藍(lán)舌病毒重組疫苗和其使用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明包括BTV疫苗或組合物。疫苗或組合物可為含有BTV抗原的疫苗或組合物。本發(fā)明也包括編碼及表達(dá)BTV抗原，表位或免疫原的重組載體，其可用于保護(hù)動(dòng)物，諸如綿羊，?；蛏窖颍庥贐TV。
【專(zhuān)利說(shuō)明】藍(lán)舌病毒重組疫苗和其使用
[0001]【相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用】
[0002]本申請(qǐng)要求2010年3月12日提交的US臨時(shí)申請(qǐng)系列N0.61/313，164和2010年7月21日提交的US臨時(shí)申請(qǐng)系列N0.61/366，363的權(quán)利。
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0003]本發(fā)明涉及抵御在動(dòng)物中的藍(lán)舌病毒(BTV)感染的組合物。本發(fā)明提供包含BTV抗原的藥物組合物，針對(duì)BTV疫苗接種的方法，及隨該方法和組合物使用的試劑盒。
【【背景技術(shù)】】
[0004]藍(lán)舌(BT)是反芻動(dòng)物的節(jié)肢動(dòng)物-造成的感染性病毒疾病。牛和山羊可容易被成因性藍(lán)舌病毒(BTV)感染，但無(wú)擴(kuò)展的血管損傷，由此這些物種通常未顯示顯著的臨床體征。相反，綿羊中的疾病特征在于口，鼻和前胃粘膜的卡他性發(fā)炎，及蹄的冠狀墊和板的發(fā)炎。有上皮抓痕，及頰粘膜的最終壞死；膨脹的及發(fā)炎的舌和口可為藍(lán)色(顧名思義)(Spreull 1905)。在綿羊中的死亡率被估計(jì)在I~30%。
[0005]BTV是環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)(呼腸孤病毒科(Reoviridae))的原型病毒,且由至少24種不同血清型組成(Wilson和Mecham2000)。已在世界上貫穿熱帶和溫帶區(qū)域鑒定不同株的BTV。在歐洲遠(yuǎn)至45° N，在亞洲和北美洲遠(yuǎn)至50° N，及往南遠(yuǎn)至35°發(fā)生了 BTV感染。BTV不在反芻動(dòng)物之間接觸傳染，由此BTV的分布依賴(lài)于蠓屬(Coides sp.)(咬蠓)的節(jié)肢動(dòng)物載體物種的存在，在世界的不同地區(qū)存在不同的載體物種。新近數(shù)據(jù)提示，遺傳漂移及沉默效應(yīng)貢獻(xiàn)于BTV野生株的個(gè)體基因段的多樣化(Bonneau，Mullens etal.2001)。
[0006]反芻動(dòng)物的BTV感 染是瞬時(shí)的，而庫(kù)蠓屬(Culicoides)昆蟲(chóng)載體的感染是持續(xù)的。病毒血癥的持續(xù)時(shí)間依賴(lài)于BTV的動(dòng)物種和株。已報(bào)道，病毒血癥可在綿羊中非常瞬時(shí)，和可在BTV-感染的個(gè)體中持續(xù)達(dá)41天，可在山羊中達(dá)42天，及可在牛中達(dá)100天。由于牛的BTV感染常常導(dǎo)致延長(zhǎng)的但不持續(xù)的病毒血癥，牛作為病毒可由庫(kù)蠓屬(Culicoides)載體攝入，然后傳播到其他反芻動(dòng)物的載體動(dòng)物(Anderson, Stott etal.1985;MacLachlan 1994;MacLachlan 和 Pearson 2004)。對(duì)庫(kù)朦屬(Culicoides)載體的許多物種的生態(tài)學(xué)知之甚少，及它們的繁殖地點(diǎn)也未表征，及它們的擴(kuò)散速度也未知。sonorensis庫(kù)蠓(Culicoides sonorensis)是北美洲BTV的主要載體。雌性庫(kù)蠓屬(Culicoides)昆蟲(chóng)持續(xù)地被BTV感染，和可在達(dá)14天的外在溫育時(shí)期之后傳播病毒(Mullens, Tabachnick et al.1995)。BTV在溫帶區(qū)域越冬,可通過(guò)垂直地感染的昆蟲(chóng)載體發(fā)生，盡管新近數(shù)據(jù)顯示，在昆蟲(chóng)載體的幼蟲(chóng)階段的持續(xù)BTV感染期間有外部殼體基因的減少的表達(dá)(White, Wilson et al.2005)。
[0007]BTV的病毒粒子具有飛9nm的直徑，有雙-帶殼的包被(殼體)，其有時(shí)被源于感染的細(xì)胞的細(xì)胞膜的脂蛋白“假-包膜”圍繞。BTV基因組包括共編碼7個(gè)結(jié)構(gòu)(VPl通過(guò)VP7)和4個(gè)非-結(jié)構(gòu)(NS1，NS2，NS3和NS3a)蛋白的雙鏈RNA的10個(gè)不同段(Roy 1996)；基因組段中的9個(gè)是單順?lè)醋樱欢?0使用第2，框內(nèi)起始密碼子編碼NS3和NS3A?；蚪MRNA被雙層的蛋白殼體殼化為二十面體病毒粒子(Verwoerd，Els et al.1972)。二十面體核心由2個(gè)主要(VP3和VP7)和3個(gè)少數(shù)蛋白(VP1，VP4, VP6)組成，及被由分別由基因組分段2和5編碼的VP2和VP5組成的外部殼體圍繞(Roy 1996)。VP2負(fù)責(zé)BTV結(jié)合及進(jìn)入細(xì)胞，中和，血清型-特異性和血細(xì)胞凝集。VP2的多聚體形式(二聚體和三聚體)裝飾病毒粒子的外部表面上VP5支架的大部分表面(Hassan和Roy 1999)。VP2在24種BTV血清型中變化很大，及抗-VP2抗體的水平與體外和體內(nèi)病毒中和關(guān)聯(lián)(Huismans和Erasmus 1981)。VP5也在BTV的不同血清型和株之間顯著改變(de Mattos, of Mattos etal.1994;DeMaula, Bonneau et al.2000),和盡管至今尚無(wú)VP5-特異性中和MAb被鑒定,數(shù)據(jù)提示，此蛋白在中和和通過(guò)其對(duì)VP2的構(gòu)象影響的血清型確定中具有作用(Huismans和 Erasmus 1981; Roy, Urakawa et al.1990;DeMaula 等人，2000)。與 BTV 抗-核心血清免疫吸附而移出痕量的VP7的純化的VP2在綿羊中提供針對(duì)相同的BTV血清型感染的保護(hù)(Huismans, van der Walt et al.1987)。新近結(jié)果顯不，VP2和NSl表達(dá)被細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTL)識(shí)別的表位(Andrew, Whiteley et al.1995)，而不可能是VP7和VP5具有CTL表位。至今，VP3, VP4, VP6, NS2和NS3未在綿羊中刺激CTL應(yīng)答(Lobato, Coupar etal.1997)。
