專利名稱：一種鋰皂石摻雜的聚乳酸-羥基乙酸納米纖維的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于聚乳酸-羥基乙酸納米纖維的制備領(lǐng)域，特別涉及一種鋰皂石摻雜的聚乳酸-羥基乙酸納米纖維的制備方法。
背景技術(shù)：
靜電紡(electrospirming)是指利用靜電場(chǎng)力使帶電聚合物溶液或熔體在靜電場(chǎng)中射流并牽伸，形成微納米尺寸纖維的新型紡絲方法。靜電紡絲技術(shù)是目前唯一能夠直接、連續(xù)制備聚合物納米纖維的新型紡絲技術(shù)。用靜電紡絲技術(shù)制得的纖維具有孔隙率高、 比表面積大、纖維精細(xì)度與均一度高、長(zhǎng)徑比大等特點(diǎn)。這些用傳統(tǒng)紡絲方法所無(wú)法獲得的優(yōu)良特性，賦予了靜電紡纖維廣泛的應(yīng)用前景。此外，靜電紡絲技術(shù)還具有快速、高效，設(shè)備簡(jiǎn)單、易于操作，制備的無(wú)紡布或纖維氈種類繁多，而且易于控制化學(xué)組分和物理性能等一系列優(yōu)點(diǎn)。聚乳酸羥基乙酸共聚物(polydactide-co-glycolide)，PLGA)是一種已經(jīng)被美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)使用，具有良好的生物相容性和生物降解性的高分子聚合物。PLGA在人體內(nèi)可以降解，產(chǎn)物能通過(guò)人體正常新陳代謝排出體外，因此對(duì)人體無(wú)毒。而且，PLGA聚合物作為一種優(yōu)良的生物醫(yī)用材料，已被廣泛地應(yīng)用于可植入材料和組織工程用支架材料領(lǐng)域。鋰皂石(Laponite，LAP)是一種含鎂、鋰、硅的粘土礦物，其晶體結(jié)構(gòu)為三八面體型。鋰皂石在水環(huán)境中具有極強(qiáng)的成膠性能，能很快膨脹并形成凝膠，具有較好的分散性、懸浮性和增稠性。人工合成的LAP是片狀的納米級(jí)粉體，在生理環(huán)境下，LAP可以被降解為無(wú)毒物。鋰皂石在化工涂料、化妝品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。但是截止目前，尚沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)靜電紡絲法制備PLGA/LAP復(fù)合納米纖維，并進(jìn)一步評(píng)價(jià)該復(fù)合納米纖維的機(jī)械性能、生物活性和血液相容性的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種鋰皂石摻雜的聚乳酸-羥基乙酸納米纖維的制備方法，該工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品易得，所用PLGA和LAP成本低，制備的PLGA/LAP復(fù)合納米纖維氈具有良好的機(jī)械性能、熱穩(wěn)定性、血液相容性和生物相容性。本發(fā)明的一種鋰皂石摻雜的聚乳酸-羥基乙酸納米纖維的制備方法，包括(1)將聚乳酸-羥基乙酸PLGA溶解在THF/DMF混合溶劑中，攪拌使PLGA完全溶解，得到PLGA靜電紡絲溶液；(2)在攪拌下，將鋰皂石LAP均勻分散在上述PLGA靜電紡絲溶液中，得PLGA/LAP 靜電紡絲溶液；其中LAP的質(zhì)量與PLGA的質(zhì)量百分比為0. 5-5% ；(3)采用上述PLGA/LAP靜電紡絲溶液進(jìn)行靜電紡絲，得到PLGA/LAP復(fù)合納米纖維氈，干燥，即得。步驟(1)中所述的THF/DMF混合溶劑組成為T(mén)HF和DMF的體積比為3:1。步驟(1)中所述的攪拌的攪拌時(shí)間為8_12h。
步驟(1)中所述的PLGA靜電紡絲溶液中PLGA與THF/DMF混合溶劑的質(zhì)量體積比為 Ig 5-4mL。步驟O)中所述的攪拌為磁力攪拌，其速率為200-300r/min，時(shí)間為20-30min。步驟O)中所述的PLGA/LAP靜電紡絲溶液中LAP的質(zhì)量與PLGA的質(zhì)量百分比為 0. 5%、1%、3%和 5%。步驟(3)中所述的靜電紡絲法的工藝參數(shù)為電壓18-22kV，流速0. 8-1. OmL/h，接收距離15-20cm。步驟(3)中所述的干燥為真空干燥，其中真空干燥的時(shí)間為M-4 !。本發(fā)明中可將靜電紡絲后得到的PLGA/LAP復(fù)合納米纖維氈置于真空干燥箱中除去殘留在纖維表面的水分以及THF/DMF溶劑。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便易行，產(chǎn)品易得，原材料成本低，且均具有良好的生物相容性，制備的PLGA/LAP復(fù)合納米纖維氈在藥物載體、組織工程支架材料等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前
