專利名稱：一種生物自發(fā)光的藥物載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物兼容性和功能性的微膠囊及其制備方法，尤其涉及一種生物自發(fā)光的藥物載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
藥物的微膠囊化對于藥物緩釋來說是一種很有利的技術(shù)。微膠囊緩釋藥物在提高藥效，延長藥物活性時間，較長時間內(nèi)保持血藥濃度，增加藥物的協(xié)同性等方面都有長遠(yuǎn)的意義。層層組裝法作為制備微膠囊的新技術(shù)有其獨(dú)到的優(yōu)勢。用該方法組裝微膠囊，其壁材可以有多種選擇性，如聚電解質(zhì)、可生物降解的高分子聚合物、蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)體等。組裝膠囊的驅(qū)動力也從傳統(tǒng)的靜電作用擴(kuò)展到氫鍵作用、疏水作用、范德華力、共價交聯(lián)等多種作用力。多樣化的選擇賦予了膠囊靶向性、磁性、熒光性、生物兼容性等性質(zhì)，方便其在不同領(lǐng)域中的應(yīng)用。目前針對具有發(fā)光性質(zhì)微膠囊的研究主要集中在熒光性質(zhì)層面上，基本思路包括引入擁有熒光特性的物質(zhì)或者通過反應(yīng)生成熒光基團(tuán)，主要方法有如下幾種將量子點(diǎn)進(jìn)行恰當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)后裝載到膠囊壁上；用熒光物質(zhì)如異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記帶有氨基的聚電解質(zhì)或蛋白質(zhì)，并以標(biāo)記過的物質(zhì)為原料組裝微膠囊；將鑭系元素的發(fā)光性質(zhì)引入微膠囊。其中發(fā)展比較迅速的是將鑭系元素的熒光特性與微膠囊相結(jié)合，包括以可溶性鑭系元素的鹽類為原料，和其它聚電解質(zhì)一起層層組裝微膠囊，或者令鑭系元素在膠囊壁上生成不溶鹽的納米顆粒，從而引入熒光特性(參見J. Mater. Chem.，2009，19，1458-1463， Enriched encapsulation and fluorescence enhancement of europium complexes in microcapsules)。將具有熒光性質(zhì)的微膠囊作為藥物載體裝載光敏劑用于光動力治療中，可以增加藥物的選擇性，具有一定的優(yōu)勢。光動力反應(yīng)是由可見光、近紅外光或紫外光所驅(qū)動的，通過生物組織中激發(fā)態(tài)光敏物質(zhì)的退激而引發(fā)的一系列物理、化學(xué)和生物學(xué)過程。而光動力治療是一種冷光化學(xué)反應(yīng)，是有氧分子參與的伴隨生物效應(yīng)的光敏化反應(yīng)，包括光敏劑、照射光和氧分子三個要素。生物組織中的內(nèi)源性或外源性光敏物質(zhì)受到相應(yīng)波長(可見光、 近紅外光或紫外光)的光照時，吸收光子能量，由基態(tài)變成激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的光敏物質(zhì)很不穩(wěn)定，迅速經(jīng)過物理退激或化學(xué)退激過程釋放出能量而返回基態(tài)，其物理退激過程可以產(chǎn)生熒光，通過分析熒光光譜能進(jìn)行疾病的診斷；其化學(xué)退激過程可以生成活性很強(qiáng)的單態(tài)氧，單態(tài)氧和相鄰的生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)或影響細(xì)胞功能，導(dǎo)致細(xì)胞受損乃至死亡。