專利名稱：用于預防和治療炎性疾病的包括掛金燈提取物作為活性成分的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預防和治療炎性疾病的組合物，所述組合物包括掛金燈(Physalis alkekengi var. francheti Hort)的提取物作為活性成分。
背景技術(shù)：
炎癥是機體抵抗由諸如細菌、病毒等多種污染物污染或組織損傷所造成的各種刺激的屏障反應，其對于將損害局限于損傷區(qū)或受損區(qū)起到最初的保護作用。通常，那些炎性反應使用先天性免疫的組分以及特異性獲得免疫的誘導等使得病因去除(HawigerJ. ， Innate Immunity and inflammation A Transcriptional Paradigm， ImmunologicResearch,23，pp.99-109，2001)。炎性反應與皮膚發(fā)紅、腫瘤、發(fā)熱(calor)、疼痛(dolor)等相關(guān)聯(lián),其造成連續(xù)的免疫反應，如根據(jù)炎性介質(zhì)、細胞因子等在發(fā)炎區(qū)域的作用所造成的血管舒張，病灶處血流增加以及血流速度降低；根據(jù)血管透性增加，血漿組分的流出增加，根據(jù)血管內(nèi)皮細胞對于循環(huán)免疫細胞的粘附能力增加，免疫細胞的流出增加以及由于趨藥性等所造成的向感染區(qū)的移動增加(Gallo RL et al. , Biology and Clinical Relevance of naturallyoccurring antimicrobial peptides, J. Allergy Clin. Immunol. ,110, pp. 823-831,2002 ；Graeme B et al. , Acute Inflammation, American Journal of Pathology,86(I),pp.185-274，1977)。在感染區(qū)的炎性反應啟動了針對于外部細菌的巨噬細胞應答并且報道了炎性介質(zhì)如ROS (活性氧類)、RNS (活性氮類)、前列腺素、白三烯等以及促炎細胞因子如TNF- a、IL-6、IL-I β 等都參與炎性反應(Renauld JC, New Insights into the role ofcytokines in asthma, J.Clin. Pathol. ,54, pp. 577-589,2001 ；Blake GJ et al. , Tumornecrosis factor-a , inflammatory biomarkers and atherogenesis, Eur.Heart J. ,23,pp. 345-347,2002)。NF-κ B，一種誘導炎性介質(zhì)的基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，的活化在巨噬細胞的那些涉及炎性的反應中起重要作用。在巨噬細胞中參與炎癥的基因如iNOS(誘導型一氧化氮合酶)、環(huán)氧酶(C0X-2)、TNF- a、IL-6、IL-1 β等通過NF- κ B轉(zhuǎn)錄。NO (—氧化氮)，具有短的半衰期的自由基被報道在L-精氨酸與L-瓜氨酸的氧化反應期間通過NOS (—氧化氮合酶)的催化作用而產(chǎn)生。它在體內(nèi)顯示出多種免疫相關(guān)的功倉泛(Moncada S. et al. , Nitric oxide Physiology, Pathology and Phamarcology.Pharmacol. Rev. ,43, pp. 109-142，1991)，然而，NO的過生產(chǎn)可顯示出細胞毒性，這造成宿主細胞和織的損傷以及可能參與多種病理綜合征如動脈粥樣硬化、癌發(fā)生等(Mordan LJ,et al. , Inhibitors of endogeneous nitrogen oxide formation block the promotionof neoplastic transformation in C3H10T1/2 fibroblasts, Carcinogenesis,14,pp. 1555-1559,1993 ；Lirk P. et al. , Inducible nitric oxide synthase, Time forreappraisal, Current. Drug. Targets. Inflamm. Allergy, I,pp. 89-108, 2002)。