I 1，000 μ m的等電點(diǎn)沉淀物，調(diào)制所述等電點(diǎn)沉淀物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度至含有12 50質(zhì)量％以作為粗膠原沉淀物，將所述粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中，分離固形物，進(jìn)行干燥。此外，本發(fā)明提供膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的制造方法，特征在于，將含有膠原和/或膠原衍生物的溶液在PH3.5 10進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，將所述沉淀破碎，得到平均粒徑I 1，000 μ m的等電點(diǎn)沉淀物,調(diào)制所述等電點(diǎn)沉淀物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度至含有12 50質(zhì)量％以作為粗膠原沉淀物，將所述粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中，分離固形物，進(jìn)行干燥。此外，本發(fā)明提供膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的制造方法，特征在于，將含有膠原和/或膠原衍生物的溶液在控制膠原和/或膠原衍生物的凝聚的同時(shí)進(jìn)行鹽析，得到平均粒徑I 1，000 μ m的鹽析物，調(diào)整所述鹽析物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度至12 50質(zhì)量％，得到粗膠原沉淀物，將所述粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中，分離固形物，進(jìn)行干燥。此外，本發(fā)明提供膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的制造方法，特征在于，對(duì)含有膠原和/或膠原衍生物的溶液進(jìn) 行鹽析，將所述鹽析物破碎，得到平均粒徑I 1，000 μ m的鹽析物，調(diào)整所述鹽析物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度至12 50質(zhì)量％，得到粗膠原沉淀物，將所述粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中，分離固形物，進(jìn)行干燥。此外，本發(fā)明提供的上述膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的制造方法中，所述親水性有機(jī)溶劑是醇、酮、醚及其混合液。此外，本發(fā)明中，在從膠原和/或膠原衍生物溶液使所述膠原和/或膠原衍生物凝聚而形成膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物時(shí)，通過在攪拌所述膠原和/或膠原衍生物溶液的同時(shí)添加鹽類以通過鹽析使膠原和/或膠原衍生物沉淀，或?qū)⑺瞿z原和/或膠原衍生物溶液調(diào)整到PH3.5 10并在進(jìn)行攪拌的同時(shí)使膠原和/或膠原衍生物進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，可以調(diào)整膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的粒徑。發(fā)明效果由本發(fā)明的制造方法所得到的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的熱穩(wěn)定性、保存性良好。而且，由于膠原和/或膠原衍生物構(gòu)成為三重螺旋結(jié)構(gòu)，膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的溶解液對(duì)于皮膚等的保濕性良好。本發(fā)明的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末與其溶液相比，輸送效率良好，可以降低保管、輸送費(fèi)用。進(jìn)而，由于膠原等的溶液粘度高，在從容器轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)發(fā)生在容器上的附著、殘存、流失等，而膠原粉末則避免了這些問題，可以進(jìn)行簡(jiǎn)便的操作。本發(fā)明的膠原粉末的制造方法，由于粗膠原沉淀物的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度為12 50質(zhì)量％，通過親水性有機(jī)溶劑易于進(jìn)行脫水，可以通過風(fēng)干來(lái)進(jìn)行干燥，制造極為簡(jiǎn)便。


圖1是顯示 實(shí)施例1中調(diào)制的膠原沉淀物的相差顯微鏡圖像的圖。圖2是顯示實(shí)施例1中調(diào)制的膠原粉末的電子顯微鏡圖像的圖。圖3是顯示實(shí)施例1中調(diào)制的膠原粉末的差示掃描量熱計(jì)(DSC)的結(jié)果的圖。圖4是顯示實(shí)施例1中的將粉末膠原再溶解的膠原溶液的圓二色性的圖。圖5是實(shí)施例1中所得的膠原粉末的粒度分布的圖。圖6是顯示實(shí)施例1中的測(cè)定粒度分布的膠原粉末的電子顯微鏡圖像的圖。圖7是顯示實(shí)施例4中調(diào)制的膠原粉末的電子顯微鏡圖像的圖。圖8是顯示實(shí)施例4中的將粉末膠原再溶解的膠原溶液的圓二色性的圖。圖9是顯示比較例3中調(diào)制的膠原沉淀物的相差顯微鏡圖像的圖。圖10是比較例4中所得的膠原粉末的粒度分布的圖。圖11是顯示比較例4中的使用噴霧干燥機(jī)干燥而得的膠原粉末的電子顯微鏡圖像的圖。圖12是計(jì)算實(shí)施例1、實(shí)施例7的粉末膠原和比較例3、比較例5的膠原的溶解初速度的圖。圖13是顯示比較例5中所得的膠原海綿的電子顯微鏡圖像的圖。圖14是顯示比較例6中所得的膠原纖維的電子顯微鏡圖像的圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的第一方面是膠原粉末和/或膠原衍生物粉末，是通過將含有12 50質(zhì)量％的平均粒徑I 1，000 μ m的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中、分離固形物、干燥而得到的。此外，本發(fā)明的第二、第三方面是膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的制造方法，特征在于，將含有膠原和/或膠原衍生物的溶液在控制膠原和/或膠原衍生物的凝聚的同時(shí)在pH3.5 10進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀,或?qū)⒌入婞c(diǎn)沉淀物破碎，得到平均粒徑I 1，000 μ m的等電點(diǎn)沉淀物，調(diào)整所述等電點(diǎn)沉淀物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度至含有12 50質(zhì)量％，作為粗膠原沉淀物，將所述粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中，分離固形物，進(jìn)行干燥。此外，本發(fā)明的第四、第五方面是膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的制造方法，特征在于，將含有膠原和/或膠原衍生物的溶液在控制膠原和/或膠原衍生物的凝聚的同時(shí)進(jìn)行鹽析，或?qū)Ⅺ}析物破碎，得到平均粒徑I 1，000 μ m的鹽析物，將所述鹽析物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度調(diào)整到12 50質(zhì)量％，得到粗膠原沉淀物，將所述粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中，分離固形物，進(jìn)行干燥。以下，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。(I)膠原和/或膠原衍生物本申請(qǐng)說(shuō)明書中，“膠原”是蛋白質(zhì)的一種，是3根多肽鏈卷繞成螺旋的蛋白質(zhì)的總稱。以往已知有I XXIX型，但作為本發(fā)明中所使用的膠原，可以是任一種，也可以是新發(fā)現(xiàn)的膠原。生物體內(nèi)中所含的膠原的大部分是水不溶性的，本發(fā)明中，把將動(dòng)物的皮、骨等原料中所含的膠原通過添加蛋白酶等酶而可溶化的膠原、通過添加堿而可溶化的膠原稱為“可溶化膠原”。需要說(shuō)明的是，生物體內(nèi)，在動(dòng)物的皮、骨等原料中，也含有少量溶解于中性鹽溶液、酸性溶液的可溶 性膠原。本發(fā)明中所使用的膠原，只要是在水溶液中可溶解的即可，可以是將不溶性膠原進(jìn)行可溶化而成的，也可以是本來(lái)含有的可溶性膠原。需要說(shuō)明的是，本申請(qǐng)說(shuō)明書中，是使用以生物體內(nèi)大量存在的不溶性膠原作為原料來(lái)調(diào)制的“可溶化膠原”來(lái)進(jìn)行說(shuō)明，但本申請(qǐng)的發(fā)明中的“膠原”中包括“可溶性膠原”和“可溶化膠原”的雙方。