專利名稱：：一種遞送和采用異硫氰酸酯預防和/或治療膀胱癌的新型方法
技術領域：
：本發(fā)明一般涉及癌癥治療的領域，并且更具體涉及異硫氰酸酯(ITC)治療和/或預防膀胱癌的用途。
背景技術：
：在西方社會，膀胱癌在男性和女性中分別是第四和第八位最常見惡性腫瘤[1]，大部分(約80%)初始診斷為淺表性非浸潤性腫瘤，對其進行經尿道切除術仍是首選療法，而在復發(fā)風險高的情況中則再進行膀胱內免疫治療或化療。即使如此，幾乎80%的患者會復發(fā)，約10%發(fā)展為更有侵略性的肌層浸潤性腫瘤[2，3]。處于該病較高階段的病人發(fā)展更頻繁，其中三分之一死于該病。診斷出膀胱癌的年齡中值接近70歲(late60s)[4]。順鉬聯(lián)合化療仍然是浸潤性膀胱癌的主要療法。在這種高齡下常見的腎功能障礙和性能不佳使得無法進行順鉬化療，而所用的其他方案相對于順鉬聯(lián)合化療都不是最理想[5]。膽囊切除術和放療與化療經常伴有高發(fā)病率和死亡率[4]。因此，膀胱癌在治療和處理上仍然是最昂貴的癌癥之一。另外，大部分人膀胱癌檢測為沒有肌層浸潤性的淺表性癌并用經尿道切除術治療。因此，高復發(fā)危險的患者在手術后通過使用減毒卡介苗(BCG)的免疫療法或化療(例如絲裂霉素)來抑制復發(fā)。這些療法不僅必須經過尿道遞送來防止全身毒性作用，而且療效有限并且局部副作用明顯。另一方面，有可觀比例的肌層浸潤性膀胱癌患者先前沒有發(fā)生淺表性疾病，并且，約50%的肌層浸潤性膀胱癌患者在病情出現(xiàn)時已發(fā)生遠距離轉移。盡管轉移病例中初始應答率高達40-70%，但化療的總存活率只有5-20%[5]。因此，對治療以及預防膀胱癌，尤其是復發(fā)膀胱癌的方法一直有需求且未得到滿足。發(fā)明簡述本發(fā)明提供了治療和/或預防膀胱癌的組合物和方法。該方法包括向診斷為、疑似患有、或有患膀胱癌風險的個體給予包括一種或多種ITC的組合物，以至該ITC的給予能夠抑制膀胱癌的生長、肌層浸潤和/或復發(fā)。該組合物包含各種ITC，包括但不限于含有ITC或其前體(硫代葡萄糖苷(glucosinolate))的蔬菜制品的各種混合物。在一個實施方式中，本發(fā)明包括一種包含給予含ITC組合物的方法，其中所述ITC以含ITC的蔬菜制品的形式提供。該蔬菜制品包括但不限于莖椰菜/莖椰菜芽提取物、莖椰菜種子粉、芥菜種子粉、辣根粗粉(meal)/粉末(powder)、山葵粉或其組合。在一個實施方式中，蔬菜制品包括莖椰菜種子。所述種子通過經受烘烤和加壓熱處理(例如高壓蒸汽滅菌)來制備用于膀胱癌的治療和/或預防。我們發(fā)現(xiàn)該方法可使表硫特異蛋白(epithiospecifier)(ESP)失活,這在經相應處理的種子與含黑芥子苷的產品(例如芥菜種子粉)混合時很有利。因此，在一個實施方式中，用于本發(fā)明的莖椰菜產品包含熱/壓力失活的ESP。這個獨特的方法產生了適于優(yōu)化遞送異硫氰酸烯丙酯(AITC)和蘿卜硫素(SF)兩者的穩(wěn)定廣品。本發(fā)明還提供了一種獨特的給藥方案，將含至少一種ITC的組合物以口服的方式給予個體并且優(yōu)選在個體即將入睡的時候給予。該給藥方案包括每日給予所述個體單份或多份無毒劑量的ITC并持續(xù)一段時間(至少幾天)。在各實施方式中，ITC是作為藥物制品來提供的分離的和/或純化的或合成的ITCoITC的一些例子是AITC、異硫氰酸芐酯(BITC)、異硫氰酸苯乙酯(PEITC)和SF。在另一個實施方式中，ITC的衍生物和/或代謝物(包括谷胱苷肽偶聯(lián)物、胱氨酰甘氨酸偶聯(lián)物、半胱氨酸偶聯(lián)物和N-乙酰半胱氨酸(NAC)偶聯(lián)物)可單獨或以各種組合給予。附圖簡要說明·圖I.AITC和SF的化學結構和推定的抗癌機制。箭頭表示活化，符號T表示抑制。圖中信息匯編自不同細胞系的已公開研究的集合。圖2.葡糖硫苷酶催化轉化硫代葡萄糖苷為ITC以及ESP的干擾。圖3.AITC對細胞存活和增殖的作用。在人膀胱癌UM-UC-3細胞、大鼠膀胱癌AY-27細胞和正常的人膀胱上皮細胞(HUC)中以指定濃度來評估AITC。A.MTT試驗測定的細胞生長抑制，AITC處理72小時。通過非線性回歸曲線擬合計算IC50。B.流式細胞儀測定的細胞周期停滯(口，亞Gl;s,Gl;■,S;■，G2/M)，AITC處理24小時。均值+SE,η=3-6)，*Ρ〈0·05。圖4.人膀胱癌UM-UC-3細胞中AITC對有絲分裂、微管蛋白表達以及細胞凋亡的影響。細胞用載劑或AITC處理24小時(各數(shù)值是均值土SD)。Α.流式細胞儀對細胞周期停滯的分析。B.瑞式一姬姆薩(Wright-Giemsa)染色對核分裂像計數(shù)。箭頭指向有絲分裂或有絲分裂崩潰中的細胞。C.微管的免疫熒光染色(綠色)以及DNA的DAPI染色(藍色)。D.微管蛋白的蛋白質印記(GAPDH作為加樣對照)。E.流式細胞儀測定的線粒體跨膜電位流失。F.胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的蛋白質印記(GAPDH作為加樣對照)。G.流式細胞儀測定的凋亡細胞(TUNEL細胞)。F和G中的細胞是用或不用20微摩爾Z-LEHD-FMK(胱天蛋白酶9抑制劑)共同處理過的細胞。圖5.人膀胱癌細胞中AITC和SF對環(huán)氧合酶2(Cox_2)表達的影響。