專利名稱：嵌合momp抗原、方法和使用的制作方法
嵌合MOMP抗原、方法和使用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明總體上涉及能夠誘導(dǎo)抗沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)的保護性免疫應(yīng)答(反應(yīng))的多肽類的領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及這些多肽類的生產(chǎn)并涉及包括它們的藥用組合物。
背景技術(shù)：
已知形成沙眼衣原體的外膜復(fù)合物的蛋白質(zhì)之一的主要外膜蛋白(MOMP)能夠誘導(dǎo)兩種T-細胞應(yīng)答并且中和哺乳動物(如人類)的抗衣原體感染的抗體。MOMP 蛋白質(zhì)的示意性概觀在圖1中示出，改編自Findlay HE, McClafferty H&Ashley RH(2005)，重組沙眼衣原體主要外膜蛋白的表面表達、單通道分析和膜拓撲學(xué)(Surface expression, single-channel analysis and membranetopology of recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein)。BMCMicrobiology 5，5是一篇闡明MOMP蛋白質(zhì)的拓撲學(xué)的論文。在圖1中，A表示細胞膜而B表示細胞膜的外表面。
將總MOMP蛋白質(zhì)用作抗沙眼衣原體的疫苗已在WO 2008/040757A1中披露。
不過，動物實驗已表明抗-衣原體的MOMP亞單位疫苗的成功非常有限。此外，整體MOMP蛋白質(zhì)的生產(chǎn)是繁瑣的和昂貴的，更不用說還受限于某些特定的生產(chǎn)方法。
為了克服上述的缺陷，已有人提出使用合成肽類，所述合成肽類結(jié)合了來自沙眼衣原體的特異性表位，這些表位觸發(fā)免疫應(yīng)答。
不過，所述分離的表位在合成的背景下可能不具備功能性，并因而不能提供希望的效果。
因此，用于產(chǎn)生抗沙眼衣原體的保護性免疫應(yīng)答的改進的多肽會是有優(yōu)勢的，并且尤其是允許有增大的靈活性、成本效率、簡化的生產(chǎn)和純化同時具有保留或改進的免疫效應(yīng)的多肽會是有優(yōu)勢的。發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明優(yōu)選尋求減輕、緩和或消除本領(lǐng)域的一個或多個上述缺陷以及單獨或以任何組合形式的缺點的解決方案并且通過提供根據(jù)所附權(quán)利要求所述的多肽解決至少上面提到的問題。
本發(fā)明的一般解決方案是提供一種多肽，所述多肽易于生產(chǎn)和純化，但具有保留的用于產(chǎn)生抗沙眼衣原體的免疫應(yīng)答的能力。
因此，根據(jù)第一方面，提供了一種多肽。所述多肽包括第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列具有與根據(jù)SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少90% (如至少95%)的同源性(％ — 致性)，如用標準設(shè)置通過BLAST算法進行測量；和第二氨基酸序列，所述第二氨基酸序列具有與根據(jù)SEQ ID NO 2的氨基酸序列至少90% (如至少95%)的同源性，如用標準設(shè)置通過BLAST算法進行測量；其 中所述第一和第二氨基酸序列被少于30個氨基酸殘基分開。所述第一和第二氨基酸序列分別包括用于產(chǎn)生抗沙眼衣原體的保護性的抗原-特異性免疫應(yīng)答的表位，以及沙眼衣原體的主要外膜蛋白(MOMP)的跨膜部分的一部分。所述第一和第二氨基酸序列合起來包括大約25個表位，這些表位可能刺激T細胞應(yīng)答(⑶4+和⑶8+)以及B細胞應(yīng)答。這樣的優(yōu)點是與整個(完整的)MOMP蛋白質(zhì)相比，該多肽易于以純化的形式生產(chǎn)，同時仍誘導(dǎo)可接受的免疫應(yīng)答。多肽(每個包括MOMP的跨膜部分的一部分)的優(yōu)點是表位的三維結(jié)構(gòu)被保存(是保守的)，因為兩個跨膜部分可能互相作用以形成疏水結(jié)構(gòu)， 如圖14中所示。包括MOMP的跨膜部分的一部分的多肽的另一個優(yōu)點是在生產(chǎn)過程中，表位被保留在構(gòu)造中。這樣的另一個優(yōu)點是為嵌合體的兩個部分之間的疏水相互作用提供了可能，繼而提供可模擬整個MOMP蛋白質(zhì)的抗原特征的三維域。因此，通過去除根據(jù)第一方面的多肽中的大部分的MOMP蛋白質(zhì)的膜部分，獲得了比野生型MOMP更易于處理的多肽；并且通過同時保留特別選定的、在序列端部的膜螺旋(體)的最小部分，獲得了與較短的人工序列相比更穩(wěn)定并且可能更有效的多肽。
一并考慮，所述多肽提供了基于MOMP蛋白質(zhì)的替代的合成肽，所述合成肽是抗原性的并且適用作疫苗。
具體地說，與只有兩個鏈接(結(jié)合)表位的人工的較短的序列相比，所述多肽能夠?qū)崿F(xiàn)保留或改進的抗原性，同時與野生型MOMP相比易于生產(chǎn)和純化。
在一個實施例中，所述多肽的長度在107和132個氨基酸之間，如在107和112個氨基酸之間的長度。這樣的優(yōu)點是所述多肽更易于表達。
在一個實施例中，所述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列被根據(jù)SEQ IDNO 20或 SEQ ID NO 26的接頭分開。
這是有優(yōu)勢的，因為根據(jù)SEQ ID N0:20或SEQ ID NO :26的接頭是撓性的，這意味著它為嵌合體的兩個部分之間隨機的相互作用提供了可能，增大了三維結(jié)構(gòu)形成的機率， 所述三維結(jié)構(gòu)在不將蛋白質(zhì)鎖定在不利構(gòu)象的前提下會被免疫系統(tǒng)認可。
撓性的接頭的另一個優(yōu)點是它為多肽的兩個部分同時與免疫系統(tǒng)的不同部分發(fā)生相互作用提供了機會，因為它們可以彼此相對運動(移動)，如圖15所示。
在一個實施例中，用于產(chǎn)生抗沙眼衣原體的保護性的抗原特異性免疫應(yīng)答的表位在若干沙眼衣原體的血清(變)型中被保存。
這是有優(yōu)勢的，因為它能夠使(對)抗一種以上的沙眼衣原體的血清(變)型的保護性應(yīng)答成為可能。
在一個實施例中，所述第一和第二氨基酸序列分別是根據(jù)SEQ ID N0:21和SEQ ID NO 22的序列(沙眼衣原體，E血清型)。在另一個實施例中，所述第一和第二氨基酸序列分別是根據(jù)SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24的序列(沙眼衣原體，D血清型)。所述第一和第二氨基酸序列還可以由不同的血清型進行組合。
這是有優(yōu)勢的，因為它能夠使抗一種以上沙眼衣原體的血清型的保護性應(yīng)答成為可能。
在一個實施例中，如用標準設(shè)置通過BLAST算法所測量的，多肽具有與根據(jù)SEQ ID NO 3的氨基酸序列至少90% (如至少95%)的同源性。在一 個實施例中，多肽包括根據(jù)SEQ ID NO :3的氨基酸序列并且在另一個實施例中，多肽具有根據(jù)SEQ ID NO :3的氨基酸序列。
在一個實施例中，多肽被融合到一氨基酸序列，所述氨基酸序列包括根據(jù)SEQ ID NO :5的His-標簽(多聚組氨酸標簽)和/或根據(jù)SEQ ID NO 4的V5標簽。
這樣的一個優(yōu)點是所述多肽更易于純化。