此外，“膠原纖維”是指多個(gè)“膠原分子”相互之間凝聚而成的意思。作為膠原分子，相當(dāng)于所述的可溶化膠原、可溶性膠原。對(duì)可溶化膠原溶液進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀或鹽析，則膠原分子相互之間發(fā)生凝聚，可以作為沉淀物分離膠原纖維。膠原纖維有時(shí)會(huì)在沉淀時(shí)多個(gè)膠原纖維凝聚而作為大的凝集體來(lái)沉淀。因此，本發(fā)明中的“凝聚”包含了膠原分子相互之間的結(jié)合和膠原纖維相互之間的結(jié)合。此外，“膠原沉淀物”是指從膠原溶液以固體析出的膠原，“膠原粉末”是指“膠原沉淀物的粉狀固形物”。需要說(shuō)明的是，“可溶化膠原”、“可溶性膠原”，在化學(xué)處理時(shí)，構(gòu)成氨基酸被改性。因此，作為本發(fā)明中所使用的“膠原”，包括例如通過堿處理將天冬酰胺殘基、谷氨酰胺殘基等通過堿的脫酰胺反應(yīng)而分別改變?yōu)樘於０匪釟埢凸劝滨０匪釟埢哪z原。即，將膠原分子中所含的酰胺基轉(zhuǎn)變?yōu)轸然谀z原的實(shí)效電荷為負(fù)時(shí)，將等電點(diǎn)調(diào)整至酸性或中性。例如，對(duì)于堿可溶化膠原，天冬酰胺殘基和谷氨酰胺殘基通過堿的脫酰胺反應(yīng)而轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０匪釟埢凸劝滨０匪釟埢?，等電點(diǎn)為PH4.5 6.0，轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝?。本發(fā)明中，也可以是這樣的構(gòu)成膠原的氨基酸被改性的膠原。進(jìn)而，本發(fā)明中的“膠原衍生物”是指在構(gòu)成所述膠原的氨基酸上修飾了其他的官能基團(tuán)的物質(zhì)。例如，?；z原、酯化膠原等。需要說(shuō)明的是，作為膠原衍生物，除了預(yù)先調(diào)制的?；z原、酯化膠原以外，也可以是鹽析、等電點(diǎn)沉淀時(shí)被酯化或被?；哪z原。在從含有膠原組織提取可溶化膠原、可溶性膠原的工序之前，有時(shí)會(huì)對(duì)膠原進(jìn)行?；瘉?lái)調(diào)整等電點(diǎn)，此外，作為酯化膠原的制造方法，有時(shí)預(yù)先將含有膠原組織中所含的不溶性膠原進(jìn)行酯化，然后對(duì)酯化膠原進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀來(lái)分離。需要說(shuō)明的是，作為?；z原、酯化膠原，如下所示。(i)酰基化膠原作為?；z原，有琥珀化膠原、鄰苯二甲酸化膠原、馬來(lái)化(7 X力化)膠原等。例如是將經(jīng)過酶處理而提取的端膠原溶液調(diào)整到PH9 12，之后，添加琥珀酸、鄰苯二甲酸酸酐、馬來(lái)酸酐等酸酐而成的琥珀化膠原、鄰苯二甲酸化膠原、馬來(lái)化膠原等的酰基化膠原等。(ii)酯化膠原作為酯化膠原，除了將可溶化膠原酯化外，包括在不溶性膠原酯化后，由酶反應(yīng)等進(jìn)行可溶化的酯化膠原等。作為用于對(duì)膠原進(jìn)行作用而得到酯化膠原的醇類，除了伯醇之外，還可以是仲醇、叔醇。此外，不限于I元醇，可以是2元醇、3元醇、其他的多元醇。例如，作為I元醇，例舉甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、dl-2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、dl-2-戊醇、3-戊醇、1-己醇、dl-2-己醇、dl_3-己醇、1_庚醇、2-庚醇、3-庚醇、
1-辛醇、dl-2-辛醇、3-辛醇、1-壬醇、2-壬醇、3-壬醇、4-壬醇、5-壬醇、癸醇、1-1^一醇、
2-1^一癸醇、乙二醇單甲醚、乙二醇單乙醚、乙二醇單丁醚、乙二醇單苯基醚等。此外，作為2元醇，有乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、聚乙二醇(M.W.200 20000)、丙二醇、1，3_ 丙二醇、二丙二醇、甘油、1，2_ 丁二醇、1，3_ 丁二醇、1，4-丁二醇、2，3-丁二醇、1，5-戊二醇、2，4-戊二醇、1，6-己二醇、2，5-己二醇。作為其他的多元醇，有甘油、各種糖醇等。本發(fā)明中所使用的膠原衍生物和膠原在溶解液中具有三重螺旋結(jié)構(gòu)。(2)粗膠原沉淀物本發(fā)明中使用的粗膠原沉淀物是“含有12 50質(zhì)量％的平均粒徑I 1，000 μ m的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的粗膠原沉淀物”。如所述的膠原在生物體內(nèi)是不溶性的，這樣的不溶性膠原通過酶處理、堿處理可以調(diào)制成可溶化膠原。這樣的可溶化膠原在水溶液中進(jìn)行調(diào)制，通過鹽析、等電點(diǎn)沉淀而被精制，成為固形的沉淀物。本發(fā)明中，使用如此得到的膠原的沉淀物。這樣的膠原沉淀物、由此得到的膠原粉末如果再度在溶液中溶解，則成為具有三重螺旋結(jié)構(gòu)的膠原溶液。此外，將粗膠原沉淀物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的平均粒徑限定為I 1，000μπι，這是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)膠原沉淀物通過親水性有機(jī)溶劑而可以效率良好地脫水，通過風(fēng)干而可以粉末化，所得的粉末成為微細(xì)的膠原粉末。為此，本發(fā)明中，還發(fā)現(xiàn)了將膠原沉淀物的平均粒徑控制在短徑一側(cè)的方法。即，如果將可溶化膠原溶液進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀、鹽析，則膠原分子相互之間發(fā)生凝聚而成為膠原纖維，進(jìn)而膠原纖維發(fā)生凝聚而成為凝集體，因此，一般地，沉淀物的 平均粒徑為約2，000 μ m或其以上。但是，通過在攪拌膠原溶液的同時(shí)控制膠原的凝聚，同時(shí)生成膠原沉淀物，可以將所得的膠原沉淀物的平均粒徑控制在I 1，OOO μ m,最終可以得到平均粒徑I 1，000 μ m的膠原粉末。⑴平均粒徑本發(fā)明中使用的粗膠原沉淀物的平均粒徑為I Ι,ΟΟΟμπι，更優(yōu)選為5 900 μ m,特別優(yōu)選為10 750 μ m,更加優(yōu)選為30 500 μ m。平均粒徑如果超過1，000 μ m，則有時(shí)會(huì)有粉末化困難的情形。需要說(shuō)明的是，膠原分子的長(zhǎng)徑是300nm，在膠原分子相互之間不發(fā)生凝聚的情況下，膠原的粒徑為300nm。但是，如后所述，發(fā)現(xiàn)這樣的300nm的膠原分子平行地多個(gè)結(jié)合形成的SLS纖維，SLS纖維相互凝聚而形成凝集體，成為沉淀物。這樣的SLS纖維的沉淀物中，如果假定3個(gè)以上的SLS纖維發(fā)生凝聚，則下限為I μ m。需要說(shuō)明的是，本申請(qǐng)中的粗膠原沉淀物的平均粒徑是由相差顯微鏡所觀察的值。本申請(qǐng)的發(fā)明中，將相差顯微鏡圖像中具有的長(zhǎng)徑作為粗膠原沉淀物的粒徑，將十個(gè)視野中所含的全部粗膠原沉淀物的粒徑進(jìn)行平均，得到平均粒徑。在調(diào)制粗膠原沉淀物時(shí)，在控制所構(gòu)成的膠原沉淀物、膠原衍生物沉淀物的粒徑為短徑的過程中，對(duì)溶解可溶化膠原、膠原衍生物的溶液進(jìn)行物理處理、化學(xué)處理，或?qū)⑸傻某恋砦镞M(jìn)行物理破碎，可以進(jìn)行調(diào)整。(1-Ι)物理處理作為物理處理方法，例如，有將溶解膠原、膠原衍生物的溶液進(jìn)行攪拌的同時(shí)進(jìn)行鹽析，或在攪拌溶液的同時(shí)在PH3.5 10進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀的方法。通過攪拌，抑制膠原分子相互之間的凝聚，成為纖維長(zhǎng)度較短的膠原纖維，進(jìn)而可以抑制由多個(gè)膠原纖維的凝聚生成的凝集體。進(jìn)而，通過將生成的沉淀物破碎，可以沉淀出粒徑短的膠原沉淀物。攪拌的程度可以根據(jù)溶液的膠原、膠原衍生物的濃度、攪拌方法、攪拌容器的形狀、尺寸等適宜地選擇。此外，為了有效地抑制因膠原纖維的凝聚而生成的凝集體，或有效進(jìn)行生成的沉淀物的破碎，還可以使用具有攪拌和破碎機(jī)構(gòu) 的裝置。(1-2)化學(xué)處理此外，作為化學(xué)處理方法，有添加阻止膠原分子相互之間的凝聚的凝聚阻止劑的方法。作為這樣的凝聚阻止劑，有葡萄糖、蔗糖、木糖、半乳糖、果糖、甘油等的糖類。此外，有形成膠原分子的束狀集合體的ATP。例如，在膠原溶液中在酸性條件下添加三磷酸腺苷(ATP)，膠原分子的堿基性部位相互之間被ATP的磷酸基交聯(lián)。通過ATP，多個(gè)膠原分子平行地交聯(lián)，生成膠原分子的堿基性部位相互之間被ATP的磷酸基交聯(lián)的SLS(Segment-long-spacing)纖維。即，通過所述的疏水性相互作用，膠原分子相互之間優(yōu)先凝聚，由ATP而產(chǎn)生膠原分子的交聯(lián)，因此，300nm的膠原分子平行地連結(jié)，成為平均粒徑300nm的SLS纖維。