人膀胱癌HT1376細胞過量表達Cox-2，該細胞用所示濃度的AITC或SF處理24小時，然后收集用于Cox-2的蛋白質印記分析。GAPDH用作加樣對照。圖6.AITC抑制膀胱癌發(fā)展。雌性F344大鼠膀胱內接種膀胱癌AY-27細胞，以啟動原位膀胱腫瘤發(fā)展。AY-27細胞接種一天后，開始每天一次口服給予0、10、25、50和300微摩爾/千克的AITC，三周后停止。每組的大鼠個數(shù)為633只不等；一些數(shù)據，尤其是對照組(n=33)和用最低劑量AITC處理組的數(shù)據，是從多個試驗合并得來。A.初始和最終體重。B.膀胱腫瘤重量。荷瘤膀胱重量減去正常膀胱的平均重量得到膀胱腫瘤重量。*P〈0.05.C.腫瘤浸潤肌肉組織的膀胱百分比。D.正常大鼠膀胱壁(Dl)，淺表性大鼠膀胱腫瘤(D2)和浸潤肌層的大鼠膀胱腫瘤(D3)的Η/E染色。圖7.F344大鼠中AITC的藥物動力學。A和B.給予各含46只雌性大鼠的5個組10或300微摩爾/千克的單次口服量AITC，然后將所述大鼠置于代謝籠中用以在I.5、3、6、12和24小時時采集尿液(I只大鼠/籠)。每段時期結束時，取一組大鼠抽血，從中制備血漿。C.大鼠接種AY-27細胞3周后，給予原位膀胱腫瘤荷瘤大鼠300微摩爾/千克的單次口服量AITC。給予AITC后O小時(Tl)、1.5小時(Τ2)和6小時(Τ3)時取出原位腫瘤。采用我們實驗室研發(fā)的環(huán)縮合試驗測定血漿、尿液和腫瘤組織勻漿中的AITC當量濃度。各數(shù)值是均值土SE。圖8.MSP-I抑制膀胱癌發(fā)展。雌性F344大鼠通過尿道導尿管接種ΑΥ-27細胞膀胱內，以啟動原位膀胱癌發(fā)展。癌細胞接種一天后，開始每日一次用載劑(水)給予MSP-I，三周后停止。每組的大鼠個數(shù)為1129不等。Α.初始(口)和最終(■)體重。B.荷瘤膀胱重量減去正常膀胱的平均重量計算得到腫瘤重量。*Ρ〈0.05。A和B中的各數(shù)值為均值+SEM0C.腫瘤浸潤肌肉組織的膀胱百分比。D.在UM-UC-3細胞(體外)、ΑΥ-27細胞(體夕卜)和ΑΥ-27腫瘤(體內)中MSP-I對選定抗癌靶標的作用。細胞用MSP-I以13和26微摩爾的黑芥子苷濃度處理24小時。癌細胞接種一天后，開始每日一次用MSP-I以9或90微摩爾/千克的黑芥子苷劑量處理3周，然后從大鼠中取出膀胱腫瘤。用蛋白質印記檢測細胞裂解物和腫瘤勻漿，使用GAPDH作為加樣對照。圖9.MSP-I和莖椰菜種子粉(BSP)的混合物(MSP_1:BSP=1:1)抑制膀胱癌發(fā)展。雌性F344大鼠接種膀胱癌AY-27細胞以啟動原位膀胱癌發(fā)展。AY-27細胞接種一天后，開始每日一次口服給予所述的粉末(黑芥子苷和蘿卜硫苷(glucoraphanin):各為10微摩爾/千克)，三周后停止。每組的大鼠個數(shù)為910只。各數(shù)值是均值土SE。
發(fā)明內容本發(fā)明涉及含ITC的組合物來治療和/或預防膀胱癌的用途。ITC存在于日常消耗的十字花科蔬菜中。例如，AITC(其化學結構見圖I)富含于芥菜，辣根和山葵中[8]，SF富含于莖椰菜(其化學結構見圖1)[9，10]。ITC以生物惰性的硫代葡萄糖苷(β-硫糖苷N-羥基硫酸鹽(β-thioglucosideN-hydroxysulfates))儲存于十字花科蔬菜中，并且所述硫代葡萄糖苷(例如黑芥子苷(AITC硫代葡萄糖苷))和蘿卜硫苷(SF硫代葡萄糖苷)通過葡糖硫苷酶(硫糖苷-葡萄糖苷酶)轉化為可快速自發(fā)重排而產生ITC的亞氨逐硫代羧酸酯-O-磺酸鹽(thiohydroximate-0-sulfonates)。正常情況下,葡糖硫苷酶通常與硫代葡萄糖苷分開地存在于相同植物中。然而，一些植物還含有ESP，所述ESP以損失ITC為代價將亞氨逐硫代羧酸酯-O-磺酸鹽轉化為生物學上無價值的腈和氰基表硫燒(cyanoepithioalkane)(圖2)。已知ESP存在于莖椰菜和莖椰菜種子中[7]，但不存在于芥菜子中。還已知通過人類或動物腸道菌群的葡糖硫苷酶活性，攝取的硫代葡萄糖苷在脫離植物葡糖硫苷酶的情況下，可在體內轉化成ITC[11]。認為AITC和SF以及其它ITC具有很高的生物利用度并主要通過尿排泄消除[12-14]。ITC在體內主要通過硫醇尿酸途徑代謝，致使形成通過尿液排泄的N-乙酰半胱氨酸(NAC)偶聯(lián)物。所述NAC偶聯(lián)物自身沒有生物學活性，但當它們儲存在膀胱的尿液中時，可被解離為母體ITC，因此可作為ITC的前藥。在各種實施方式中，本發(fā)明的組合物和方法包括以硫醇偶聯(lián)物或其衍生物提供ITC。在一個實施方式中，硫醇偶聯(lián)物的衍生物是N-乙酰半胱氨酸偶聯(lián)物。AITC和SF[11，15]以及其它ITC已顯示具有抗菌和殺蟲的活性。這些化合物的化學預防活性也可能部分由于它們抑制第I相酶和誘導第II相酶的能力[14]。圖I概述了AITC和SF的推定化學預防機制。然而，本領域沒有認識或證實有關ITC可用于設計以預防或治療膀胱癌的方法，并且本領域中也沒有適于預防和/或治療膀胱癌的ITC制劑的啟示。另外，本領域也沒有對于使莖椰菜產品(例如莖椰菜種子)經受烘烤并加壓加熱如以加壓蒸汽處理(即高壓滅菌)的形式加壓加熱的任何提示。因此，據信這是首次公開如下方法烘烤并加壓熱處理莖椰菜產品，并將所述處理過的莖椰菜產品與芥菜產品混合以提供針對膀胱癌具有治療和預防功效的組合物。