旦
ο本發(fā)明使用掃描電子顯微鏡(SEM)、熱重分析法(TGA)、差示掃描量熱法(DSC)、機(jī)械性能測(cè)試等表征手段驗(yàn)證本發(fā)明方法的可行性。此外，本發(fā)明還對(duì)材料的親水性、蛋白質(zhì)吸附能力、生物相容性和血液相容性等特性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。具體測(cè)試結(jié)果如下(1)掃描電子顯微鏡(SEM)的測(cè)試結(jié)果 SEM觀察顯示(如圖1所示)，本發(fā)明制備的PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3 % LAP 和PLGA/5% LAP納米纖維形貌規(guī)則、表面規(guī)整，纖維直徑分別為9 士274nm、617士 178nm、 584士 167nm和550士 183nm。很明顯，當(dāng)一定量的LAP納米粒子摻雜于PLGA紡絲液中時(shí)，在同樣的紡絲條件下，所得納米纖維的直徑有所降低，主要是因摻雜LAP納米粒子引起PLGA 紡絲液性質(zhì)(如電導(dǎo)率、表面張力以及粘度等)變化而致。(2) TGA和DSC的測(cè)試結(jié)果圖 2 所示為 PLGA、PLGA/1 % LAP,PLGA/3 % LAP 和 PLGA/5 % LAP 納米纖維租的 TGA 和DSC曲線。從圖2可以看出，當(dāng)一定量的LAP納米粒子摻雜于PLGA紡絲液中時(shí)，纖維氈的熔點(diǎn)和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度降低的幅度很小，這說(shuō)明了 LAP摻雜于PLGA纖維中并不會(huì)明顯降低PLGA納米纖維氈的熱穩(wěn)定性。(3)機(jī)械性能測(cè)試結(jié)果圖 3 為 PLGA、PLGA/1 % LAP,PLGA/3 % LAP 和 PLGA/5 % LAP 納米纖維氈的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。從圖3可以看出，復(fù)合納米纖維氈的斷裂強(qiáng)度隨著LAP含量的增加而提高，這說(shuō)明摻雜的LAP可以提高纖維的斷裂強(qiáng)度。(4)接觸角測(cè)試結(jié)果圖 4 為 PLGA、PLGA/1 % LAP,PLGA/3 % LAP 和 PLGA/5 % LAP 納米纖維氈的接觸角測(cè)試圖。由于LAP是一種親水性材料，因此，蒸餾水在PLGA/1% LAP、PLGA/3% LAP和PLGA/5% LAP納米纖維氈表面的接觸角較PLGA納米纖維氈均有一定程度的降低，這說(shuō)明LAP摻雜于 PLGA纖維中能夠一定程度上提高PLGA納米纖維氈的親水性，因而，PLGA/LAP納米纖維氈在組織工程支架材料等領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景。(5)不同種類納米纖維氈對(duì)胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的吸附效果比較
為了進(jìn)一步驗(yàn)證PLGA/LAP納米纖維氈較PLGA納米纖維氈在組織工程領(lǐng)域具有更好的應(yīng)用潛能，本發(fā)明還研究了 FBS在納米纖維氈表面的吸附性能。如圖5所示，PLGA、 PLGA/1% LAP,PLGA/3% LAP對(duì)FBS的吸附能力明顯優(yōu)于蓋玻片對(duì)FBS的吸附(具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值分別為ρ < 0. 001，ρ < 0. 01，和ρ < 0. 05)，且PLGA/LAP納米纖維氈對(duì) FBS的吸附明顯的優(yōu)于PLGA納米纖維氈(ρ < 0. 05)。