此外這一過程引發(fā)的毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷和血管栓塞造成的局部微循環(huán)障礙，能夠進(jìn)一步導(dǎo)致病變組織的缺血性壞死，從而產(chǎn)生治療作用。光動力治療的優(yōu)勢在于光敏劑在暗條件下無毒，只在光照區(qū)域內(nèi)具有殺傷效果，可以避免正常器官及細(xì)胞的損傷，不會損害造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的功能。由于其毒性表現(xiàn)為單態(tài)氧的強(qiáng)氧化作用，腫瘤細(xì)胞不會對這一過程產(chǎn)生抵抗性，故光動力療法可以反復(fù)使用。但是由于受到可見光對人體組織透過能力差的局限性的影響，目前光動力治療僅局限于靶組織為“薄層”結(jié)構(gòu)的疾病，如皮膚癌、支氣管癌、膀胱癌等淺表腫瘤及視網(wǎng)膜黃斑變性，動脈粥樣硬化和牛皮癬等疾病。對于身體內(nèi)部腫瘤則沒有合適的方法，目前多采取的方法是在病灶區(qū)域引入若干光纖并恰當(dāng)安排光纖密度和布局，將特定波長的激光引導(dǎo)到腫瘤區(qū)域進(jìn)行治療。然而這些手段會對身體造成一定的傷害，并且無法保證腫瘤周圍光照的均勻性，未暴露在光照之下的腫瘤及已經(jīng)轉(zhuǎn)移的部分都無法得到有效的治療。已知的激發(fā)出膠囊熒光所用的激光多為短波長的藍(lán)綠色光，能量較高，但穿透能力差，對人體組織只能穿透幾微米，難以到達(dá)身體內(nèi)部的腫瘤，這就限制了其使用范圍。因此，需要找到一種不需要激發(fā)光源激發(fā)就能發(fā)光的載體，用其來裝載光敏藥物， 達(dá)到在載藥同時激活藥物的目的，從而擴(kuò)大光動力治療方法在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對光動力治療中光源無法到達(dá)身體內(nèi)部組織的問題，提供了一種具有自發(fā)光性質(zhì)(即不需要任何激發(fā)光源便可發(fā)光)的微膠囊及其制備方法。本發(fā)明所提供的生物自發(fā)光微膠囊，由囊芯、包覆所述囊芯的陽離子聚電解質(zhì)層以及包覆所述聚電解質(zhì)層的囊壁組成；其中，所述囊芯為熒光素，所述囊壁由交聯(lián)劑和熒光素酶交替層層組裝構(gòu)成，所述交聯(lián)劑為含有兩個醛基并能保護(hù)所述熒光素酶活性的化合物。本發(fā)明中所選用的熒光素酶具體可為螢火蟲熒光素酶、海螢熒光素酶、細(xì)菌熒光素酶等生物熒光素酶。當(dāng)囊芯為螢火蟲熒光素時，所述熒光素酶為螢火蟲熒光素酶；當(dāng)囊芯為海螢熒光素時，所述熒光素酶為海螢熒光素酶；
當(dāng)囊芯為細(xì)菌熒光素時，所述熒光素酶為細(xì)菌熒光素酶。本發(fā)明中所述交聯(lián)劑具體為部分氧化海藻酸鈉(ADA)，其氧化度為60-70%。ADA是用高碘酸鈉氧化海藻酸鈉制備得到的，氧化后的海藻酸鈉生成了活性醛基， 具有二醛結(jié)構(gòu)，是一種毒副作用很小的天然交聯(lián)劑。所述陽離子聚電解質(zhì)層優(yōu)選聚乙烯亞胺(Mw = 50000-100000)。