不想受任何特定理論的限制，還認為本文公開的莖椰菜產品處理方法有破壞其內源ESP的作用。因此，當經處理莖椰菜產品與適當芥菜產品(例如芥菜種子粉)混合時提供了一種可用來遞送AITC和SF的穩(wěn)定的經優(yōu)化的組合物。更具體地，本發(fā)明是基于我們的以下意外發(fā)現(xiàn)在口服給藥時，某些ITC，例如AITC、SF和含ITC的蔬菜制品(例如芥菜種子粉，和芥菜種子粉與莖椰菜種子粉的混合物)適于治療和/或預防膀胱癌。具體而言，我們證實AITC在膀胱癌細胞中引起強烈的細胞周期停滯(有絲分裂停滯)和細胞凋亡(有絲分裂崩潰)，但對正常人膀胱上皮細胞的毒性作用明顯較低。已證實本發(fā)明的組合物和方法抑制了癌癥發(fā)展，包括以很低劑量水平抑制肌層浸潤，以及通過尿排泄選擇性遞送到膀胱癌組織。因此，認為富含AITC的芥菜種子粉和熱處理過的莖椰菜種子粉的混合物適用于人膀胱癌的治療。就此而言，SF顯著下調抗膀胱癌的熟知靶標環(huán)氧合酶2(Cox-2)，而AITC沒有表現(xiàn)出該活性(圖5)。另外，在原位大鼠膀胱癌模型中展示了該方法的特定實施方式。因此，表明本發(fā)明的方法在體內有作用。在各種實施方式中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含蔬菜制品和芥菜產品的混合物，其中，所述蔬菜制品經受烘烤和加壓熱處理，所述加壓熱處理可以加壓蒸汽處理的方式提供。適用與本發(fā)明的蔬菜包括但不限于莖椰菜/莖椰菜芽提取物、莖椰菜種子粉、芥菜種子粉、辣根粗粉/粉末、山葵粉或其組合。在某些實施方式中，所述蔬菜制品是任何十字花科蔬菜或其衍生產品。在各種實施方式中，十字花科蔬菜制品是包括莖椰菜產品或基本由莖椰菜產品組成或由莖椰菜產品組成的組合物。在某些實施方式中，莖椰菜產品包括莖椰菜種子或基本由莖椰菜種子組成或由莖椰菜種子組成。在各種實施方式中，將十字花科蔬菜制品與芥菜產品聯(lián)用。芥菜產品可包括芥菜種子或基本由芥菜種子組成或由芥菜種子組成。在某些實施方式中，本發(fā)明的組合物包括莖椰菜種子和芥菜種子的混合物或基本由該混合物組成或由該混合物組成?？梢苑勰┬问教峁┣o椰菜種子和/或芥菜種子。在一個實施方式中，將莖椰菜產品在足以滅活所述莖椰菜產品中的部分或全部表硫特異蛋白(ESP)的溫度和持續(xù)時間下烘烤，所述莖椰菜產品例如可以是以種子粉提供的莖椰菜種子。本領域技術人員知道如何確定ESP是否已失活。例如,可用Matusheski等所述的方法測定ESP失活[7]，該方法通過引用納入本文。在各個實施方式中，莖椰菜產品在至少華氏200度下烘烤至少30分鐘。烘烤可持續(xù)進行10分鐘至300分鐘之間的任何時長，包含上限和下限、并包括該范圍間的所有數(shù)字以及連續(xù)整數(shù)間至十分位的所有數(shù)值。在一個實施方式中，莖椰菜產品在華氏250度下烘烤至少90分鐘。莖椰菜產品還可經受加壓熱處理。所述的加壓熱處理包括加壓蒸汽處理，即加壓熱處理可包括高壓滅菌。在各種實施方式中，加壓熱處理在至少華氏200度下以至少10磅/平方英寸(P.s.i.)壓力進行至少5分鐘?？蓮那笆鰞热葜姓J識到該烘烤和/或加壓熱處理(可以是加壓蒸汽處理)，可以在至少華氏200度實施，并可以在華氏200至350度間任何溫度實施，包含上限和下限并包括它們之間的所有數(shù)字以及連續(xù)整數(shù)間到十分位的所有數(shù)值。所述加壓熱處理(可以是加壓蒸汽處理如高壓滅菌)，可以在至少10磅/平方英寸(p.s.i.)的壓力下實施，最高至40p.s.i.，包含上限和下限并包括它們之間的所有數(shù)字以及所連續(xù)整數(shù)間到十分位的所有數(shù)值。在一個實施方式中，加壓蒸汽處理在15p.Si.的壓力下實施。在一個實施方式中，莖椰菜在本文公開的任何溫度下，于15p.Si.壓力下經受15分鐘加壓蒸汽處理?？梢哉J識到，需要時，可在一次或多次處理過程中，改變處理莖椰菜產品所用的溫度和/或壓力。烘烤和加壓蒸汽處理優(yōu)選通過連續(xù)烘烤和進行加壓蒸汽處理的次序來實行。在一個實施方式中，莖椰菜產品先經受烘烤和加壓蒸汽處理，然后再混合芥菜產品和該莖椰菜產品。在一個實施方式中，該組合物包含已烘烤并經受加壓熱處理的莖椰菜產品的混合物，還包含未經烘烤或加壓熱處理的芥菜產品。因此，在一個實施方式中，包含所述經處理莖椰菜產品和所述芥菜產品的混合物的組合物不包含經過烘烤的芥菜產品和/或不包含經受加壓熱處理的芥菜產品?？梢匀魏伪壤旌锨o椰菜和芥菜產品。在特定實施方式中，它們可以I:I至10:1的比例混合，該比例包含上限和下限并包括該范圍間的所有數(shù)字以及連續(xù)整數(shù)間至十分位的所有數(shù)值。所述比例可以是莖椰菜比芥菜產品，反之亦然。本發(fā)明考慮所有能使硫代葡萄糖苷的水解最大化的比例?？稍谇o椰菜粉烘烤處理之前或之后，和/或在莖椰菜受加壓熱處理之前或之后，將莖椰菜產品和/或芥菜產品研磨成粉末。在各個實施方式中，粉末可包括直徑小于Imm的莖椰菜和/或芥菜顆粒。在各個實施方式中，本發(fā)明的粉末可包括至少50%、60%、70%、80%、90%,99%或100%的直徑小于Imm的顆粒。在特定實施方式中，顆粒大小可小到5微米。