在一個實施例中，所述多肽具有根據(jù)SEQ ID NO :6的氨基酸序列，即由根據(jù)SEQ ID NO 6的氨基酸序列構(gòu)成。
根據(jù)第二方面，提供了包括根據(jù)第一方面的氨基酸序列的化合物。
根據(jù)第三方面，提供了一種核酸，所述核酸編碼根據(jù)第一方面的多肽。
在一個實施例中，核酸具有第一核酸序列，如用標準設(shè)置通過BLAST算法所測量的，所述第一核酸序列具有與根據(jù)SEQ ID NO 7的核酸序列至少60%或至少70%，如至少 80%,或優(yōu)選至少90%的同源性；以及第二核酸序列，如用標準設(shè)置通過BLAST算法所測量的，所述第二核酸序列具有與根據(jù)SEQ ID NO 8的核酸序列至少60%或至少70%，如至少 80%，或優(yōu)選至少90%的同源性，其中所述第一和第二核酸序列被少于90個核酸殘基分開。
在一個實施例中，所述核酸包括根據(jù)SEQ ID NO 9的核酸序列。
根據(jù)第四方面，提供了一種質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包括根據(jù)第三方面的核酸。
在一個實施例中，所述質(zhì)粒被用作表達載體。
根據(jù)第五方面，提供了一種通過根據(jù)第四方面的表達載體轉(zhuǎn)化的細胞。
在一個實施例中，所述細胞選自由下述各項構(gòu)成的組植物細胞、細菌、酵母細胞、 真菌細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
根據(jù)第六方面，提供了一種用于產(chǎn)生根據(jù)第一方面的多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)第五方面的細胞并且恢復(fù)(回收)所述多肽。
根據(jù)第七方面，提供了一種組合物，所述組合物包括根據(jù)第一方面的多肽連同藥學(xué)上可接受的賦形劑。
在一個實施例中，所述組合物還包括佐劑，如霍亂毒素(CT)佐劑。
根據(jù)第八方面，提供了用作藥劑的根據(jù)第一方面的多肽、根據(jù)第二方面的化合物、 或根據(jù)第七方面的組合物。
根據(jù)第九方面，提供了用作抗沙眼衣原體的疫苗的根據(jù)第一方面的多肽、根據(jù)第二方面的化合物、或根據(jù)第七方面的組合物。
根據(jù)第十方面，提供了用于防止由于沙眼衣原體感染引起的不孕的根據(jù)第一方面的多肽、根據(jù)第二方面的化合物、或根據(jù)第七方面的組合物。
根據(jù)第十一方面，提供了使用，其中根據(jù)第一方面的所述多肽、根據(jù)第二方面的所述化合物、或根據(jù)第七方面的所述組合物通過口服、腸道外給藥、通過吸入噴霧給藥、局部外敷、直腸給藥、鼻給藥、口腔(向頰)給藥、舌下給藥或陰道給藥。
在一個實施例中，所述給藥是(經(jīng))鼻給藥。(經(jīng))鼻給藥可以通過鼻噴霧劑或滴鼻劑實現(xiàn)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點是它更易于生產(chǎn)，具有保持的或改進的免疫效應(yīng)，這繼而允許更靈活的給藥途徑。
本發(fā)明還具有的優(yōu)點是它更易于以可溶的形式純化并且在溶液中具有增大的穩(wěn)定性。



由本發(fā)明下文的實施例的描述顯而易見并可闡明本發(fā)明所能夠?qū)崿F(xiàn)的這些和其它方面、特征和優(yōu)點，參見附圖，其中
圖1是WT MOMP蛋白質(zhì)的示意性圖解；
圖2是根據(jù)一個實施例的基因構(gòu)造的PCR分析結(jié)果的圖像；
圖3是根據(jù)一個實施例的多肽的蛋白質(zhì)印跡分析(Western blot analysis)結(jié)果的圖像；
圖4是根據(jù)一個實施例的純化的MOMP蛋白質(zhì)的考馬斯藍染色(Coomassie blue staining)的圖像；
圖5是根據(jù)另一實施例的多肽的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果的圖像；
圖6是根據(jù)一個實施例的轉(zhuǎn)化的基因組DNA的Southern印跡分析結(jié)果的圖像；
圖7是根據(jù)另一個實施例的多肽的半定量結(jié)果的圖像；
圖8和9是示出根據(jù)某些實施例的免疫接種實驗結(jié)果的圖解；
圖10是示出根據(jù)一個實施例的在小鼠上免疫接種的保護效應(yīng)的圖表；
圖11是示出根據(jù)一個實施例的免疫接種實驗結(jié)果的圖解；
圖12是示出根據(jù)一個實施例的在小鼠上免疫接種的保護效應(yīng)的圖表；
圖13是示出根據(jù)一個實施例的在小鼠上免疫接種的禁止效應(yīng)的圖表；
圖14是根據(jù)一個實施例的跨膜部分相互作用以形成疏水結(jié)構(gòu)的示意性概觀；和
圖15是根據(jù)一個實施例的多肽的兩個部分的示意性概觀，它們彼此相對移動(運動)。
具體實施方式
為了本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明，將在下文結(jié)合附圖更詳細地描述本發(fā)明的幾個實施例。不過，本發(fā)明可能以許多不同的形式來體現(xiàn)并且不應(yīng)當被解釋為受限于在此所列舉的實施例。相反，這些實施例提供的目的是為了使本文公開內(nèi)容能詳盡和完整，并且將本發(fā)明的范圍完全地傳達給本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員。實施例不是對本發(fā)明的限制，而是本發(fā)明僅限于所附的權(quán)利要求書。此外，在附圖中示出的具體實施例的詳細說明所用的術(shù)語不旨在對本發(fā)明進行限制。
下文的說明書著重于本發(fā)明的一個實施例，所述實施例可應(yīng)用于一種用于產(chǎn)生抗沙眼衣原體的保護性的免疫應(yīng)答的多肽，并且特別地可適用于一種嵌合多肽，所述嵌合多肽基于沙眼衣原體E血清型多肽Μ0ΜΡ，用于產(chǎn)生抗沙眼衣原體的保護性的免疫應(yīng)答。不過， 應(yīng)當理解的是本發(fā)明并不局限于本申請的公開內(nèi)容，而是可被應(yīng)用到許多其他的血清型， 包括例如血清型 A-K、Ba、Da、la、Ja、L1-L3、和 L2a。
本發(fā)明的發(fā)明人業(yè)已發(fā)現(xiàn)一種嵌合多肽，所述嵌合多肽基于MOMP蛋白質(zhì)，起到抗沙眼衣原體的免疫的抗原的作用，并且還易于純化，這是由于與WTMOMP蛋白質(zhì)相比它的尺寸相對小并且疏水性降低。