制備上述生物自發(fā)光微膠囊的方法，包括下述步驟1)制備含熒光素的模板粒子；2)將所述含熒光素的模板粒子置于陽離子聚電解質(zhì)的PBS緩沖溶液中進(jìn)行吸附， 吸附結(jié)束后離心分離并清洗，得到表面包覆陽離子聚電解質(zhì)層的含熒光素的模板粒子；3)將步驟2)得到的模板粒子置于交聯(lián)劑PBS緩沖溶液中進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后離心分離并清洗，得到表面吸附交聯(lián)劑層的模板粒子；所述交聯(lián)劑為含有兩個醛基并能保護(hù)所述熒光素酶活性的化合物；4)將步驟3)得到的模板粒子置于熒光素酶的PBS緩沖溶液中進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后離心分離并清洗，得到表面吸附熒光素酶層的模板粒子；5)以所述步驟幻和4)作為一次組裝處理，重復(fù)所述組裝處理直至得到目標(biāo)層數(shù)；6)溶解步驟5)得到的微膠囊中的模板粒子，得到所述生物自發(fā)光的微膠囊。其中，步驟2)和步驟4)中所述PBS緩沖溶液為0. 2M、pH 6. 0的PBS緩沖溶液。
步驟2)所述陽離子聚電解質(zhì)的PBS緩沖溶液中陽離子聚電解質(zhì)濃度為l_5mg/mL， 具體可為lmg/mL ；步驟；3)所述交聯(lián)劑的溶液中交聯(lián)劑濃度為l_5mg/mL，具體可為lmg/mL ； 步驟4)所述熒光素酶的PBS緩沖液中熒光素酶濃度為2-10mg/mL，具體可為ang/mL。步驟2)-4)中所述吸附時間為30-60min。所述模板粒子具體為碳酸鈣粒子。本發(fā)明提供的生物自發(fā)光的微膠囊作為光敏藥物的載體，在載藥的同時可以自動激活光敏劑，從而為身體內(nèi)部腫瘤的治療提供新的途徑。本發(fā)明的再一個目的是提供一種光敏藥物微膠囊及其制備方法。本發(fā)明所提供的光敏藥物微膠囊，由囊芯、包覆所述囊芯的陽離子聚電解質(zhì)層以及包覆所述聚電解質(zhì)層的囊壁組成；其中，所述囊芯為熒光素和光敏藥物組成，所述囊壁由交聯(lián)劑和熒光素酶交替層層組裝構(gòu)成，所述交聯(lián)劑為含有兩個醛基并能保護(hù)所述熒光素酶活性的化合物。其中，所述熒光素酶具體可為螢火蟲熒光素酶、海螢熒光素酶、細(xì)菌熒光素酶等生物熒光素酶。所述交聯(lián)劑具體為部分氧化海藻酸鈉(ADA)，氧化度為60-70%。所述陽離子聚電解質(zhì)層優(yōu)選由聚乙烯亞胺組成(Mw = 50000-100000)。所述光敏藥物為水溶性藥物，其激發(fā)波長在550 580nm。制備所述光敏藥物微膠囊的方法，包括下述步驟1)制備含熒光素和光敏藥物的模板粒子；2)將所述含熒光素和光敏藥物的模板粒子置于陽離子聚電解質(zhì)的PBS緩沖溶液中進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后離心分離并清洗，得到表面包覆陽離子聚電解質(zhì)層的含熒光素和光敏藥物的模板粒子；3)將步驟2)得到的模板粒子置于交聯(lián)劑的PBS緩沖溶液中進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后離心分離并清洗，得到表面吸附交聯(lián)劑層的模板粒子；所述交聯(lián)劑為含有兩個醛基并能保護(hù)所述熒光素酶活性的化合物；4)將步驟3)得到的模板粒子置于熒光素酶的PBS緩沖液中進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后離心分離并清洗，得到表面吸附熒光素酶層的模板粒子；5)以所述步驟幻和4)作為一次組裝處理，重復(fù)所述組裝處理直至得到目標(biāo)層數(shù)；6)溶解步驟幻得到的微膠囊中的模板粒子，得到所述生物自發(fā)光的微膠囊。本發(fā)明使用傳統(tǒng)的層層組裝技術(shù)，巧妙的將酶的催化性能與微膠囊相結(jié)合，得到了具有自發(fā)光性質(zhì)的微膠囊。該微膠囊可用于裝載和激活光敏藥物，解決載體在裝載光敏劑過程中若沒有外加光源時無法被有效激活的缺陷，為光動力治療提供新的更有效的途徑。本發(fā)明提供的具有生物發(fā)光性能且具有良好生物兼容性的藥物載體，是本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)展起來的新型體系，在目前期刊和文獻(xiàn)中并未出現(xiàn)公開過。根據(jù)本發(fā)明的方法制得的含螢火蟲熒光素酶的微膠囊，在Mg2+和ATP存在的條件下，即可自主發(fā)出波長為550 580nm的可見光，而不需要其他外加條件。因此，當(dāng)其裝載光敏藥物時，無需輔助外加光源，在人體生理?xiàng)l件下就可以發(fā)光，從而激活藥物，達(dá)到治療