[0008]Lobato 及 Coupar (Lobato, Coupar et al.1997)開(kāi)發(fā)了含有各種對(duì)應(yīng)于編碼 BTV的結(jié)構(gòu)蛋白VP2,VP5和VP7的核苷酸序列的插入子的基于痘苗病毒的表達(dá)載體用于體內(nèi)和體外研究。將這些表達(dá)載體施用于兔和綿羊，以評(píng)價(jià)就ELISA及中和抗體滴度的免疫應(yīng)答，及在綿羊中測(cè)試VP2和VP5構(gòu)建體的保護(hù)性功效。痘苗病毒-表達(dá)的VP2，VP5和VP2+VP5是保護(hù)性的，最可再現(xiàn)的保護(hù)在用VP2和VP5免疫的動(dòng)物中發(fā)生，但是用此構(gòu)建體的保護(hù)甚至是可變的及不完全有效。開(kāi)發(fā)重組BTV疫苗組合物的努力可，例如，見(jiàn)于公開(kāi)的US專(zhuān)利申請(qǐng)US 2007/280960。其他也描述了含有，例如，由桿狀病毒產(chǎn)生的各種BTV抗原的BTV免疫學(xué)組合物(見(jiàn)例如US專(zhuān)利N0.5，833，995和5，690，938)。
[0009]由此，提供針對(duì)BTV的改善的免疫原性和疫苗組合物，及制造及使用該組合物的方法，包括該提供差異診斷`方法，測(cè)定和試劑盒的組合物會(huì)是有利的。
[0010]最近，植物已作為產(chǎn)生治療劑諸如疫苗，抗體和生物醫(yī)藥的來(lái)源被研究。但是，疫苗，抗體，蛋白和生物醫(yī)藥自植物的產(chǎn)生與治療方法相去甚遠(yuǎn)，且有與該疫苗產(chǎn)生通常關(guān)聯(lián)的多種障礙。對(duì)成功地產(chǎn)生植物疫苗的限制包括生物產(chǎn)品或表達(dá)的抗原的低產(chǎn)率(Chargelegue et al., Trends in Plant Science 2001，6，495-496),蛋白不穩(wěn)定性，產(chǎn)品質(zhì)量的不一致性(Schillberg et al., Vaccine 2005，23，1764-1769)和產(chǎn)生預(yù)期的尺寸和免疫原性的病毒-樣產(chǎn)物的不足的容量(Arntzen et al., Vaccine 2005，23，1753-1756)。為了解決這些問(wèn)題，密碼子優(yōu)化，小心收獲及純化植物產(chǎn)物的方法，使用植物部分諸如葉綠體來(lái)增加物質(zhì)攝取，及改善的亞細(xì)胞祀向全部被考慮為潛在策略(Koprowski, Vaccine2005，23，1757-1763)。
[0011]考慮到動(dòng)物對(duì)BTV的感受性，防止BTV感染及保護(hù)動(dòng)物的方法是必要的。因此，有對(duì)針對(duì)BTV的有效疫苗的需求。
[0012]【發(fā)明概述】
[0013]提供包含抗原性BTV多肽和其片段和變體的組合物。BTV抗原和其片段和變體具有免疫原性和保護(hù)性性質(zhì)。BTV抗原可在植物或藻中產(chǎn)生。
[0014]抗原性多肽和其片段和變體可配制成疫苗和/或藥物組合物。該疫苗可用于免疫接種動(dòng)物及提供針對(duì)至少一種BTV株的保護(hù)。
[0015]本發(fā)明的方法包括在植物或藻中制造抗原性多肽的方法。方法也包括使用方法，其包括給動(dòng)物施用有效量的抗原性多肽或其片段或變體以產(chǎn)生保護(hù)性免疫原性應(yīng)答。在植物或藻中產(chǎn)生之后，抗原性多肽可經(jīng)部分或基本上純化而用作疫苗。
【【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】】
[0016]以下詳述，以例的方式提供，但不旨在限制本發(fā)明于描述的單獨(dú)特定實(shí)施方式，這些實(shí)施方式可結(jié)合附圖理解，其中:
[0017]圖1描繪總結(jié)分配給DNA和蛋白序列的SEQ ID NO的表。
[0018]圖2描繪作為篩選用陽(yáng)性對(duì)照使用的編碼BTV1VP5 (SEQ ID NO: 10)的pCG102質(zhì)粒。
[0019]圖3描繪作為篩選用陽(yáng)性對(duì)照使用的編碼BTV1VP2 (SEQ ID N0:4)的pCGlOO質(zhì)粒。
[0020]圖4描繪作為篩選用陽(yáng)性對(duì)照使用的編碼BTVlVP2-c-myc(SEQID N0:6)的pCGlOl質(zhì)粒。
[0021]圖5是指示AHSV VP510AE12抗體的CHO細(xì)胞裂解物的蛋白印跡選擇性地檢測(cè)PCG102 表達(dá)的 BTV1VP5 蛋白(SEQ ID NO: 10)。
[0022]圖6是指示小鼠抗-c-Myc抗體的CHO細(xì)胞裂解物的蛋白印跡選擇性地檢測(cè)c-Myc-標(biāo)記的pCGlOl表達(dá)的BTV1VP2蛋白(SEQ ID NO:6)，但不檢測(cè)未標(biāo)記的pCGlOO表達(dá)的 BTV1VP2 蛋白(SEQ ID N0:4)。
[0023]圖7a和7b是用指示的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的裂解物的蛋白印跡。L167和L168多克隆BTV1VP2抗體選擇性地檢測(cè)在用pCGlOO轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)的VP2蛋白(SEQ IDN0:4)。
[0024]圖8顯示編碼BTV VP2的多核苷酸的序列比對(duì)和序列同一性百分率。
[0025]圖9顯示編碼BTV VP5的多核苷酸的序列比對(duì)和序列同一性百分率。
[0026]圖10描繪用于4種浮萍表達(dá)構(gòu)建體的浮萍-優(yōu)化的BTVl抗原的鑒定和布置。
[0027]圖11描繪串聯(lián)含有細(xì)胞質(zhì)地定位的VP2和VP5的pMerDOl質(zhì)粒。
[0028]圖12描繪串聯(lián)含有細(xì)胞質(zhì)地定位的VP2 (具有優(yōu)化的5’UTR)和VP5的MerD02質(zhì)粒。
[0029]圖13描繪MerD03質(zhì)粒，細(xì)胞質(zhì)地定位的VP2單獨(dú)。
[0030]圖14描繪MerD04質(zhì)粒，細(xì)胞質(zhì)地定位的VP2，具有優(yōu)化的5’ UTR單獨(dú)。