需要說(shuō)明的是，多個(gè)SLS纖維凝聚而形成凝集體，形成沉淀。SLS纖維中，除了膠原之外，含有ATP作為交聯(lián)劑，與其他膠原、膠原衍生物同樣，可以在含有ATP的狀態(tài)下粉末化。此外，還可以在得到SLS纖維的沉淀物后除去ATP，然后進(jìn)行粉末化。(ii)膠原濃度粗膠原沉淀物中的所述平均粒徑I 1，000 μ m的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度為12 50質(zhì)量％，更優(yōu)選為15 40質(zhì)量％，特別優(yōu)選為20 35質(zhì)量％。如果為12質(zhì)量％以下，則粗膠原沉淀物的含水率過高，通過親水性有機(jī)溶劑的脫水效率變差，如果進(jìn)行干燥，有時(shí)不能成為微細(xì)且多孔質(zhì)的膠原粉末，而成為膜狀。另一方面，不容易調(diào)制成50質(zhì)量％以上的粗膠原沉淀物，而且，有時(shí)還不能均勻地分散于親水性有機(jī)溶劑中。需要說(shuō)明的是，粗膠原沉淀物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物以外的主成分是構(gòu)成沉淀前的膠原溶液、膠原衍生物溶液的水溶液。(iii)粗膠原沉淀物的調(diào)制方法本發(fā)明中，可以將等電點(diǎn)沉淀、鹽析中所得的粗膠原沉淀物作為原料來(lái)使用。由于在等電點(diǎn)沉淀物的調(diào)制工序中也可以進(jìn)行鹽析，以下對(duì)調(diào)制等電點(diǎn)沉淀物的情形下的粗膠原沉淀物的調(diào)制方法進(jìn)行說(shuō)明。此外，本發(fā)明中，還可以使用I XXIX型中任一種膠原，但以下對(duì)于從生物體提取I型膠原的情形進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明中使用的膠原，可以自牛、豬、鳥、魚等動(dòng)物的皮膚、其他的含有膠原的組織中采取。一般地，膠原多含于動(dòng)物的結(jié)締組織中，但如果通過熱處理來(lái)提取，膠原發(fā)生熱改性而破壞特有的三重螺旋結(jié)構(gòu)，成為明膠狀態(tài)。本發(fā)明中使用能構(gòu)成三重螺旋結(jié)構(gòu)的膠原。作為這樣的膠原的提取方法，有將動(dòng)物的骨、皮等作為材料，通過堿處理、酸處理、酶處理而可溶化的方法等。優(yōu)選將牛、豬、雞、鴕鳥、馬、魚類等的真皮、腱作為膠原的提取原料。如果使用源自胎兒等的組織或使用動(dòng)物的組織，則收率提高，因而優(yōu)選。(ii1-Ι)等電點(diǎn)ρΗ4.5的粗膠原沉淀物例如，可以使用如下物質(zhì)，即:作為成為原料的不溶性膠原，將石灰浸潰后的二層皮(床皮)洗凈，用切片機(jī)細(xì)切成約IOcm方塊，剁碎后進(jìn)一步將機(jī)械性地磨碎的物質(zhì)使用丙酮、醚等有機(jī)溶劑或者脂肪分解酶使用進(jìn)行脫脂后，充分洗凈來(lái)使用。將不溶性膠原在最終濃度為3質(zhì)量％氫氧化鈉、1.9% (v/w) 一甲胺的混合的可溶化水溶液中懸濁，使得膠原的最終濃度為4.5質(zhì)量％，在18°C進(jìn)行3周可溶化處理。可溶化反應(yīng)停止后，加入最終濃度為5質(zhì)量％氯化鈉等鹽，進(jìn)行鹽析，在由鹽酸等調(diào)制成酸性的水溶液中再溶解鹽析沉淀，由布、濾紙、金屬網(wǎng)等進(jìn)行過濾來(lái)精制，將該膠原溶液用氫氧化鈉調(diào)制到PH4.5即可以得到等電點(diǎn)4.5的粗膠原沉淀物。需要說(shuō)明的是，平均粒徑可以通過在攪拌上述膠原溶液的同時(shí)進(jìn)行pH4.5的等電點(diǎn)沉淀、鹽析來(lái)調(diào)整到I Ι,ΟΟΟμπι。這樣的平均粒徑的控制方法在(ii1-2)、(iii_3)、(ii1-4)中也同樣。(ii1-2)等電點(diǎn)ρΗ9.0的粗膠原沉淀物可以將牛皮的真皮層用絞肉機(jī)等攪碎，將脫脂后充分洗凈的不溶性膠原作為原料。在蒸餾水中懸濁，使得不溶性膠原的膠原最終濃度為I質(zhì)量％，之后，加入鹽酸，調(diào)整到ρΗ3.0。加入相對(duì)于膠原重量百分之一量的酸性蛋白酶，在25°C進(jìn)行72小時(shí)可溶化處理。酶反應(yīng)停止后，如上所述，在得到的酶可溶化膠原液中加入最終濃度為5質(zhì)量％的氯化鈉來(lái)進(jìn)行鹽析，通過離心分離來(lái)回收沉淀?；厥盏柠}析沉淀分散到一定容量的蒸餾水中，使得膠原濃度為2質(zhì)量％，加入鹽酸，調(diào)整到pH3.0,進(jìn)行均勻溶解，得到膠原溶液。然后，將該膠原溶液用布和濾紙過濾后，由氫氧化鈉調(diào)整到PH9.0，可以得到等電點(diǎn)9.0的粗膠原沉淀物。(ii1-3)等電點(diǎn)ρΗ4.5 9.0的粗膠原沉淀物將不溶性膠原、(ii1-2)記載的所述酶可溶化膠原懸浮于最終濃度3質(zhì)量％氫氧化鈉、1.9% (v/w) 一甲胺 的水溶液中，進(jìn)行所需時(shí)間的堿處理，從而可以得到沉淀物。例如，在以酶可溶化膠原為原料的情況下，4小時(shí)的堿處理可以將等電點(diǎn)降低到7.8，通過I天的堿處理將等電點(diǎn)降低至5.6。在到達(dá)所需等電點(diǎn)時(shí)，加入鹽酸來(lái)停止反應(yīng)，加入氯化鈉使最終濃度為5質(zhì)量％來(lái)進(jìn)行鹽析，通過離心分離回收沉淀。將回收的鹽析沉淀物分散于一定容量的蒸餾水中，使得膠原濃度為2質(zhì)量％，加入鹽酸，調(diào)整至pH3.0，進(jìn)行均勻地溶解，得到膠原溶液。然后，將該膠原溶液用布和濾紙過濾后，由氫氧化鈉調(diào)整到所需的等電點(diǎn)的PH即可，可以得到等電點(diǎn)4.5 9.0的粗膠原沉淀物。(ii1-4)由膠原衍生物構(gòu)成粗膠原沉淀物將不溶性膠原、(ii1-2)記載的酶可溶化膠原或者(ii1-Ι)記載的堿可溶化膠原進(jìn)行?；蝓セ?，可以得到等電點(diǎn)PH4.5 9.0的膠原衍生物。需要說(shuō)明的是，還可以將膠原分子中羧基衍生成羧酸酰氯、所述醇類的羥基與酰氯的脫鹽酸反應(yīng)來(lái)進(jìn)行酯化。例如，在將等電點(diǎn)9.0的酶可溶化膠原進(jìn)行?；瘯r(shí)，膠原的氨基被改性而等電點(diǎn)向酸性側(cè)偏移。此外，在將等電點(diǎn)4.5的堿可溶化膠原進(jìn)行酯化時(shí)，膠原的羧基被改性而等電點(diǎn)向堿性側(cè)偏移。在到達(dá)所需等電點(diǎn)時(shí)，加入最終濃度為5質(zhì)量％的氯化鈉來(lái)進(jìn)行鹽析，通過離心分離回收沉淀。將回收的鹽析沉淀分散于一定容量的蒸餾水中，使得膠原濃度為2質(zhì)量％，加入鹽酸調(diào)整至pH3.0，進(jìn)行均勻溶解，得到膠原溶液。然后，將該膠原溶液用布和濾紙過濾后，由氫氧化鈉調(diào)整到所望的等電點(diǎn)的pH，可以得到等電點(diǎn)4.5 9.0的粗膠原沉淀物。(iv)等電點(diǎn)膠原、膠原衍生物的等電點(diǎn)可以通過可溶化方法、其他的方法來(lái)調(diào)整。本發(fā)明中，以將所述膠原和/或膠原衍生物溶液調(diào)整到PH3.5 10而得到的膠原和/或膠原衍生物為對(duì)象來(lái)作為等電點(diǎn)沉淀物。等電點(diǎn)是指在含有膠原和/或膠原衍生物的水溶液中，膠原和/或膠原衍生物表現(xiàn)出最小溶解度時(shí)的溶液的pH。一般地，膠原的等電點(diǎn)為pH4.3 9.3，但在不足PH4.3、超過p H9.3的溶液中也會(huì)形成沉淀物，因此，把將所述膠原和/或膠原衍生物溶液調(diào)整至PH3.5 10而得到的膠原和/或膠原衍生物作為等電點(diǎn)沉淀物。更優(yōu)選為pH4.0 9.0、特別優(yōu)選為pH4.5 9.0的等電點(diǎn)沉淀物。此外，對(duì)應(yīng)于用途，還可以使用ρΗ3.5 8.0、ρΗ3.5 7.0、ρΗ3.5 6.0、ρΗ4.5 5.0的等電點(diǎn)沉淀物。如后述實(shí)施例所示，本發(fā)明的膠原粉末，即使平均粒徑增大，也具有與微細(xì)粒子大致相同的比表面積，因而認(rèn)為溶解性良好，即使在本來(lái)溶解性差的中性溶液中溶解性也良好。需要說(shuō)明的是，將含有膠原和/或膠原衍生物溶液調(diào)整至ΡΗ4.5而回收的粗膠原沉淀物的等電點(diǎn)為ΡΗ4.5、含有膠原和/或膠原衍生物水溶液調(diào)整至ρΗ9.0而回收的粗膠原沉淀物的等電點(diǎn)為ΡΗ9.0。本申請(qǐng)的發(fā)明中，在親水性有機(jī)溶劑中分散的“粗膠原沉淀物”并不限于等電點(diǎn)為ΡΗ4.5的粗膠原沉淀物、等電點(diǎn)為ρΗ9.0的粗膠原沉淀物，根據(jù)用途還可以使用等電點(diǎn)為ΡΗ4.5的粗膠原沉淀物和等電點(diǎn)為ρΗ9.0的粗膠原沉淀物的混合物等。這是因?yàn)?，不限于等電點(diǎn)，粗膠原沉淀物中所含的所述膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度只要為12 50質(zhì)量％，將膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物在親水性有機(jī)溶劑中均勻分散，就可以制造微細(xì)的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末。