6的目的。


圖1是層層組裝制備藥物自激活載體的方法示意圖。圖2是生物自發(fā)光微膠囊懸液加入ATP前后的發(fā)光情況對比圖。圖3是生物自發(fā)光微膠囊懸液在加入光敏劑前后的發(fā)光情況對比圖。圖4是包裹光敏劑的微膠囊對宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性柱狀分析圖；其中，(1)代表無任何外加物質(zhì)，(2)代表加入實(shí)施例1制備的無藥物微膠囊，(3)代表加入實(shí)施例2制備的含RB的微膠囊，(4)代表加入對比例1制備的含RB的微膠囊。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，以便于本領(lǐng)域技術(shù)員理解和實(shí)施本發(fā)明，并進(jìn)一步認(rèn)識本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。除非在本發(fā)明說明書中另有定義，否則在此所有的技術(shù)術(shù)語都是根據(jù)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所通常使用和理解的慣用定義來使用。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。囊壁材料的選用本發(fā)明采用的作為發(fā)光膠囊的囊壁材料為螢火蟲熒光素酶和部分氧化的海藻酸鈉(ADA)，氧化度為60-70%。螢火蟲熒光素酶屬于加氧酶，不含金屬和輔酶。在Mg2+，02* ATP存在的條件下，螢火蟲熒光素酶可以催化螢火蟲熒光素生成氧化熒光素，并在這一過程中放出生物光。ADA是用高碘酸鈉氧化海藻酸鈉制備得到的，制備方法簡述如下lg海藻酸鈉溶于40mL去離子水中，加入1. 08g高碘酸鈉，室溫下避光攪拌24h后，加入2mL乙二醇，避光反應(yīng)15min以終止反應(yīng)，產(chǎn)物于4°C下透析至完全除去過量的高碘酸鈉和乙二醇，凍干并真空保存，得到氧化度約為70%的ADA。氧化后的海藻酸鈉生成了活性醛基，具有二醛結(jié)構(gòu)， 是一種毒副作用很小的天然交聯(lián)劑。使用ADA作為交聯(lián)劑交聯(lián)蛋白不僅可以避免傳統(tǒng)交聯(lián)劑對生物體產(chǎn)生的毒害作用，還可以利用海藻酸的特殊結(jié)構(gòu)對熒光素酶進(jìn)行一定程度的保護(hù)，增強(qiáng)體系的生物兼容性并擴(kuò)大其使用范圍。制備生物自發(fā)光藥物載體如附圖1所示，首先將含有螢火蟲熒光素的模板置于聚乙烯亞胺的PBS(0.2M，pH 6.0)緩沖溶液中，吸附一定時間后，離心分離，清洗、去除未吸附的聚電解質(zhì)溶液；然后將上述粒子分別加入蛋白質(zhì)溶液(螢火蟲熒光素酶溶液)和部分氧化海藻酸鈉(ADA)溶液中，吸附一定時間后，離心分離，清洗；重復(fù)上述過程，依次交替吸附蛋白質(zhì)和ADA至所需層數(shù)，除核后即可得到生物自發(fā)光載體。藥物模型本發(fā)明采用一種紅色染料Rose Bengal (RB)作為模型藥物。RB是一種靈敏性較好的水溶性光敏藥物，其微分量子產(chǎn)率Φ Δ 0. 75，激發(fā)波長為550nm，暴露在該波長的光下會產(chǎn)生活性很強(qiáng)的單態(tài)氧，具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。而其激發(fā)波長接近蟲熒光素氧化生物發(fā)光的波長，可被該生物發(fā)光有效的激發(fā)。