這一結(jié)果表明PLGA/LAP納米纖維氈較PLGA納米纖維氈具有更好的蛋白吸附性能，在組織工程領(lǐng)域可能具有更好的應(yīng)用潛能。(6)不同種類納米纖維氈溶血和抗凝血效果比較本發(fā)明通過(guò)溶血和抗凝血實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)PLGA、PLGA/LAP納米纖維氈的血液相容性。圖 6(a)為溶血試驗(yàn)后PBS中血紅蛋白的含量。分析附圖6(a)可知，人紅細(xì)胞與各實(shí)驗(yàn)濃度下的材料共培養(yǎng)池并經(jīng)離心后，上清液中血紅蛋白的含量與對(duì)照組(蒸餾水)相比均存在著顯著性差異廣P < 0. 01)，表明 PLGA、PLGA/1% LAP,PLGA/3% LAP,PLGA/5% LAP 均未發(fā)生溶血現(xiàn)象。本發(fā)明制備的PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA/5% LAP 納米纖維氈除了具備不溶血性能之外，還可以在有促凝劑存在的情況下阻止血液的凝固。圖6(b)是對(duì) PLGA/1% LAP、PLGA/3% LAP和PLGA/5% LAP納米纖維氈抗凝血性能的評(píng)價(jià)結(jié)果，對(duì)照組為蓋玻片。圖6(b)給出了經(jīng)處理不同時(shí)間(5、10、20、40和60min)后的血液溶于蒸餾水后血紅蛋白的含量(用Mlnm處的OD值表示，此OD值與血紅蛋白含量正相關(guān))，血紅蛋白的含量越高說(shuō)明血液凝固現(xiàn)象越不明顯，則材料阻止凝血凝固的能力越強(qiáng)。分析圖6(b) 可知，在設(shè)定的時(shí)間段，實(shí)驗(yàn)組血紅蛋白的含量均高于對(duì)照組，這說(shuō)明PLGA、PLGA/1% LAP、 PLGA/3% LAP和PLGA/5% LAP納米纖維氈均可以在一定程度上抑制血液的凝固。(7)不同種類納米纖維氈的生物相容性評(píng)價(jià)圖 7、8 和 9 為對(duì) PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3 % LAP 和 PLGA/5 % LAP 納米纖維氈的生物相容性的評(píng)價(jià)結(jié)果。如圖7所示，隨著時(shí)間遞增，豬髂動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(porcine iliacartery endothelial cells,PIECs)在PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP和PLGA/5% LAP納米纖維氈表面的粘附和增殖活力呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，說(shuō)明豬髂動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞可以在上述材料表面正常地粘附和分裂。通過(guò)比較第1、8小時(shí)的細(xì)胞粘附以及第3、7天細(xì)胞的增殖可以發(fā)現(xiàn)，PIECs細(xì)胞在PLGA/3% LAP和PLGA/1% LAP納米纖維表面的粘附以及在PLGA/1% LAP納米纖維表面的增殖情況與純PLGA相比具有顯著性差異(ρ < 0. 05)，證明了 PLGA/1 % LAP, PLGA/3% LAP和PLGA/5% LAP納米纖維氈具有良好的生物相容性。圖8禾Π 9分別為經(jīng)2. 5%戊二醛溶液固定1_3小時(shí)后(a)PLGA、(b)PLGA/1% LAP、 (c)PLGA/3% LAP和(d)PLGA/5% LAP納米纖維氈表面的PIECs細(xì)胞的SEM圖。從細(xì)胞的 SEM圖片可以看出，PIECs細(xì)胞可以很好地在各組納米纖維表面粘附以及增殖，進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明報(bào)道的納米纖維具有良好的生物相容性。