如將在下文中更詳細示出的，多肽可能在多種宿主中表達，如大腸桿菌 (Escherichia coli)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)和古月蘿卜(Daucus carota)。不過， 任何一種宿主(如細菌酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞)都可用于表達。包 括兩個WT MOMP蛋白質(zhì)環(huán)的多肽或MOMP嵌合體比WT蛋白質(zhì)更溶于水并且在抗原性方面是優(yōu)化的，因為它包括T和B淋巴細胞-刺激表位，這對于免疫效應(yīng)是重要的。此外，它更易于純化并更穩(wěn)定。多肽可通過對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說已知的任何方式給藥給受用對象。例如，給藥給人或動物可以是局部的或全身的并且通過口服、腸道外給藥、通過吸入噴霧、局部外敷、直腸給藥、經(jīng)鼻給藥、口腔(向頰)給藥、舌下給藥、陰道給藥或經(jīng)植入式儲藥器實現(xiàn)。術(shù)語“腸道外(給藥)”用在本文中包括皮下、靜脈注射、動脈內(nèi)、肌肉、皮膚內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱內(nèi)和骨內(nèi)的注射和輸注技術(shù)。在一個實施例中，還提供了藥用組合物，所述組合物包括有效量的根據(jù)某些實施例的至少一種多肽和藥學(xué)上可接受的載體。組合物可被配制成固態(tài)、液態(tài)、凝膠或懸浮液形式，用于口服給藥，例如，片劑(例如，針對口腔、舌下或全身的吸收)、大丸齊U、粉齊U、顆粒齊U、施用于舌的糊劑或凝膠劑、硬膠囊劑、軟膠囊、口腔噴劑、乳劑和微乳劑；通過皮下、肌肉、靜脈或硬膜外注射的腸道外給藥，例如，無菌溶液或懸浮液；局部外敷給藥，例如，施加于皮膚的乳霜、藥膏、貼劑或噴劑；陰道內(nèi)或直腸內(nèi)給藥，例如，陰道栓、霜或泡沫劑；舌下給藥；眼部給藥；經(jīng)皮膚給藥；或經(jīng)鼻給藥，如鼻噴霧劑或滴鼻劑。在一個實施例中，多肽可以口服地給藥給受用對象，如小鼠或人。在另一個實施例中，多肽可以經(jīng)鼻給藥給受用對象，如小鼠或人。經(jīng)鼻給藥可以通過噴霧劑或通過滴劑進行。.在另一個實施例中，多肽可以腸道外給藥給受用對象，如小鼠或人。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)具有根據(jù)一個實施例的表位的構(gòu)造，對于CD4+T淋巴細胞、細胞毒T淋巴細胞(CTL)以及中和抗體是重要的，它們對于形成抗沙眼衣原體的保護性免疫應(yīng)答是必要的。這種新的蛋白質(zhì)在小鼠上誘導(dǎo)免疫原性應(yīng)答以及保護性效應(yīng)。分開表位(如分開SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2)的氨基酸殘基的類型和數(shù)量可以選擇，如本領(lǐng)域所知的，以使多肽易于被純化，相應(yīng)的核酸序列以希望的細胞類型方便表達和/或多肽可以按希望的劑型給藥。優(yōu)選的，進行這種選擇使得多肽的產(chǎn)生抗沙眼衣原體的免疫應(yīng)答的能力保持在高位，或至少在可接受的水平。

所設(shè)計的構(gòu)造被成功地轉(zhuǎn)到擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因組中，并且超過至少六代證實了轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定整合，這通過免疫印跡分析得到證明。這是有優(yōu)勢的，因為后代中轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性對于未來擴大轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的可能性是重要的。由于擬南芥(A. thaliana)被小鼠生吃，在臨床前試驗中，它可用作模型系統(tǒng)。將可食用轉(zhuǎn)基因植物用作接種疫苗的其它優(yōu)點包括運輸簡單、成本效率和用于當?shù)厣a(chǎn)的可能性。此外，通過這種方式生產(chǎn)的疫苗是安全的和非傳染性的并且為高頻率的增漲提供了可能性。在口服(接種)疫苗期間給藥方案的改進和佐劑的使用可增大可食用疫苗的功效?；谥参锏目墒秤靡呙鐚τ谒雒庖呓臃N是良好的候選者。它們安全、便宜并且可以在當?shù)胤N植。此外，通過雜交植物產(chǎn)生不同的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)基因植物能夠產(chǎn)生若干種不同的抗原。已知的是，轉(zhuǎn)基因植物可以刺激全身和粘膜的雙向免疫應(yīng)答。此外,所設(shè)計的構(gòu)造被成功地轉(zhuǎn)到大腸桿菌(Escherichia coli)中。這是有優(yōu)勢的，因為大腸桿菌(E. coli)對于蛋白質(zhì)生產(chǎn)是公知的和常用的宿主。在一個實施例中，多肽被鏈接至表達標簽，如V5和/或His (多聚組氨酸)標簽。這是有優(yōu)勢的，因為它簡化了多肽的生產(chǎn)和純化。
實施例的詳細說明
以下是實施例的詳細說明。提供的實施例僅用于示例目的，以便本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠?qū)嵤┖褪褂帽景l(fā)明。不過，實施例不應(yīng)被理解為以任何方式對本發(fā)明加以限制。
嵌合MOMP構(gòu)誥根據(jù)制造商的方案，使用QlAamp DNA Mini Kit (迷你試劑盒)(Qiagen, Hilden,Germany),從源自被沙眼衣原體E血清型感染的病人的細菌懸浮液(OrebroUniversityHospital, Sweden)中分離出總基因組DNA。利用根據(jù)SEQ ID NOs : 10至13的引物(分別是VS2正向1、VS2反向1、VS4正向I和VS4反向I )，從制備好的基因組DNA起，對包含多個選定的B和T細胞表位的沙眼衣原體MOMP的兩個DNA片段(如圖1中的相似部分VS2和VS4所示)進行初始擴增。PCR反應(yīng)利用了 Ex Taq DNA聚合酶(Takara Bio Inc, Shiga, Japan)并且由98° ((10秒)、55° C (30秒)和72° C (I分鐘)35個循環(huán)組成，隨后在72° C下延伸(15 分鐘)。PCR 產(chǎn)物通過 QIAquick PCR Purification Kit (純化試劑盒)(Qiagen,Hilden, Germany)進行純化,并且在與第一次PCR相同的條件下通過用于VS2延伸的片段的根據(jù)SEQ ID NOs :14至15的引物(分別是VS2正向2&3和VS2反向2)以及用于VS4延伸的片段的根據(jù)SEQ ID NOs 16至17的引物(分別是VS4正向2和VS4反向2&3)進行第二次PCR0用于擴增VS2和VS4片段的PCR引物外加接頭序列[(Gly4Ser)3](根據(jù)SEQ ID NO:20)或接頭序列[(Gly4Ser)2Gly4](根據(jù)SEQID NO :26)是基于接頭和選定的MOMP片段的核苷酸序列設(shè)計的。純化的片段被提供為SEQ ID NOs :1和2，并且與根據(jù)圖1的VS2和VS4片段相似。純化的片段通過對于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重疊延伸利用下述條件進行拼接95° C(1分鐘)、55° ((1分鐘)、72° C (2分鐘)循環(huán)10次，接著在72° C下延伸15分鐘。拼接的產(chǎn)物被用于第三次PCR,其中使用Pfx Taq-聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)和94° C (15秒)、55° C (30秒)、72° C (2分鐘)循環(huán)25次，接著是在72° C下單個延伸步驟(30分鐘)。擴增通過引物SEQ ID N0:14和SEQ ID N0:17進行。如上文所述對所獲得的根據(jù)SEQ ID NO 9的PCR產(chǎn)物進行純化。純化的片段SEQ ID NOs :1和2包括用于產(chǎn)生抗沙眼衣原體的保護性的抗原特異性免疫應(yīng)答的表位，以及沙眼衣原體的主要外膜蛋白(MOMP)的跨膜部分的部分。SEQ IDNO 1的跨膜部分由氨基酸編號22 至27來表示，并且SEQID NO 2的跨膜部分分別由氨基酸編號3至9和17至23來表示。只使用MOMP的片段的一個優(yōu)點是與整個MOMP蛋白質(zhì)相t匕，多肽更易于以純化的形成生產(chǎn)。