不受限于理論，認為本發(fā)明提供的經處理莖椰菜/芥菜種子粉混合物由于以硫代葡萄糖苷(黑芥子苷和蘿卜硫苷)的方式保存AITC和SF而包含AITC和SF的穩(wěn)定來源，并且由于芥菜種子粉中的葡糖硫苷酶會在無ESP干擾下水解硫代葡萄糖苷還在水合或攝取后提供AITC和SF的最佳量。在各個實施方式中，十字花科蔬菜制品包括富含蘿卜硫苷的莖椰菜種子。在特定實施方式中，富含蘿卜硫苷的莖椰菜含有至少50、60、70、80、90或100，或110微摩爾/克蘿卜硫苷，包括它們之間的所有整數(shù)以及連續(xù)整數(shù)間至十分位的所有數(shù)值。在各個實施方式中，芥菜產品包含至少50、60、70、80、90或100，或110微摩爾/克黑芥子苷，包括它們之間的所有整數(shù)以及連續(xù)整數(shù)間至十分位的所有數(shù)值。此類十字花科蔬菜和芥菜產品可存在于本發(fā)明的組合物中，并可用于本發(fā)明所述方法。本領域的技術人員可以認識到本發(fā)明包括制備本發(fā)明組合物的方法。制備本發(fā)明組合物的方法包括但不必限于實施上述任何或所有方法，以及使用上述任何或所有溫度、壓力、時間參數(shù)，以及具有上述任何或所有的功能和/或物理性質的莖椰菜和芥菜產品。因此，在一種實施方式中，制備本發(fā)明組合物的方法包括使莖椰菜產品如本文所述經受烘烤和加壓熱處理，然后將所述莖椰菜產品與芥菜產品混合。在一個實施方式中，本發(fā)明所述預防和/或治療膀胱癌的方法包括向有需要的個體口服遞送包含一種ITC或多種ITC或其前體的組合物，使得ITC通過尿排泄選擇性遞送到膀胱來特異性抑制膀胱癌發(fā)展/復發(fā)和/或轉移，例如通過肌層浸潤的疾病擴散。在一個實施方式中，ITC作為含有分離的和/或純化的ITC和/或合成的ITC的組合物向個體給予。該ITC可以是任何合適的ITC。該組合物可以包括ITC，基本由ITC組成，或由ITC組成。例如，該組合物可包含10%-100%(包括該范圍內的所有數(shù)值)的一種ITC或多種ITC的混合物。在一個實施方式中，該組合物包含芥菜種子粉。在一個實施方式中，該組合物包含芥菜種子粉和莖椰菜種子粉，后者由加熱處理過的種子(如上述的烘烤和高壓滅菌)制得。含有ITC如AITC或其衍生物的組合物可以任何合適的方式和/或遞送載劑配制用于口服遞送。例如，可作為粉末、液體、凝膠、噴霧、懸浮劑、乳劑，片劑，膠囊，作為緩釋或速釋制劑等來提供該組合物。該組合物可作為水性溶液提供，其還可包括合適的調味糖漿，水性或油性懸浮劑，或含食用油的調味乳劑?？诜椒砂ǖ幌抻谕谭蛲ㄟ^例如醫(yī)療設備(例如飼管)遞送到胃。如需要，該組合物也可通過如導管插入而直接遞送到膀胱。本發(fā)明使用的組合物可包括藥學上接受的載體、賦形劑和/或穩(wěn)定劑。適合與ITC混合的組合物的一些例子可參見Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(《雷明頓藥物科學與實踐》)(2005)，第21版，賓夕法尼亞州費城，Lffff出版社(Lippincottffilliams&ffilkins)。在一個實施方式中，對需要治療膀胱癌或預防膀胱癌的人實施本發(fā)明的方法。因此給予含ITC組合物的個體可以是患有、疑似患有或已診斷有膀胱癌的個體。所述個體也可以是具有膀胱癌復發(fā)和/或膀胱癌轉移的風險。在一個實施方式中，所述個體是先前接受過膀胱癌治療的個體。本發(fā)明的方法可以聯(lián)同旨在治療和預防膀胱癌的常規(guī)療法一起實施。例如，附加的治療形式包括但不限于化療、手術治療和放射治療，上述治療可在本發(fā)明的方法之前，同時或之后進行。本發(fā)明還提供一種用于治療和/或預防膀胱癌的新型給藥方案。我們的結果出乎意料，與認為消耗十字花科蔬菜和/或其提取物所得益處通常隨攝入量的增加而提高的傳統(tǒng)觀念相反，我們證實較高劑量的ITC并沒有比某些較低劑量更好地抑制膀胱癌的生長以及肌層浸潤。另外，我們證實并非所有含ITC前體(葡萄糖硫苷)的天然產品必然能夠抑制膀胱癌生長。例如，我們證實AITC的前體黑芥子苷自身沒有抗癌活性，并極少在體內被腸道菌落葡糖硫苷酶水解。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明的新型給藥方案包括口服給予含有AITC的組合物，其中，所述AITC以無毒性劑量提供給個體。具體但非限制性的劑量示例包括但不限于5、10、25和50微摩爾/千克，包含上限和下限并包括它們之間的所有數(shù)字以及連續(xù)整數(shù)間到十分位的所有數(shù)值。含ITC組合物的給予可在任何時間進行。優(yōu)選在個體接近入睡時給予該組合物，使得ITC可在該個體膀胱的尿液中濃縮。因此，在一個實施方式中，在晚上實施給予。不受限于任何具體理論，認為這在個體膀胱中提供增加的局部濃度，有效地抑制膀胱癌細胞/腫瘤的生長。也可在白天的任何時間給予含ITC的組合物。所述給予可以每日一次或每日多次，并且可以持續(xù)給予任何所需的時間，例如數(shù)日、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。本發(fā)明的方法的效果可用多種參數(shù)證明，所述參數(shù)包括但不限于膀胱癌細胞和/或膀胱腫瘤的生長抑制、膀胱癌浸潤的和轉移的抑制、和/或患有膀胱癌的個體的存活壽命的延長。以下實施例意在說明而非限制本發(fā)明。實施例I本實施例證實AITC對正常和惡性膀胱癌細胞增殖和存活的影響。