[0031 ]圖15描繪使用VP2抗體的來(lái)自表達(dá)各種MerD構(gòu)建體的浮萍的裂解物的代表性的蛋白印跡。
[0032]圖16描繪使用VP2和VP5抗體的來(lái)自表達(dá)MerDOl構(gòu)建體的浮萍的裂解物的代表性的蛋白印跡。
[0033]圖17描繪自表達(dá)MerDO I，MerD02，MerD03和Mer04的浮萍的裂解物的VP2蛋白印跡。[0034]圖18描繪自表達(dá)MerDO I和MerD02的浮萍的裂解物的VP5單克隆抗體克隆#10AE12蛋白印跡。
[0035]圖19描繪用于VP2的Agilent 2100生物分析儀光密度測(cè)定法分析的代表性的像。
[0036]圖20描繪在注射位點(diǎn)的局部反應(yīng)的平均尺寸。
[0037]圖21描繪第IBTV疫苗接種后的直腸溫度。
[0038]圖22描繪第2BTV疫苗接種后的直腸溫度。
[0039]圖23描繪BTV攻擊后的直腸溫度。
[0040]圖24描繪BTV攻擊后的臨床體征。
[0041]圖25描繪通過(guò)血清中和的BTVl抗體滴度。
[0042]圖26描繪在各處理組中通過(guò)qRT-PCR測(cè)量的平均病毒血癥滴度。
[0043]圖27顯示BTV1VP2的蛋白序列比對(duì)和序列同一性百分率。
[0044]圖28顯示7種BTV1VP5及I種BTV2VP5序列的蛋白序列比對(duì)和序列同一性百分率。
[0045]【發(fā)明詳述】
[0046]提供在動(dòng)物中引發(fā)免疫原性應(yīng)答的包含BTV多肽，抗原和其片段和變體的組合物。抗原性多肽或其片段或變體在植物或藻中產(chǎn)生?？乖远嚯幕蚱位蜃凅w可配制成疫苗或藥物組合物及，其用來(lái)在動(dòng)物中引發(fā)或刺激保護(hù)性應(yīng)答。在一實(shí)施方式中，多肽抗原是BTV VP2或BTV VP5多肽或其活性片段或變體。
[0047]需知，本發(fā)明的抗原性多肽可為全長(zhǎng)多肽或其活性片段或變體?！盎钚云巍被颉坝谢钚缘淖凅w”期望片段或變體保留多肽的抗原性性質(zhì)。由此，本發(fā)明包括在動(dòng)物中引發(fā)免疫原性應(yīng)答的任何BTV多肽，抗原，表位或免疫原。BTV多肽，抗原，表位或免疫原可為任何BTV多肽，抗原，表位或免疫原，諸如但不限于在動(dòng)物，諸如綿羊，牛或山羊中引發(fā)，誘導(dǎo)或刺激應(yīng)答的蛋白，肽或其片段或變體。
[0048]本發(fā)明涉及牛，綿羊或山羊疫苗或組合物，其可包含有效量的重組BTV抗原和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)地可接受的載體，賦形劑，佐劑或媒質(zhì)。
[0049]在一些實(shí)施方式中，疫苗還包含佐劑，諸如水包油(0/W)乳劑，其描述于US專(zhuān)利7，371，395。
[0050]在仍其他實(shí)施方式中，佐劑包括EMUISIGEN?,氫氧化鋁和皂苷，CpG或其組合。
[0051]在一些實(shí)施方式中，動(dòng)物中的應(yīng)答是保護(hù)性免疫應(yīng)答。
[0052]“動(dòng)物”是指哺乳動(dòng)物，鳥(niǎo)，等。動(dòng)物或宿主包括哺乳動(dòng)物和人。動(dòng)物可選自:馬(例如，馬)，狗(例如，狗，狼，狐，山狗，豺)，貓(例如，獅，虎，家養(yǎng)貓，野生貓，其他大貓，及其他貓包括獵豹和山貓)，綿羊(例如，綿羊)，牛(例如，牛)，豬(例如，豬)，山羊(例如，山羊)，禽(例如，雞，鴨，鵝，火雞，鵪鶉，雉雞，鸚鵡，雀，鷹，烏鴉，鴕鳥(niǎo)，鴯鹋和鶴鴕)，靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如，狐猴，跗猴，猴，長(zhǎng)臂猿，猿)和魚(yú)。術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”也包括在發(fā)育的全部階段，包括胚胎和胚胎階段的個(gè)體動(dòng)物。
[0053]本文所用的術(shù)語(yǔ)“植物”包括雙子葉(雙子葉植物)植物和單子葉(單子葉植物)植物。雙子葉植物包括，但不限于，豆諸如豌豆，紫花苜蓿和大豆，胡蘿卜，芹菜，番茄，馬鈴薯，煙草，胡椒，油菜，甜菜，卷心菜，花椰菜，嫩莖花椰菜，萵苣，花生，等。單子葉植物包括，但不限于，谷物諸如小麥，大麥，高粱和粟，黑麥，黑小麥，玉米，稻或燕麥，甘蔗，浮萍，草，等。術(shù)語(yǔ)“植物”也包括非-開(kāi)花植物包括但不限于蕨，木賊，石松，蘚，苔，金魚(yú)藻，藻。本文所用的術(shù)語(yǔ)“藻”和“藻”包括任何能產(chǎn)生多肽或其片段或變體的藻的株。藻可包括紅色，棕和綠藻，配子體，等。藻可為微藻。微藻可為破囊壺菌科(Thraustochytriaceae),例如,裂殖壺菌屬(Schizochytrium),破囊壺菌屬(Thraustochytrium),類(lèi)網(wǎng)粘菌屬(Labyrinthuloides)和日本壺菌屬(Japonochytrium)ο
[0054]除非另外解釋的，本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與由本公開(kāi)所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常明白的相同的含義。單數(shù)術(shù)語(yǔ)“a”，“an”和“the”包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物，除非情景明顯另外指示。類(lèi)似地，詞匯“或”旨在包括“和”，除非情景明顯另外指示。
[0055]需知，在本公開(kāi)和特別在權(quán)利要求和/或段落中，術(shù)語(yǔ)諸如“包含(comprises)”，“包含(comprised)”, “包含(comprising)”等可具有美國(guó)專(zhuān)利法中規(guī)定的含義；例如，它們可意指“包括(includes)”，“包括(included)”，“包括(including)”，等；及術(shù)語(yǔ)諸如“基本上由…組成(consisting essentially of)”和“基本上由…組成(consists essentiallyof)”具有美國(guó)專(zhuān)利法中規(guī)定的含義，例如，它們?cè)试S未明確地?cái)⑹龅囊?，但排除?jiàn)于。