存在三種催化NO復制的NOS并且nNOS(神經(jīng)元N0S，N0S11)和eN0S(內(nèi)皮N0S，N0S3)通常是組成型表達，而iNOS是誘導型表達，其僅通過轉(zhuǎn)錄因子NF- κ B轉(zhuǎn)錄，而NF- κ B被細菌內(nèi)毒素LPS (脂多糖)激活。轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B與其抑制物I κ B結(jié)合，在巨噬細胞內(nèi)以未活化的形式存在，而當細菌LPS結(jié)合細胞表面的Toll-樣受體(這造成通過蛋白體的溶解過程的作用而釋放并除去IkB)時，誘導信號途徑的作用，通過I κ B磷酸化，NF-k B被激活。結(jié)果，NF-κ B移至核以誘導炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄并且報道了 NF-κ B激活涉及Akt信號途徑(Hattori Y. etal, lipopolysaccharide activate Akt in vascular smooth muscle cells resultingin induction of inducible nitric oxide synthase through nuclear factor-kappaBactivation，Eur. J. Pharmacol. ,481, pp.153-158，2003)；以及 ERK、c-jun 和 p38_MAPK的信號途徑(Kim SH, et al. ， Selenium attenuates lipopoIysaccharide-inducedoxidative stress responses through modulation of p38MAPK and NF-κ B signalingpathways,Exp. Biol. Medicine,pp565-701,2004 ；Robinson MJ et al,mit ogen-activatedprotein kinase pathways, Cur.Opi. Cell Biol. ,9, pp.180-186，1997)?？刂圃趇NOS轉(zhuǎn)錄階段與炎性反應相關(guān)的基因表達對于NO的持續(xù)期和復制水平通常很重要。因此，將iNOS表達的控制機制以及iNOS的酶活性用作研究改善或治療慢性炎性疾病的新型抗炎劑的主要靶標。已經(jīng)報道了分布在韓國的多年生草本植物掛金燈的果實含有酸漿苦味素A，B，C、皂甙、黃酮類化合物、生物堿、類胡蘿卜素、樹脂、果膠、丹寧、槲皮素、咖啡酸(caffecicacid)、肉桂酸、阿魏酸、菌草素、菌根酸(rubierythric acid)、輕基菌草素、異菌草素、菌草
酸、偽羥基茜草素等。然而，在任何上述文獻中都尚未報道或公開掛金燈提取物的抗炎活性，在此通過引用將上述文獻的公開內(nèi)容引入本文。因此，本發(fā)明人使用RAW264. 7細胞系，通過各種實驗證實了掛金燈提取物顯示出潛在的抗炎作用，即對于NO復制和被LPS處理誘導的促炎細胞因子如iNOS、C0X-2、TNF-α、IL-6和IL-I β的復制的抑制作用以及對于ρ-Ι κ Ba、iN0S和C0X-2蛋白的基因表達的降低作用。因此，掛金燈提取物可以用作治療和預防關(guān)節(jié)炎疾病的有效且安全的療法或保健食品。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供一種用于炎性疾病的預防和治療的組合物，所述組合物包括掛金燈(Physalis alkekengi var francheti Hort)提取物。解決問題的技術(shù)方案因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于治療或預防炎性疾病的藥學組合物，所述藥學組合物包括作為活性成分的掛金燈提取物以及藥學上可接受的載體。本發(fā)明的另一目的在于提供掛金燈提取物在制造用于治療或預防人類或哺乳動物的炎性疾病的藥物中的應用。本發(fā)明的另一目的在于提供一種治療人類或哺乳動物的炎性疾病的方法，包括給予所述哺乳動物有效量的掛金燈提取物以及其藥學上可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種用于預防或改善炎性疾病的保健功能性食品，包括以對于預防和改善所述疾病有效的量的掛金燈提取物作為活性成分，以及營養(yǎng)學上可接受的添加劑。在此公開的術(shù)語“提取物”包括通過用水、諸如甲醇、乙醇或它們的混合物的低級醇提取植物材料而制備的提取物，優(yōu)選用水提取植物材料而制備的提取物。