蛋白質(zhì)緩沖溶液的配制合適的緩沖溶液可以保護(hù)蛋白質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)從而最大限度的保持其活性。配制一定離子強(qiáng)度(0.2M，pH 6.0)的PBS緩沖溶液，在此條件下螢火蟲熒光素酶的活性可以得到最大程度的保護(hù)，穩(wěn)定性最好。制備生物自發(fā)光藥物載體如附圖1所示，首先將含有螢火蟲熒光素的模板置于聚乙烯亞胺的PBS(0.2M，pH 6.0)緩沖溶液中，吸附一定時間后，離心分離，清洗、去除未吸附的聚電解質(zhì)溶液；然后將上述粒子依次分別加入部分氧化海藻酸鈉(ADA)溶液和蛋白質(zhì)溶液中，吸附一定時間后， 離心分離，清洗；重復(fù)上述過程，依次交替吸附ADA和蛋白質(zhì)至所需層數(shù)，除核后即可得到載有光敏藥物的生物自發(fā)光載體。下述實(shí)施例所用的含有熒光素的模板粒子以及同時含有熒光素和光敏藥物RB的模板粒子均按照文獻(xiàn)所述的共沉淀法制備(參見Biotechnol. Prog.，2005，21，918-925， Protein-Calcium Carbonate Coprecipitation :A Tool for Protein Encapsulation)。實(shí)施例1、制備生物自發(fā)光微膠囊取一定量(SOmg)含有螢火蟲熒光素的CaCO3模板粒子，其中螢火蟲熒光素的含量為 156μΜ，加入 ImL lmg/mL 聚乙烯亞胺(PEI，Mw = 50000-100000)的 PBS 緩沖溶液(0. 2M， PH 6.0)，吸附30min后，3000rpm離心分離;3min，去掉上層多余的PEI，洗滌3次。然后將洗滌后的粒子加入ImL濃度為lmg/mL部分氧化海藻酸鈉(ADA，氧化度70% )的PBS(0. 2M，pH 6. 0)緩沖溶液中，吸附30min后，3000rpm離心分離3min，去掉未被吸附的ADA，洗滌3次。 接著將洗滌后的粒子加入濃度為ang/mL螢火蟲熒光素酶(fLuc)的PBS(0. 2M，pH 6. 0)緩沖溶液中，吸附30min后，3000rpm離心分離3min，去掉未被吸附的fLuc，洗滌3次。重復(fù)8次上述吸附ADA和fLuc的過程，用EDTA溶核，最終獲得所設(shè)計(jì)的生物自發(fā)光微膠囊PEI/(ADA/fLuc)8(如附圖1所示)。取一定量微膠囊分散到含有一定濃度Mg2+，pH 7. 8的甘氨酰甘氨酸緩沖溶液中， 置于石英比色皿，關(guān)閉熒光光譜儀的激發(fā)光源，并測量波長在400 700nm范圍內(nèi)的發(fā)光情況。隨后加入適量ATP溶液，再次測量溶液的發(fā)光情況，并與未加ATP時溶液的發(fā)光情況作對比。如附圖2所示，未加入ATP時，體系無發(fā)光現(xiàn)象，而加入ATP后，可以觀察到體系在 560nm附近出現(xiàn)明顯的發(fā)射峰。發(fā)光機(jī)理見附圖1，并可用如下方程式表示
蟲熒光素酶
蟲熒光素+ΑΤΡ+02->氧化蟲熒光素+AMP+ppi+H20+可見光
