專利名稱：Plga修飾磁性納米簇及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)用藥物治療材料和功能材料、及其制備方法，尤其涉及一種具有緩釋功能的PLGA修飾的磁性納米簇、及其制備方法和應用。
背景技術：
基因治療是將外源基因?qū)氚屑毎?，以糾正或補償基因缺陷和異常引起的疾病，從而達到治療目的，也就是將外源基因通過基因轉移技術將其整合到病人的適當?shù)氖荏w細胞中，使外源基因表達的遺傳產(chǎn)物能治療某種疾病；廣義概念的基因治療，指的是將某些遺傳物質(zhì)轉移到患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達，最終達到治療疾病的目的。早在1991年，中國科學家首先進行了世界首例血友病的基因治療臨床實驗，隨后，我國科學家利用胸腺激酶基因治療惡性腦膠質(zhì)瘤基因治療方案獲準進入I期臨床試驗，初步的觀察表明:生存期超過I年以上者占55%，其中I例已超過三年半，至今仍未見腫瘤復發(fā)。此外，采用血管內(nèi)皮生長因子基因治療外周梗塞性下肢血管病基因治療方案也已獲準進入臨床試驗。基因治療技術需要將遺傳物質(zhì)組裝在基因載體上，一般采用病毒介導基因轉移，即以病毒為載體，將遺傳物質(zhì)通過基因重組等技術組裝于病毒上，然后使重組病毒感染受體宿主細胞。其中，反轉錄病毒載體具有穿透細胞的能力，可使近100%的受體細胞被感染，轉化細胞效率高；其次，它能感染廣譜動物物種和細胞類型而無嚴格的組織特異性；再者隨機整合的病毒可長期存留，一般無害于細胞；如崔媛媛等(《西安交通大學學報(醫(yī)學版)》，2007年第6期,第624 625頁)公開了源于moloney小鼠白血病病毒的pLSXN反轉錄病毒載體，制備出介導β -分泌酶底物肽基因表達的反轉錄病毒載體；專利W001/90390A1公開了一種桿狀病毒載體，可用于血管病的基因治療；專利US20020064520A1還公開了一種用于基因治療的組合物，以重組病毒顆粒為核心，制成基因?qū)胼d體。但反轉錄病毒載體也存在諸多缺點:這種載體只能把其DNA整合到能旺盛分裂細胞的染色體，而不適合于那些不能正常分裂的細胞，如神經(jīng)元；最嚴重的問題是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主細胞感染病毒和致癌的危險性，加上病毒載體在宿主細胞基因組隨機插上，人們更是擔心其臨床應用的安全性。此外廣義的基因載體包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、孢疹病毒等病毒載體，同樣地，該類病毒載體也存在毒副作用，并且一般認為難以改造成缺陷型病毒，以除去病毒基因和癌基因。并且，用于基因治療的遺傳物質(zhì)都在在體外和體內(nèi)不穩(wěn)定，非常容易被酶等降解，理想的載體系統(tǒng)除了具備安全性外，還應當具有如下特征:可提供長期可控制的持續(xù)基因表達，并且能夠大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。目前來看，充分發(fā)揮基因治療巨大潛力的障礙仍然是缺乏理想的載體系統(tǒng)，因此，如何制備安全性高、緩釋效果好的基因載體一直是基因治療領域的研究熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以緩釋遺傳物質(zhì)的PLGA修飾的磁性納米簇，PLGA于磁性納米粒子交聯(lián)，將遺傳物質(zhì)包裹，形成的復合結構既能保護遺傳物質(zhì)，又能實現(xiàn)緩釋目的，并解決了磁性納米粒子容易團聚的問題，為基因治療提供了一種可工業(yè)化的基因載體。本發(fā)明的第一個目的是提供一種PLGA修飾的磁性納米簇，包括乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA, Ploylactide-co-glycolide)和能夠與所述PLGA交聯(lián)的磁性納米顆粒；所述PLGA與所述磁性納米顆粒交聯(lián)結合。