專利名稱：以PA_C-PB1_N復(fù)合物為靶點的抗流感病毒抑制劑的高通量篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗流感病毒物質(zhì)的篩選方法及其應(yīng)用，具體通過酶聯(lián)免疫吸附和高通量藥物篩選的體系，以禽流感病毒PA亞基C端(PA。片段)-PBl亞基N端(PBIn片段)復(fù)合物為底物對中藥提取物進行抗流感病毒的活性篩選，并由此得到具有活性的中藥提取物丁香、老鶴草、血見愁或余甘子等。
背景技術(shù)：
流行性感冒簡稱流感，是由流感病毒引起的一種常見的急性呼吸道傳染病，以冬春季多見，臨床以高熱、乏力、頭痛、全身酸痛等全身中毒癥狀重而呼吸道其它癥狀較輕為特征。流感病毒屬正粘病毒科，可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中甲型病毒經(jīng)常發(fā)生抗原變異，傳染性大，傳播迅速，易發(fā)生大范圍流行。近年來，由屬于甲型病毒的H5N1亞型禽流感病毒導(dǎo)致的禽類與人的疫情的廣泛傳播對人類健康造成了全球性的重大威脅，最近，墨西哥爆發(fā)了甲型HlNl流感并傳播到全球數(shù)十個國家，進一步加劇了這種威脅。由于流感病毒的高速變異和進化，使得傳統(tǒng)的疫苗很難對未來的流感疫情具有針對性，并且流感病毒本身也不斷對目前已有的藥物產(chǎn)生抗藥性，因此開發(fā)新型抗流感藥物已成為各國極為迫切的重大課題。目前，針對流感的疫苗和藥物主要針對的是流感病毒包膜上的HA受體、NA神經(jīng)氨酸酶、M2離子通道，而這些蛋白由于突變較快，能很快產(chǎn)生抗性。相比之下，作為流感病毒RNA聚合酶三元復(fù)合物的PA、PB I和PB2亞基，由于一方面在流感病毒基因組轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中具有非常重要的生物學(xué)功能，其中PB I亞基具有聚合酶和核酸內(nèi)切酶活性，PB2亞基負責(zé)帽結(jié)合，PA亞基涉及RNA復(fù)制和蛋白水解活性，PBl能與PB2或PA形成二元復(fù)合物，但PB2和PA則無法形成復(fù)合物，所述復(fù)合物均在流感病毒基因組轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中起重要作用；另一方面在整體氨基酸序列尤其是活性位點處具有高度的保守性。因此使得上述亞基尤其是PA亞基成為一個非常理想的新型藥物設(shè)計和篩選的靶標。2008年下半年以來，生物物理所劉迎芳研究院課題組和饒子和院士領(lǐng)導(dǎo)團隊聯(lián)合解析了禽流感病毒(A/goose/Guangdong/l/1996(H5Nl))PA 亞基 C 端(PA。片段)-PBl 亞基N端(PBIn片段)復(fù)合物和以及PA亞基N端(PAn片段)兩個部分的晶體結(jié)構(gòu)，并對其功能也做了相應(yīng)的研究。禽流感病毒的PA。片段與PBl亞基的N端25個氨基酸被證明具有很強的特異性相互作用，能夠在體外形成非常穩(wěn)定的二元復(fù)合物(參見圖1)，這對于RNA聚合酶三元復(fù)合體的順利組裝并且發(fā)揮聚合酶活性具有重要意義。同時，也有文獻報道在細胞內(nèi)單獨表達的PB IN端25個氨基酸的小肽能有效抑制禽流感病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制，這說明PA。是與PBl相互作用的主要部位。如果能夠用小分子將PA。片段中負責(zé)與PBl結(jié)合的口袋部位屏蔽，將會有效阻止RNA聚合酶三元復(fù)合物的組裝，從而直接抑制了禽流感病毒在宿主細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。因此，本發(fā)明根據(jù)PA。片段的這一性質(zhì)，以阻斷PA。片段-PBIn復(fù)合物的形成作為本發(fā)明藥物篩選的直接對象和目標之一。