[0056]本發(fā)明的抗原性多肽能保護(hù)免于BTV。即，它們能刺激動(dòng)物中的免疫應(yīng)答。“抗原”或“免疫原”是指在宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)特定免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？乖砂?，殺死的，衰減的或活的；生物的亞單位或部分；含有具有免疫原性性質(zhì)的插入子的重組載體；能在提供給宿主動(dòng)物后誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的DNA的碎片或片段；多肽，表位，半抗原，或其任何組合。另外，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。
[0057]本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性蛋白，多肽或肽”包括在一旦施用給宿主，其能引發(fā)針對(duì)蛋白的體液和/或細(xì)胞類(lèi)型導(dǎo)向的免疫應(yīng)答的意義上有免疫學(xué)活性的多肽。優(yōu)選蛋白片段是具有與總蛋白基本上相同的免疫學(xué)活性的片段。由此，本發(fā)明的蛋白片段包含至少一個(gè)表位或抗原決定簇，或基本上由其組成或由其組成。"免疫原性"蛋白或多肽，如本文所用，包括蛋白的全長(zhǎng)序列，其類(lèi)似物，或其免疫原性片段?！懊庖咴云巍ㄊ侵赴ㄒ粋€(gè)或更多表位由此引發(fā)上述免疫學(xué)應(yīng)答的蛋白片段。該片段可使用本領(lǐng)域熟知的任意數(shù)的表位標(biāo)位技術(shù)鑒定。見(jiàn)，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology, Vol.66(Glenn E.Morris, Ed, 1996)。例如,線性表位可通過(guò)例如，同時(shí)在固體支持物上合成大量肽，肽對(duì)應(yīng)于蛋白分子的部分，及使肽與抗體反應(yīng)而肽仍附接于支持物來(lái)確定。該技術(shù)本領(lǐng)域熟知且描述于，例如，美國(guó)專(zhuān)利N0.4，708, 871 ;Geysen等人，1984 ；Geysen等人，1986。類(lèi)似地，構(gòu)象表位容易由諸如通過(guò)，例如，X-射線晶體學(xué)和2-維核磁共振測(cè)定氨基酸的空間構(gòu)象來(lái)鑒定。見(jiàn)，例如，Epitope MappingProtocols,見(jiàn)上。
[0058]如本文所述，本發(fā)明包括抗原性多肽的活性片段和變體。由此，術(shù)語(yǔ)“免疫原性蛋白，多肽或肽”還涵蓋序列的缺失，添加和取代，只要多肽發(fā)揮產(chǎn)生本文定義的免疫學(xué)應(yīng)答的功能。術(shù)語(yǔ)"保守性變異"表示氨基酸殘基被另一生物學(xué)類(lèi)似的殘基取代，或核酸序列中核苷酸取代，使得編碼的氨基酸殘基不變化或是另一生物學(xué)類(lèi)似的殘基。在這點(diǎn)上，特別優(yōu)選的取代會(huì)通常是在性質(zhì)上保守性的，即，在氨基酸家族之內(nèi)發(fā)生的那些取代。例如，氨基酸是通常分為4個(gè)家族:(I)酸性一天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性一賴(lài)氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非-極性一丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；及(4)不帶電的極性一甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸是有時(shí)分類(lèi)為芳族氨基酸。保守性變異的例包括一種疏水殘基諸如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸對(duì)另一疏水殘基的取代，或一種極性殘基對(duì)另一極性殘基的取代，諸如精氨酸對(duì)賴(lài)氨酸，谷氨酸對(duì)天冬氨酸，或谷氨酰胺對(duì)天冬酰胺的取代，等；或會(huì)對(duì)生物學(xué)活性不具有主要效應(yīng)的氨基酸用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸的類(lèi)似保守性取代。因此，與參照分子具有基本上相同的氨基酸序列，但具有少數(shù)基本上不影響蛋白的免疫原性的氨基酸取代的蛋白在參照多肽的定義之內(nèi)。本文包括由這些修飾產(chǎn)生的多肽的全部。術(shù)語(yǔ)〃保守性變異〃也包括使用取代的氨基酸代替未經(jīng)取代的親本氨基酸，只要是針對(duì)取代的多肽產(chǎn)生的抗體也與未經(jīng)取代的多肽進(jìn)行免疫反應(yīng)。
[0059]術(shù)語(yǔ)〃表位〃指稱(chēng)特定B細(xì)胞和/或T細(xì)胞所應(yīng)答的抗原或半抗原上的位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)也與”抗原決定簇”或”抗原決定簇位點(diǎn)”互換使用。認(rèn)識(shí)相同的表位的抗體可在顯示一種抗體阻斷另一抗體與靶抗原的結(jié)合的能力的簡(jiǎn)單免疫測(cè)定中鑒定。
[0060]對(duì)組合物或疫苗的”免疫學(xué)應(yīng)答”是細(xì)胞宿主和/或抗體-介導(dǎo)的對(duì)目的組合物或疫苗的免疫應(yīng)答的發(fā)展。通常，"免疫學(xué)應(yīng)答"包括但不限于一種或更多下列效應(yīng):特別針對(duì)在目的組合物或疫苗中包括的抗原的抗體，B細(xì)胞,輔助性T細(xì)胞,和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生。優(yōu)選地，宿主會(huì)顯示治療性或保護(hù)性免疫學(xué)應(yīng)答，使得對(duì)新感染的抗性會(huì)增強(qiáng)和/或疾病的臨床嚴(yán)重性減小。該保護(hù)會(huì)通過(guò)由感染的宿主正常顯示的癥狀的減小或缺乏，更快恢復(fù)時(shí)間和/或感染的宿主中降低的病毒滴度來(lái)展示。
[0061]合成抗原是也包括的定義之內(nèi)，例如，多表位，側(cè)接表位，及其他重組體或合成來(lái)源的抗原。見(jiàn)，例如，Bergmann 等人，1993 ；Bergmann 等人，1996 ；Suhrbier, 1997 ；Gardner等人，1998。免疫原性片段，為本發(fā)明的目的，會(huì)通常包括分子的至少約3個(gè)氨基酸，至少約5個(gè)氨基酸，至少約10~15個(gè)氨基酸，或約15~25個(gè)氨基酸或更多氨基酸。片段長(zhǎng)度無(wú)臨界上限，其可包含蛋白序列的幾乎全長(zhǎng)，或甚至包含蛋白的至少一個(gè)表位的融合蛋白。