Mg2+上述現(xiàn)象說明實(shí)施例1成功地構(gòu)筑了一種具有生物發(fā)光性質(zhì)的微膠囊，在合適條件下不需外界光源激發(fā)即有生物發(fā)光現(xiàn)象。取一定量實(shí)施例1中的微膠囊懸液，置于石英比色皿中，加入適量ATP溶液，關(guān)閉熒光光譜儀的激發(fā)光源，并測量波長在400 700nm范圍內(nèi)的發(fā)光情況；隨后向比色皿中加入適量紅色染料RB溶液，快速混合均勻，立即重新測量波長在400 700nm范圍內(nèi)的發(fā)光情況。比較加入RB溶液前后體系的發(fā)光情況可知，加入RB溶液后，體系在560nm附近的發(fā)光強(qiáng)度顯著降低，如附圖3所示。這一現(xiàn)象說明RB可以吸收微膠囊所發(fā)出的光，從而被有效激發(fā)。實(shí)施例2、制備含RB的生物自發(fā)光微膠囊用含有一定量RB和螢火蟲熒光素的CaCO3為模板(模板中所含RB和螢火蟲熒光素的質(zhì)量比約為1 10)，按照實(shí)施例1的方法，組裝含有光敏藥物RB的生物載體，并測定其在暗光下對癌細(xì)胞的殺傷效果。將處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞置于M孔板中，24h后加入含有光敏藥物RB的生物自發(fā)光微膠囊，共同培養(yǎng)24h后用MTT法測定HeLa的活性，其結(jié)果如附圖4(4)所示。附圖4(1)、( 分別為無任何外加物質(zhì)和加入無藥物微膠囊時的細(xì)胞活性柱狀圖。實(shí)施例3、制備生物自發(fā)光微膠囊取一定量(約80mg)含有海螢熒光素的CaCO3模板，加入ImL lmg/mL聚乙烯亞胺 (PEI，Mw = 50000-100000)的 PBS 緩沖溶液(0. 2M, pH 6. 0)，吸附 30min 后，3000rpm 離心分離3min，去掉上層多余的PEI，洗滌3次。然后將洗滌后的粒子加入ImL濃度為lmg/mL 部分氧化海藻酸鈉(ADA，氧化度70% )的PBS (0. 2M，pH 6. 0)緩沖溶液中，吸附30min后， 3000rpm離心分離3min，去掉未被吸附的ADA，洗滌3次。接著將洗滌后的粒子加入濃度為ang/mL海螢熒光素的PBS (0. 2M，pH 6. 0)緩沖溶液中，吸附30min后，3000rpm離心分離 3min,去掉未被吸附的海螢熒光素，洗滌3次。重復(fù)上述吸附ADA和海螢熒光素的過程，直至所需層數(shù)，用EDTA溶核，最終獲得所設(shè)計(jì)的生物自發(fā)光微膠囊。在無外界光源的條件下分別測量加入Ca2+前后體系的發(fā)光情況。在用EDTA溶核過程中及溶核后，由于存在少量游離Ca2+，體系會出現(xiàn)微弱的發(fā)光現(xiàn)象；而在加入較大量Ca2+ 后，可以觀測到明顯的發(fā)光現(xiàn)象。實(shí)施例4取一定量(約80mg)含有細(xì)菌熒光素的CaCO3模板，加入ImL lmg/mL聚乙烯亞胺 (PEI，Mw = 50000-100000)的 PBS 緩沖溶液(0. 2M, pH 6. 0)，吸附 30min 后，3000rpm 離心分離;3min，去掉上層多余的PEI，洗滌3次。然后將洗滌后的粒子加入ImL濃度為lmg/mL 部分氧化海藻酸鈉(ADA，氧化度70% )的PBS(0. 2M，pH 6. 0)緩沖溶液中，吸附30min后， 3000rpm離心分離3min，去掉未被吸附的ADA，洗滌3次。接著將洗滌后的粒子加入濃度為 2mg/mL細(xì)菌熒光素的PBS(0. 2M，pH 6.0)緩沖溶液中，吸附30mi η后，3000rpm離心分離 3min,去掉未被吸附的細(xì)菌熒光素，洗滌3次。重復(fù)上述吸附ADA和細(xì)菌熒光素的過程，直至所需層數(shù)，用EDTA溶核，最終獲得所設(shè)計(jì)的生物自發(fā)光微膠囊。將組裝后的CaCO3粒子分散到pH 7.0的PBS溶液中，加入少量十四醛的PBS飽和溶液，在用EDTA溶核過程中測定體系的發(fā)光情況。隨著模板的溶解，熒光素酶與熒光素接觸，體系會體現(xiàn)出自發(fā)光性質(zhì)。對比例1按照本發(fā)明的方法，用含有一定量RB和螢火蟲熒光素的CaCO3為模板(模板中所含RB和螢火蟲熒光素的質(zhì)量比約為1 10)，以無自發(fā)光性質(zhì)的物質(zhì)(海藻酸鈉/殼聚糖)為壁材，組裝含有光敏藥物RB的載體，測定其在暗光下對癌細(xì)胞的殺傷效果，并與自發(fā)光膠囊做載體時相比較，如附圖4C3)所示?？梢钥闯?，使用具有生物發(fā)光特性的微膠囊做藥物載體時，體系對癌細(xì)胞的殺傷效果明顯優(yōu)于無發(fā)光性質(zhì)的膠囊。