有益效果(1)本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，所用PLGA和LAP成本低，原料易得，可用于工業(yè)生產(chǎn)；(2)本發(fā)明方法制備的PLGA/LAP復(fù)合納米纖維氈具有良好的機(jī)械性能、熱穩(wěn)定性、血液相容性和生物相容性，因而在藥物載體、組織工程支架材料等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖 1 為本發(fā)明涉及的(a) PLGA、(b) PLGA/1 % LAP, (c)PLGA/3% LAP 和(d) PLGA/5% LAP納米纖維氈的SEM圖及其對(duì)應(yīng)的納米纖維的直徑分布圖；圖 2 為本發(fā)明涉及的 PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA 維氈的TGA(上圖)和DSC(下圖)曲線；圖 3 為本發(fā)明涉及的 PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA 維氈的應(yīng)力應(yīng)變曲線；圖 4 為本發(fā)明涉及的 PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA 維氈的接觸角測(cè)試圖片；圖 5 為本發(fā)明涉及的 PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA 維氈對(duì)FBS吸附的測(cè)試結(jié)果；圖 6 為本發(fā)明涉及的 PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA 維氈的(a)溶血和(b)抗凝血測(cè)試結(jié)果；圖 7 為本發(fā)明涉及的 PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA 維氈對(duì)PIECs細(xì)胞粘附活力(a)和增殖活力(b)影響的測(cè)試結(jié)果；圖 8 為 PIECs 細(xì)胞在(a) PLGA、(b) PLGA/1 % LAP、(c) PLGA/3 % LAP 和(d) PLGA/5 % LAP納米纖維氈表面培養(yǎng)8小時(shí)細(xì)胞粘附的形態(tài)；圖 9 為 PIECs 細(xì)胞在(a) PLGA、(b) PLGA/1 % LAP、(c) PLGA/3 % LAP 和(d) PLGA/5 % LAP納米纖維氈表面培養(yǎng)3天細(xì)胞增殖的形態(tài)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例1取4份各0. 8g PLGA，分別與2. 4mL THF和0. 8mL DMF混合，室溫下攪拌8h，待PLGA 完全溶解。分別向第2、3和4份PLGA溶液中加入8mg、2^ig和40mg LAP粉末。使用磁力攪拌20min，攪拌速率為200r/min，得到PLGA及PLGA/LAP紡絲液。通過(guò)靜電紡絲法制備 PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA/5% LAP 納米纖維氈。其中，接收距離為 15cm， 電壓為20kV，流速為0. 8mL/h，制備的復(fù)合納米纖維氈在真空置干燥箱內(nèi)干燥48h以除去殘留的水分和溶劑。SEM 觀察結(jié)果顯示，所得到的 PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA/5% LAP 納米纖維形貌規(guī)則、表面規(guī)整，纖維直徑分別為9 士 274nm、617 士 178nm、584士 167nm和 550士 183nm(見(jiàn)附圖1)。比較四種不同纖維的直徑可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一定量的LAP納米粒子摻雜于PLGA紡絲液中時(shí)，在同樣的紡絲條件下，所得納米纖維的直徑有所降低，主要是因摻雜LAP納米粒子引起PLGA紡絲液性質(zhì)(如電導(dǎo)率、表面張力以及粘度等)變化而致。實(shí)施例2分別稱取一定質(zhì)量(5mg左右)的實(shí)施例1中制備的PLGA、PLGA/1% LAP、PLGA/3%