天然產(chǎn)物又稱次級代謝產(chǎn)物(Secondary Metabolites),具有結(jié)構(gòu)的多樣性和生物活性的多樣性。天然產(chǎn)物及其衍生物在以往的疾病治療中發(fā)揮了無可限量的作用，也是當今藥物研發(fā)過程中最具潛力的資源之一?，F(xiàn)在對中藥等傳統(tǒng)藥物、海洋生物以及微生物代謝過程中的天然產(chǎn)物研究方興未艾，每年都會有大量結(jié)構(gòu)新穎的化合物被發(fā)現(xiàn)提供出來，這些新穎化合物是合成方法所無法實現(xiàn)的藥物和藥物先導(dǎo)化合物的重要源泉，在新藥和先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)中起著重要作用。傳統(tǒng)中藥是本發(fā)明中華民族幾千年來在治療各種疾病過程中積累的寶貴的知識財富，很多常見的疾病在中醫(yī)理論中都有針對的藥方存在；同時，中藥中存在的天然生物活性小分子的種類和數(shù)目是極其龐大的，本身也是一個非常豐富的小分子藥物庫，其中有非常多的小分子是傳統(tǒng)的化工合成所不能合成的。因此，使用天然產(chǎn)物提取物如中藥提取物作為本發(fā)明藥物篩選的平臺，具有傳統(tǒng)的藥物篩選平臺所不具有優(yōu)點，同時也有利于發(fā)展我國的中藥事業(yè)，賦予其更加科學(xué)的理論基礎(chǔ)。酶免疫測定(enzyme immunoassay, EIA)是將酶催化作用的高效性與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合的一種微量分析技術(shù)。酶免疫測定包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA),其可用于測定可溶性抗原或抗體。由于ELISA具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)點，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，包括用于多種細菌和病毒等疾病的診斷，用于鑒定涉及生物過程重要物質(zhì)的調(diào)節(jié)物如CN 101076602A中所公開的內(nèi)容。基于突光的熱量變化體系(Thermal shift assay):這是一種常用的篩選革巴蛋白抑制劑的方法。利用對環(huán)境敏感的熒光粉來控制蛋白熱量的釋放(unfolding)，比較靶蛋白的抑制劑存在和不存在時引起的ATm(轉(zhuǎn)移溫度)的變化來評估抑制劑的活性。以ΒΑ0Ε1(β位點淀粉前體物蛋白剪切酶I)抑制劑的篩選為例說明這種技術(shù)手段的大概流程(圖例參見附圖2)。首先這種篩選體系要在Biorad PCR 96孔板中進行，這種體系包括一個用于精確控制溫度的加熱和降溫裝置，以及一個用于熒光圖形呈現(xiàn)的裝置CCD(電荷耦合器材)。然后向96孔板中加入20 μ 1，I μΜ BACEl ;50 μ I熒光粉；10 μ 1，10，50，或ΙΟΟμΜ濃度的化合物；20μ I BACEl緩沖液(各種物質(zhì)的量和比例在不同實驗中可以不同)。在25到89°C的溫度變化范圍內(nèi)檢測熒光的信號。最后對獲得的數(shù)據(jù)進行處理，一般來說，ATm(轉(zhuǎn)移溫度)變化越大的表明化合物與蛋白結(jié)合的能力越強，抑制效果越明顯?，F(xiàn)有的技術(shù)方案主要參考文獻:Me1-Chu Lo, Ann Aulabaugh, Guixian Jin, etal.Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification indrug discovery.Analytical Biochemistry 2004(332):153-159.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種抗流感病毒化合物或提取物的篩選方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)和高通量篩選相結(jié)合篩選具有抗流感病毒化合物或提取物的方法。本發(fā)明提供一種利用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)和高通量篩選相結(jié)合篩選具有抗禽流感病毒化合物或提取物的方法。本發(fā)明提供一種利用禽流感病毒(A/goose/Guangdong/l/1996(H5Nl))PA亞基C端(PA。片段)-PBl亞基N端(PBIn片段)復(fù)合物篩選化合物或提取物的方法。