用AITC處理人膀胱癌UM-UC-3細胞和大鼠膀胱癌AY-27細胞導致對細胞增殖的劑量依賴性抑制，IC5tl分別為2.7和3.3μM(圖3Α)。該抑制與顯著細胞周期停滯有關，相對對照細胞9.9-11.5%處于G2/M期，用7.515μMAITC處理24小時后多達72%的UM-UC-3細胞和49%的ΑΥ-27細胞處于G2/M期(圖3Β)。AITC強烈誘導細胞凋亡還表現(xiàn)為，亞Gl群(圖3Β)增加至最高達6.5倍(UM-UC-3)和7.8倍(ΑΥ-27)(圖3Β)，并且在組蛋白關聯(lián)DNA的胞質水平增加至最高達3.9倍(UM-UC-3)和5.2倍(ΑΥ-27)。相反，發(fā)現(xiàn)AITC對正常膀胱上皮細胞(HUC)的毒性低很多，IC5tl是69.4μM(圖3Α)，該值比AITC在惡性細胞組中的相應IC5tl值高21.O25.7倍。另外，在HUC中，7.5和/或15μM劑量的AITC沒有導致細胞周期停滯和細胞凋亡(圖3Β和3C)。實施例2本實施例證實了AITC靶向α-微管蛋白和β-微管蛋白，使細胞有絲分裂停滯，并激活線粒體介導的細胞凋亡。對流式細胞儀檢測為被AITC停滯在G2/M期的UM-UC-3細胞(圖4Α)和用瑞氏一姬姆薩染色檢測為被AITC停滯在有絲分裂階段的細胞作比較，發(fā)現(xiàn)AITC所停滯的細胞幾乎只在有絲分裂階段(圖4Β)。另外，許多AITC處理過的細胞表現(xiàn)出多微核化，表明有絲分裂崩潰。同時對α-微管蛋白做免疫染色(綠色)和用4’，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI，藍色)進行DNA染色，顯示對照細胞進行典型的有絲分裂和細胞分裂(二極的有絲分裂紡錘體和姐妹染色體分離)，而AITC處理過的細胞呈現(xiàn)異常的多極有絲分裂紡錘體并且缺乏姐妹染色體分離(圖4C)，使人聯(lián)想到長春新堿(微管解聚劑)和紫杉醇(微管穩(wěn)定劑)的影響[17]。然而，AITC看來不影響微管蛋白聚合，因為在體外測試中AITC不影響微管蛋白的聚合速率(結果未顯示)。相反，AITC顯著下調α-微管蛋白和β-微管蛋白，但沒有下調Y-微管蛋白(圖4D)，表明α-微管蛋白和β_微管蛋白可能是AITC對有絲分裂停滯的關鍵靶標。進一步的實驗表明，AITC使α-微管蛋白和β_微管蛋白不穩(wěn)定(結果未顯示)。我們的發(fā)現(xiàn)證實AITC是新一類有絲分裂阻斷劑，因為它的作用機理不同于紫杉醇和長春新堿。另外，我們發(fā)現(xiàn)AITC導致線粒體膜電位的流失(圖4Ε)，細胞色素c從線粒體釋放到細胞質(結果未顯示)，胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的活化(圖4F)，和TUNEL陽性細胞的形成(圖4G)，以及胱天蛋白酶9抑制劑Z-LEHD-FMK完全阻斷AITC引起的胱天蛋白酶激活和TUNEL陽性細胞形成。這些結果表明AITC通過引起有絲分裂停滯和活化線粒體介導的細胞凋亡通路來殺死膀胱癌細胞。實施例3本實施例證實SF下調人膀胱癌細胞中的Cox-2。Cox_2是熟知的致癌基因，在大多數(shù)人膀胱癌中過量表達，并被認為是膀胱癌治療的主要藥靶。我們揭示SF通過破壞Cox-2mRNA的穩(wěn)定性(結果未顯示)，顯著下調過量表達Cox_2的所培養(yǎng)人膀胱癌細胞中的Cox-2(圖5)。然而，AITC對Cox-2的抑制作用未能測得(圖5)。實施例4本實施例證實通過施行本發(fā)明的實施方式來體內抑制膀胱癌生長。在原位大鼠膀胱癌模型中評估AITC。在膀胱內滴注Ix106AY-27細胞之后三周，腫瘤平均重O.30克，約是正常膀胱重量的4.4倍。滴注AY-27細胞一天后開始每日口服給予AITC并持續(xù)3周。以4個劑量水平評估AITC:10、25、50和300微摩爾/千克。未見動物體重下降的情況反映出沒有治療相關不良作用(圖6A)。300微摩爾/千克的AITC對原位膀胱癌發(fā)展的抑制為20%，但因為某些原因較低劑量水平變得更加有效，并對腫瘤生長的抑制為30%，10微摩爾/千克的作用顯示出統(tǒng)計顯著性(P=O.034)(圖6B)。腫瘤的組織學檢測表明了對肌層浸潤的抑制隨AITC劑量減少而增強(圖6C)。在用10微摩爾/千克的AITC處理過的大鼠中，只有18.9%的荷瘤膀胱顯示肌層浸潤，相比之下，以25微摩爾/千克的AITC處理過的大鼠中有27%，以50或300微摩爾/千克的AITC處理過的大鼠中有50%，而對照大鼠中有71%(圖6C)。圖6D顯示正常大鼠膀胱壁(D1)，淺表性AY-27大鼠膀胱腫瘤(D2)，以及肌層浸潤性AY-27大鼠膀胱腫瘤(D3)的代表性圖像。實施例5本實施例證實在血漿，尿液和腫瘤組織中的AITC水平。向大鼠給予單次口服劑量為10或300微摩爾/千克的AITC，在數(shù)次間隔時間采集尿液和血液直至24小時。通過環(huán)縮合試驗檢測樣品中的AITC當量[12]?？诜o予AITC引起血漿和尿液中AITC當量水平的劑量依賴性增長(圖7A和7B)。以10和300微摩爾/千克劑量給予AITC的三小時內到達血漿AITC當量濃度峰值，分別是I.5μM和23.4μΜ。在給予后6小時，相應的尿液AITC當量濃度達到O.6mM和9.9mM。尿液的AITC當量濃度峰值比血漿中高400423倍。