(2)親水性有機(jī)溶劑作為分散所述粗膠原沉淀物的親水性有機(jī)溶劑，只要是與水混和的含有碳原子的溶劑即可，沒有特別限定，例舉例如醇、酮、醚、酯、極性非質(zhì)子性溶劑等。作為醇，有甲醇、乙醇、異丙醇、叔丁醇等碳原子數(shù)I 6的一元醇、乙二醇、丙二醇等多元醇等。作為酮，有丙酮、甲乙酮等。此外，作為醚，有二乙醚、甲乙醚、乙二醇單甲醚、二乙二醇單丁醚等乙二醇醚、四氫呋喃、二惡烷等環(huán)狀醚等。而且，作為酯，有醋酸乙酯、乳酸乙酯等，作為極性非質(zhì)子性溶劑，有二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶等。其中優(yōu)選可以與水以任意比例混和的溶劑，可以舉出例如丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺等。其中，可以適合地使用乙醇、丙酮、二乙基醚或這些的混合液。使用量可以根據(jù)親水性有機(jī)溶劑而適宜選擇，例如在使用乙醇時(shí)，相對(duì)于所述粗膠原沉淀物I質(zhì)量份可以添加乙醇3 2000質(zhì)量份，優(yōu)選5 1000質(zhì)量份，更優(yōu)選10 100質(zhì)量份，特別優(yōu)選10 30質(zhì)量份。(3)膠原粉末和膠原衍生物粉末本發(fā)明的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末是通過將所述粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中、分離固形物、干燥而獲得的。通過親水性有機(jī)溶劑對(duì)粗膠原沉淀物進(jìn)行脫水，將所得的固形物干燥而成為膠原粉末、膠原衍生物粉末。所述粗膠原沉淀物通過等電點(diǎn)沉淀調(diào)整至固有的等電點(diǎn)。該等電點(diǎn)由于不因親水性有機(jī)溶劑的脫水、其后的干燥而改變，因而本發(fā)明的膠原粉末、膠原衍生物粉末的等電點(diǎn)依存于等電點(diǎn)沉淀時(shí)的等電點(diǎn)。在使用等電點(diǎn)為PH4.5的粗膠原沉淀物時(shí)，則成為等電點(diǎn)為PH4.5的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末，在使用等電點(diǎn)為pH9.0的粗膠原沉淀物時(shí)，則成為等電點(diǎn)為pH9.0的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末。而且，在使用例如等電點(diǎn)為PH4.5 9.0的膠原和/或膠原衍生物的混合物時(shí)，成為等電點(diǎn)為pH4.5 9.0的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末。本發(fā)明的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末在等電點(diǎn)為pH3.5 8.0、更優(yōu)選等電點(diǎn)PH3.5 7.0、特別是等電點(diǎn)pH3.5 6.0的場(chǎng)合，該粉末5mg的pH6.5溶液的溶解初速度為0.2mg/分以上，更優(yōu)選為0.3mg/分以上，特別優(yōu)選為0.5mg/分以上。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中的“溶解初速度”是以后述實(shí)施例中所示方法測(cè)定的。由于以往的等電點(diǎn)pH3.5 8.0的膠原在中性溶液中的溶解性不充分，因此，需要在比其等電點(diǎn)更酸性側(cè)的溶液中暫時(shí)溶解，然后添加堿來(lái)調(diào)整至PH5.5 8.5。本發(fā)明中，例如等電點(diǎn)為PH4.5的膠原粉末的情況下，為了在pH5.5 8.5的溶解液中快速溶解，不需要在酸性更強(qiáng)的酸中溶解，因此，也就不需要其后的堿的添加。不僅溶解操作簡(jiǎn)便，且可以避免因使用酸和堿而形成的鹽類。此外，由于不再需要溶解于堿，可以避免膠原的肽化，可以制造三重螺旋結(jié)構(gòu)的含有率高的膠原溶液。對(duì)本發(fā)明的膠原粉末和膠原衍生物粉末的平均粒徑?jīng)]有限定，但通過使用平均粒徑1 1，000 μ m的粗膠原沉淀物等，最終平均粒徑為8 1，000 μ m、優(yōu)選為10 1000 μ m、更優(yōu)選為30 950 μ m、更加優(yōu)選為30 900 μ m、特別優(yōu)選為30 800 μ m的膠原粉末、膠原衍生物粉末。需要說(shuō)明的是，本申請(qǐng)說(shuō)明書中，膠原粉末、膠原衍生物粉末的平均粒徑，與所述粗膠原沉淀物同樣地，也是由電子顯微鏡測(cè)定的值。如上所述，由于凝聚通常變?yōu)?000 μ m以上，如果通過噴霧干燥則不足5 μ m。本發(fā)明的膠原粉末和膠原衍生物粉末，由于平均粒徑為8 1，000 μ m，可以防止飛散且可以確保流動(dòng)性。而且，如后述的實(shí)施例所示，如果膠原粉末的平均粒徑不足5 μ m，則有時(shí)會(huì)在溶解液中會(huì)形成結(jié)塊(”)，溶解性下降，但如果在上述范圍內(nèi)就不會(huì)形成結(jié)塊，溶解性良好。
此外，本發(fā)明的膠原粉末和膠原衍生物粉末，由于以親水性有機(jī)溶劑來(lái)分散粗膠原沉淀物，在溶劑中膠原微細(xì)地分散，所得的沉淀物為多孔質(zhì)，發(fā)現(xiàn)增大了比表面積。本發(fā)明的膠原粉末和膠原衍生物粉末的比表面積為0.5m2/g以上，優(yōu)選為0.8 30m2/g，更優(yōu)選以上，1.0 25m2/g，特別優(yōu)選1.2 20m2/g，更加優(yōu)選1.5 20m2/g?；谶@樣的比表面積，確保了親水性、溶解性。即使膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中，在膠原濃度低的情況下，因親水性有機(jī)溶劑進(jìn)行脫水困難，沉淀物固化成顆粒狀，不能得到粉末狀的干燥物。此外，膠原沉淀物、膠原衍生物沉淀物的平均粒徑為以往的2，000 μ m的情形下，粉末化變得困難。因此，本發(fā)明中，為了將膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的平均粒徑控制在I 1，000 μ m，將粗膠原沉淀物中所含的膠原沉淀物、膠原衍生物沉淀物的濃度控制在12 50質(zhì)量％，在由親水性有機(jī)溶劑進(jìn)行脫水時(shí)，能以粉末狀進(jìn)行脫水，分離的固形物通過風(fēng)干得到膠原粉末和/或膠原衍生物粉末。而且，在親水性有機(jī)溶劑中分散之前的膠原沉淀物，由于平均粒徑為I 1，000 μ m,發(fā)現(xiàn)將其風(fēng)干則成為平均粒徑8 1，000 μ m的膠原粉末。這被認(rèn)為是在上述親水性有機(jī)溶劑中的分散、干燥工序中，可以避免膠原的凝聚、凝集。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中，還可以對(duì)上述膠原衍生物粉末、膠原粉末實(shí)施更微細(xì)的加工。本發(fā)明的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末，由于不經(jīng)過加熱工序而被干燥，若將其溶解，則成為三重螺旋結(jié)構(gòu)的膠原。此外，本發(fā)明的膠原粉末、膠原衍生物粉末的耐熱性良好，因而不需要以往的膠原溶液那樣的冷藏保存。需要說(shuō)明的是，如果將本發(fā)明的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末溶解，所述凝集體、膠原纖維溶解成為原來(lái)的膠原分子、膠原衍生物分子。因此，將該溶液以以往的方法進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀或鹽析，能夠生成平均粒徑比1，000 μ m大，即以往的約2，000 μ m的膠原沉淀物、膠原衍生物沉淀物。(4)用途本發(fā)明的膠原粉末、膠原衍`生物粉末適合用于醫(yī)療用途、化妝品用途等。例如，作為化妝品用途，可以例示化妝水、乳液、美容液、一般霜?jiǎng)?、卸妝油等的洗臉用、面膜、剃須霜、防曬霜、防曬乳、防曬油、化妝皂、粉底、撲面粉、口紅、唇膏、洗發(fā)水、護(hù)發(fā)素等。此外，作為醫(yī)療用途，可以例示再生醫(yī)療中使用的DDS(給藥系統(tǒng)，Drug DeliverySystem)的載體、ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等各種細(xì)胞的培養(yǎng)基材、止血?jiǎng)⑷靹?chuàng)治療劑、骨充填劑