在此公開的術(shù)語“掛金燈(Physalisalkekengi var francheti Hort) ”包括掛金燈的果實、根、葉和整個植株，優(yōu)選掛金燈的果實。在此公開的術(shù)語“治療和預防炎性疾病”是通過抑制NO復制和促炎細胞因子如iNOS、C0X-2、TNF-a、IL_6和IL-I β的復制以及降低ρ_Ι κ B α、iNOS和C0X-2蛋白的基因 表達的方式來執(zhí)行。在此公開的術(shù)語“炎性疾病”包括炎性高熱、扁桃體炎、胃炎、結(jié)腸炎、關(guān)節(jié)炎、腎炎、肝炎、結(jié)膜炎、過敏性皮炎、鼻炎、高血壓、糖尿病、癌癥、哮喘、尿道炎、膀胱炎、動脈粥樣硬化、過敏性疾病、鼻炎、哮喘、急性疼痛疾病、慢性疼痛疾病、牙周炎、齒齦炎、炎性腸病、痛風、心肌梗死、充血性心臟衰竭、心絞痛、胃潰瘍、缺血性卒中、膿毒癥、燒傷或胰腺炎，優(yōu)選炎性高熱、扁桃體炎、胃炎、結(jié)腸炎、關(guān)節(jié)炎、腎炎、肝炎、結(jié)膜炎、過敏性皮炎，更優(yōu)選炎性高熱或扁桃體炎，它們通過NO的過產(chǎn)生以及促炎細胞因子如iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6和IL-I β的過產(chǎn)生而發(fā)生。用于治療目的疾病的藥學組合物基于組合物的總重量計，可含有約O. 01至95w/w % ,優(yōu)選O. 5至50 /\￥%的本發(fā)明的提取物或化合物。在下文中，詳細描述本發(fā)明。本發(fā)明的提取物可以通過下面的方法來具體制備。例如，將掛金燈的果實干燥、切片并加入I至20倍，優(yōu)選約I至10倍體積的蒸餾水、C1至C4低級醇或它們的混合物，優(yōu)選蒸餾水，在10°C 80°C范圍的溫度，優(yōu)選室溫，進行第一次水提取，持續(xù)6至72小時范圍，優(yōu)選12至36小時的時間；將溶液在10°C 100°C范圍，優(yōu)選50°C 90°C的溫度用熱水進行第二次提取，持續(xù)I至20小時范圍，優(yōu)選5至15小時的時間，提取方法為用熱水、冷水提取、回流提取或超聲波提取，優(yōu)選，用熱水提取，通過過濾收集提取物，減壓濃縮并干燥以獲得本發(fā)明的提取物。因此，本發(fā)明的另一目的是提供一種制備掛金燈提取物的方法，包括由下述組成的步驟在第一步中，將掛金燈干燥、切開并切片，用I至20倍，優(yōu)選約I至10倍體積的蒸餾水、C1至C4低級醇或它們的混合物，優(yōu)選蒸餾水，在10°C 80°C范圍的溫度，優(yōu)選室溫，進行第一次水提取，持續(xù)6至72小時范圍，優(yōu)選12至36小時的時間；在第二步中，在10°C 100°C范圍，優(yōu)選50°C 90°C的溫度用熱水進行第二次提取，持續(xù)I至20小時范圍，優(yōu)選5至15小時的時間，提取方法為用熱水、冷水提取、回流提取或超聲波提取，優(yōu)選，用熱水提??；過濾、真空濃縮并干燥以獲得本發(fā)明的提取物。另外，可修改上述方法或者對上述方法進行進一步的步驟以通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法來分餾或分離最潛在的餾分或化合物，該方法公開于文獻Har b ο r n eJ. B. Phytochemical methods A guide to modern techniques of plant analysis,3rdEd. pp. 6-7，1998)。
因此，本發(fā)明也提供一種治療或預防炎性疾病的藥學組合物，包括通過上述制備方法制備的掛金燈提取物以及藥學上可接受的載體。本發(fā)明也提供通過上述制備方法制備的掛金燈提取物在制備用于治療和預防哺乳動物或人類的炎性疾病的治療劑中的應用。本發(fā)明的一個目的是提供一種治療或預防人類或哺乳動物的炎性疾病的方法，其中所述方法包括給予治療有效量的通過上述制備方法制備的掛金燈提取物作為有效成分以及其藥學上可接受的載體。使用RAW 264. 7細胞系，經(jīng)過各種實驗證實了通過上述方法制備的本發(fā)明的提取物顯示出潛在的抗炎作用，即，對于NO復制和由LPS處理誘導的促炎細胞因子如iNOS、COX-2、TNF- α、IL-6和IL-I β的復制的抑制作用以及對于ρ_Ι κ B α、iNOS和C0X-2蛋白的基因表達的降低作用。 本發(fā)明的用于治療和預防炎性疾病的組合物可包括基于組合物的總重量計，