另外，盡管血漿AITC當量濃度此后快速下降(低AITC劑量的半衰期不到3小時，較高劑量約為6小時)，但尿液AITC當量濃度下降緩慢。例如，24小時平均尿液AITC當量濃度為63.8μM(低AITC劑量)和4.5mM(高AITC劑量)，該濃度是尿液濃度峰值的11.6~45.2%，但比給藥24小時后的相應血漿濃度高4，91114，501倍。在原位腫瘤中測得AITC當量的低基礎水平(2.4微摩爾/毫克蛋白質)(圖7C)，這可能是由于大鼠膳食含有微量AITC或相關化合物。以300微摩爾/千克的單次口服劑量給予AITC后I.5和6小時，原位膀胱腫瘤中的AITC當量水平為I.9和2.5毫摩爾/毫克蛋白質，該水平比基礎水平高7901，071倍。這些數(shù)據清楚地表明，口服給予的AITC可通過尿排泄選擇性遞送到膀胱中的癌組織。總的來說，口服遞送AITC在以下方面顯示有效抗癌活性口服后24小時內顯著遞送至并濃縮于尿液和膀胱癌組織中；抑制膀胱癌生長；防止膀胱肌層浸潤并因此減緩膀胱癌轉移。這些數(shù)據說明將本發(fā)明的組合物遞送進尿道膀胱中的功效，所述組合物在尿道膀胱中有活性且其可利用濃度能選擇性靶向惡性細胞但不傷及正常細胞。另外，我們揭示SF也能通過尿排泄選擇性遞送到膀胱組織。實施例6本實施例證實黑芥子苷自身沒有生物活性。硫代葡萄糖苷(例如蘿卜硫苷和黑芥子苷)是十字花科蔬菜及其種子(例如，芥菜種子粉，辣根粉，和山葵粉等)中的ITC前體。硫代葡萄糖苷可通過葡糖硫苷酶轉化為各種ITC。黑芥子苷是AITC的特異前體。發(fā)現(xiàn)黑芥子苷本身在體外對膀胱癌細胞系如UM-UC-3和AY-27沒有活性，并需要葡糖硫代酶的存在(因而轉化為AITC)以得到和AITC相似的結果(結果未顯示)。腸道中的微生物群落具有一些葡糖硫代酶的活性，可在體內將黑芥子苷部分轉化為AITC。然而，我們的分析顯示只有35%的黑芥子苷在大鼠體內轉化為AITC，并且在體內黑芥子苷在原位膀胱癌模型中無效。這說明如果黑芥子苷不水解為AITC，攝入黑芥子苷或含有黑芥子苷的天然產品(不伴有葡糖硫苷酶)可能無法釋放AITC的全部功效。本發(fā)明解決了此問題。實施例7本實施例證實芥菜種子粉是有效的抗膀胱癌物質。我們的數(shù)據證實十字花科蔬菜如山葵粉、辣根粉和芥菜種子粉包含的黑芥子苷/AITC量有很大差異。關于芥菜種子，就我們的一些測試而言，分析了一種購自辣屋公司(SpiceHouse)(伊利諾伊州芝加哥)的市售芥菜種子粉(MSP-I)。我們顯示其含有129微摩爾/克的黑芥子苷。根據我們的分析，相信該粉末中不存在AITC，但存在足夠的葡糖硫苷酶，在體內或體外水合后，能使黑芥子苷顯然完全轉化為AITC。我們對室溫存放的粉末的分析表明該粉末中的黑芥子苷可穩(wěn)定至少2年。在上述的原位大鼠膀胱癌模型中，該物質對體重增加沒有影響(圖8A)，但在9微摩爾/千克的黑芥子苷劑量下對膀胱癌生長的抑制為35%，而在90微摩爾/千克的黑芥子苷劑量下抑制23%(圖SB)，以及在9微摩爾/千克的黑芥子苷劑量下完全抑制肌層浸潤并在90微摩爾/千克的劑量下對肌層浸潤的抑制為13%(圖SC)。因此，MSP-I低劑量比高劑量更有效。然而，進一步降低MSP-I劑量導致抗癌效力降低。更感興趣的是，在等摩爾時，作為芥菜種子粉遞送的AITC的抗癌活性比純AITC更有效。另外，在培養(yǎng)的膀胱癌細胞和體內膀胱腫瘤中，MSP-I都引起了強烈的胱天蛋白酶3活化并降低血管內皮生長因子(VEGF)水平(圖8D)。VERF是主要的腫瘤血管生成刺激因子。胱天蛋白酶3和VEGF都是抗癌靶標。感興趣的是，MSP-I在體內只在低劑量時才對VEGF有效，這說明VEGF可能是通過MSP-I抑制腫瘤肌層浸潤的關鍵靶標。實施例8本實施例證實MSP-I和莖椰菜種子混合物抑制膀胱癌發(fā)展。從考迪爾種子公司(CaudillSeed)(肯塔基州路易斯維爾)購得富含蘿卜硫苷的莖椰菜種子(cultivaSAGA)，如上文所述進行烘烤和高壓滅菌以使ESP失活(據信在次過程中葡糖硫苷酶也被滅活)，然后研磨成細粉。據信去除ESP對于蘿卜硫苷盡可能轉化成ITC很重要，因為SF得率從每克普通種子(粉末)60微摩爾提高27%升至每克熱處理過的種子(粉)76微摩爾。將該粉末與MSP-I混合(約1:1)。該混合物包含蘿卜硫苷和黑芥子苷以及葡糖硫苷酶(由MSP-I攜帶)。水合或攝入后，粉末中葡糖硫苷酶顯然將蘿卜硫苷和黑芥子苷全部轉化為SF和AITC(數(shù)據沒有顯示)。我們已經證實，該混合粉末在用來評估AITC和MSP-I的相同原位大鼠膀胱癌模型體中，體內抑制膀胱癌的發(fā)展。以黑芥子苷和蘿卜硫苷各10微摩爾/千克的劑量，用粉末喂食大鼠，每日一次持續(xù)三周。膀胱腫瘤生長被抑制了46%(圖9A)，這比單獨使用MSP-I時更顯著，以9微摩爾/千克的黑芥子苷劑量單用MSP-I時腫瘤生長被抑制了35%(圖SB)。另外，聯(lián)合處理還強烈抑制膀胱癌的肌層浸潤(圖9B)。值得關注的是，AY-27細胞并沒有過度表達Cox-2(結果未顯示)，并且在該動物模型中的SF的抗癌功效可能沒有完全顯現(xiàn)。因此，預期本發(fā)明的方法會對患有膀胱癌的人群更有效。參考文獻I.KirkaliZ,ChanT,ManoharanM等，Bladdercancer:epidemiology,stagingandgrading,anddiagnosis.