本發(fā)明第二個目的是提供一種所述PLGA修飾的磁性納米簇組成的納米簇團，優(yōu)選地，所述每個納米簇團由1(Γ20個所述納米簇組成。本發(fā)明的第三個目的是提供一種上述PLGA修飾的磁性納米簇制備的基因載體材料。其中，所述PLGA修飾的磁性納米簇粒徑優(yōu)選為7(T300nm,進一步優(yōu)選為10(T250nm，更優(yōu)選為 100 200nm。其中，所述PLGA與所述納米顆粒摩爾比優(yōu)選為1:5 20，進一步優(yōu)選為1:5 15 ;更優(yōu)選為1:10 15。其中，所述PLGA優(yōu)選為醫(yī)學上可用的PLGA材料，并且分子量優(yōu)選為3 X IO3 7 X 104，進一步優(yōu)選為4父103 6父104，更優(yōu)選為4 X IO3飛.5 X IO4。所述磁性納米顆?？梢允侨我馀c所述PLGA交聯(lián)的磁性納米顆粒或其組合，如鐵、鈷、鎳、及其氧化物，優(yōu)選為鐵氧體(CoFe2O3和/或BaFe 12019 )、氧化鉻(CrO2 )、四氧化三鐵(Fe3O4 )、二氧化鈷 (CoO2)、或上述物質(zhì)的任意組合。所述磁性納米顆粒粒徑優(yōu)選為5 50nm,進一步優(yōu)選為l(T35nm，更優(yōu)選為20 25nm。根據(jù)本發(fā)明所述PLGA修飾的磁性納米簇，其中，還可以包括用于基因治療的遺傳物質(zhì)，包括DNA和/或RNA,并優(yōu)選為siRNA( short interference RNA,小干擾RNA)。所述遺傳物質(zhì)可以負載于載體中。其中，所述遺傳物質(zhì)與PLGA摩爾比優(yōu)選為1:0.05 0.5，進一步優(yōu)選為1:0.Γθ.5 ；更優(yōu)選為1:0.Γ0.2。本發(fā)明第四個目的是提供一種上述PLGA修飾的磁性納米簇的制備方法，步驟包括:
步驟I，制備水相磁性納米顆粒；
步驟2，所述水相磁性納米顆粒與PLGA和遺傳物質(zhì)混合反應，使磁性納米顆粒與PLGA交聯(lián)形成團簇將所述遺傳物質(zhì)包裹在所述團簇結果中，收集制備的PLGA修飾的磁性納米簇。其中，所述磁性納米顆粒可以是任意與所述PLGA交聯(lián)的磁性納米顆?；蚱浣M合，如鐵、鈷、鎳、及其氧化物，優(yōu)選為鐵氧體(CoFe2O3和/或BaFe12O19X氧化鉻(CrO2)、四氧化三鐵(Fe304)、二氧化鈷(Co02)、或上述物質(zhì)的任意組合。所述磁性納米顆粒粒徑優(yōu)選為5 50nm，進一步優(yōu)選為l(T35nm，更優(yōu)選為20 25nm。其中，所述PLGA優(yōu)選為醫(yī)用級PLGA材料，分子量優(yōu)選為3 X 103 7 X 104，進一步優(yōu)選為4 X IO3 6 X IO4,更優(yōu)選為4 X IO3 5.5 X IO4。
所述遺傳物質(zhì)包括DNA和/或RNA,并優(yōu)選為siRNA (short interference RNA,小干擾RNA)。所述遺傳物質(zhì)可以負載于載體中。所述PLGA、遺傳物質(zhì)、以及所述納米顆粒摩爾比優(yōu)選為1:0.05、.5:5 20，進一步優(yōu)選為I:0.1 0.5:5 15 ;更優(yōu)選為I:0.1 0.2:10 15。根據(jù)本發(fā)明所述PLGA修飾的磁性納米簇的制備方法的一種優(yōu)選實施方式，步驟2中，PLGA與所述遺傳物質(zhì)混合勻化制成初乳，然后與到所述水相磁性納米顆?；旌戏磻?。本發(fā)明上述的PLGA修飾的磁性納米簇的制備方法，PLGA與磁性納米顆粒交聯(lián)時的反應溫度優(yōu)選控制在1(T150°C，進一步優(yōu)選為2(Tl00°C，更優(yōu)選為25°C 80°C。本發(fā)明上述的PLGA修飾的磁性納米簇的制備方法，PLGA與磁性納米顆粒交聯(lián)時的反應PH值優(yōu)選控制在4 14，進一步優(yōu)選為5 13，更優(yōu)選為5.5 7。