O.I 50%重量的上述提取物。本發(fā)明的組合物可按照本領(lǐng)域公知的使用方法，另外包括常規(guī)載體、佐劑或稀釋齊U。優(yōu)選根據(jù)用途和應用方法，使用所述載體作為適當?shù)奈镔|(zhì)，但是并不局限于此。適當?shù)?br> RemingtonJ s Pharmaceutical Science (Mack Publishing co, EastonPA)的文稿中列出。在下文中，下面的配制方法和賦形劑都僅僅是示例性的而不以任何方式限制本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以提供為含有藥學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物，所述藥學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、海藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥苯甲酯、羥苯丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。該制劑可另外包括填充劑、抗凝劑、潤滑劑、潤濕劑、調(diào)味劑、乳化劑、防腐劑等。本發(fā)明的組合物可采用本領(lǐng)域公知的方法來配制成在給藥于患者后提供活性成分的速釋、緩釋或遲釋。例如，本發(fā)明的組合物可以溶解在油、丙二醇或其他生產(chǎn)注射劑常用的溶劑中。適當?shù)妮d體的實例包括生理鹽水、聚乙二醇、乙醇、植物油、十四酸異丙酯等，但不限于它們。對于局部給藥，本發(fā)明的提取物可以配制成軟膏和乳膏的形式。含有本發(fā)明的組合物的藥物制劑可制備成任何形式，例如口服劑量形式(粉劑、片劑、膠囊劑、軟膠囊、水性藥物、糖漿劑、酏劑、丸劑、散劑、小包、顆粒劑、)或局部制劑(乳膏、軟膏、乳液、凝膠、半固體膏、貼劑、糊膏、噴霧劑、氣霧劑等)或注射制劑(溶液、懸劑、乳劑)。藥物劑量形式的本發(fā)明的組合物可以它們的藥學上可接受的鹽的形式使用，并且也可單獨使用或者在適當?shù)膱龊舷屡c其它藥學活性化合物組合使用。本發(fā)明提取物或組合物的理想劑量根據(jù)受試者的狀況和體重、嚴重性、藥物形式、給藥途徑和時期而變化并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。然而，為了獲得理想的效果，通常推薦按重量/天計，以0. I至1000mg/kg,優(yōu)選I至100mg/kg范圍量給予本發(fā)明的提取物。劑量可以每天一次或者分成若干次給予。就組合物而言，基于組合物的總重量計，本發(fā)明提取物的量應以0. 01至50 %重量之間，優(yōu)選0. 5至40 %重量存在。
本發(fā)明的藥學組合物可以通過各種途徑給予受試動物，如哺乳動物(大鼠、小鼠、家畜或人類)。考慮所有的給藥模式，例如給藥可以通過口服、直腸或通過靜脈、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外或腦室內(nèi)注射來進行。因此，本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于改善和預防炎性疾病的功能性保健食品，包括掛金燈提取物作為活性成分。在此限定的術(shù)語“功能性保健食品”是“具有增強的功能性(例如物理功能或生理功能)的功能性食品，其通過向傳統(tǒng)食品中添加本發(fā)明的提取物來預防或改善人類或哺乳動物的目標疾病”。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于預防和減輕目標疾病的保健食品，包括掛金燈提取物以及營養(yǎng)學上可接受的添加劑。
在此限定的術(shù)語“保健食品”是“含有本發(fā)明提取物的食品，其中本發(fā)明提取物以非常小的量按照添加劑的形式，或者以全部量按照膠囊劑、丸劑、片劑等形式，都沒有表現(xiàn)出特定的預期效果而是一般的預期效果”。在此限定的術(shù)語“營養(yǎng)學上可接受的添加劑”是“其預期的用途造成或者可合理地預期會直接或間接造成它變成任何食品的組分或者影響任何食品的特性的任何物質(zhì)”，例如稠化劑、促熟劑、漂白劑、螯合劑、濕潤劑、抗結(jié)劑、澄清劑、固化劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、增稠齊 、堿和酸、發(fā)泡劑、營養(yǎng)素、著色劑、增味劑、甜化劑、防腐劑、抗氧化劑等，它們都是本領(lǐng)域公知的。如果為了在食品中的特定目的而向該食品中添加物質(zhì)，該物質(zhì)被稱作直接添加齊U，而間接食品添加劑是那些由于食品的封裝、儲存或其他操作而以痕量成為食品一部分的物質(zhì)。上述保健食品可以包含在食品、保健飲料、膳食療法等之中并且可以粉劑、顆粒齊U、片劑、咀嚼片、膠囊劑、飲料等的形式使用來預防或改善目標疾病。