本發(fā)明提供一種通過酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)和高通量篩選相結(jié)合，以禽流感病毒(A/goose/Guangdong/1/1996 (H5N1)) PA 亞基 C 端(PA。片段)-PBl 亞基 N 端(PBIn 片段)復(fù)合物為底物篩選化合物或提取物的方法。本發(fā)明提供一種具有抗流感病毒，具體為禽流感病毒的中藥提取物的篩選方法，其通過酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)和高通量篩選相結(jié)合，以禽流感病毒(A/goose/Guangdong/1/1996 (H5N1)) PA亞基C端(PAc片段)-PBl亞基N端(PBIn片段)復(fù)合物為底物篩選得到。本發(fā)明提供一種具有抗流感病毒，具體為禽流感病毒的中藥提取物，包括丁香提取物、老鶴草提取物、血見愁提取物或余甘子提取物。本發(fā)明提供一種通過酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)和高通量篩選相結(jié)合，以禽流感病毒(A/goose/Guangdong/l/1996(H5Nl))PA 亞基 C 端(PA。片段)-PBl 亞基 N 端(PB In 片段)復(fù)合物為底物篩選得到的天然產(chǎn)物在制備治療和/或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防流感病毒的藥物組合物，該藥物組合物包括由上述篩選方法篩選得到的抗流感病毒物質(zhì)，抗流感病毒物質(zhì)優(yōu)選中藥提取物，所述中藥選自丁香、老鶴草、血見愁或余甘子。本發(fā)明所述中藥提取物均來自于西安小草中藥庫，購買于西安小草植物科技有限公司，取自莖葉，提取的主要步驟分為三步:首先，根據(jù)藥材質(zhì)地適當粉碎，加入95%乙醇提取兩次，藥渣加50%乙醇提取兩次，提取溶劑參考量為8倍量。合并濃縮成浸膏。其次，將浸膏用水分散(參考量為2-3倍量的水)，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取四次(溶劑用量與水層比例為1:1)，以上四層及水層濃縮成浸膏。最后，將不同層進行硅膠柱分離，利用本篩選方法獲得的丁香、老鶴草、血見愁或余甘子均是用不同比例的石油醚和二氯甲烷洗脫獲得的組分(比例分別為50: 1,50: 1,20: 1,5: I)。本申請使用的縮略語和關(guān)鍵術(shù)語定義為:PAc:PA亞基羧基端PAn:PA亞基氨基端PBIn:PB1亞基氨基端HA:血凝素NA:神經(jīng)氨酸酶ELISA:酶聯(lián)免疫吸附法GST:谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶BACEl: β位點淀粉前體物蛋白剪切酶I天然產(chǎn)物:又稱次級代謝產(chǎn)物(Secondary Metabolites),是指由活的生物體產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、不具已知功能的任何繼發(fā)代謝物。作為本申請抗流感病毒物質(zhì)的篩選方法，具體包括如下步驟:(I).將作為捕捉試劑的一種流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段結(jié)合在固相載體表面上；(2).將天然產(chǎn)物提取物和所述捕捉試劑接觸；(3).將步驟(2)中接觸后的捕捉試劑與任選地連接有標簽的另一種流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段接觸，其中所述流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段能與步驟(I)中所述的流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段形成二元復(fù)合物；(4).將步驟(3)中接觸后的捕捉試劑與能和上述另一種流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段結(jié)合的可檢測物質(zhì)接觸，或?qū)⒉襟E(3)中接觸后的捕捉試劑與能和上述標簽結(jié)合的可檢測物質(zhì)接觸；(5).用針對所述可檢測物質(zhì)的檢測工具測定結(jié)合于捕捉試劑的所述另一種流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段的水平；和(6).根據(jù)所述測定的水平確定作為抗流感病毒物質(zhì)的所述天然產(chǎn)物提取物。