/5% LAP納米纖 /5% LAP納米纖 /5% LAP納米纖 /5% LAP納米纖 /5% LAP納米纖 /5% LAP納米纖LAP和PLGA/5% LAP納米纖維氈，用于測(cè)試?yán)w維材料的熱力學(xué)性能(見(jiàn)附圖幻。熱力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果表明，當(dāng)一定量的LAP納米粒子摻雜于PLGA紡絲液中時(shí)，纖維氈的熔點(diǎn)和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度降低的幅度很小，說(shuō)明LAP摻雜于PLGA纖維中并不會(huì)明顯降低PLGA納米纖維氈的熱穩(wěn)定性。實(shí)施例3將實(shí)施例1 中制備的 PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA/5% LAP 納米纖維氈剪成IcmX 5cm的長(zhǎng)條，每個(gè)樣品取3個(gè)平行樣。用千分尺測(cè)量每條纖維氈的3個(gè)不同位置的厚度，求平均值做為每個(gè)樣品的厚度。用萬(wàn)能材料測(cè)試機(jī)測(cè)試?yán)w維氈的機(jī)械性能，得出應(yīng)力-應(yīng)變曲線(見(jiàn)附圖3)。從應(yīng)力-應(yīng)變曲線可以看出，一定量的LAP摻雜于PLGA纖維后，可以明顯地提高PLGA納米纖維的斷裂強(qiáng)度。實(shí)施例4將實(shí)施例1 中制備的 PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA/5% LAP 納米纖維氈剪成IcmX Icm的正方形小塊，每個(gè)樣品取3個(gè)平行樣。使用研究型接觸角測(cè)量?jī)xDSA 30測(cè)試不同納米纖維氈的水接觸角。很明顯，蒸餾水在PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP和 PLGA/5% LAP納米纖維氈表面的接觸角較PLGA納米纖維氈均有一定程度的降低，這說(shuō)明 LAP摻雜于PLGA纖維中能夠一定程度上提高PLGA納米纖維氈的親水性(見(jiàn)附圖4)。實(shí)施例5將實(shí)施例1 中制備的 PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA/5% LAP 納米纖維氈剪成2cmX 2cm小塊，每種纖維取3個(gè)平行樣，并鋪展在直徑1. 8cm的蓋玻片上，置于 M孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。對(duì)鋪在蓋玻片上的纖維進(jìn)行紫外線殺菌，然后每孔中加入ImL濃度為 10%的FBS溶液，置于37°C環(huán)境下孵育Mh。然后，用Lamada 25型紫外分光光度計(jì)測(cè)試上清液在280nm處的吸光值，根據(jù)事先準(zhǔn)備好的標(biāo)定曲線計(jì)算出24h后每孔中FBS的濃度， 分析不同纖維氈對(duì)FBS的吸附性能(見(jiàn)附圖5)。結(jié)果表明，PLGA、PLGA/1% LAP,PLGA/3% LAP對(duì)FBS的吸附能力明顯優(yōu)于蓋玻片對(duì)FBS的吸附(具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ρ值分別為ρ < 0. 001，ρ < 0. 01，和ρ < 0. 05)，且PLGA/1 % LAP納米纖維氈對(duì)FBS的吸附明顯優(yōu)于PLGA 納米纖維氈(P < 0. 05)。實(shí)施例6取肝素鋰穩(wěn)定的健康成年人全血5mL，離心;3min (轉(zhuǎn)速為3000r/min)，用PBS洗滌沉淀3次，得血紅細(xì)胞。用PBS按照1 100的比例配置成人血紅細(xì)胞懸濁液，于4°C冰箱中備用。分別稱取一定質(zhì)量(5mg左右)的實(shí)施例1中制備的PLGA、PLGA/1% LAP、PLGA/3% LAP和PLGA/5% LAP納米纖維氈，每種材料取3個(gè)平行樣。然后，按照纖維氈質(zhì)量人血紅細(xì)胞懸濁液體積之比為ang ImL將不同的纖維氈浸入人血紅細(xì)胞懸濁液(對(duì)照組設(shè)置 0. 3mL人血紅細(xì)胞懸濁液溶于1. 2mLPBS中，以及0. 3 mL人血紅細(xì)胞懸濁液溶于1. 2mL蒸餾水中)，并在37°C環(huán)境下孵育》1。然后，取出纖維氈，并將浸泡過(guò)纖維氈的人血紅細(xì)胞懸濁液離心lmin (IOOOrpm)，取上清液并用Lamada 25型紫外分光光度計(jì)測(cè)試上清液在MOnm 處的吸光值，以評(píng)價(jià)材料的溶血性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP、 PLGA/5% LAP均未發(fā)生溶血現(xiàn)象(見(jiàn)附圖6)。實(shí)施例7