另外，本發(fā)明的提取物可以添加到食品或飲料中用于預防和改善目標疾病。本發(fā)明提取物在作為功能性保健食品或保健食品的食品或飲料中的量通?？稍诠δ苄员＝∈称方M合物的總重量的約O. 01至100 / %的范圍。特別地，盡管本發(fā)明提取物在功能性食品、保健食品或特殊營養(yǎng)食品中的優(yōu)選量可根據(jù)各食品的預期目的而變化，但是通常優(yōu)選將它作為添加劑，基于食品組合物的100%的比例，以在食品如面條等中約O. 01至5%的范圍量，在保健食品中以40至100%的范圍量使用本發(fā)明的提取物。只要本發(fā)明的保健飲料組合物含有指示比例的本發(fā)明的提取物作為必要組分，那么對于其他液體組分就沒有特別的限制，其中其它組分可以是各種除臭劑或天然碳水化合物等，例如傳統(tǒng)飲料。前述天然碳水化合物的實例是單糖例如葡萄糖、果糖等；二糖例如麥芽糖、蔗糖等；傳統(tǒng)糖例如糊精、環(huán)糊精；以及糖醇例如木糖醇和赤蘚糖醇等。作為除了上述以外的其他除臭劑，天然除臭劑例如索馬甜(taumatin)、甜葉菊提取物如萊鮑迪式A(levaudioside A)、甘草甜素等,并且合成的除臭劑如糖精、阿斯巴甜等可能是被有利地使用的。上述天然碳水化合物的量通常在IOOml比例的本發(fā)明飲料組合物中約I至20g，優(yōu)選5至12g的范圍。除了前述組合物以外的其他組分是各種營養(yǎng)素、維生素、礦物質(zhì)或電解質(zhì)，在奶酪、巧克力等的情形下，合成的增味劑、著色劑和改進劑，果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機酸、保護膠體黏合劑、pH控制劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、醇、用于碳酸飲料的碳化劑等。除了前述組分以外的其他組分可為用于制備天然果汁、果汁飲料和蔬菜飲料的果汁，其中該組分可以獨立使用或者組合使用。組分的比例并不非常重要，但是通常在每100w/w%本發(fā)明的組合物中約O至20 / %的范圍。其中包括前述提取物的可添加的食品的實例是各種食品、飲料、口香糖、維生素復合物、健康改善食品等。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的是可以對本發(fā)明的組合物、用途及制備進行各種修改和改變而不背離本發(fā)明的精神或范圍。通過下面的實施例來更具體地解釋本發(fā)明。然而，應理解，本發(fā)明并不以任何方式局限于這些實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的是可以對本發(fā)明的組合物、用途及制備進行各 種修改和改變而不背離本發(fā)明的精神或范圍。發(fā)明有益效果使用RAW264. 7細胞系，通過各種實驗證實了本發(fā)明包括掛金燈提取物的組合物顯示出潛在的抗炎作用，即對于NO復制和被LPS處理誘導的促炎細胞因子如iN0S、C0X-2、TNF- α、IL-6和IL-1 β的復制的抑制作用以及對于ρ_Ι κ B α、iNOS和C0X-2蛋白的基因表達的降低作用，因此，掛金燈提取物可以用作治療和預防炎性疾病的有效且安全的療法或保健食品。通過下面的附圖和實施例來更具體地解釋本發(fā)明。然而，應理解，本發(fā)明不以任何方式局限于這些實施例。。


結(jié)合附圖，通過下面的詳細說明，將更加清楚地理解本發(fā)明的上面的以及其他目的、特征及其他優(yōu)點，在附圖中圖I示出掛金燈提取物的細胞毒性結(jié)果；圖2示出了在通過LPS的炎性反應中，本發(fā)明提取物對于IL-I β基因表達的抑制作用；圖3示出了在通過LPS的炎性反應中，本發(fā)明提取物對于TNF-α基因表達的抑制作用； 圖4示出了 iNOS的mRNA水平的RT-PCR分析；圖5示出了 C0X-2的mRNA水平的RT-PCR分析；圖6示出了本發(fā)明的提取物對于LPS-誘導的皮脂酮的抑制作用。
具體實施例方式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的是可以對本發(fā)明的組合物、用途及制備進行各種修改和改變而不背離本發(fā)明的精神或范圍。通過下面的實施例來更具體地解釋本發(fā)明。然而，應理解，本發(fā)明不以任何方式局限于這些實施例。實施方式下面的參照例、實施例和實驗例都旨在進一步說明本發(fā)明而并不限制其范圍。