坐寸ο(5)制造方法本發(fā)明的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末由如下方式制造:將含有膠原和/或膠原衍生物的溶液在控制膠原和/或膠原衍生物的凝聚的同時(shí)，在PH3.5 10進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，得到平均粒徑I 1，000μπι的等電點(diǎn)沉淀物，調(diào)整所述等電點(diǎn)沉淀物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度至含有12 50質(zhì)量％，作為粗膠原沉淀物，將所述粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中，分離固形物，進(jìn)行干燥。此外，也可以通過改變等電點(diǎn)沉淀物而進(jìn)行鹽析，得到平均粒徑I 1，000 μ m的鹽析物，調(diào)整所述鹽析物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度到12 50質(zhì)量％，得到粗膠原沉淀物，將所述粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中，分離固形物，進(jìn)行干燥。
(i)粗膠原沉淀物的生成對(duì)膠原溶液進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀或鹽析，一般會(huì)沉淀出平均粒徑約2，000 μ m的膠原沉淀物。但是，如前所述，通過抑制膠原分子的凝聚或物理粉碎，調(diào)制出由平均粒徑I 1，000 μ m的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物構(gòu)成的粗膠原沉淀物。需要說(shuō)明的是，為了得到平均粒徑為I 1，000 μ m的膠原沉淀物而攪拌膠原溶液時(shí)，優(yōu)選在膠原沉淀物生成前和膠原沉淀物生成后都進(jìn)行攪拌。在膠原沉淀物的生成前，可以阻止膠原分子的凝聚而生成纖維長(zhǎng)的短膠原纖維，并且，在膠原沉淀物的生成后，可以阻止膠原纖維的凝聚來(lái)抑制凝集體的生成。需要說(shuō)明的是，在使用所述的電動(dòng)磨碎機(jī)(I ^ZT 口 4夕''一)等的石臼式磨碎機(jī)時(shí)，由于在攪拌的同時(shí)進(jìn)行沉淀物的破碎，因而優(yōu)選。這是因?yàn)閷?duì)由膠原溶液生成的沉淀物進(jìn)行破碎，能使粒徑變小。進(jìn)而，在通過鹽析或等電點(diǎn)沉淀得到沉淀物后，也可以在溶液中由石白式磨碎機(jī)等對(duì)所述沉淀物進(jìn)行破碎。由于是在溶液中，不會(huì)加熱沉淀物而進(jìn)行破碎，可以分離凝集體的凝聚，使沉淀物的粒徑變小。攪拌、破碎的程度，可以根據(jù)溶液的膠原、膠原衍生物的濃度、攪拌方法、攪拌容器的形狀、尺寸等適宜選擇，如前所述，在使用均質(zhì)器時(shí)，旋轉(zhuǎn)數(shù)為1，000 20，OOOrpm,攪拌時(shí)間可根據(jù)旋轉(zhuǎn)數(shù)等而適宜選擇，為I分鐘 5小時(shí)。通過測(cè)定實(shí)際的粒徑，改變攪拌強(qiáng)度，可以得到所需平均粒徑的膠原沉淀物、膠原衍生物沉淀物。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中，膠原沉淀物、膠原衍生物沉淀物的破碎，如上所述在膠原溶液中進(jìn)行。這是因?yàn)椴恍枰獜娜芤褐蟹蛛x沉淀物的工序，且破碎效率良好。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中作為抑制膠原分子的凝聚的方法，可以添加所述的凝聚阻止劑，例如，在膠原溶液中在酸性條件下添加三磷酸腺苷(ATP)等凝聚阻止劑，通過ATP的添加，可以生成300nm的SLS纖維， 得到多個(gè)SLS纖維凝聚而成的凝集體作為沉淀物。本發(fā)明中，在添加凝聚阻止劑的同時(shí)，還可以攪拌膠原溶液來(lái)物理地抑制凝聚。通過攪拌來(lái)破碎SLS纖維的凝集，可以將沉淀物的粒徑調(diào)整至更短徑。本發(fā)明中，將膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度為12 50質(zhì)量％的等電點(diǎn)沉淀物作為粗膠原沉淀物來(lái)使用。在所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度不足12質(zhì)量％時(shí)，將經(jīng)過離心分離、過濾等回收的等電點(diǎn)沉淀物再度進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，由調(diào)整到相同PH的水進(jìn)行洗凈、脫鹽，再度進(jìn)行離心分離、過濾等，可以作為粗膠原沉淀物來(lái)使用。同樣地，在由鹽析生成沉淀物時(shí)，如果再度鹽析并由相同鹽濃度的水洗凈后，再度進(jìn)行離心分離、過濾等，可以作為粗膠原沉淀物來(lái)使用。需要說(shuō)明的是，在通過等電點(diǎn)沉淀物、鹽析物的單次的離心分離、過濾等達(dá)到上述濃度時(shí)，這樣的離心分離、過濾就同時(shí)成為濃度調(diào)整工序，不再需要特別的濃度調(diào)整工序。(ii)在親水性有機(jī)溶劑中的分散本發(fā)明中，將如此所得的粗膠原沉淀物分散于所述親水性有機(jī)溶劑中。如此是對(duì)粗膠原組成物進(jìn)行脫水。所使用的親水性有機(jī)溶劑的溫度優(yōu)選為15°C以下。這是為了可溶化膠原、膠原衍生物不發(fā)生改性，維持三重螺旋結(jié)構(gòu)。相對(duì)于粗膠原沉淀物的所述親水性有機(jī)溶劑的使用量可以根據(jù)所使用的親水性有機(jī)溶劑而適宜選擇，例如，在使用乙醇時(shí)，相對(duì)于所述粗膠原沉淀物I質(zhì)量份，添加乙醇3 2000質(zhì)量份，優(yōu)選5 1000質(zhì)量份，更優(yōu)選10 100質(zhì)量份，特別優(yōu)選10 30質(zhì)量份。需要說(shuō)明的是，在分散有粗膠原沉淀物的親水性有機(jī)溶劑中，優(yōu)選所述親水性有機(jī)溶劑的濃度為75質(zhì)量％以上，更優(yōu)選為90質(zhì)量％以上，特別優(yōu)選為95質(zhì)量％以上。如果粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中的膠原分散液的親水性有機(jī)溶劑的濃度不足75質(zhì)量％，由于從親水性有機(jī)溶劑回收的膠原吸濕，需要長(zhǎng)時(shí)間的干燥時(shí)間，且干燥中膠原分子相互接著，會(huì)有不能得到微細(xì)且多孔質(zhì)的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的情形。粗膠原沉淀物還可以在親水性有機(jī)溶劑中分散后進(jìn)行攪拌。例如，在使用均質(zhì)器時(shí)，以旋轉(zhuǎn)數(shù)1，000 20，OOOrpm、更優(yōu)選2,000 13，OOOrpm、特別優(yōu)選2，500 10，OOOrpm、尤其優(yōu)選3，000 5，OOOrpm來(lái)攪拌。攪拌時(shí)間可以根據(jù)旋轉(zhuǎn)數(shù)等適宜選擇，為I分鐘 5小時(shí)，更優(yōu)選為I分鐘 3小時(shí)，特別優(yōu)選為3分鐘 I小時(shí)，更加優(yōu)選為5分鐘 30分鐘。需要說(shuō)明的是，上述攪拌條件是例示，根據(jù)攪拌裝置的攪拌方法而各不同。對(duì)應(yīng)于實(shí)際的分散程度，可以適宜選擇。需要說(shuō)明的是，由于攪拌會(huì)產(chǎn)生熱，優(yōu)選在冷卻的同時(shí)進(jìn)行攪拌。(iii)固形物的分離在親水性有機(jī)溶劑中分散的粗膠原沉淀物在溶劑中進(jìn)行沉淀。本發(fā)明中，為了分離該沉淀物，對(duì)親水性有機(jī)溶劑分散液進(jìn)行過濾，或通過離心分離等的分離手段來(lái)分離膠原沉淀物。通過這樣的親水性有機(jī)溶劑進(jìn)行的分散和分離，I次就足夠了，但也可以進(jìn)行2 3次等多次。(iv)干燥本發(fā)明中，對(duì)所述固形物進(jìn)行干燥，可以得到膠原粉末和/或膠原衍生物粉末。本發(fā)明的特征在于，在室溫通過 風(fēng)干來(lái)干燥所述固形物。但是，也可以以采用干燥機(jī)等其他的方法來(lái)干燥。此時(shí)，優(yōu)選溫度不足15°C。構(gòu)成所述粗膠原沉淀物的膠原沉淀物、膠原衍生物沉淀物，平均粒徑為I 1，000 μ m,比以往更短，因而每單位質(zhì)量的表面積增大，通過親水性有機(jī)溶劑的脫水變得容易，由于粗膠原沉淀物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度為12 50質(zhì)量％，降低了親水性有機(jī)溶劑中所含的水分量，通過風(fēng)干干燥，能夠使膠原沉淀物、膠原衍生物沉淀物的粉末化。而且，由于可通過風(fēng)干來(lái)干燥，避免了加熱處理，可以防止膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的熱改性。由此，膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的溶液呈現(xiàn)三重螺旋結(jié)構(gòu)。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中，如此所得的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末還可以進(jìn)一步由研磨等進(jìn)行破碎來(lái)調(diào)整粒徑。