多肽包括MOMP的跨膜部分的部分的一個優(yōu)點是表位的三維結(jié)構(gòu)被保存(是保守的)。多肽包括MOMP的跨膜部分的部分的另一個優(yōu)點是在生產(chǎn)過程中表位被保留在構(gòu)造中。這種結(jié)構(gòu)的另一個優(yōu)點是它為嵌合體的兩個部分之間的疏水性相互作用提供了可能，繼而提供可以模擬整個MOMP蛋白質(zhì)的抗原特征的三維域。相信跨膜部分是螺旋構(gòu)象。在一個實施例中，每個片段，如SEQ ID NOs 1和2，包括兩個螺旋。這是有利的，因為它進一步增強了上述優(yōu)點?！⒖紤]，多肽使保留或改進的抗原性成為可能，同時易于生產(chǎn)和純化。在一個實施例中，用于產(chǎn)生抗沙眼衣原體的保護性的抗原特異性免疫應(yīng)答的表位在若干沙眼衣原體的血清型中被保存(是保守的)。這是有利的，因為它使抗一種以上的沙眼衣原體的血清型的保護性應(yīng)答成為可倉泛。大腸桿菌m.coli)中MOMP嵌合體的克隆和表達根據(jù)制造商的方案，利用Champion pET Directional TQPO ExpressionKit (表達試劑盒)(Invitrogen, Groningen, The Netherlands)將純化的 MOMP 嵌合體克隆到 pET101/D-TOPOr載體。通過測序(ABI PRISM 310 Genetic Analyser, AppliedBiosystems,Foster City, CA)確認我們的構(gòu)造與C-端V5和6xHis融合標簽在框架中。嵌合蛋白質(zhì)在BL21 StarTM(DE3)大腸桿菌(E. coli)菌株中表達。用IOml的源自大腸桿菌單菌落的新鮮的過夜培養(yǎng)物接種體積為IOOOml的包含50 u g/ml羧芐西林和2. 5mM甜菜堿的LB培養(yǎng)基(Sigma, Steinheim, Germany)并且在 600nm 下 0. 72 的光密度(OD)在 37° C 下生長。加入異丙基 -D-硫代半乳糖苷(IPTG, Invitrogen, Groningen, The Netherlands)到最終濃度為0. 15mM，并且將培養(yǎng)物再孵育4小時。細菌通過離心作用(5000 x g，15分鐘)被收集并且根據(jù)針對它們的N1-NTA樹脂的Sigma-Aldrich的方案進行蛋白質(zhì)純化。
MOMP嵌合體的鈍化將細菌沉淀物(粒料)重懸在裂解液中(50mM磷酸鉀，pH 7. 8,400mMNaCl, IOOmM此1，10%甘油，0. 5%Triton X-100, IOmM L-組胺酸，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF))，在液氮中冷凍并隨后在42° C下解凍。重復(fù)冷凍和解凍三次，接著在冰上超聲處理(35W，6 X 30秒)以便裂解。超速離心后(45000 X g，45分鐘)獲得兩個部分-可溶部分和不可溶部分。根據(jù)制造商的方案，在天然條件下·利用HIS-Select鎳親和凝膠(HIS-Select Nickel AffinityGel) (Sigma, Saint Louis, Missouri)純化可溶部分。沉淀物(粒料)被重懸在0.1M磷酸鈉(pH為8.0)，8M尿素中并且經(jīng)聲波處理，如上文所述。通過超速離心(50000 x g，60分鐘)除去不可溶物質(zhì)。根據(jù)制造商的建議，通過固定化的金屬-離子親和層析在變性條件下對上層清液進行純化。將洗脫的蛋白質(zhì)的已收集的部分匯集起來(分別對于天然蛋白質(zhì)和對于變性蛋白質(zhì))并且通過截留分子量為IOKDa的Amicon Ultra離心過濾器裝置(Millipore, Billerica, MA)進行濃縮。
對于棺物轉(zhuǎn)化的DNA構(gòu)律利用引物SEQ ID N0:14和18 (STOP密碼子被引入根據(jù)SEQ ID N0:18的引物)以及Pfx Taq-聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA),由先前獲得的構(gòu)造再擴增嵌合M0MP,以便產(chǎn)生鈍端PCR產(chǎn)物。利用以下條件進行PCR :94° C下15秒、55° C下30秒、72° C下2秒循環(huán)35次，接著72° C下單個延伸步驟達30分鐘。PCR產(chǎn)物如前所述被純化并用于亞克隆到植物表達載體。作為植物表達載體，我們使用了 pGreen0229 (www. pgreen, ac. uk),由Dr.P. MulIineaux 和 Dr.R.Hellens, John Innes Centre 和 Biotechnology andBiologicalSciences Research Council (Norwich Research Park, UK)惠贈。表達盒包含了 CaMV35S啟動子和CaMV聚腺苷酸終止(子)序列，由多克隆位點分開。載體由SmaI酶在多克隆位點線性化并且用于克隆嵌合MOMP構(gòu)造。通過測序核實所得到的質(zhì)粒以確定插入物的正確定向(ABI PRISM 310GeneticAnalyser, Applied Biosystems, Foster City,CA)。
擬南芥中的植物轉(zhuǎn)化通過電穿孔,利用pGreen0229/嵌合MOMP來轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) (EHA105),由 E. E. Hood (Department of Biology, UtahState University)惠贈。在添加有卡那霉素(50 U g/ml)和四環(huán)素(5 ii g/ml)的LB培養(yǎng)基上選擇陽性克隆(系)。擬南芥生態(tài)型Columbia-0 (Col-O) (The European Arabidopsis StockCentre, Loughborough, UK)被用作植物轉(zhuǎn)化的背景。在施肥的土壤珍珠巖蛭石混合物(1:1:1)上播種后，種子在4° C下(黑暗)保持5天，然后轉(zhuǎn)移到生長室(22° C，16小時光照，8小時黑暗，70%濕度)。白光的熒光率是100 u mo I光子HT2JT1 (PAR)。轉(zhuǎn)基因植物通過本領(lǐng)域已知的四周齡擬南芥屬植物的簡化的花序浸潰(floral dip)法產(chǎn)生并且通過在包含草銨勝(glufosinate-ammonium) (BASTA) (10 U g/ml) (Riedel-de Haen, Seelze, Germany)^Psephatoxime (400 u g/ml) (Sigma, Steinheim, Germany)的 Murashige and Skog(MS)培養(yǎng)基上發(fā)芽進行選擇?？剐灾参锉晦D(zhuǎn)移到盆栽混合土(potting mix),以便分析、自體受粉和種子生產(chǎn)。由產(chǎn)生100%BASTA-抗性后代的各植物所獲得的種子被用于進一步的實驗。
胡蘿卜中的植物轉(zhuǎn)化在一個替代性實施例中，通過電穿孔，利用pGreen0229/嵌合MOMP來轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌(EHA105),該菌株由 E. E. Hood (Department of Biology, UtahState University)惠贈。在添加有卡那霉素(50 g/ml)和四環(huán)素(5 g/ml)的LB培養(yǎng)基上選擇陽性克隆(系)。胡蘿卜(Daucus carota (carrot) (L. ) ssp. sativus cv Napoli Fl)(Weibullstradgard AB, Hammenhog, Sweden)的種子在 25%[v/v]氯中消毒 45 分鐘又在