本申請篩選方法中，步驟(6)具體包括將所述測定的水平與陽性和陰性對照品的測定水平進行比較，選擇高于或等于陽性對照水平的或者低于陰性對照水平但高于或等于陽性對照水平天然產(chǎn)物提取物作為抗流感病毒物質(zhì)。本申請篩選方法中，所述流感病毒為甲型流感病毒。甲型流感病毒包括但不限于甲型人流感病毒、甲型禽流感病毒和甲型豬流感病毒，優(yōu)選甲型禽流感病毒，更優(yōu)選甲型H5N1亞型禽流感病毒。本申請篩選方法中，天然產(chǎn)物提取物制備自單味中藥、按中藥處方規(guī)定的藥材種類和用量組成的混合物、未進行藥用開發(fā)的動植物品種、海洋生物和微生物。優(yōu)選中藥材或其混合物的提取物。更優(yōu)選丁香、老鶴草、血見愁或余甘子。本申請篩選方法中所述標簽選自GST、MyC、HA、Flag、His6、生物素。本申請篩選方法中所述可檢測物質(zhì)是任選地帶有標記的抗體，并且所述標記優(yōu)選為酶。本申請篩選方法，步驟(5)優(yōu)選包括:a.當所述抗體帶有酶標記時，利用包含所述酶標記的底物的檢測工具測定結(jié)合于捕捉試劑的所述另一種流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段的水平；b.當所述抗體不帶有酶標記時，利用包含與所述抗體特異性結(jié)合的帶有酶標記的另一種抗體和所述酶標記的底物的檢測工具測定結(jié)合于捕捉試劑的所述另一種流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段的水平。本申請篩選方法中，酶標記的底物與相應(yīng)的酶標記作用后顯色、發(fā)熒光或?qū)е禄瘜W(xué)發(fā)光。所述酶優(yōu)選自辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶。本申請篩選方法中，優(yōu)先選擇陽性對照品為不含有中藥提取物和ΡΒ1ν，陰性對照品為不含有中藥提取物但含有ΡΒ1ν。本申請篩選方法還可以進一步優(yōu)選為以下具體步驟和工藝:(I)將PA。片段溶于碳酸鹽緩沖液加入PVC微量滴定板；(2)蓋上蓋子，4°C孵育過夜或37°C，2h孵育；(3)倒掉溶液，用洗滌液洗滌；(4)在每個孔中加入封閉液，阻抑剩余的蛋白結(jié)合位點；(5)倒空，用洗滌液洗滌；(6)在每個孔中加入用洗滌液進行不同濃度稀釋后的各種天然提取物溶液孵育，陽性對照孔和陰性對照孔只加洗滌液；(7)在每個孔中加入用洗滌液稀釋的PBl-GST溶液；陽性對照孔只加入等體積洗滌液孵育；(8)去除溶液，用洗滌液洗滌；
(9)加入用洗滌液稀釋的兔源GST抗體溶液；(10)蓋上蓋子，孵育；(11) 一小時后用洗滌液洗滌；(12)加入用洗滌液稀釋后的羊抗兔GST抗體-辣根過氧化物酶溶液；(13)蓋上蓋子，孵育；(14)用洗滌液洗滌；(15)吸取底物溶液，室溫孵育直至陰性對照孔的顏色足夠深，加入終止液，室溫靜置， 在450nm波長處檢測每孔OD值；(16)對數(shù)據(jù)進行分析本申請篩選方法中，碳酸鹽緩沖液優(yōu)選為0.05MNaC03 0.318gNaHC03 0.586g加蒸懼水150mL調(diào)ρΗ9.6,最后定容到200mL本申請篩選方法中，洗滌緩沖液優(yōu)選為:Ix PBS 0.15MKH2P04 0.2gNa2HP04.12H20 2.9gNaCl8.0gKCl 0.2g加蒸懼水900mL調(diào)ρΗ7.4最后定容到IOOOmLTween-200.05% (v/v)BSA 0.2% (w/v)本申請篩選方法，封閉液優(yōu)選為:Ix PBS 0.15M pH 7.4 (配法同洗滌緩沖液)Tween-20 0.05% (v/v)BSA 1% (w/v)；本申請篩選方法，底物緩沖液優(yōu)選為:200mM醋酸鈉緩沖液PH5.0本申請篩選方法，底物溶液優(yōu)選為:TMB (IOmg 溶于 5mL 無水乙醇)0.5mL底物緩沖液IOmL0.75% H202 32 μ L本申請篩選方法，終止液優(yōu)選為:2Μ H2SO4:蒸餾水 178.3mL，逐滴加入濃硫酸(98% ) 21.7mL


圖1示出禽流感病毒RNA聚合酶PA。片段與PBIn片段所形成的二元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)(Π2部分為PBIn片段)。圖2 不出 Thermal shift assay 的原理圖。圖3示出本發(fā)明基于ELISA原理的抗流感病毒物質(zhì)篩選方法的示意圖。(其中I為包被蛋白PAC，2為加入要篩選的中藥，3為加入蛋白GST-PB1，4為加入一抗，5為加入二抗，6為加入TMB-H2O2, 7為加入2M H2SO4終止反應(yīng))。圖4示出不同稀釋梯度的中藥對PA。與PBIn片段相互作用的曲線圖(注:陽性對照為不含有中藥提取物和PB1n，陰性對照為沒有含有中藥提取物但含有PBIn)