將實(shí)施例1 中制備的 PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA/5% LAP 納米纖維氈剪成IcmX Icm的正方形小塊，每個(gè)樣品取3個(gè)平行樣(對(duì)照組為直徑1. 8mm的蓋玻片)。將試驗(yàn)組和對(duì)照組置于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。然后，向每孔中纖維氈以及對(duì)照組蓋玻片上滴加20 μ L實(shí)施例6中準(zhǔn)備的健康成年人全血，同時(shí)加10 μ LCaCl2溶液(0. 2mol/L)， 置于37°C環(huán)境下孵育不同的時(shí)間。在每個(gè)培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，向每孔加5mL蒸餾水并孵育5 分鐘，然后用Lamada 25型紫外分光光度計(jì)測(cè)試溶液在MOnm處的吸光值，以評(píng)價(jià)材料的抗凝血性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PLGA、PLGA/1% LAP、PLGA/3% LAP和PLGA/5% LAP納米纖維氈均可以在一定程度上抑制血液的凝固(見(jiàn)附圖6)。實(shí)施例8將實(shí)施例1 中制備的 PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA/5% LAP 納米纖維氈剪成2cmX2cm小塊，鋪展在直徑1. 8cm的蓋玻片上并置于M孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。對(duì)鋪在蓋玻片上的纖維進(jìn)行紫外線殺菌并用DMEM高糖培養(yǎng)基浸泡12h，然后每孔補(bǔ)充400 μ L培養(yǎng)基并接種2 X IO4個(gè)PIECs細(xì)胞。每塊培養(yǎng)板設(shè)置不同的培養(yǎng)時(shí)間(1，3，5和7天和1，2， 4和8小時(shí)，共8塊培養(yǎng)板)。在每個(gè)培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，向培養(yǎng)孔中加入40 μ LMTT，繼續(xù)培養(yǎng) 4h，使活細(xì)胞與MTT完全作用生成MTT甲瓚晶體。棄去每孔中的培養(yǎng)基，補(bǔ)加400 μ L DMS0， 將MTT甲瓚晶體完全溶解并記錄570nm處的OD值，分析不同培養(yǎng)時(shí)間下，細(xì)胞在納米纖維表面的粘附或增殖情況，評(píng)價(jià)PLGA、PLGA/1% LAP,PLGA/3% LAP和PLGA/5% LAP納米纖維氈對(duì)細(xì)胞粘附和增殖的影響。隨著時(shí)間遞增，PIECs細(xì)胞在 PLGA、PLGA/1 % LAP、PLGA/3% LAP 和 PLGA/5% LAP 納米纖維氈表面的粘附和增殖活力呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，說(shuō)明豬髂動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞可以在上述材料表面正常地粘附和分裂。通過(guò)比較第1、8小時(shí)的細(xì)胞粘附以及第3、7天細(xì)胞的增殖(見(jiàn)附圖7)可以發(fā)現(xiàn)，PIECs細(xì)胞在PLGA/3% LAP和PLGA/1% LAP納米纖維表面的粘附以及在 PLGA/1 % LAP納米纖維表面的增殖情況與純PLGA相比具有顯著性差異(ρ < 0. 05)，進(jìn)一步證明了 PLGA/1% LAP, PLGA/3% LAP和PLGA/5% LAP納米纖維氈具有良好的生物相容性。實(shí)施例9將實(shí)施例8中培養(yǎng)他和3d的PIECs細(xì)胞用PBS緩沖溶液洗滌3遍，并用2. 5%的戊二醛溶液固定池。然后，將上述固定的PIECs細(xì)胞用梯度酒精(30^^50^^70^^80%, 90^^95%和100% )依次進(jìn)行脫水處理，每次處理lOmin，酒精用量為lmL。將處理完畢的 PIECs細(xì)胞自然干燥后，通過(guò)SEM觀察納米纖維表面的細(xì)胞形貌(見(jiàn)附圖8和9)。結(jié)果表明，PIECs細(xì)胞可以很好地在各組納米纖維表面粘附以及增殖，進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明報(bào)道的納米纖維具有良好的生物相容性。