(《膀胱癌流行病學，分期和分級，以及診斷》)Urology2005;66:4-34.2.CooksonMS,Herr麗，ZhangZFjSolowayS，SoganiPC,FairWR.Thetreatednaturalhistoryofhighrisksuperficialbladdercancer:15-yearoutcome.(〈〈高危淺表性膀胱癌的的自然治療史15年成果》)JUrol1997;158:62-7.3.Shahin0，ThalmannGNjRentschCjMazzucchelIiL，StuderUE.Aretrospectiveanalysisof153patientstreatedwithorwithoutintravesicalbacillusCalmette-GuerinforprimarystageTlgrade3bladdercancer!recurrence,progressionandsurvival.(《對初級階段Tl第3級的膀胱癌使用或不使用膀胱內卡介苗治療153名患者的回顧分析復發(fā)、發(fā)展和存活》)JUrol2003;169:96-100.4.PinkowishMD.Earlieruseofaggressivetherapycouldpreventone-thirdofbladdercancerdeaths.(《積極治療的更早應用可防止三分之一的膀胱癌死亡》)CACancerJClin2009;59:142-4.5.SonpavdeGjElfikyAAjRosenbergJE.Novelagentsforadvancedbladdercancer.(《針對晚期膀胱癌的新型藥劑》)TherapeuticAdvancesinMedicalOncology2009;1:13.6.RaghavanD，QuinnD，SkinnerDG，SteinJP.Surgeryandandunctivechemotherapyforinvasivebladdercancer.(《對浸潤性膀脫癌的手術和輔助化療》)SurgOncol2002;11:55-63.7.MatusheskiN,JuvikJAjJefferyEH.HeatingHeatingdecreasesepithiospecifierproteinactivityandincreasessulforaphaneformationinbroccoli.(《莖椰菜中加熱降低表硫特異蛋白的活性并提高蘿卜硫素的形成》)Phytochem2004;65:1273-1281.8.UematsuY，HirataK,SuzukiK，IidaK，UetaT，KamataK.Determinationofisothiocyanatesandrelatedcompoundsinmustardextractandhorseradishextractusedasnaturalfoodadditives.(《用作天然食物添加劑的芥菜提取物和辣根提取物中的異硫氰酸酯及相關化合物的測定》)ShokuhinEiseigakuZasshi2002;43:10-7.9.ZhangY,TalalayP，ChoCGjPosnerGH.Amajorinducerofanticarcinogenicprotectiveenzymesfrombroccoli:isolationandelucidationofstructure.(《莖椰菜中抗癌保護酶的主要誘導物提取及結構說明》)ProcNatlAcadSciUSA1992;89:2399-2403.10.FaheyJWjZhangY,TalalayP.Broccolisprouts:anexceptionallyrichsourceofinducersofenzymesthatprotectagainstchemicalcarcinogens.(《莖椰菜芽保護抵御化學致癌物的酶誘導物的異常豐富資源》)ProcNatlAcadSciUSA1997;94:10367-10372.11.ZhangY.AlIylisothiocyanateasacancerchemopreventivephytochemical.(《異硫氰酸烯丙酯作為癌癥的化學預防性植化物質》)MolNutrFoodRes2010;54:127-35.12.BhattacharyaA,TangLjLiY等.InhibitionofBladderCancerDevelopmentbyAllylIsothiocyanate.(《通過異硫氰酸烯丙酯抑制膀胱癌發(fā)展》)Carcinogenesis2010;31:281-86.13.ZhangY，MundayRjJobsonHE，MundayCM,ListerC，WilsonP,FaheyJWjMhawech-FaucegliaP.InductionofGSTandNQOlinculturedbladdercellsandintheurinarybladdersofratsbyaneextractofbroccoli(brassicaoleraceaitalica)sprouts.(《通過莖椰菜(brassicaoleraceaitalica)芽的提取物在培養(yǎng)的膀胱細胞和大鼠膀胱中誘導GST和NQ01》)JAgricFoodChem2006;54:9370-9376.14.ZhangY.Cancer-preventiveisothiocyanates!measurementofhumanexposureandmechanismofaction.