實施例I、掛金燈(Physalis alkekengi var francheti Hort)提取物的制備將從韓國KCLB (Korean Cell Line Bank http: //cellbank. snu. ac. kr)購得的280g干燥的掛金燈果實切片，室溫下浸入2. 8L水中持續(xù)24小時并且將溶液在90°C攪拌下進行熱水提取2小時。過濾殘留物并重復提取過程四次。收集過濾物，真空濃縮并且凍干，獲得23g掛金燈的水溶性提取物(產(chǎn)率8. 2%，下文稱作“PA”)。參照例I、試劑的制備RPMI-1640培養(yǎng)基，DMEM(Dubecco’ s改良伊格爾培養(yǎng)基)，10 % FBS (胎牛血清)，青霉素、鏈霉素等都購自市售可得的公司(Welgene Co. Ltd. LS202-02，S-OO1-04,LM001-01, Korea) ;Ezcytox 試劑購自 Daeillab Co. Ltd. (ez 3000, Korea) ;Rotary 蒸發(fā)器購自 BUCHI Co. Ltd(R-124, Germany) ；Freeze 干燥器購自 Iishin(FDU-2200, Korea)，TRIzolTM 購自 GIBCO BRL Co. Ltd. (MD, USA) ；ELISA Reader 購自 Anthos (Multiread 400，Austria) ;Spectrophotometer 購自 GE healthcare Life Science (Ultraspec 2100pro,Sweden) ；Primeacript Rtase 購自 TaKaRa Co. Ltd. (Shiga, Japan) ;PTC_100Programmable·Thermal Controller TM 購自 MJ Research Waltham Co. Ltd. (MA, USA);以及 ImageMasterTotalLab TM 購自 Amersham Biosciences Co. Ltd. (Piscataway, NJ, USA)。實驗中使用的所有試劑都是比分析級更高的級別。參照例2、細胞培養(yǎng)在37°C，濕度5% CO2培養(yǎng)箱中，將RAW 264. 7細胞系，小鼠巨噬細胞(Korean CellLine Bank ;http://cellbank. snu. ac. kr in Korea)在補充了 10% FBS 和 100 微克/ml 的鏈霉素的High葡萄糖DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco，s Modified eagle Medium)中培養(yǎng)并用于本實驗。實驗例I、細胞毒性為了測定在實施例中制備的提取物的細胞毒性，根據(jù)文獻(Hwang HJ et al.，Inhibitory Effect of amygdalin on polysaccharide-inducible TNF—alpha andIL-Ibeta mRNA expression and carrageenan—induced rat arthritis. J. Microbiol.Biotechnol.，18 (10)，pp. 1641-1647，2008)中公開的方法執(zhí)行 MTT 分析檢測法。將RAW 264. 7細胞接種到96孔板中，調(diào)整細胞濃度至IO4細胞/孔，孵育24小時并調(diào)整至沒有FBS的最低限度培養(yǎng)基，持續(xù)4小時。向其中加入0. lmg/ml和lmg/ml實施例I中制備的檢測樣品，持續(xù)24小時。向其中加入I微克/ml的LPS孵育24小時并且向每個孔中加入10微升Ezcytox試劑，相互反應I小時。孵育后，使用ELISA讀數(shù)器(Variokan，Thermo Eletron)在450nm測定產(chǎn)生的吸收值。結(jié)果，如圖I可見，用檢測樣品處理的組以劑量依賴的方式顯示出顯著增加的細胞存活率。實驗例2、對于促炎細胞因子的影響為了測定在實施例中制備的提取物對各種細胞因子如IL-I β、TNF-α、iNOS和C0X-2蛋白的基因表達的作用，使用RAW 264.7細胞系，根據(jù)文獻(Hwang HJ et al.，Inhibitory Effect of amygdalin on polysaccharide-inducibIe TNF—alpha andIL-I beta mRNA expression and carrageenan—induced rat arthritis. J. Microbiol.Biotechnol.，18 (10)，pp. 1641-1647，2008)中公開的方法執(zhí)行下面的分析。