權(quán)利要求
1.一種鋰皂石摻雜的聚乳酸-羥基乙酸納米纖維的制備方法，包括(1)將聚乳酸-羥基乙酸PLGA溶解在THF/DMF混合溶劑中，攪拌使PLGA完全溶解，得到PLGA靜電紡絲溶液；(2)在攪拌下，將鋰皂石LAP均勻分散在上述PLGA靜電紡絲溶液中，得PLGA/LAP靜電紡絲溶液；其中LAP的質(zhì)量與PLGA的質(zhì)量百分比為0. 5-5% ；(3)采用上述PLGA/LAP靜電紡絲溶液進(jìn)行靜電紡絲，得到PLGA/LAP復(fù)合納米纖維氈， 干燥，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鋰皂石摻雜的聚乳酸-羥基乙酸納米纖維的制備方法， 其特征在于步驟(1)中所述的THF/DMF混合溶劑組成為T(mén)HF和DMF的體積比為3:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鋰皂石摻雜的聚乳酸-羥基乙酸納米纖維的制備方法， 其特征在于步驟(1)中所述攪拌的攪拌時(shí)間為8-12h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鋰皂石摻雜的聚乳酸-羥基乙酸納米纖維的制備方法， 其特征在于步驟(1)中所述的PLGA靜電紡絲溶液中PLGA與THF/DMF混合溶劑的質(zhì)量體積比為Ig 4-5mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鋰皂石摻雜的聚乳酸-羥基乙酸納米纖維的制備方法，其特征在于步驟O)中所述的攪拌為磁力攪拌，其速率為200-300r/min，時(shí)間為 20-30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鋰皂石摻雜的聚乳酸-羥基乙酸納米纖維的制備方法， 其特征在于步驟O)中所述的PLGA/LAP靜電紡絲溶液中LAP的質(zhì)量與PLGA的質(zhì)量百分比為 0. 5%、1%、3%和 5%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鋰皂石摻雜的聚乳酸-羥基乙酸納米纖維的制備方法， 其特征在于步驟(3)中所述的靜電紡絲法的工藝參數(shù)為電壓18-22kV，流速0. 8-1. OmL/ h，接收距離15-20cm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鋰皂石摻雜的聚乳酸-羥基乙酸納米纖維的制備方法， 其特征在于步驟(3)中所述的干燥為真空干燥，其中真空干燥的時(shí)間為M-4 !。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鋰皂石摻雜的聚乳酸-羥基乙酸納米纖維的制備方法，包括(1)將聚乳酸-羥基乙酸PLGA溶解在THF/DMF混合溶劑中，攪拌使PLGA完全溶解，得到PLGA靜電紡絲溶液；(2)在攪拌下，將鋰皂石LAP均勻分散在上述PLGA靜電紡絲溶液中，得PLGA/LAP靜電紡絲溶液；(3)采用上述PLGA/LAP靜電紡絲溶液進(jìn)行靜電紡絲，得到PLGA/LAP復(fù)合納米纖維氈，干燥，即得。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品易得，所用PLGA和LAP成本較低；制備的鋰皂石摻雜的聚乳酸-羥基乙酸納米纖維具有良好的機(jī)械性能、熱穩(wěn)定性、血液相容性和生物相容性，在藥物載體、組織工程支架材料等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K47/34GK102505176SQ201110349280
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者史向陽(yáng), 王世革, 鄭付印 申請(qǐng)人:東華大學(xué)