(《預防癌癥的異硫氰酸酯人類接觸和作用機理的測定》)2004:555:173-190.·15.JohanssonNLjPaviaCS，ChiaoJW.Growthinhibitionofaspectrumofbacterialandfungalpathogensbysulforaphane，anisothiocyanateproductfoundingbroccoliandothercruciferousvegetables.(《發(fā)現(xiàn)于莖椰菜和其它十字花科蔬菜的異硫氰酸酯一蘿卜硫素對多種細菌和真菌病原體的生長抑制》)PlantaMed2008;74:747-750.16.ZhangY，TangL.Discoveryanddevelopmentofsulforaphaneasacancerchemopreventivephytochemical.(《蘿卜硫素作為癌癥化學預防性植化物質的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展》ActaPharmacolSin2007;28:1343-1354.17.JoH,LoisonF，HattoriH,SilbersteinLEjYuH,LuoHR.NaturalproductCelastroldestabilizestubulinheterodimerandfacilitatesmitoticcelldeathtriggeredbymicrotubule-targetinganti-cancerdrugs.(〈〈天然產品雷公藤紅素使微管蛋白異二聚體不穩(wěn)定性并促進由微管蛋白靶向型抗癌藥物引起的有絲分裂細胞死亡》)PLoSOne2010;5:el0318.18.MundayRjMhawech-FaucegliaP,MundayCM，等，Inhibitionofurinarybladdercarcinogenesisbybroccolisprouts.(《莖椰菜芽抑制尿道膀胱癌發(fā)生》)CancerRes2008;68:1593-600.權利要求1.一種包含莖椰菜種子和芥菜種子混合物的組合物，其特征在于，莖椰菜種子經受烘烤和加壓熱處理，然后與芥菜種子混合。2.如權利要求I所述的組合物，其特征在于，所述莖椰菜種子在至少華氏200度的溫度下烘烤至少60分鐘，然后與芥菜種子混合。3.如權利要求2所述的組合物，其特征在于，所述加壓熱處理包括在至少華氏200度的溫度下，以至少10磅/平方英寸(P.s.i.)的壓力加壓蒸汽處理至少5分鐘。4.如權利要求I所述的組合物，其特征在于，所述莖椰菜種子包含至少90微摩爾/克的蘿卜硫苷。5.如權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述莖椰菜種子包含加熱失活的表硫特異蛋白(ESP)。6.如權利要求5所述的組合物，其特征在于，所述芥菜種子包含至少90微摩爾/克的黑芥子苷。7.如權利要求5所述的組合物，其特征在于，所述莖椰菜種子和芥菜種子的混合物是粉末狀。8.一種在個體中治療和/或預防膀胱癌的方法，包括向所述個體口服給予包含異硫氰酸酯(ITC)的組合物，使得所述給予抑制膀胱癌的生長和/或復發(fā)。9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述組合物在晚上口服給予所述個體。10.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述ITC分離自蔬菜。11.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述ITC是異硫氰酸烯丙酯(AITC)、蘿卜硫素或其組合物。12.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述ITC是硫醇偶聯(lián)物或其衍生物。13.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述ITC以硫代葡萄糖苷的形式和葡糖硫苷酶存在于權利要求I所述的組合物中。14.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述個體具有膀胱癌復發(fā)的風險。15.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述組合物至少每日給予一次，持續(xù)至少一周。全文摘要提供一種組合物，其中包含莖椰菜種子和芥菜種子的混合物。在混合莖椰菜種子和芥菜種子之前，莖椰菜受烘烤和加壓熱處理。該莖椰菜種子在溫度至少200華氏度下烘烤至少60分鐘，并在溫度至少200華氏度下且壓力至少10磅/平方英寸下受加壓熱處理至少5分鐘。本發(fā)明還提供了一種在個體中治療和/或預防膀胱癌的方法。該方法包括口服給予個體含有異硫氰酸酯(ITC)的組合物使得所述給予抑制膀胱癌的生長和/或復發(fā)。文檔編號A61P35/00GK102905713SQ201180013514公開日2013年1月30日申請日期2011年3月11日優(yōu)先權日2010年3月11日發(fā)明者Y·張,A·巴塔查里亞,L·唐,Y·李,J·D·保耐薩,F·耿,Y·丁申請人:健康研究股份有限公司