2-1、對于IL-I β表達的影響將RAW 264. 7細胞接種到96孔板中，調(diào)整細胞濃度至5χ1064細胞/孔，孵育24小時并調(diào)整至沒有FBS的最低限度培養(yǎng)基，持續(xù)4小時。向其中加入O. lmg/ml和lmg/ml實施例I中制備的檢測樣品，持續(xù)24小時。向其中加入I微克/ml的LPS孵育24小時，備用
于后續(xù)程序。使用TRIzole (GIBCO BRL, MD，USA)提取所回收的細胞的總RNA，并且用分光光度計在260nm定量測定以在_80°C儲存。取I微克總RNA在65°C變性10分鐘后，在20微升總反應混合物中，使用O. 2微升Primeacript Rtase (TaKaRaq, Shiga, Japan)執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄反應以獲得 cDNA 混合物。使用 TC-100 Programmable Thermal Controller (MJ Resear h,ffalttham, MA, USA)，將cDNA在20微升反應混合物中擴增，反應混合物包括IOx PCR緩沖液、每種引物以及O. 5U Taq聚合酶(TaKaRa, Shiga, Japan)。通過篩選在Genbank中記錄的最適堿基序列來制備各種引物，并且如表I所示執(zhí)行PCR反應。通過I. 2%瓊脂糖凝膠電泳來確認擴增的DNA。使用Image Master TotalLab (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)來分析凝膠上的帶強度并且使用甘油醒3_磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參來矯正基因的定表達水平。表I
權(quán)利要求
1.一種治療或預防炎性疾病的藥學組合物，包括作為活性成分的掛金燈提取物，以及藥學上可接受的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的藥學組合物，其中所述提取物通過用水、諸如甲醇、乙醇或它們的混合物的低級醇進行提取而制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的藥學組合物，其中所述掛金燈是它的果實、根、葉或整個植株。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的藥學組合物，其中所述炎性疾病選自炎性高熱、扁桃體炎、胃炎、結(jié)腸炎、關(guān)節(jié)炎、腎炎、肝炎、結(jié)膜炎、過敏性皮炎、鼻炎、高血壓、糖尿病、癌癥、哮喘、尿道炎、膀胱炎、動脈粥樣硬化、過敏性疾病、鼻炎、哮喘、急性疼痛疾病、慢性疼痛疾病、牙周炎、齒齦炎、炎性腸病、痛風、心肌梗死、充血性心臟衰竭、心絞痛、胃潰瘍、缺血性卒中、膿毒癥、燒傷或胰腺炎。
5.掛金燈提取物在制造用于治療或預防人類或哺乳動物的炎性疾病的藥物中的應用。
6.一種治療人類或哺乳動物的炎性疾病的方法，包括給予所述哺乳動物有效量的掛金燈提取物以及其藥學上可接受的載體。
7.一種用于預防或改善炎性疾病的功能性保健食品，包括以有效預防和改善所述疾病的量的作為活性成分的掛金燈提取物，以及營養(yǎng)學上可接受的添加劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的保健食品，其中所述保健食品以散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑或飲料形式提供。
9.一種制備掛金燈提取物的方法，包括由下面組成的步驟在第一步中，將掛金燈干燥、切開并切片，用C1至C4低級醇或它們的混合物、I至20倍體積的蒸餾水，在10°C 80°C范圍的溫度，進行第一次水提取，持續(xù)6至72小時范圍；在第二步中，在10°C 100°C范圍的溫度，用熱水進行第二次提取，持續(xù)I至20小時范圍的時間，提取方法為用熱水提取、冷水提取、回流提取或超聲波提?。贿^濾、真空濃縮并干燥以獲得所述提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括掛金燈提取物的組合物通過各種實驗顯示出潛在的抗炎作用，因此，它可以用作治療和預防炎性疾病的有效且安全的療法和保健食品。
文檔編號A61K36/81GK102971000SQ201180025356
公開日2013年3月13日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者金亨一, 沈寅燮, 金潤相 申請人:金亨一