以往，作為膠原的精制方法，已知有在酸性的膠原溶液中添加鹽類來(lái)沉淀的鹽析方法、添加有機(jī)溶劑的有機(jī)溶劑沉淀法、添加酸或堿的等電點(diǎn)沉淀法等。但是，沒有在等電點(diǎn)為pH3.5 10的膠原溶液的等電點(diǎn)沉淀物、鹽析物中添加親水性有機(jī)溶劑而使膠原粉末化的例子。膠原本來(lái)的親水性高，即使在等電點(diǎn)沉淀物中也存在大量的水，因此一般是通過凍結(jié)干燥、噴霧干燥等來(lái)形成固形物。當(dāng)然，在所述專利公報(bào)6的比較例I中，嘗試了用乙醇對(duì)端膠原進(jìn)行鹽析的膠原的沉淀物進(jìn)行洗凈，但記載了由于在膠原纖維中浸入了含有食鹽的水而無(wú)法脫水。但是，本發(fā)明中，通過將等電點(diǎn)沉淀物、鹽析物中所含的膠原沉淀物、膠原衍生物沉淀物控制在平均粒徑為I 1,000 μ m，可以容易地在親水性有機(jī)溶劑中分散，通過將粗膠原沉淀物的所述膠原沉淀物的濃度限制在12 50質(zhì)量％，可以由親水性有機(jī)溶劑有效地進(jìn)行脫水，因此，可以將從親水性有機(jī)溶劑中分離的固形分的含水率調(diào)整至極低，將其在室溫進(jìn)行干燥，可以調(diào)制成微細(xì)的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末。需要說(shuō)明的是，盡管可以花長(zhǎng)時(shí)間將膠原溶液在室溫干燥而得到膠原的干燥物，但膠原、膠原衍生物附著在容器的壁上等，成為膜狀、板狀或塊狀。本發(fā)明的特征在于，通過風(fēng)干來(lái)得到膠原粉末。此外，如果將膠原濃度為0.1 10質(zhì)量％的溶解液經(jīng)過噴嘴的吐出孔投入到親水性有機(jī)溶劑中來(lái)使膠原纖維沉淀，所得的膠原纖維的表面上不能形成多孔，成為表面平滑的膜狀。實(shí)施例以下例舉實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明不受這些實(shí)施例的任何限制。(實(shí)施例1)(I)將豬皮的真皮層由絞肉機(jī)等細(xì)碎，將脫脂后充分洗凈的不溶性膠原作為原料。在構(gòu)成為最終濃度為3質(zhì)量％氫氧化鈉、1.9% (v/w) 一甲胺混合可溶化水溶液中，使調(diào)制的不溶性膠原懸濁，使得膠原最終濃度為4.5質(zhì)量％，在18°C進(jìn)行3周的可溶化處理。如上所述而得到的堿可溶化膠原液中，添加氯化鈉以使得最終濃度為5質(zhì)量％來(lái)進(jìn)行鹽析，通過離心分離回收沉淀。將回收的鹽析沉淀在一定容量的蒸餾水中分散，使得膠原濃度為3質(zhì)量％，添加鹽酸調(diào)整至pH3.0，均勻地溶解。然后由布和濾紙過濾后，由氫氧化鈉調(diào)整至PH4.5，由電動(dòng)磨碎機(jī)(石臼式磨碎機(jī)增幸產(chǎn)業(yè)社制)以流速500ml/min、旋轉(zhuǎn)數(shù)1，500rpm、間隙(” 了 m )50μπι進(jìn)行攪拌，同時(shí)對(duì)膠原進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀。所得的沉淀物中所含的膠原沉淀物的平均粒徑為141 μ m。然后,通過17，500rpm、20分鐘的離心分離回收沉淀，再度調(diào)整至PH4.5，由蒸餾水洗凈、脫鹽，進(jìn)行10次上述的離心分離，回收粗膠原沉淀物。該粗膠原沉淀物的膠原濃度為30質(zhì)量％。所得的膠原沉淀物的相差顯微鏡圖像示于圖1。

然后，將所得的粗膠原沉淀物50g投入溫度20°C的乙醇950g中，使用均質(zhì)器進(jìn)行30分鐘的分散，過濾分散液，分離固形膠原，在室溫通過風(fēng)干得到膠原粉末。表I中顯示膠原的性狀、等電點(diǎn)、可否粉末化等。(2)通過電子顯微鏡圖像觀察所得的膠原粉。結(jié)果示于圖2。粉末膠原的平均粒徑為158mm,判斷為多孔質(zhì)的粉體。(3)用差示掃描量熱計(jì)(DSC)測(cè)定所得的膠原粉末的改性溫度。結(jié)果示于圖3和表
2。作為對(duì)照也顯示實(shí)施例1中所得的堿可溶化膠原溶液的結(jié)果。確認(rèn)了粉末膠原在112°C有大的熱量變化的峰。(4)將所得的膠原粉末5mg再溶解于IOmM醋酸Iml中，在20°C測(cè)定由5mM醋酸調(diào)制的最終濃度0.lmg/ml的膠原溶液的圓二色性(CD)。結(jié)果示于圖4。作為對(duì)照，也顯示了實(shí)施例I中所得的堿可溶化膠原溶液(未改性膠原)和所述堿可溶化膠原溶液在溫度100°C進(jìn)行3分鐘熱改性的堿可溶化膠原溶液(改性膠原)的結(jié)果。再溶解的膠原溶液(本發(fā)明的膠原粉末)與未改性膠原的曲線基本一致，表明在20°C維持了三重螺旋結(jié)構(gòu)。(5)將上述(I)中調(diào)制的固形膠原，使用中央化工機(jī)株式會(huì)社制的振動(dòng)干燥機(jī)VU-45，在真空度40Torr、干燥溫度40°C干燥4小時(shí)，得到膠原粉末。對(duì)該膠原粉末，使用4連式比表面積細(xì)孔分布測(cè)定裝置(Quantachrome制、商品名“N0VA_4200e型”)，由BETl點(diǎn)法測(cè)定比表面積。結(jié)果示于表3。
(6)對(duì)于上述(5)中調(diào)制的膠原粉末，由激光衍射散亂法測(cè)定粒度分布。使用(株式會(huì)社七4 V >企業(yè)制、商品名“LMS_2000e”)進(jìn)行測(cè)定。該膠原粉末的平均粒徑示于表3，粒度分布示于圖5，膠原粉末的電子顯微鏡圖像示于圖6。(7)將所得的膠原粉末5mg分別添加到Iml的表4所示組成的溶解基準(zhǔn)液、溶解液A、溶解液B、溶解液C、溶解液D中，評(píng)價(jià)溶解性。(8)此外，使用溶解液B來(lái)測(cè)定溶解初速度。由于膠原的親水性高，不清楚溶解與膨潤(rùn)之間的區(qū)別，所以如下進(jìn)行溶解初速度的測(cè)定。溶解初速度的測(cè)定在內(nèi)徑10mm、長(zhǎng)度40mm、容量2ml的圓筒形試管中，與Iml表I的溶解液B—起混合樣品5mg，密封，進(jìn)行I分鐘內(nèi)20次的180°C的搖動(dòng)混和。需要說(shuō)明的是，溶解液B和操作在溫度20°C下進(jìn)行?；旌秃螅?分鐘、4分鐘、6分鐘、8分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘時(shí)，取樣其一部分，對(duì)5，OOOrpm離心的上清液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用CBB染色凝膠。脫色后，用圖像解析軟件(NIH image)對(duì)膠原帶的濃度定量，算出上清液的膠原濃度。接著，根據(jù)經(jīng)過時(shí)間與膠原濃度之間的關(guān)系算出溶解初速度。需要說(shuō)明的是，溶解初速度是由混和O時(shí)至10分鐘以內(nèi)的直線性的時(shí)間來(lái)算出。表5中顯示溶解性、表6中顯示溶解初速度的結(jié)果。需要說(shuō)明的是，表5中，◎表示不到45分鐘即溶解的情形，〇表示在45分鐘以上不到90分鐘內(nèi)溶解的情形，Λ表示在90分鐘以上不到180分鐘內(nèi)溶解的情形，X表示180分鐘以內(nèi)不溶解的情形。此外，圖12顯示測(cè)定溶解初速度時(shí)，上述上清液的膠原濃度的經(jīng)時(shí)變化。(實(shí)施例2)
除了將分散粗膠原沉淀物的親水性有機(jī)溶劑變更為丙酮以外，與實(shí)施例1同樣地操作，得到膠原粉末。使用所得的膠原粉末5mg，與實(shí)施例1同樣地操作，評(píng)價(jià)溶解性。表I顯示實(shí)施例2的概要，表5顯示溶解性，表6顯示溶解初速度的結(jié)果。由于溶解液的添加，膠原粉末快速溶解，得到透明的膠原溶液。(實(shí)施例3)除了將分散粗膠原沉淀物的親水性有機(jī)溶劑變更為二乙醚以外，與實(shí)施例1同樣地操作，得到膠原粉末。使用所得的膠原粉末5mg，與實(shí)施例1同樣地操作，評(píng)價(jià)溶解性。表I顯示實(shí)施例3的概要，表5顯示溶解性，表6顯示溶解初速度的結(jié)果。由于溶解液的添加，膠原粉末快速溶解，得到透明的膠原溶液。(實(shí)施例4)(I)將牛皮的真皮層由絞肉機(jī)等細(xì)碎，將脫脂后充分洗凈的不溶性膠原作為原料。在蒸餾水中懸濁，使得不溶性膠原的膠原最終濃度為2質(zhì)量％，之后，加入鹽酸調(diào)整至pH3.0。加入相對(duì)于膠原重量百分之一的量的酸性蛋白酶,在25°C進(jìn)行72小時(shí)可溶化處理。酶反應(yīng)停止后，在如上所述所得的酶可溶化膠原液中加入最終濃度為5質(zhì)量％的氯化鈉，來(lái)進(jìn)行鹽析，通過離心分離回收沉淀。將回收的鹽析沉淀分散于一定容量的蒸餾水中，使得膠原濃度為I質(zhì)量％，加入鹽酸調(diào)整至PH3.0，均勻地溶解。然后，使用布和濾紙進(jìn)行過濾，之后由氫氧化鈉調(diào)整至pH9.0,由電動(dòng)磨碎機(jī)在流速500ml/min、旋轉(zhuǎn)數(shù)1，500rpm、間隙50 μ m下進(jìn)行攪拌，同時(shí)對(duì)膠原進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀。所得的沉淀物中所含的膠原沉淀物的平均粒徑為131 μ m。然后，由17，500rpm、20分鐘的離心分離回收沉淀后，再度調(diào)整至PH9.0，用蒸餾水洗凈、脫鹽，將上述離心分離進(jìn)行10次，回收作為粗膠原沉淀物。該粗膠原沉淀物的膠原濃度為23質(zhì)量％。然后，將所得的粗膠原沉淀物50g投入溫度20°C的乙醇950g中，使用均質(zhì)器進(jìn)行30分鐘的分散，過濾分散液，分離固形膠原，在室溫通過風(fēng)干得到膠原粉末。(2)通過電子顯微鏡圖像觀察所得的膠原粉末。結(jié)果示于圖7。粉末膠原的平均粒徑為333 μ m，判明為多孔質(zhì)的粉體。(3)由差示掃描量熱計(jì)(DSC)測(cè)定所得的膠原粉末的改性溫度。結(jié)果示于表2。確認(rèn)了粉末膠原在113°C的大的熱量變化的峰。(4)在IOmM醋酸Iml中再溶解所得的膠原粉末5mg，在20°C測(cè)定由5mM醋酸調(diào)制到最終濃度0.lmg/ml的膠原溶液的圓二色性(CD)。結(jié)果示于圖8。確認(rèn)了再溶解的膠原溶液(本發(fā)明的膠原粉末)的三重螺旋結(jié)構(gòu)特有的221nm的峰，明確可知在20°C維持了三