本發(fā)明上述的PLGA修飾的磁性納米簇的制備方法，其中，PLGA與所述遺傳物質(zhì)混合勻化時間優(yōu)選控制在0.5 10h，進一步優(yōu)選為l 8h，更優(yōu)選為2 6h。根據(jù)本發(fā)明所述PLGA修飾的磁性納米簇的制備方法的進一步優(yōu)選實施方式，所述PLGA與所述遺傳物質(zhì)混合勻在攪拌下進行，攪拌速度優(yōu)選控制在40(Tl5000r/m，進一步優(yōu)選為 50(Tl300r/m，更優(yōu)選為 60(Tl200r/m。更優(yōu)選地，所述混合勻在漩渦混合設備中進行，并且漩渦混合速度優(yōu)選為中速。本發(fā)明PLGA修飾的磁性納米簇表面光滑，顆粒規(guī)則無粘連；并且包封率高，遺傳物質(zhì)緩釋期可達2周；具有水溶性，和良好的穩(wěn)定性、生物相容性。本發(fā)明PLGA修飾的 磁性納米簇，可用作MRI造影劑和基因載體材料，體內(nèi)穩(wěn)定，降解期可調(diào)控。 本發(fā)明制備方法操作簡單，條件溫和，成本低，并且對環(huán)境友好。


圖1為本發(fā)明PLGA修飾的磁性納米簇團結構示意 圖2和圖3為本發(fā)明制備的PLGA修飾磁性納米簇電鏡照片；
圖4本發(fā)明PLGA修飾磁性納米簇組成的磁性納米簇團電鏡照片；
圖5為本發(fā)明PLGA修飾磁性納米簇遺傳物質(zhì)緩釋曲線。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種PLGA修飾的磁性納米簇、所述納米簇構成的納米簇團、基因載體材料、以及制備方法，首先制備水相磁性納米顆粒，然后與PLGA (或加入遺傳物質(zhì)的混合物)與磁性納米顆粒交聯(lián)，制成PLGA修飾的磁性納米簇組成的磁性納米簇團。其中，PLGA優(yōu)選為醫(yī)用級PLGA材料，為了更好的控制降解和遺傳物質(zhì)緩釋速度、以及加工性能，分子量優(yōu)選為3X IO3 7X 104，進一步優(yōu)選為4X IO3 6X 104，更優(yōu)選為4X103 5.5X104。所述遺傳物質(zhì)可以是任意用于基因治療的遺傳物質(zhì)，如DNA和RNA等。所述磁性納米顆?？梢允侨我馀c所述PLGA交聯(lián)的磁性納米顆?；蚱浣M合，如鐵、鈷、鎳、及其氧化物，優(yōu)選為鐵氧體(CoFe2O3和/或BaFe12O19X氧化鉻(CrO2)、四氧化三鐵(Fe304)、二氧化鈷(CoO2)或上述物質(zhì)的任意組合。為了更好的控制制備的PLGA修飾的磁性納米簇的穩(wěn)定性和緩解周期，所述磁性納米顆粒粒徑優(yōu)選為5 50nm，進一步優(yōu)選為l(T35nm，更優(yōu)選為 2(T25nm。為了安全、有效的使用，遺傳物質(zhì)濃度不宜過低或過高，所述PLGA、遺傳物質(zhì)、以及所述納米顆粒摩爾比優(yōu)選為1:0.05、.5:5 20，進一步優(yōu)選為1:0.Γθ.5:5^15 ;更優(yōu)選為
1:0.Γθ.2:10 15。為了更快的進行交聯(lián)反應，交聯(lián)反應溫度一般控制在1(T150°C，進一步優(yōu)選為2(TlO(rC，更優(yōu)選為25°C 80°C。交聯(lián)反應體系pH值不宜酸性過強，一般在彡4，進一步優(yōu)選為5 13，更優(yōu)選為5.5 7。當PLGA與遺傳物質(zhì)混合后再與磁性納米顆粒反應的情況下，混合應當盡可能均勻，一般在40(Tl5000r/m (進一步優(yōu)選為50(Tl300r/m，更優(yōu)選為60(Tl200r/m)攪拌速度下，混合勻化0.5 IOh (進一步優(yōu)選為l 8h，更優(yōu)選為2飛h)即可。總所周知，磁性納米材料隨著粒徑的增加，體外穩(wěn)定性越差，越容易發(fā)生團聚現(xiàn)象，不宜長時間保存，本發(fā)明制備的PLGA修飾的磁性納米簇很好的解決了這一問題，通過形成團簇結構，不僅保留了磁性納米粒子的特性，同時對團簇大小可進行調(diào)節(jié)控制，從而更好的控制磁力材料的穩(wěn)定性和體內(nèi)降解周期。下面參照附圖，對本發(fā)明PLGA修飾的磁性納米簇、所述納米簇構成的納米簇團、基因載體材料、以及制備方法進行詳細的介紹和描述，以使更好地理解本發(fā)明，但是應當理解的是，下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。實施例1