2.5%[v/v]氯中消毒2小時，70%乙醇中I分鐘，并最終在I小時內(nèi)在水中洗三次。無菌的胡蘿卜(D. carota)種子在 沒有生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上發(fā)芽并且通過用2，4- 二氯苯氧乙酸(lmg/1)在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)由切斷的下胚軸開始生長愈傷組織細胞。將愈傷組織細胞懸浮在相同類型的液態(tài)培養(yǎng)基中并且在25° C下在黑暗中的搖床(90rpm)上生長。為了產(chǎn)生體細胞胚，細胞被轉(zhuǎn)移到無生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基。為了轉(zhuǎn)化，在添加了新鮮的生長培養(yǎng)基后的10-14天取胡蘿卜細胞。通過離心作用(在IOOg達I分鐘)將胡蘿卜細胞進行濃集，4-5ml濃集的細胞在可達到20ml的液態(tài)MS培養(yǎng)基中被稀釋并且添加600 的LB培養(yǎng)基(在600nm下1. 5的光密度)中攜帶載體的根癌土壤桿菌(A. tumefaciens)。利用搖床(90rpm)在25° C下在黑暗中將細胞和細菌共培養(yǎng)3天。為了選擇轉(zhuǎn)基因胡蘿卜細胞，它們通過離心作用在液態(tài)MS培養(yǎng)基中被重復(fù)洗三次以便除去細菌，并且隨后在25° C下在弱光(lu E/m2/s)中在添加有BASTA(0、1、5、* 10 u g/ml)以及頭孢噻月虧(cephotaxime)(500 u g/ml)的無生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中埋入并進一步培養(yǎng)。胡蘿卜細胞的密度為0. 1-0. 9ml濃集細胞/IOml的培養(yǎng)基。生長聚集物以及某些情況下植物被轉(zhuǎn)移到?jīng)]有BASTA的無生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基。體外植物在薄霧-房子(mist-house)中在11 (個)塑料罐(PhytoTechnology Laboratories, Terrace Lenexa, KS, USA)中被培養(yǎng)并適應(yīng)環(huán)境達大致 2 周，在弱光下給予18h/6h光/黑暗，并隨后利用相等的光周期但用50 u E/m2/s的光強在盆中培養(yǎng)。
免疫印跡為了制備蛋白質(zhì)樣本，通過研缽和研件在包含50mM Tris、8M尿素、l%TritonX_100和ImM DTT (pH 7. 5)的提取緩沖液中研磨擬南芥屬組織。蛋白質(zhì)提取物通過SDS-PAGE被分離并且被印跡到硝化纖維素膜Hybond-C上(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England)。所述膜在 TBS (0. 02MTris_HCl、0. 15M NaCl, pH 7. 4)中的 3%BSA(Sigma, Steinheim, Germany)中封閉I小時并且用稀釋了 1:2500倍的小鼠抗沙眼衣原體MOMP的單克隆抗體(AcrisAntibodies Gmbh, Germany)探測I小時。用結(jié)合了堿性磷酸酶(AP)的抗-鼠抗體(Promega，Madison, WI)檢測嵌合MOMPE并且用NBT和BCIP(Promega, Madison, WI)進行可視化。
基因組DNA提耳又和Southern印跡分析利用JETFLEX 基因組 DNA 純化試劑盒(JETFLEX Genomic DNAPurification Kit)(GENOMED GmbH, Lohne, Germany)隔離植物基因組 DNA,并通過 DraI,NdeI 或 NotI (Sigma)裂解15 ii g DNA。這些酶不裂解嵌合MOMP序列。裂解的DNA通過在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離被分離并被轉(zhuǎn)移到Hybond-N膜(GE Healthcare)。膜通過利用隨機引物DNA標記系統(tǒng)(Invitrogen, Carlsbad, CA)標記有32P_dCTP的嵌合MOMP DNA進行探測。在X-射線膠片上觀察到的帶的數(shù)量與植物基因組中T-DNA插入物的數(shù)量相對應(yīng)。
構(gòu)建的免疫基因的驗證進行了中間試驗。用鼻內(nèi)給藥通過重組MOMP嵌合體使五只小鼠(C57/bl6)得到免疫，每次免疫啟動之間有10天間隔。給藥劑量是10 ii g的純化的重組MOMP嵌合體。小鼠在免疫接種開始前和每次免疫啟動后被采集血液，并且通過ELISA分析血清抗-MOMP嵌合體 IgG。ELISA 板(Nunc Maxisorp, Odense, Denmark)覆有重組 MOMP 嵌合蛋白質(zhì)(2 u g/ml)。血清在PBS中被稀釋?？骨逗象w抗體(Abs)之后是HRP-標記的兔抗鼠Ig Abs并利用檸檬酸鹽緩沖液(pH 4. 5)中的鄰苯二胺底物/0. 04%H202進行可視化。在450nm下通過分光光度法讀取(這些)反應(yīng)?？?MOMP嵌合體血清效價Iogltl滴度，表明了有希望的結(jié)果(數(shù)據(jù)末示出)。
嵌合MOMP構(gòu)造及其在大腸桿菌中的過表達用于PCR以便擴增用于組裝嵌合體的MOMP的VS2和VS4可變區(qū)的反向和正向引物是從核苷酸序列數(shù)據(jù)設(shè)計的。根據(jù)SEQ ID NO :19、編碼根據(jù)SEQ IDNO :20的共同撓性接頭(Gly4Ser3)3的序列被分別引入根據(jù)SEQ ID NOs 14和15的引物的5’ -端。在一個實施例中，根據(jù)SEQ ID NO :25、編碼根據(jù)SEQ ID NO :26的另一共同撓性接頭(Gly4Ser)2Gly4的序列被分別引入根據(jù)SEQ ID NOs :14和15的引物的5’-端。隨后沿以下方向組裝擴增的 VS2-和 VS4-類片段(分別是 SEQ IDNOs :1 和 2):5’-SEQ ID NOs :1:接頭SEQ ID NOs 2-3’。所產(chǎn)生的嵌合體顯示351bp的預(yù)期尺寸，如圖2中L道中的強帶所示出。圖2示出了組裝的基因構(gòu)造的PCR分析的結(jié)果。N表示PCR-反應(yīng)的陰性對照，L表示DNA尺寸標記物。產(chǎn)物通過測序進行驗證并且克隆到PETlOl載體。過表達的蛋白質(zhì)通過抗-His Abs(數(shù)據(jù)未不出)和抗-MOMP Abs (Acris Antibodies Gmbh, Germany)進行檢測,如圖3中所見，圖3示出了在大腸桿菌中表達的并利用N1-NTA技術(shù)純化的重組嵌合MOMP蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡分析(Western blot analysis)的結(jié)果。通過對沙眼衣原體MOMP的小鼠單克隆抗體(Acris Antibodies Gmbh, Germany)檢測預(yù)期尺寸(17kD)的帶。L表示蛋白質(zhì)尺寸標記物。我們將MOMP嵌合體的表達擴大到2000ml細菌培養(yǎng)物，以便利用N1-NTA親和技術(shù)進行純化。用考馬斯藍(Coomassie Blue)染色的純化的嵌合體蛋白質(zhì)在圖4中示出。在天然條件下純化的蛋白質(zhì)被用在以后的免疫接種實驗中，用于驗證所設(shè)計的構(gòu)造的免疫原性特征和用于產(chǎn)生抗-MOMP嵌合體多克隆抗血清。在變性條件下純化的蛋白質(zhì)被用于覆蓋(包被)ELISA板，(所述ELISA板)用于檢測小鼠血清中的特異性Abs。