具體實施例方式抗流感病毒物質(zhì)篩選方法的實驗如下:1、實驗設(shè)計ELISA是酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay)的簡稱,它是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。本發(fā)明的藥物篩選體系使用的是類似于ELISA的實驗方法(參見圖3)。首先將PAc片段通過疏水相互作用固定到96孔ELISA板的底部，并用牛血清白蛋白(BSA)封閉未結(jié)合PA。片段的位點。之后加入含有適當稀釋濃度中藥提取液的PBl-GST融合蛋白溶液，進行孵育。之后加入兔源GST抗體、羊抗兔GST抗體-辣根過氧化物酶偶聯(lián)蛋白，每一步加入蛋白溶液并孵育后，都用緩沖液進行充分洗滌以除去未結(jié)合的蛋白。最后加入底物TMB-H2O2進行顯色反應(yīng)，再用稀硫酸終止顯色，最后用450nm波長的分光光度計檢測顯色的強弱。對于含有能有效抑制PAC-PBl相互作用成分的中藥提取物來說，最后的顯色相對于陰性反應(yīng)(不含有中藥提取物的PBl對照)會比較弱。每板反應(yīng)都會設(shè)置陽性與陰性對照，作為每次實驗的質(zhì)檢標準；同時每個反應(yīng)條件平行做兩個重復(fù)樣品，以提高實驗結(jié)果的可靠性和準確性。2、實驗材料a.實驗用蛋白/抗體所用禽流感病毒RNA聚合酶來自A/goose/Guangdong/l/1996(HlN5)毒株，其中PA亞基的氣基酸序列如SEQ ID NO:I所不；PB1亞基的氣基酸序列如SEQ ID NO:2所不；PAC片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示〈請核實毒株來源并提供上述PA、PBl、PA。的具體
氨基酸序列>。所用牛血清白蛋白(BSA)購自BBI。所用兔源GST 抗體購自 Sino Biological Inc。羊抗兔GST抗體-辣根過氧化物酶購自Sino Biological Inc。b.實驗試劑(I)碳酸鹽緩沖液(0.05M):NaC03 0.318gNaHC03 0.586g加蒸懼水150mL調(diào)pH9.6最后定容到200mL(2)洗滌緩沖液(lx PBS 0.15M):KH2P04 0.2gNa2HP04.12H20 2.9gNaCl 8.0gKCl 0.2g
加蒸餾水900mL調(diào)ρΗ7.4最后定容到IOOOmLTween-20 0.05% (v/v)BSA 0.2% (w/v)⑵封閉液:Ix PBS 0.15M pH 7.4 (配法同洗滌緩沖液)Tween-20 0.05% (v/v)BSA I % (w/V)(3)底物緩沖液:200mM醋酸鈉緩沖液PH5.0(4)底物溶液:TMB (IOmg 溶于 5mL 無水乙醇)0.5mL底物緩沖液IOmL0.75% H202 32 μ L(5)終止液(2Μ H2SO4):蒸餾水178.3mL，逐滴加入濃硫酸(98% )21.7mL3、實驗步驟(I)將I μ g/mL的PAc片段(溶于碳酸鹽緩沖液ρΗ9.6)按100 μ L/孔加入PVC微
量滴定板；(2)蓋上蓋子，4°C孵育過夜(37°C，2h也可以達到包被的效果，但不均一也不徹底)；(3)倒掉溶液，用200 μ L洗滌液洗滌2次(除去液體時先將液體倒出，再倒扣在吸水紙上輕輕拍打，盡可能除盡液體，每次2分鐘)；(4)在每個孔中加入封閉液200 μ L，阻抑剩余的蛋白結(jié)合位點，蓋上蓋子，37°C孵育1-2小時(這一步相當關(guān)鍵)；(5)倒空，用200 μ L洗滌液洗3次；(6)在每個孔中加入用洗滌液進行不同濃度稀釋后的各種中藥提取物溶液75yL，37°C孵育30分鐘(陽性對照孔和陰性對照孔在此階段只加洗滌液)；(7)在每個孔中加入用洗滌液稀釋的8 μ g/mL PBl-GST溶液75 μ L (陽性對照孔這步只加入等體積洗滌液)，37°C孵育60分鐘；(8)去除溶液，用200 μ L洗滌液洗3次；(9)加入100 μ L用洗滌液稀釋后的0.1 μ g/mL的兔源GST抗體溶液；(10)蓋上蓋子，37°C孵育I小時；(11) 一小時后用200 μ L洗滌液洗4次；(12)加入100 μ I用洗滌液稀釋后的0.1 μ g/mL羊抗兔GST抗體-辣根過氧化物酶溶液；(13)蓋上蓋子，37°C孵育I小時；(14)用200 μ L洗滌液洗4次；(15)用排槍吸取100 μ L底物溶液，室溫孵育10分鐘左右直至陰性對照孔的顏色足夠深，最后加入100 U L終止液，室溫靜直10分鐘后，在450nm波長處檢測每孔OD值；