傳統(tǒng)水熱法制備得到Fe3O4水相磁性納米粒子。將Iml 0.0OlM濃度的siRNA與Iml 0.05M濃度的PLGA在磁力攪拌下混勻，滴加到Iml 0.5M濃度的Fe3O4水相磁性納米粒子中，pH值調(diào)節(jié)至8。在25°C下磁力攪拌反應3小時，將獲得的懸浮液中的納米簇離心收集，并用無RNA酶的DEPC水洗滌數(shù)次后，常規(guī)冷凍干燥保存，得到直徑100-200nm的緩釋siRNA的PLGA修飾的磁性納米簇。12天siRNA釋放98.9%,緩釋周期在兩周左右。實施例2
傳統(tǒng)水熱法制備得到CoO2水相磁性納米粒子。將Iml 0.0OlM的siRNA與Iml 0.05M的PLGA在磁力攪拌下混勻，然后加入Iml0.5M濃度的傳統(tǒng)水熱法得到的CoO2磁性納米粒子，pH值調(diào)節(jié)至7。在60攝氏度下磁力攪拌反應2小時，將獲得的懸浮液中的納米簇離心收集，并用無RNA酶的DEPC水洗滌數(shù)次后，常規(guī)冷凍干燥保存，得到直徑100-200nm的緩釋siRNA的PLGA修飾的磁性納米簇。12天siRNA釋放98%以上，緩釋周期在兩周左右。實施例3
傳統(tǒng)水熱法制備得到Fe3O4水相磁性納米粒子。將Iml 0.0OlM濃度的siRNA與Iml 0.05M濃度的PLGA在磁力攪拌下混勻，然后加入Iml 0.5M濃度的傳統(tǒng)水熱法得到的Fe3O4磁性納米粒子，pH值調(diào)節(jié)至5.5。在60攝氏度下漩渦攪拌反應3小時，將獲得的懸浮液中的納米簇離心收集，并用無RNA酶的DEPC水洗滌數(shù)次后，常規(guī)冷凍干燥保存，得到直徑100-200nm的緩釋siRNA的PLGA修飾的磁性納米簇。
12天siRNA釋放99%左右，緩釋周期在兩周左右。實施例4
傳統(tǒng)水熱法制備得到Fe3O4水相磁性納米粒子。將Iml 0.005M濃度的siRNA與Iml 0.0lM濃度的PLGA在磁力攪拌下混勻，然后加入Iml 0.1M濃度傳統(tǒng)水熱法得到的Fe3O4磁性納米粒子，pH值調(diào)節(jié)至10。在60攝氏度下漩渦攪拌反應3小時，將獲 得的懸浮液中的納米簇離心收集，并用無RNA酶的DEPC水洗滌數(shù)次后，常規(guī)冷凍干燥保存，得到直徑50-100nm的緩釋siRNA的PLGA修飾的磁性納米簇。12天siRNA釋放99%左右，緩釋周期在兩周左右。實施例5
傳統(tǒng)水熱法制備得到Fe3O4水相磁性納米粒子。將Iml 0.005M濃度的siRNA與Iml 0.0lM濃度的PLGA在磁力攪拌下混勻，然后加入Iml 0.1M濃度傳統(tǒng)水熱法得到的Fe3O4磁性納米粒子。在50攝氏度、pH值為10的條件下，漩渦攪拌反應6小時，將獲得的懸浮液中的納米簇離心收集，并用無RNA酶的DEPC水洗滌數(shù)次后，常規(guī)冷凍干燥保存，得到直徑80-150nm的緩釋siRNA的PLGA修飾的磁性納米簇。12天siRNA釋放99%左右，緩釋周期在兩周左右。實施例6
傳統(tǒng)水熱法制備得到鐵氧體水相磁性納米粒子。將Iml 0.005M濃度的siRNA與Iml 0.0lM濃度的PLGA在磁力攪拌下混勻，然后加入Iml 0.1M濃度傳統(tǒng)水熱法得到的鐵氧體磁性納米粒子。在100攝氏度、pH值為6的條件下，漩渦攪拌反應4小時，將獲得的懸浮液中的納米簇離心收集，并用無RNA酶的DEPC水洗滌數(shù)次后，常規(guī)冷凍干燥保存，得到直徑50-150nm的緩釋siRNA的PLGA修飾的磁性納米簇。12天siRNA釋放99%左右，緩釋周期在兩周左右。實施例7