植物中轉(zhuǎn)基因插入物和嵌合體產(chǎn)生的分析所設(shè)計的MOMP嵌合體被連接到pGreen載體的SacI克隆位點，并且克隆片段的序列被驗證。重組表達載體被用于轉(zhuǎn)化Col-O生態(tài)型的擬南芥植物。在用雙丙氨磷進行初始幼苗篩選后選定四十株轉(zhuǎn)基因植物。三個選定的轉(zhuǎn)基因系編號9、15和25被用于進一步的分析，并且已經(jīng)證實可達到第六代的轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定整合，如圖4中所見。未分級(段)的葉提取物中的組成性表達的嵌合MOMP蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡檢測在圖5中示出三個轉(zhuǎn)基因系(一式二份“a”和“b”)與未轉(zhuǎn)化的植物(WT，作為陰性對照)的比較揭示了適當尺寸的特異性帶，所述尺寸完全符合嵌合體和大腸桿菌表達的重組蛋白質(zhì)的計算尺寸。將選定的轉(zhuǎn)基因植物進行Southern印跡分析以便估算轉(zhuǎn)基因的數(shù)量。限制性酶Dra1.Nde I和Mlu I被用于植物基因組DNA的裂解。用Dra I和Nde I所獲得的結(jié)果在圖6中示出。不同數(shù)量的轉(zhuǎn)基因插入物出現(xiàn)在不同的系中系9包含一個插入物，系12-三個，系15-兩個，而系25-四個插入物。盡管在不同的系中存在不同數(shù)量的轉(zhuǎn)基因，但這并沒有在視覺上影響植物的顯型(表現(xiàn)型)。與擬南芥野生型(WT)植物相比，所述轉(zhuǎn)化株具有相同的形態(tài)學(xué)的外觀。通過用研缽和研棒在液氮中研磨大約200mg胡蘿卜(根)來分析使用胡蘿卜的替代性實施例的結(jié)果。冷凍的粉末在冰上被解凍并用200 ill的50mM Tris-HCl緩沖液(pH
7.3)進行渦流， 并隨后如上所述進行分析。圖7示出了根據(jù)上文所述利用胡蘿卜產(chǎn)生的MOMP嵌合體的量的半定量分析的結(jié)果，用栽培種Karotan (系+ ;圖7中表示為Kar)和栽培種Napoli (系313/3 ;圖7中表示為313/3)，并與我們的MOMP嵌合蛋白質(zhì)的標準量(180、300、600、和1200ng)進行比較。系Kar+每40 y g總可溶蛋白質(zhì)(TSP)產(chǎn)生450ng M0MP，這對應(yīng)于 1%。系 Napoli313/l 每 20 y g TSP 產(chǎn)生 600ng M0MP，這對應(yīng)于 3%。
通過具有His/V 5標簽的重組嵌合MOMP蛋白質(zhì)在小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答四組10只小鼠被給予根據(jù)SEQ ID NO 6的構(gòu)建的MOMP嵌合體。根據(jù)下述進行給藥給予第一組10 i! g純化的MOMP嵌合體和I U g霍亂毒素(CT)佐劑的混合物，鼻內(nèi)給藥(1. n. )20 u I三次，有10天間隔。在MOMP嵌合體+CT佐劑的末次給藥十天后，給小鼠皮下(s. c)注射 Depo-Provera (Pfizer)。在 Depo-Provera 注射后七天，經(jīng)陰道(1. vag)給藥40 ill的10 ii g MOMP嵌合體+1 ii g CT佐劑的混合物的后續(xù)給藥(加強)。給予第二組根據(jù)上文所述轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因擬南芥，口服三次，有十天的間隔。每次，除常規(guī)飼料(喂料)之外，給予小鼠過量的新鮮的轉(zhuǎn)基因擬南芥。在轉(zhuǎn)基因擬南芥的末次給藥后十天，給小鼠皮下(s. c)注射 Depo-Provera (Pfizer)。在 Depo-Provera (Pfizer)注射后七天，經(jīng)陰道(1. vag)給予40 ill的10 ii g MOMP嵌合體+1 y g CT佐劑的混合物的后續(xù)給藥(加強)。給予第三組根據(jù)上文所述轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因擬南芥，口服三次，有十天的間隔。每次，除常規(guī)飼料(喂料)之外，給予小鼠過量的新鮮的轉(zhuǎn)基因擬南芥。在轉(zhuǎn)基因擬南芥的末次給藥后十天，給小鼠皮下(s. c.)注射 Depo-Provera (Pfizer)。在 Depo-Provera (Pfizer)注射后七天，經(jīng)陰道(1. vag)給予40iU的PBS緩沖劑的后續(xù)給藥(加強)。第四組被用作陰性對照，g卩，沒有任何給藥。通過ELISA針對抗原特異性抗體(IgG和IgA)分析小鼠的免疫應(yīng)答。然后，通過用沙眼衣原體入侵(挑戰(zhàn))小鼠來測試免疫應(yīng)答的強度，以查看是否獲得了保護性免疫或保護性免疫應(yīng)答。末次處理后十天，采集血液和陰道樣本。在七天過程中再次用Depo-Provera(Pfizer)處理小鼠，然后受(沙眼衣原體的)入侵。血液和陰道液體的樣本被采集并通過ELISA進行分析，如上文“構(gòu)建的免疫基因的驗證”中所描述。當分析血清和陰道分泌物中的免疫應(yīng)答時，第一組小鼠的免疫應(yīng)答最強。第二和第三組顯示較低一些的應(yīng)答(某些小鼠是陰性的)。在陰道分泌物中可檢測到低水平的抗體，主要是來自第一組中的小鼠。結(jié)果總結(jié)在圖8和圖9中。圖8是示出分別在上述組一( )、組二( 口)和組三(A)的小鼠的免疫應(yīng)答(IgG的Iogltl滴度)的圖表。結(jié)果被分段以顯示(從左到右)I次給藥后、2次給藥后、3次給藥后、3次給藥加上加強后、由獨立的抗原破傷風(fēng)類毒素刺激(以確保小鼠不是反應(yīng)過度的)以及只由V5表位刺激的免疫應(yīng)答。上述的組四(對照)不顯示任何應(yīng)答(數(shù)據(jù)未示出)。圖9A和9B是示出分別在上述的組一( )、組二( 口)和組三(▲))中的小鼠的免疫應(yīng)答(A-1gG的Iogltl滴度；B-1gA的Iogltl滴度)的圖表。結(jié)果被分段以顯示(從左到右)3次給藥加上加強后的免疫應(yīng)答，如用ELISA分別靶向MOMP嵌合體和V5表位所測量的。此外，研究了被沙眼衣原體血清型D感染的小鼠中用所構(gòu)建的MOMP嵌合體進行免疫接種引起的保護效應(yīng)。在圖10中示出的結(jié)果根據(jù)標準的方法進行測量，即，分別在感染后攜帶細菌8((18)、16((116)、32((132)和40 (d40)天的小鼠的數(shù)量。黑條表示沒有被免疫接種的小鼠(第四組)，白 條表示用根據(jù)上文所述的大腸桿菌產(chǎn)生的MOMP嵌合體處理的小鼠(鼻內(nèi)給藥和陰道內(nèi)加強)(第一組)，而灰條表示用根據(jù)上文所述的擬南芥產(chǎn)生的MOMP嵌合體處理的小鼠(口服給藥和陰道內(nèi)加強)(第二組)?？梢钥吹剑庖呓臃N明顯地提供了保護效應(yīng)。第一組的小鼠部分得到了保護，比對照組更快的恢復(fù)。