[0062]因此，表達(dá)表位的多核苷酸的最小結(jié)構(gòu)是其包含編碼BTV多肽的表位或抗原決定簇的核苷酸，或基本上由其組成或由其組成。編碼BTV多肽的片段的多核苷酸可包含編碼多肽的序列的最小15個(gè)核苷酸，約30~45個(gè)核苷酸，約45~75或至少57，87或150個(gè)連續(xù)或連續(xù)的核苷酸，或基本上由其組成或由其組成。表位確定過(guò)程，諸如，產(chǎn)生重疊肽庫(kù)(Hemmer 等人，1998), Pepscan (Geysen et al., 1984;Geysen et al., 1985; Van der ZeeR.et al., 1989;Geysen, 1990;Multipin.RTM.Peptide Synthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot等人，1999 ;PCT/US2004/022605)可用在本發(fā)明中的實(shí)踐中。
[0063]術(shù)語(yǔ)“核酸”或“多核苷酸”指稱(chēng)線性或分支的，單或雙鏈的RNA或DNA，或其雜交體。術(shù)語(yǔ)也包括RNA/DNA雜交體。下列是多核苷酸的非限制性例:基因或基因片段，外顯子，內(nèi)含子，mRNA, tRNA, rRNA，核酶，cDNA，重組多核苷酸，分支的多核苷酸，質(zhì)粒，載體，任何序列的分離的DNA，任何序列的分離的RNA，核酸探針和引物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸，諸如甲基化的核苷酸和核苷酸類(lèi)似物，尿嘧啶，其他糖和連接基諸如氟核糖和硫醇酯，及核苷酸分枝。核苷酸序列可還在聚合之后修飾，諸如由與標(biāo)記組分綴合。包括在此定義內(nèi)的其他類(lèi)型的修飾是封頭，一種或更多天然存在的核苷酸用類(lèi)似物的取代，及將多核苷酸附接于蛋白，金屬離子，標(biāo)記組分，其他多核苷酸或固體支持物的手段的導(dǎo)入。多核苷酸可由化學(xué)合成獲得或源于微生物。[0064]術(shù)語(yǔ)“基因”廣泛地用來(lái)指稱(chēng)與生物學(xué)功能關(guān)聯(lián)的任何多核苷酸段。由此，基因如在基因組序列中包括內(nèi)含子和外顯子，或如在cDNA中僅編碼序列和/或它們的表達(dá)需要的調(diào)控序列。例如，基因也指稱(chēng)表達(dá)mRNA或功能RNA，或編碼特異性蛋白，及包括調(diào)控序列的核酸片段。
[0065]本發(fā)明還包含編碼BTV抗原，表位或免疫原的多核苷酸的互補(bǔ)鏈?；パa(bǔ)鏈可為聚合物及任何長(zhǎng)度，且可以任何組合含有脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和類(lèi)似物。
[0066]術(shù)語(yǔ)“蛋白”，“肽”，“多肽”和“多肽片段”在本文互換使用以指稱(chēng)任何長(zhǎng)度的氨基酸殘基的聚合物。聚合物可為線性或分支的，其可包含修飾的氨基酸或氨基酸類(lèi)似物，且其可由非氨基酸的化學(xué)部分間斷。術(shù)語(yǔ)也包括已天然地或由干預(yù)修飾的氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成，糖基化，脂質(zhì)化，乙?；?，磷酸化或任何其他操作或修飾，諸如用標(biāo)記或生物活性組分綴合。
[0067]“分離的”生物學(xué)組分(諸如核酸或蛋白或細(xì)胞器)指稱(chēng)已在組分天然地存在的生物細(xì)胞中從其他生物學(xué)組分基本上分離的或純化的組分，例如，其他染色體和額外-染色體DNA和RNA，蛋白和細(xì)胞器。已“分離”的核酸和蛋白包括由標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白。術(shù)語(yǔ)也包含由重組技術(shù)以及化學(xué)合成制備的核酸和蛋白。
[0068]本文所用的術(shù)語(yǔ)“純化的”不需要絕對(duì)純度；其旨在作為相對(duì)術(shù)語(yǔ)。由此，例如，純化的多肽制備物是相比多肽在其天然的環(huán)境中，多肽更富集的制備物。即，多肽從細(xì)胞組分分離。“基本上純化的”其期望使得多肽代表幾個(gè)實(shí)施方式已去除至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，或至少98%，或更多細(xì)胞組分或物質(zhì)。同樣，多肽可為部分純化的?！安糠旨兓摹逼谕コ∮?0%的細(xì)胞組分或物質(zhì)。對(duì)于多核苷酸也同樣適用。本文公開(kāi)的多肽可由本領(lǐng)域知道的任何手段純化。
[0069]如上所述，抗原性多肽或其片段或變體是在植物或藻中產(chǎn)生的BTV抗原性多肽。公開(kāi)的多核苷酸和由此編碼的多肽的片段和變體也包括在本發(fā)明中。“片段”是指部分多核苷酸或由此編碼的部分抗原 性氨基酸序列。多核苷酸片段可編碼保留天然蛋白的生物學(xué)活性，因此具有如在本文別處提到的免疫原性活性的蛋白片段。多肽序列的片段保留在動(dòng)物中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力。
[0070]“變體”旨在表示基本上類(lèi)似序列。對(duì)于多核苷酸，變體包含在天然多核苷酸之內(nèi)的一個(gè)或更多位點(diǎn)的一個(gè)或更多核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中一個(gè)或更多位點(diǎn)的一個(gè)或更多核苷酸的取代。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分別包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本發(fā)明的特定多核苷酸(即，參照多核苷酸)的變體也可通過(guò)比較由變體多核苷酸編碼的多肽和由參照多核苷酸編碼的多肽之間的百分率序列同一性來(lái)評(píng)價(jià)?！白凅w”蛋白旨在表示通過(guò)在天然蛋白中的一個(gè)或更多位點(diǎn)的一個(gè)或更多氨基酸的缺失或添加，和/或天然蛋白中的一個(gè)或更多位點(diǎn)的一個(gè)或更多氨基酸的取代而源于天然蛋白的蛋白。本發(fā)明包括的變體蛋白有生物學(xué)活性，即，它們有引發(fā)免疫應(yīng)答的能力。
[0071]一方面，本發(fā)明提供來(lái)自綿羊，?；蛏窖虻腂TV多肽。在另一方面，本發(fā)明提供具有 SEQ ID N0:4，6，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 或 25 所示的序列的