傳統(tǒng)水熱法制備得到Fe3O4水相磁性納米粒子。將Iml 0.0OlM濃度的siRNA與Iml 0.0lM濃度的PLGA在磁力攪拌下混勻，然后加入Iml 0.5M濃度傳統(tǒng)水熱法得到的Fe3O4磁性納米粒子。在15攝氏度、pH值為13的條件下，漩渦攪拌反應8小時，將獲得的懸浮液中的納米簇離心收集，并用無RNA酶的DEPC水洗滌數(shù)次后，常規(guī)冷凍干燥保存，得到直徑100-150nm的緩釋siRNA的PLGA修飾的磁性納米簇。12天siRNA釋放99%左右，緩釋周期在兩周左右。圖2和圖3給出了本發(fā)明上述實施例制備的PLGA修飾的磁性納米簇外觀電鏡照片，從圖中可以看出，本發(fā)明上述實施例制備的PLGA修飾的磁性納米簇表面光滑、無粘結。圖1給出了本發(fā)明上述實施例中制備的PLGA修飾的磁性納米簇圖的結構示意圖，其中，空白處為PLGA材料1，曲線代表遺傳物質(zhì)2，黑色圓形代表磁性納米顆粒3。圖4給出了本發(fā)明上述實施例制備的PLGA修飾的磁性納米簇組成的納米簇團的電鏡照片，從圖中可以看出，所述納米簇團由1(Γ20個納米簇組成，并很好的解決了納米顆粒的團聚問題。
圖5為本發(fā)明實施例1制備的PLGA修飾的磁性納米簇進行緩釋效果實驗得到的結果，從圖中可以看出，實施例1制備的納米簇緩釋期在2周左右，12天后釋放99%左右；同樣地，其它實施例中制備的PLGA修飾的磁性納米簇舒服效果相似(圖中未畫出)。以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在 本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權利要求
1.一種PLGA修飾的磁性納米簇，其特征在于，包括乳酸/羥基乙酸共聚物和能夠與所述PLGA交聯(lián)的磁性納米顆粒；所述PLGA與所述磁性納米顆粒交聯(lián)結合。
2.根據(jù)權利要求1所述的PLGA修飾的磁性納米簇，其特征在于，所述PLGA修飾的磁性納米簇粒徑為70 300nm。
3.根據(jù)權利要求1所述的PLGA修飾的磁性納米簇，其特征在于，所述PLGA分子量為3 X IO3 7 X 104。
4.根據(jù)權利要求1所述的PLGA修飾的磁性納米簇，其特征在于，所述磁性納米顆粒粒徑為5 50nm。
5.根據(jù)權利要求1所述的PLGA修飾的磁性納米簇，其特征在于，還包括用于基因治療的遺傳物質(zhì)。
6.根據(jù)權利要求5所述的PLGA修飾的磁性納米簇，其特征在于，所述PLGA、遺傳物質(zhì)、以及所述納米顆粒摩爾比為1:0.05、.5:5 20。
7.—種權利要求1所述PLGA修飾的磁性納米簇的制備方法，其特征在于，步驟包括: 步驟I，制備水相磁性納米顆粒； 步驟2，所述水相磁性納米顆粒與PLGA和遺傳物質(zhì)混合反應，使磁性納米顆粒與PLGA交聯(lián)形成團簇將所述遺傳物質(zhì)包裹在所述團簇結果中，收集制備的PLGA修飾的磁性納米簇。
8.根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于，PLGA與磁性納米顆粒交聯(lián)時的反應溫度控制在1(T150°C。
9.一種包括權利要求1所述PLGA修飾的磁性納米簇的基因載體材料，其特征在于，包括納米簇團，所述納米簇團 包括權利要求1所述的PLGA修飾的磁性納米簇。
10.根據(jù)權利要求9所述的納米簇團，其特征在于，每個納米簇團中包括1(Γ20個權利要求I所述的PLGA修飾的磁性納米簇。
全文摘要
一種PLGA修飾的磁性納米簇、及其制備方法和應用；首先制備水相磁性納米顆粒，然后與PLGA(或加入遺傳物質(zhì)的混合物)與磁性納米顆粒交聯(lián)，制成PLGA修飾的磁性納米簇組成的磁性納米簇團。本發(fā)明制備的PLGA修飾的磁性納米簇，解決了納米粒子容易團聚的問題；可作為基因載體材料用于基因治療，具有良好的緩釋效果；并且本發(fā)明基因載體不涉及病毒載體，安全性能好。
文檔編號A61K49/12GK103182088SQ201110446700
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權日2011年12月28日
發(fā)明者張先龍, 彭曉春, 程濤, 史思峰, 郭永園 申請人:上海市第六人民醫(yī)院