通過沒有His/V 5標簽的重組嵌合MOMP蛋白質(zhì)在小鼠中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答給予三組10齡對照小鼠根據(jù)SEQ ID NO 3的所構(gòu)建的MOMP嵌合體，即，沒有His/V5標簽。根據(jù)下述進行給藥給予第一組10 ii g純化的MOMP嵌合體+1 ii g CT佐劑的混合物，鼻內(nèi)(1. n.)給藥20 ill三次，有10天時間間隔。MOMP嵌合體+CT佐劑的末次給藥后的十天，給小鼠皮下(s. c)注射 Depo_Provera(Pfizer)。在 Depo-Provera (Pfizer)注射后七天，經(jīng)陰道(1. vag)給予40 ill的10 ii g MOMP嵌合體+1 ii g CT佐劑的混合物的后續(xù)給藥(加強)。經(jīng)鼻內(nèi)給予第二組20 ill PBS緩沖液三次，有十天的時間間隔。在PBS緩沖液末次給藥后十天，給小鼠皮下(s. c.)注射 Depo-Provera (Pfizer)。在 Depo-Provera (Pfizer)注射后七天，經(jīng)陰道(1. vag)給予40 ill的10 ii g MOMP嵌合體+1 y g CT佐劑的混合物的后續(xù)給藥(加強)。第三組被用作陰性對照，即，沒有任何給藥。通過使小鼠受沙眼衣原體的入侵來測量小鼠的免疫應(yīng)答。末次處理后十天，采集血液和陰道樣本。在七天過程中再次用Depo-Provera (Pfizer)處理小鼠，并隨后受(沙眼衣原體的)入侵。取血液和陰道液體的樣本并用如上文“所構(gòu)建的免疫基因的驗證”所述的ELISA分析。圖11示出每次給藥后第一組小鼠(黑點)的血清中逐漸增加的免疫應(yīng)答。第三組的小鼠(對照組)顯示為白色方塊。研究了被沙眼衣原體血清型D感染的小鼠中用所構(gòu)建的MOMP嵌合體免疫接種引起的保護效應(yīng)。在圖12中示出的結(jié)果根據(jù)標準化的方法進行測量，S卩，分別在感染后攜帶細菌7或14天的小鼠的數(shù)量。.白條表示沒有被免疫接種的小鼠(第三組)，灰條表示用根據(jù)上文所述的大腸桿菌中產(chǎn)生的MOMP嵌合體處理的小鼠(鼻內(nèi)給藥和陰道內(nèi)加強)(第一組)，而黑條表示用根據(jù)上文所述的大腸桿菌中產(chǎn)生的MOMP嵌合體處理的小鼠(只有陰道內(nèi)加強)(第二組)?？梢钥吹?，免疫接種明顯地提供了保護效應(yīng)。
用沒有His/V5標簽的重組嵌合MOMP蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的小鼠的生育力研究與上文所討論的免疫接種研究同時，進行了生育力研究。進一步研究了四組10只小鼠中，預(yù)先用根據(jù)SEQ ID NO 3 (即沒有His/V5標簽)的重組嵌合MOMP蛋白質(zhì)進行免疫接種的雌性小鼠，其中每組如下第一組是沒有被免疫接種并且健康的小鼠。第二組是被免疫接種的小鼠，但感染了沙眼衣原體血清型D。第三組的小鼠經(jīng)鼻給予20 ill的10 ii g純化的MOMP嵌合體+1 U g CT佐劑的混合物三次，有十天時間間隔。MOMP嵌合體+CT佐劑的末次給藥后的十天，給小鼠皮下(s. c.)注射 Depo-Provera ( Pfizer)。在 Depo-Provera (Pfizer)注射后七天，經(jīng)陰道(1. vag)給予40 ill的10 ii g MOMP嵌合體+1 ii g CT佐劑的混合物的后續(xù)給藥(加強)。然后使小鼠受沙眼衣原體的入侵。給第四組的小鼠皮下(s.c.)注射 Depo-Provera (Pfizer)。Depo-Provera(Pfizer)注射后七天,經(jīng)陰道(1. vag)給予40 ii I的IOii g MOMP嵌合體+1 y g CT佐劑的混合物的后續(xù)給藥(加強)。然后使小鼠受沙眼衣原體的入侵。所有小鼠進行交配，然后稱重以確定是否懷孕。將懷孕的小鼠處死并且計算胚胎的數(shù)量。研究的目的是調(diào)查所構(gòu)建的MOMP抗原對小鼠生育力的影響。將受沙眼衣原體入侵的被免疫接種和未被免疫接種的小鼠的胚胎的數(shù)量進行比較。結(jié)果表現(xiàn)為受沙眼衣原體血清型D感染并且感染后交配產(chǎn)生后代的小鼠的數(shù)量。如在圖13中可見，所有的未受感染和接種過疫苗的小鼠懷孕了，而40%的受感染的雌性小鼠是不孕的。因此，該研究表明沙眼衣原體導(dǎo)致40%的受感染的雌性小鼠不孕，而未受感染的小鼠和受感染的小鼠在給藥根據(jù)SEQ ID NO :3的所構(gòu)建的MOMP嵌合體后是100%有能生育的。在一個實施例中，提供了一種用于在哺乳動物中誘導(dǎo)抗沙眼衣原體的保護性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給藥給所述哺乳動物根據(jù)第一方面的治療有效量的多肽或根據(jù)第二方面的化合物或根據(jù)第七方面的組合物。在一個實施例中，所述哺乳動物是人。盡管本發(fā)明已在上文結(jié)合具體實施例進行了描述，但它不旨在受限于本文所述的特定形式。相反，本發(fā)明僅受限于所附的權(quán)利要求書，并且以上特定的實施例以外的其它實施例在這些所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)是等同可能的。在權(quán)利要求中，術(shù)語“包括(comprises)/包括(comprising) ”不排除其它元件或步驟的存在。此外，盡管單獨列出，但多個裝置、元件或方法步驟可以通過例如單個單元來實現(xiàn)。另外，盡管各個特征可以包括在不同的權(quán)利要求中，但這些特征可能可進行有利的組合，并且納入在不同的權(quán)利要求中并不意味著特征的組合是不可行的和/或不利的。此外，單數(shù)引用不排除多個。術(shù)語“一個(a)”、“一個(an) ”、“第一”、“第二”等等不排除多個。權(quán)利要求中的附圖標記僅用作闡明示例，而不應(yīng)被解釋為以任何方式限制權(quán)利要求的范圍。
序列表自由文本在序列表中，以下人工序列具有自由文本信息
SEQ ID NO 4V5 標簽
SEQ ID NO 5His 標簽
SEQ ID NO 10VS2 引物，正向 I
SEQ ID NO 11VS2 引物，反向 I
SEQ ID NO 12VS4 引物，正向 I
SEQ ID NO 13VS4 引物，反向 I
SEQ ID NO 14VS2 引物，正向 2&3
SEQ ID NO 15VS2 引 物，反向 2
SEQ ID NO 16VS4 引物，正向 2
SEQ ID NO 17VS4 引物，反向 2&3
SEQ ID NO 18VS4 引物，反向，STOP(終止)
SEQ ID NO: 19接頭序列
SEQ ID NO 20接頭序列
SEQ ID NO 25接頭序列
SEQ ID NO 26接頭序列
權(quán)利要求