多肽，及其變體或片段。
[0072]而且，自綿羊，?；蛏窖虻腂TV多肽的同源物旨在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“同源物”包括直系同原物，類(lèi)似物和旁系同原物。術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”指稱(chēng)具有相同的或類(lèi)似功能，但在不相關(guān)的生物中獨(dú)立地進(jìn)化的2種多核苷酸或多肽。術(shù)語(yǔ)“直系同原物”指稱(chēng)來(lái)自不同物種，但從共同的祖先基因通過(guò)物種形成進(jìn)化的2種多核苷酸或多肽。正常情況下，直系同原物編碼具有相同的或類(lèi)似功能的多肽。術(shù)語(yǔ)“旁系同原物”指稱(chēng)通過(guò)在基因組之內(nèi)復(fù)制相關(guān)的2種多核苷酸或多肽。旁系同原物通常具有不同功能，但這些功能可相關(guān)。類(lèi)似物，野生型BTV多肽的直系同原物和旁系同原物可通過(guò)翻譯后修飾，通過(guò)氨基酸序列差異，或通過(guò)兩者不同于野生型BTV多肽。尤其是，本發(fā)明的同源物會(huì)通常與野生型BTV多肽或多核苷酸序列的全部或部分呈現(xiàn)至少80~85%，85~90%，90~95%或95%，96%,97%，98%，99%序列同一性，及會(huì)呈現(xiàn)類(lèi)似功能。變體包括等位基因變體。術(shù)語(yǔ)〃等位基因變體"指稱(chēng)含有導(dǎo)致蛋白的氨基酸序列變化及在天然的群(例如，病毒物種或變種)之內(nèi)存在的多態(tài)性的多核苷酸或多肽。該天然的等位基因變異可一般導(dǎo)致多核苷酸或多肽的I~5%變異。等位基因變體可通過(guò)在許多不同物種中測(cè)序目的核酸序列來(lái)鑒定，其可通過(guò)使用鑒定那些物種中的相同的遺傳座位的雜交探針來(lái)容易進(jìn)行。任何和全部該核酸變異及得到的氨基酸多態(tài)性或是天然的等位基因變異的結(jié)果且不改變目的基因的功能活性的變異旨在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0073]如本文所用，術(shù)語(yǔ)”衍生物”或“變體”指稱(chēng)多肽，或編碼多肽的核酸，其具有一個(gè)或更多保守性氨基酸變異或其他少數(shù)修飾，使得(I)對(duì)應(yīng)多肽相比野生型多肽具有基本上相當(dāng)?shù)墓δ埽?2)針對(duì)多肽產(chǎn)生的抗體與野生型多肽是免疫反應(yīng)性的。這些變體或衍生物包括具有BTV多肽一級(jí)氨基酸序列的少數(shù)修飾，其可導(dǎo)致相比未修飾的對(duì)應(yīng)物多肽具有基本上相當(dāng)?shù)幕钚缘碾牡亩嚯?。該修飾可為有意的，如通過(guò)定點(diǎn)誘變，或可為自發(fā)的。術(shù)語(yǔ)“變體”還涵蓋序列的缺失，添加和取代，只要多肽發(fā)揮產(chǎn)生本文定義的免疫學(xué)應(yīng)答的功能。
[0074]術(shù)語(yǔ)〃保守性變異〃表示氨基酸殘基被另一生物學(xué)類(lèi)似的殘基取代，或核酸序列中核苷酸取代，使得編碼的氨基酸殘基不變化或是另一生物學(xué)類(lèi)似的殘基。在這點(diǎn)上，特別優(yōu)選的取代會(huì)通常是在性質(zhì)上保守性的`，如上所述。
[0075]本公開(kāi)的多核苷酸包括作為遺傳密碼的結(jié)果的簡(jiǎn)并，例如，對(duì)于特定宿主的優(yōu)化的密碼子利用的序列。如本文所用，“優(yōu)化的”指稱(chēng)被遺傳加工成增加其在給定物種中表達(dá)的多核苷酸。為了提供優(yōu)化的編碼BTV多肽的多核苷酸，BTV蛋白基因的DNA序列可修飾為(I)包含由在特定物種中高度表達(dá)的基因優(yōu)選的密碼子；(2)包含在所述物種中實(shí)際上發(fā)現(xiàn)的核苷酸堿基組成的A+T或G+C含量；(3)形成所述物種的起始序列；或(4)消除導(dǎo)致去穩(wěn)定，不適當(dāng)?shù)亩嗑巯佘账峄?，RNA的降解和終止，或形成二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)卡或RNA剪接位點(diǎn)的序列。所述物種中BTV蛋白的增加的表達(dá)可通過(guò)利用在真核生物和原核生物，或特定物種中密碼子利用的分布頻度達(dá)到。術(shù)語(yǔ)“優(yōu)選的密碼子利用頻度”指稱(chēng)由利用核苷酸密碼子來(lái)特定給定氨基酸的特定宿主細(xì)胞呈現(xiàn)的偏好。有20種天然的氨基酸，其中多數(shù)由多于一種密碼子特定。因此，全部簡(jiǎn)并核苷酸序列包括在公開(kāi)中，只要由核苷酸序列編碼的BTV多肽的氨基酸序列功能性地未變化。
[0076]2個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性可由NCBI (美國(guó)生物技術(shù)信息中心)配對(duì)blast及bloSum62矩陣，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)建立(見(jiàn)，例如，可在”美國(guó)生物技術(shù)信息中心”(NCBI，Bethesda, Md.，USA)服務(wù)器上，以及在Altschul等人利用的BLAST或BLASTX算法;由此，此文獻(xiàn)講關(guān)于“blasts”使用算法或BLAST或BLASTX和BL0SUM62矩陣)。[0077]關(guān)于序列“同一性”可指稱(chēng)具有同一核苷酸或氨基酸的位置數(shù)除以2個(gè)序列中較短者中核苷酸或氨基酸的數(shù)，其中2個(gè)序列的比對(duì)可根據(jù)Wilbur和Lipman算法測(cè)定(Wilbur和Lipman)，例如，使用20個(gè)核苷酸的窗口大小，4個(gè)核苷酸的字長(zhǎng)，及4的間隔罰分，及包括比對(duì)的序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)-輔助分析和解析，可使用可商購(gòu)的程序便利地進(jìn)行(例如，Intelligenetics? Suite, Intelligenetics Inc.CA)。當(dāng)說(shuō) RNA 序列與 DNA 序列類(lèi)似，或具有一定程度的序列同一性或同源性時(shí)，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被認(rèn)為等同于RNA序列中的尿嘧啶(U )。由此，RNA序列在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，且可源于DNA序列，通過(guò)認(rèn)為DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