(16)對數(shù)據(jù)進行分析通過對丁香、老鶴草、血見愁和余甘子幾種中藥進行不同梯度的稀釋，獲得不同梯度下的吸光值，做出的曲線表明篩選到的丁香、老鶴草、血見愁和余甘子對PA。與PBIn蛋白相互作用確實是有較強抑制的。利用本發(fā)明篩選方法篩選中藥提取物利用本發(fā)明所篩選的丁香、老鶴草、血見愁和余甘子均來自于西安小草中藥庫，取自莖葉提取的主要步驟分為三步:首先根據(jù)藥材質(zhì)地適當粉碎，加入95%乙醇提取兩次，藥渣加50%乙醇提取兩次，提取溶劑參考量為8倍量。合并濃縮成浸膏。其次將浸膏用水分散(參考量為2-3倍量的水)，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取四次(溶劑用量與水層比例為1:1)，以上四層及水層濃縮成浸膏。最后，將不同層進行硅膠柱分離，利用本篩選方法獲得的丁香、老鶴草、血見愁或余甘子均是用不同比例的石油醚和二氯甲烷洗脫獲得的組分(比例分別為50: 1，50: 1，20: 1，5:1)。本發(fā)明在初次篩選西安小草中藥庫時首先選擇抑制率(1_(藥物孔-陽性孔)/(陰性孔-陽性孔)X 100% )在50%以上的中藥進行復(fù)篩，復(fù)篩時設(shè)置四次平行取最接近的兩個值并求得平均值，計算抑制率，最后選取活性最好的四種中藥即丁香、老鶴草、血見愁和余甘子進行下一輪的數(shù)據(jù)分析。通過對丁香、老鶴草、血見愁和余甘子四種中藥進行不同梯度(50X，100X，200X，400X)的稀釋，獲得不同梯度下的吸光值，做出曲線圖(參見圖4)。與陽性和陰性對照值相比丁香、老鶴草、血見愁和余甘子四種中藥在稀釋50X，100 X, 200 X的條件下光吸收值均在陽性對照值以上，陰性對照值以下，確實可以證明丁香、老鶴草、血見愁或余甘子具有抑制流感病毒的作用，當這四種中藥被稀釋到400倍的時候光吸收值在陰性對照值以上，預(yù)測是因為樣品在此條件下受到了污染。表I示出所篩選出的中藥提取物對PA。與PBIn片段相互作用的抑制數(shù)據(jù)。表I
權(quán)利要求
1.一種抗流感病毒物質(zhì)的篩選方法，其特征在于:包括如下步驟: (1).將作為捕捉試劑的一種流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段結(jié)合在固相載體表面上； (2).將天然產(chǎn)物提取物和所述捕捉試劑接觸； (3).將步驟(2)中接觸后的捕捉試劑與任選地連接有標簽的另一種流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段接觸，其中所述流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段能與步驟(I)中所述的流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段形成二元復(fù)合物； (4).將步驟(3)中接觸后的捕捉試劑與能和上述另一種流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段結(jié)合的可檢測物質(zhì)接觸，或?qū)⒉襟E(3)中接觸后的捕捉試劑與能和上述標簽結(jié)合的可檢測物質(zhì)接觸； (5).用針對所述可檢測物質(zhì)的檢測工具測定結(jié)合于捕捉試劑的所述另一種流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段的水平；和 (6).