重螺旋結(jié)構(gòu)。(5)使用所得的膠原粉末5mg，與實(shí)施例1同樣地操作，評(píng)價(jià)溶解性。表I表示實(shí)施例4的概要，表5表示溶解性，表6表示溶解初速度的結(jié)果。(實(shí)施例5)在實(shí)施例4所得的酶可溶化膠原液中，加入最終濃度為5質(zhì)量％的氯化鈉，由電動(dòng)磨碎機(jī)在流速500ml/min、旋轉(zhuǎn)數(shù)1，500rpm、間隙50 μ m下攪拌，同時(shí)對(duì)膠原進(jìn)行鹽析，由17，500rpm、20分鐘的離心分離回收沉淀，上述離心分離進(jìn)行10次，得到粗膠原沉淀物。所得的沉淀物中所含的膠原沉淀物的平均粒徑為142 μ m。該粗膠原沉淀物的膠原濃度為38
質(zhì)量％。然后，將所得的粗膠原沉淀物50g投入溫度20°C的乙醇950g中，使用均質(zhì)器進(jìn)行30分鐘分散，過濾分散液，分離固形膠原，在室溫通過風(fēng)干得到膠原粉末。表I中顯示粗膠原沉淀物的性狀、等電點(diǎn)、可否粉末化等。(實(shí)施例6)在實(shí)施例4所得的酶可溶化膠原液中一邊攪拌一邊加入最終濃度為0.22質(zhì)量％的三磷酸腺苷2鈉(ATP 2Na)，在冰上靜置I小時(shí)。由離心分離回收生成的SLS纖維。所得的沉淀物中所含的膠原沉淀物的平均粒徑為13.4μπι。該粗膠原沉淀物的膠原濃度為12
質(zhì)量％。然后，將所得的粗膠原沉淀物SOmg投入溫度20°C的乙醇20g中，使用均質(zhì)器分散30分鐘，過濾分散液，分離固形膠原，在室溫通過風(fēng)干得到膠原粉末。表I中顯示粗膠原沉淀物的性狀、等電點(diǎn)、可否粉末化等。(實(shí)施例7)在實(shí)施例1所得的堿可溶化膠原液中，加入氫氧化鈉，調(diào)制至pH4.5，通過靜置對(duì)膠原進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀。之后，由電動(dòng)磨碎機(jī)在流速500ml/min、旋轉(zhuǎn)數(shù)1，500rpm、間隙50 μ m的條件下對(duì)等電點(diǎn)沉淀進(jìn)行破碎。所得的沉淀物中所含的膠原沉淀物的平均粒徑為724 μ m。由離心分離回收沉淀后，再度調(diào)制至pH4.5，用蒸餾水洗凈、脫鹽，上述離心分離進(jìn)行10次，回收作為粗膠原沉淀物。該粗膠原沉淀物的膠原濃度為27質(zhì)量％。

然后，將所得的粗膠原沉淀物50g投入溫度20°C的乙醇950g中，使用均質(zhì)器分散30分鐘，過濾分散液，分離固形膠原，在室溫通過風(fēng)干得到膠原粉末。
使用所得的膠原粉末5mg，與實(shí)施例1同樣地操作，評(píng)價(jià)溶解性。表I中顯示粗膠原沉淀物的性狀、等電點(diǎn)、可否粉末化等，表5顯示溶解性，表6顯示溶解初速度的結(jié)果。此夕卜，圖12顯示在測(cè)定溶解初速度中，上述上清液的膠原濃度的經(jīng)時(shí)變化。(實(shí)施例8)在實(shí)施例1所得的堿可溶化膠原液中，添加氫氧化鈉，調(diào)制至pH4.5，通過靜置對(duì)膠原進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀。之后，由電動(dòng)磨碎機(jī)在流速500ml/min、旋轉(zhuǎn)數(shù)1，500rpm、間隙50 μ m的條件下，進(jìn)行3次等電點(diǎn)沉淀的破碎。所得的沉淀物中所含的膠原沉淀物的平均粒徑為335 μ m。由離心分離回收沉淀后，再度調(diào)制至pH4.5，由蒸餾水洗凈、脫鹽，上述離心分離進(jìn)行10次，回收作為粗膠原沉淀物。該粗膠原沉淀物的膠原濃度為28質(zhì)量％。然后，將所得的粗膠原沉淀物50g投入溫度20°C的乙醇950g中，使用均質(zhì)器分散30分鐘，過濾分散液，分離固形膠原，在室溫通過風(fēng)干得到膠原粉末。使用所得的膠原粉末5mg，與實(shí)施例1同樣地操作，評(píng)價(jià)溶解性。表I中顯示粗膠原沉淀物的性狀、等電點(diǎn)、可否粉末化等，表5顯示溶解性，表6顯示溶解初速度的結(jié)果。(實(shí)施例9)將實(shí)施例1所得的堿可溶化膠原的等電點(diǎn)沉淀物(等電點(diǎn)pH4.5)在甲醇中分散，加入最終濃度為0.1M的鹽酸。在室溫?cái)嚢?小時(shí)的同時(shí)進(jìn)行酯化反應(yīng)，由氫氧化鈉溶液調(diào)至PH中性，停止反應(yīng)的同時(shí)使膠原沉淀。將沉淀物離心分離后，再溶解于IOmM的醋酸，得到甲酯化膠原。甲酯化膠原的等電點(diǎn)為PH7.9。在甲酯化膠原溶液中加入最終濃度為5質(zhì)量％的氯化鈉，由均質(zhì)器攪拌的同時(shí)進(jìn)行鹽析，由17，500rpm、20分鐘的離心分離回收沉淀，上述離心分離進(jìn)行10次，得到粗膠原沉淀物。所得的沉淀物中所含的膠原沉淀物的平均粒徑為244 μ m，膠原濃度為29質(zhì)量％。
`
然后，將所得的粗膠原沉淀物0.5g投入溫度20°C的乙醇9.5g中，使用均質(zhì)器分散30分鐘，過濾分散液，分離固形膠原，在室溫風(fēng)干，得到膠原粉末。表I中顯示粗膠原沉淀物的性狀、等電點(diǎn)、可否粉末化等。(實(shí)施例10)在實(shí)施例4所得的酶可溶化膠原液(等電點(diǎn)pH9.0)中加入氫氧化鈉溶液，調(diào)整至PH8 9，對(duì)膠原進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀。在該等電點(diǎn)沉淀分散液中加入最終濃度為0.5mM的琥珀酸酐，在室溫?cái)嚢璧耐瑫r(shí)進(jìn)行I小時(shí)酰基化反應(yīng)。反應(yīng)后，加入鹽酸使溶液為酸性，加入最終濃度為5質(zhì)量％的氯化鈉，使反應(yīng)停止的同時(shí)使琥珀化膠原沉淀。將沉淀物離心分離后，在IOmM的醋酸中再溶解琥珀化膠原，得到琥珀化膠原。琥珀化膠原的等電點(diǎn)為5.4。在琥珀化膠原液中加入最終濃度為5質(zhì)量％的氯化鈉，用均質(zhì)器攪拌的同時(shí)進(jìn)行鹽析，由17，500rpm、20分鐘的離心分離回收沉淀，上述離心分離進(jìn)行10次，得到粗膠原沉淀物。所得的沉淀物中所含的膠原沉淀物的平均粒徑為167 μ m，膠原濃度為42質(zhì)量％。然后，將所得的粗膠原沉淀物0.5g投入溫度20°C的乙醇9.5g中，使用均質(zhì)器分散30分鐘，過濾分散液，分離固形膠原，在室溫通過風(fēng)干得到膠原粉末。表I顯示粗膠原沉淀物的性狀、等電點(diǎn)、可否粉末化等。(實(shí)施例11)在實(shí)施例4所得的酶可溶化膠原液(等電點(diǎn)9.0)中加入5倍濃度的PBS (_)，調(diào)整至膠原濃度為0.75mg/ml，在37°C攪拌一夜的同時(shí)形成膠原再生纖維。該用均質(zhì)器破碎再生纖維分散液,調(diào)制微細(xì)的再生纖維分散液。將該再生纖維分散液由17，500rpm、20分鐘的離心分離回收沉淀，上述離心分離進(jìn)行10次，得到粗膠原沉淀物。所得的沉淀物中所含的膠原沉淀物的平均粒徑為213 μ m。該粗膠原沉淀物的膠原濃度為30質(zhì)量％。然后，將所得的粗膠原沉淀物0.5g投入溫度20°C的乙醇9.5g中，使用均質(zhì)器分散30分鐘，過濾分散液，分離固形膠原，在室溫通過風(fēng)干得到膠原粉末。表I中顯示粗膠原沉淀物的性狀、等電點(diǎn)、可否粉末化等。(比較例I)將實(shí)施例1所得的堿可溶化膠原溶液(最終濃度I質(zhì)量％ ) 50g投入溫度20°C的乙醇950g中，使用均質(zhì)器分散30分鐘，過濾分散液。但是，過濾后膠原分散物成為膜狀，沒有形成為粉末。表I中顯示粗膠原沉淀物的性狀、等電點(diǎn)、可否粉末化等。(比較例2)在實(shí)施例1所得的堿可溶化膠原液中添加氫氧化鈉調(diào)整至pH4.5，由電動(dòng)磨碎機(jī)在流速500ml/min、旋轉(zhuǎn)數(shù)1，500rpm、間隙50 μ m下攪拌的同時(shí)對(duì)膠原進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀。所得的沉淀物中所含的膠原沉淀物的平均粒徑為141 μ m。