1.一種多肽，所述多肽包括與根據(jù)SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90%同源性的第一氨基酸序列和與根據(jù)SEQ ID NO :2的氨基酸序列具有至少90%同源性的第二氨基酸序列，其中所述第一和第二氨基酸序列被少于30個氨基酸殘基分開。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列與根據(jù)SEQID N0:1的氨基酸序列具有至少95%的同源性，并且所述第二氨基酸序列與根據(jù)SEQ IDNO :2的氨基酸序列具有至少95%的同源性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽，其長度在107和132個氨基酸之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列被根據(jù)SEQ ID NO :20或SEQ ID NO 26的接頭分開。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的多肽，其中所述第一氨基酸序列是根據(jù) SEQ ID N0:21或SEQ ID NO :23的序列，而所述第二氨基酸序列是根據(jù)SEQ ID NO :22或 SEQ ID NO 24 的序列。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的多肽，其與根據(jù)SEQID NO :3的氨基酸序列具有至少90%的同源性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其與根據(jù)SEQID NO 3的氨基酸序列具有至少95%的同源性。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的多肽，包括根據(jù)SEQID NO :3的氨基酸序列。
9.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的多肽，被融合到一氨基酸序列，所述氨基酸序列包括根據(jù)SEQ ID NO 5的His標簽或根據(jù)SEQ ID NO 4的V5標簽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多肽，具有根據(jù)SEQID NO :6的氨基酸序列。
11.一種化合物，包括根據(jù)上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的氨基酸序列。
12.—種核酸，所述核酸編碼如權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的核酸，所述核酸具有第一核酸序列，所述第一核酸序列與根據(jù)SEQ ID NO :7的核酸序列具有至少60%的同源性；和第二核酸序列，所述第二核酸序列與根據(jù)SEQ ID NO :8的核酸序列具有至少60%的同源性，其中所述第一和第二核酸序列被少于90個核酸殘基分開。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的核酸，其中所述第一核酸序列與根據(jù)SEQID NO :7的核酸序列具有至少70%的同源性，并且所述第二核酸序列與根據(jù)SEQ ID NO :8的核酸序列具有至少70%的同源性。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸，其中所述第一核酸序列與根據(jù)SEQID NO :7的核酸序列具有至少80%的同源性，并且所述第二核酸序列與根據(jù)SEQ ID NO :8的核酸序列具有至少80%的同源性。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸，其中所述第一核酸序列與根據(jù)SEQID NO :7的核酸序列具有至少90%的同源性，并且所述第二核酸序列與根據(jù)SEQ ID NO :8的核酸序列具有至少90%的同源性。
17.根據(jù)權(quán)利要求12-16中任一權(quán)利要求所述的核酸，包括根據(jù)SEQID NO :9的核酸序列。
18.一種質(zhì)粒,所述質(zhì)粒包括根據(jù)權(quán)利要求12-17中任一權(quán)利要求所述的核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的質(zhì)粒，用作表達載體。
20.一種通過根據(jù)權(quán)利要求19所述的表達載體轉(zhuǎn)化的細胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的細胞，所述細胞選自由下述構(gòu)成的組植物細胞、細菌、酵母細胞、真菌細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
22.—種用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的多肽的方法,所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求20-21中任一權(quán)利要求所述的細胞并且恢復(fù)所述多肽。
23.一種組合物，所述組合物包括根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的多肽，或根據(jù)權(quán)利要求11所述的化合物，連同藥學(xué)上可接受的賦形劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，還包括佐劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的多肽，根據(jù)權(quán)利要求11所述的化合物， 或根據(jù)權(quán)利要求23-24中任一權(quán)利要求所述的組合物，用作藥劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的多肽，根據(jù)權(quán)利要求11所述的化合物， 或根據(jù)權(quán)利要求23-24中任一權(quán)利要求所述的組合物，用作抗沙眼衣原體的疫苗。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的多肽，根據(jù)權(quán)利要求11所述的化合物， 或根據(jù)權(quán)利要求23-24中任一權(quán)利要求所述的組合物，用于防止由于沙眼衣原體感染而引起的不孕。
28.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一權(quán)利要求所述的多肽的使用，其中根據(jù)權(quán)利要求1-10 中任一權(quán)利要求所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求11所述的化合物、或根據(jù)權(quán)利要求23-24中任一權(quán)利要求所述的組合物通過口服、腸道外、通過吸入噴霧、局部外敷、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)口腔、舌下或經(jīng)陰道進行給藥。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的多肽的使用，其中所述給藥是經(jīng)鼻給藥。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的多肽的使用，其中所述給藥是通過鼻噴霧劑或滴鼻劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠誘導(dǎo)抗沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)的保護性免疫應(yīng)答的多肽。所述多肽包括具有與根據(jù)SEQ ID NO1的氨基酸序列至少90%同源性的第一氨基酸序列和具有與根據(jù)SEQ ID NO2的氨基酸序列至少90%同源性的第二氨基酸序列。此外，還提供了產(chǎn)生這些多肽以及包含它們的藥用組合物。
文檔編號A61K39/118GK103068837SQ201180025824
公開日2013年4月24日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者S·安德森, *·斯特里德 申請人:斯匹遐生物技術(shù)公司