根據(jù)所述測定的水平確定作為抗流感病毒物質(zhì)的所述天然產(chǎn)物提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的篩選方法，其特征在于:其中步驟(6)具體包括將所述測定的水平與陽性和陰性對照水平進行比較，選擇具有低于陽性對照水平，且高于或等于陰性對照水平的所述測定的水平的天然產(chǎn)物提取物作為抗流感病毒物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的篩選方法，其特征在于:其中所述流感病毒為甲型流感病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求 3的篩選方法，其特征在于:其中所述甲型流感病毒包括甲型人流感病毒、甲型禽流感病毒和甲型豬流感病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的篩選方法，其特征在于:其中所述甲型流感病毒為甲型禽流感病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的篩選方法，其特征在于:其中所述天然產(chǎn)物提取物制備自單味中藥、按中藥處方規(guī)定的藥材種類和用量組成的混合物、未進行藥用開發(fā)的動植物品種、海洋生物和微生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的篩選方法，其特征在于:其中所述標簽選自GST、Myc、HA、Flag、His6、生物素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2的篩選方法，其特征在于:其中所述可檢測物質(zhì)是任選地帶有標記的抗體，并且所述標記是酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的篩選方法，其特征在于:所述步驟(5)具體包括: a.當所述抗體帶有酶標記時，利用包含所述酶標記的底物的檢測工具測定結(jié)合于捕捉試劑的所述另一種流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段的水平； b.當所述抗體不帶有酶標記時，利用包含與所述抗體特異性結(jié)合的帶有酶標記的另一種抗體和所述酶標記的底物的檢測工具測定結(jié)合于捕捉試劑的所述另一種流感病毒RNA聚合酶亞基或其片段的水平。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的篩選方法，其特征在于:其中所述酶標記的底物與相應(yīng)的酶標記作用后顯色、發(fā)熒光或?qū)е禄瘜W(xué)發(fā)光。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10任一項的篩選方法，其特征在于:其中所述酶選自辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或β -D-半乳糖苷酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項的篩選方法篩選得到的抗流感病毒物質(zhì)在制備治療和/或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于:其中所述抗流感病毒物質(zhì)選自中藥提取物，所述中藥選自丁香、老鶴草、血見愁或余甘子。
14.一種治療和/或預(yù)防流感病毒的藥物組合物，其特征在于:所述藥物組合物包括由權(quán)利要求1-11任一項所述篩選方法篩選得到的抗流感病毒物質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其特征在于:所述抗流感病毒物質(zhì)選自中藥提取物，所述中藥選自丁香、老鶴草、血見愁或余甘子。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗流感病毒物質(zhì)的篩選方法及其應(yīng)用，更具體地說，提供了一種基于酶聯(lián)免疫測定技術(shù)從天然產(chǎn)物提取物篩選抗流感病毒物質(zhì)的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的篩選方法能高效、便捷、準確地從大量的天然產(chǎn)物提取物中篩選獲得有效抗流感病毒的物質(zhì)，可用于制備治療和/或預(yù)防流感病毒藥物。本發(fā)明同時涉及一種以PAC-PB1N復(fù)合物為靶點的抗流感病毒抑制劑的高通量篩選方法。
文檔編號A61P31/16GK103185790SQ20111045006
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者饒子和, 楊誠, 李雪梅, 陳瑜濤, 賈艷茹, 劉影影 申請人:天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院