然后，由17，500rpm、20分鐘的離心分離回收沉淀后，再度用調(diào)整至PH4.5的蒸餾水進(jìn)行洗凈、脫鹽，回收作為粗膠原沉淀物。該粗膠原沉淀物的膠原濃度為10質(zhì)量％。然后，將所得的粗膠原沉淀物50g投入溫度20°C的乙醇950g中，使用均質(zhì)器分散30分鐘，過濾分散液。但是，過濾的膠原分散物為膜狀，沒有形成為粉末。表I中顯示粗膠原沉淀物的性狀、等電點(diǎn)、可否粉末化等。(比較例3)(I)在實(shí)施例1所得的堿可溶化膠原液中添加氫氧化鈉調(diào)制至pH4.5，通過靜置對(duì)膠原進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀。所得的沉淀物中所含的膠原沉淀物的平均粒徑為1，858 μ m。由離心分離回收沉淀后，再度調(diào)整至PH4.5，由蒸餾水洗凈、脫鹽，上述離心分離進(jìn)行10次，回收作為粗膠原沉淀物。該粗膠原沉淀物的膠原濃度為33質(zhì)量％。所得的膠原沉淀物的相差顯微鏡圖像示于圖9。然后，將所得的粗膠原沉淀物50g投入溫度20°C的乙醇950g中，使用均質(zhì)器分散30分鐘，過濾分散液。但是，過濾的膠原分散物為膜狀，沒有形成為粉末。(2)使用所得的膠原固形物5mg，與實(shí)施例1同樣地操作，評(píng)價(jià)溶解性。表I顯示比較例3的概要，表5顯示溶解性，表6顯示溶解初速度的結(jié)果。此外，圖12顯示在溶解初速度的測(cè)定中，上述上清液的膠原濃度的經(jīng)時(shí)變化。(比較例4)(I)將實(shí)施例1中所得的堿可溶化膠原的等電點(diǎn)沉淀物在蒸餾水中分散，使得最終濃度為3%，進(jìn)行30分鐘均質(zhì)，以得到均勻的分散液。使用噴霧干燥機(jī)，以入口溫度1200C、出口溫度60°C的方式調(diào)節(jié)熱風(fēng)溫度，對(duì)該分散液進(jìn)行噴霧干燥，得到膠原粉末。表I顯示比較例4的概要，表4顯示溶解性的結(jié)果。通過噴霧干燥而得到的膠原粉末在20小時(shí)后仍僅有約20%左右的溶解。由于原料的膠原沉淀物與實(shí)施例1相同 ，因此，與實(shí)施例1之間的溶解性的差異不是膠原分子的不同，而是依存于處理工序的形狀的不同造成的。如果觀察溶解殘留，噴霧干燥品的膠原粉末因微細(xì)而成為小塊狀，僅小塊的表面半透明地溶解。由于噴霧干燥中膠原粒子的平均粒徑小至4.60 μ m，且其表面比較光滑，因而溶解液難以浸透到小塊的內(nèi)部，這被認(rèn)為是溶解性差的理由。與此相對(duì),實(shí)施例1 4，實(shí)施例7 10任一項(xiàng)都沒有形成小塊。(2)對(duì)于上述⑴中調(diào)制的膠原粉末，與實(shí)施例1同樣地由BETl點(diǎn)法測(cè)定比表面積，由激光衍射散亂法測(cè)定粒度分布。比表面積和平均粒徑示于表3，粒度分布使用圖10，膠原粉末的電子顯微鏡圖像示于圖11。(比較例5)(I)將實(shí)施例1所得的粗膠原沉淀物在鹽酸中再溶解，使得最終濃度為I質(zhì)量?。?，之后由氫氧化鈉中和，得到PH7.5的堿可溶化膠原溶液。將該溶液凍結(jié)干燥，制作膠原海綿。圖13顯示膠原海綿的電子顯微鏡圖像。(2)使用所得的膠原海綿5mg，與實(shí)施例1同樣地操作，評(píng)價(jià)溶解性。表I中顯示比較例5的概要，表5顯示溶解性，表6顯示溶解初速度的結(jié)果。此外，圖12中顯示溶解初速度的測(cè)定中，上述上清液的膠原濃度的經(jīng)時(shí)變化。(比較例6)(I)將實(shí)施例1所得的粗膠原沉淀物在鹽酸中再溶解，使得最終濃度為I質(zhì)量％，之后由氫氧化鈉中和,得到PH7.5的堿可溶化膠原溶液。使用27G( H )的注射針在乙醇中吐出該溶液，之后通過風(fēng)干制作膠原纖維。圖14顯示膠原纖維的電子顯微鏡圖像。(2)使用所得的膠原纖維5mg，與實(shí)施例1同樣地操作，評(píng)價(jià)溶解性。表I顯示比較例6的概要，表5顯示溶解性，表6顯示溶解初速度的結(jié)果。[表 I]

權(quán)利要求
1.一種膠原粉末和/或膠原衍生物粉末，是通過將含有12 50質(zhì)量％的平均粒徑I 1，000 μ m的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中、分離固形物、干燥而得到的。
2.如權(quán)利要求1所述的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末，特征在于，所述粗膠原沉淀物是膠原和/或膠原衍生物的PH3.5 10的等電點(diǎn)沉淀物或鹽析物。
3.如權(quán)利要求1所述的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末，特征在于，所述粗膠原沉淀物的等電點(diǎn)為PH3.5 8.0，該粉末5mg的pH6.5溶液的溶解初速度為0.2mg/分鐘以上。
4.一種膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的制造方法，特征在于， 將含有膠原和/或膠原衍生物的溶液在控制膠原和/或膠原衍生物的凝聚的同時(shí)在pH3.5 10進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀,得到平均粒徑I 1，000 μ m的等電點(diǎn)沉淀物， 調(diào)整所述等電點(diǎn)沉淀物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度到含有12 50質(zhì)量％，作為粗膠原沉淀物， 將所述粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中，分離固形物，進(jìn)行干燥。
5.如權(quán)利要求4所述的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的制造方法，所述膠原的凝聚的控制是對(duì)含有所述膠原和/或膠原衍生物的溶液進(jìn)行攪拌。
6.一種膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的制造方法，特征在于， 將含有膠原和/或膠原衍生物的溶液 在PH3.5 10進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，破碎所述沉淀，得到平均粒徑I 1，000 μ m的等電點(diǎn)沉淀物， 調(diào)整所述等電點(diǎn)沉淀物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度到含有12 50質(zhì)量％，作為粗膠原沉淀物， 將所述粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中，分離固形物，進(jìn)行干燥。
7.—種膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的制造方法，特征在于， 將含有膠原和/或膠原衍生物的溶液在控制膠原和/或膠原衍生物的凝聚的同時(shí)進(jìn)行鹽析，得到平均粒徑I 1，000 μ m的鹽析物， 將所述鹽析物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度調(diào)整到12 50質(zhì)量％，作為粗膠原沉淀物， 將所述粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中，分離固形物，進(jìn)行干燥。
8.—種膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的制造方法，特征在于， 對(duì)含有膠原和/或膠原衍生物的溶液進(jìn)行鹽析，破碎所述鹽析物，得到平均粒徑I 1,000 μ m的鹽析物， 將所述鹽析物中所含的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的濃度調(diào)整至12 50質(zhì)量％，得到粗膠原沉淀物， 將所述粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中，分離固形物，進(jìn)行干燥。
9.如權(quán)利要求4 8任一項(xiàng)所述的膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的制造方法，所述親水性有機(jī)溶劑是醇、酮、醚及其混合液。
全文摘要
本發(fā)明提供膠原粉末和/或膠原衍生物粉末及其制造方法，該制造方法的特征在于，將含有12～50質(zhì)量％的平均粒徑1～1,000μm的膠原沉淀物和/或膠原衍生物沉淀物的粗膠原沉淀物分散于親水性有機(jī)溶劑中，分離固形物，進(jìn)行干燥。由于通過分散于親水性有機(jī)溶劑中可將沉淀物脫水，因此可以將所得的上述所述固形物通過風(fēng)干進(jìn)行干燥。而且，由于擴(kuò)大了比表面積，所得膠原粉末和/或膠原衍生物粉末的溶解性良好，且由于平均粒徑為8～1,000μm，操作性良好。
文檔編號(hào)A61K38/00GK103080194SQ201180037728
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月30日
發(fā)明者田中啟友, 小倉(cāng)孝之, 服部俊治, 松田剛一, 小林善勝, 大井章司 申請(qǐng)人:株式會(huì)社日皮