[0078]2個(gè)氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或2個(gè)核苷酸序列之間的序列同一性可使用 Vector NTI 軟件包(Invitrogen, 1600Faraday Ave.，Carlsbad, CA)測(cè)定。
[0079]以下文獻(xiàn)提供用于比較序列的相對(duì)同一性或同源性的算法，及另外地或替代性地關(guān)于上述，這些參考文獻(xiàn)中的教導(dǎo)可用于測(cè)定百分率同源性或同一性=Needleman SB和Wunsch CD ；Smith TF 和 Waterman MS ；Smith TF, Waterman MS 和 Sadler JR ；Feng DF 和Dolittle RF ；Higgins DG 和銳 PM ;Thompson JD, Higgins DG 和 Gibson TJ ;及，DevereuxJ,Haeberlie P和Smithies 0。而且,無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn),本領(lǐng)域技術(shù)人員可i咨詢(xún)用于測(cè)定百分率同源性的許多其他程序或參考文獻(xiàn)。
[0080]雜交反應(yīng)可在不同“嚴(yán)格度”條件下進(jìn)行。增加雜交反應(yīng)的嚴(yán)格度的條件是熟知的。見(jiàn)例如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第 2 版(Sambrook 等人，1989)。
[0081]本發(fā)明還包括在載體分子或表達(dá)載體中含有和可操作地連接于啟動(dòng)子元件和任選地增強(qiáng)子的BTV多核苷酸。
[0082]“載體”指稱(chēng)包含待體外或體內(nèi)遞送到靶細(xì)胞的異源多核苷酸的重組DNA或RNA質(zhì)粒或病毒。異源多核苷酸可包含旨在防止或治療的目的序列，且可任選地為表達(dá)盒形式。如本文所用，載體無(wú)需在最終 靶細(xì)胞或受試者中能復(fù)制。術(shù)語(yǔ)包括克隆載體和病毒載體。
[0083]術(shù)語(yǔ)“重組體”是指不天然存在或以不見(jiàn)于天然的排列連接到另一多核苷酸的半合成，或合成來(lái)源的多核苷酸。
[0084]“異源”是指源于與所比較的其余實(shí)體遺傳上不同的實(shí)體。例如，多核苷酸可由遺傳加工技術(shù)放入源于不同來(lái)源的質(zhì)?；蜉d體，且是異源多核苷酸。自其天然編碼序列移出且可操作地連接于非天然序列的編碼序列的啟動(dòng)子是異源啟動(dòng)子。
[0085]本發(fā)明涉及綿羊，牛和山羊疫苗或藥物或免疫學(xué)組合物，其可包含有效量的重組BTV抗原和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)地可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)。
[0086]本文所述的主題部分針對(duì)與在植物或藻表達(dá)系統(tǒng)中制備的BTV抗原相關(guān)的組合物和方法，其高度免疫原性，及保護(hù)動(dòng)物免于自BTV株的攻擊。
[0087]【組合物】
[0088]本發(fā)明涉及BTV疫苗或組合物，其可包含有效量的重組BTV抗原和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)地可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)。在一實(shí)施方式中，重組BTV抗原在植物或藻中表達(dá)。
[0089]在一實(shí)施方式中，本文公開(kāi)的主題針對(duì)組合物，其包含由浮萍表達(dá)系統(tǒng)和自浮萍，包括浮萍屬(Lemna)的植物材料產(chǎn)生的BTV抗原，及藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)地可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)。
[0090]在一實(shí)施方式中，重組BTV抗原在藻中表達(dá)。在仍另一實(shí)施方式中，藻選自裂殖壺菌屬(Schizochytrium)。在一實(shí)施方式中，重組BTV抗原可在裂殖壺菌屬(Schizochytrium)蛋白表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，如描述于，例如US專(zhuān)利N0.7，001, 772和US專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi) N0.2008/0022422。
[0091]在一實(shí)施方式中，本文公開(kāi)的主題針對(duì)由包含BTV抗原的植物或藻表達(dá)系統(tǒng)和自植物或藻的材料產(chǎn)生的蛋白。
[0092]在一實(shí)施方式中，本文公開(kāi)的主題針對(duì)疫苗或組合物包含BTV抗原由浮萍表達(dá)系統(tǒng)和自浮萍的植物材料產(chǎn)生的。
[0093]在一實(shí)施方式中，本文公開(kāi)的主題針對(duì)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的表達(dá)BTV抗原的植物或植物培養(yǎng)物，其中植物或植物培養(yǎng)物是浮萍。
[0094]本發(fā)明包括在動(dòng)物，諸如綿羊，?；蛏窖蛑幸l(fā)免疫原性應(yīng)答的任何BTV多肽，抗原，表位或免疫原。BTV多肽，抗原，表位或免疫原可為在動(dòng)物，諸如綿羊，?；蛏窖蛑幸l(fā)，誘導(dǎo)或刺激應(yīng)答的任何BTV多肽，抗原，表位或免疫原，諸如但不限于蛋白，肽或其片段。
[0095]在一實(shí)施方式中，其中BTV免疫學(xué)組合物或疫苗是重組免疫學(xué)組合物或疫苗，組合物或疫苗包含重組載體和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的賦形劑，載體或媒質(zhì)；重組載體是可包含編碼多肽，抗原，表位或免疫原的多核苷酸的植物表達(dá)載體。BTV多肽，抗原，表位或免疫原，可為 VPl, VP2, VP3, VP4, VP5, NSl, VP7, NS2, VP6, NS3, NS3a 或其任何片段。
[0096]在另一實(shí)施方式中，BTV多肽,抗原,表位或免疫原可源于被BTV株感染的綿羊，?；蛏窖颉Ｔ谝粚?shí)施方式中，BTV抗原，表位或免疫原是RNA聚合酶(VPl)，外部殼體蛋白(VP2,VP5),內(nèi)部殼體蛋白(VP3)，封頭的酶(VP4)，細(xì)管形成蛋白(NS1)，外部核心表面蛋白(VP7)，基質(zhì)蛋白(NS2)，解螺旋酶(VP6)，及糖蛋白(NS3和NS3a)。以下表1 (修飾的自Wilson和Mecham 200`0)總結(jié)BTV的基因和它們的蛋白功能。
[0097]表1.藍(lán)舌病毒基因及編碼的蛋白，蛋白的位置，性質(zhì)，及功能
[0098]
【權(quán)利要求】
1.組合物，其包含: BTV (藍(lán)舌病毒)抗原、和 藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)地可接受的載體，賦形劑，佐劑或媒質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中BTV抗原選自:BTVVP2, BTV VP5或其組合。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中BTV抗原在植物或微藻中表達(dá)。
4.權(quán)利要求1~3之任一項(xiàng)的組合物，其中BTV抗原經(jīng)部分純化。
5.權(quán)利要求1~3之任一項(xiàng)的組合物，其中BTV抗原經(jīng)基本上純化。
6.權(quán)利要求1~5之任一項(xiàng)的組合物，其中BTV抗原與具有SEQID NO:4，6或10所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中BTV抗原是與SEQID NO: 4或6具有至少80%序列同一性的 BTV VP2。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中BTV抗原是與SEQID NO: 10具有至少80%序列同一性的BTV VP5。
9.權(quán)利要求1~6之任一項(xiàng)的組合物，其中BTV抗原由與SEQID NO:1，2，3，5，7，8或9所示的序列具有至少70%序列同一性的多核苷酸編碼。
10.權(quán)利要求1~5之任一項(xiàng)的組合物，其中BTV抗原包含BTVVP2和BTV VP5。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中BTVVP2與具有SEQ ID N0:4或6所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性，而B(niǎo)TV VP5與具有SEQ ID NO: 10所示的序列的多肽具有至少80%序列同一1丨生。
12.權(quán)利要求1~11之任一項(xiàng)的組合物，其中藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)地可接受的載體，佐劑，賦形劑或媒質(zhì)是晶體鹽或水包油乳劑。
13.免疫接種對(duì)BTV敏感的宿主的方法，包括至少一次施用權(quán)利要求1~12之任一項(xiàng)的組合物。
14.權(quán)利要求13的方法，包括初施-追施流程。
15.權(quán)利要求14的方法,其中所述初施-追施包括: 初次施用權(quán)利要求1~12之任一項(xiàng)的組合物，及 追加施用 包含含有及體內(nèi)表達(dá)BTV抗原的重組病毒載體的疫苗或組合物，或 包含BTV抗原的滅活的病毒疫苗,或 含有或表達(dá)BTV抗原的DNA質(zhì)粒疫苗或組合物。
16.權(quán)利要求14的方法，其中初施-追施包括: 初次施用 包含含有及體內(nèi)表達(dá)BTV抗原的重組病毒載體的疫苗或組合物，或 包含BTV的滅活的病毒疫苗，或 含有或表達(dá)BTV抗原的DNA質(zhì)粒疫苗或組合物，及 追加施用權(quán)利要求1~12之任一項(xiàng)的組合物。
17.權(quán)利要求14的方法，其中初施-追施包括: 初次施用權(quán)利要求1~12之任一項(xiàng)的組合物，及 追加施用權(quán)利要求1~12之任一項(xiàng)的組合物。
18.權(quán)利要求13~17之任一項(xiàng)的方法，其中宿主是綿羊，?；蛏窖?。
19.基本上純化的在植物或微藻中表達(dá)的BTV多肽，其中多肽包含: (a)與具有SEQID N0:4，6或10所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的氨基酸序列； (b)SEQ ID N0:4，6或10所示的氨基酸序列的保守性變體； (c)包含SEQID N0:4，6或10所示的氨基酸序列的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段，其和與SEQ ID N0:4，6或10所示的氨基酸序列特異性結(jié)合的抗體特異性結(jié)合。
20.質(zhì)粒，其包含與SEQID ΝΟ:1，2，3，5，7，8或9所示的序列具有至少70%序列同一性的DNA片段。
21.權(quán)利要求20的質(zhì)粒，其中質(zhì)粒用于植物轉(zhuǎn)化。
22.穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的浮萍植物或培養(yǎng)物，其經(jīng)表達(dá)BTV抗原或其片段或變體的基因轉(zhuǎn)化。
23.權(quán)利要求22的浮萍植物或培養(yǎng)物，其中抗原或其片段或變體與SEQID N0:4，6或10所示的序列具有至少80%序列同一性。
24.權(quán)利要求22的浮萍植物或培養(yǎng)物，其包含權(quán)利要求21的質(zhì)粒。
25.產(chǎn)生BTV抗原的方法，其包括:(a)在浮萍培養(yǎng)基之內(nèi)培養(yǎng)浮萍植物或浮萍根瘤，其中浮萍植物或浮萍根瘤被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，以 表達(dá)抗原，及其中抗原自包含抗原的編碼序列的核苷酸序列表達(dá)；及6)自浮萍植物或浮萍根瘤收集抗原。
【文檔編號(hào)】A61K39/15GK103492410SQ201180020079
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2010年3月12日
【發(fā)明者】J-C·奧多內(nèi), 郭璇, K·考克斯 申請(qǐng)人:梅里亞有限公司, 比洛克西治療公司