結(jié)論以含有螢火蟲熒光素的CaCO3為模板，在其表面上層層組裝部分氧化海藻酸鈉和螢火蟲熒光素酶，可以獲得具有生物發(fā)光性質(zhì)的微膠囊，該微膠囊在Mg2+和ATP存在的條件下發(fā)出波長在560nm處的可見光，與光敏藥物RB的吸收波長重疊，從而激活該光敏藥物。盡管本發(fā)明已經(jīng)參照附圖和優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行了說明，但是，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。本發(fā)明的各種更改、變化、和等同物由所附的權(quán)利要求書的內(nèi)容涵蓋。
權(quán)利要求
1.一種生物自發(fā)光微膠囊，由囊芯、包覆所述囊芯的陽離子聚電解質(zhì)層以及包覆所述聚電解質(zhì)層的囊壁組成；其中，所述囊芯為熒光素，所述囊壁由交聯(lián)劑和熒光素酶交替層層組裝構(gòu)成，所述交聯(lián)劑為含有兩個醛基并能保護(hù)所述熒光素酶活性的化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物自發(fā)光微膠囊，其特征在于所述熒光素為螢火蟲熒光素，所述熒光素酶為螢火蟲熒光素酶；所述熒光素為海螢熒光素，所述熒光素酶為海螢熒光素酶；所述熒光素為細(xì)菌熒光素，所述熒光素酶為細(xì)菌熒光素酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物自發(fā)光微膠囊，其特征在于所述交聯(lián)劑為氧化度 60-70%的海藻酸鈉；所述陽離子聚電解質(zhì)層由聚乙烯亞胺組成，所述聚乙烯亞胺的重均分子量優(yōu)選 50000-100000。
4.一種制備權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述生物自發(fā)光微膠囊的方法，包括下述步驟1) 制備含熒光素的模板粒子；2)將所述含熒光素的模板粒子置于陽離子聚電解質(zhì)的PBS緩沖溶液中進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后離心分離并清洗，得到表面包覆陽離子聚電解質(zhì)層的含熒光素的模板粒子；3)將步驟2)得到的模板粒子置于交聯(lián)劑的溶液進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后離心分離并清洗，得到表面吸附交聯(lián)劑層的模板粒子；所述交聯(lián)劑為含有兩個醛基并能保護(hù)所述熒光素酶活性的化合物；4)將步驟3)得到的模板粒子置于熒光素酶的PBS緩沖液中進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后離心分離并清洗，得到表面吸附熒光素酶層的模板粒子；5)以所述步驟幻和4)作為一次組裝處理，重復(fù)所述組裝處理直至得到目標(biāo)層數(shù)；6)溶解步驟幻得到的微膠囊中的模板粒子，得到所述生物自發(fā)光微膠囊。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟幻和步驟4)中所述PBS緩沖溶液為0. 2M、pH 6. 0的PBS緩沖溶液；步驟2)所述陽離子聚電解質(zhì)的PBS緩沖溶液中陽離子聚電解質(zhì)濃度為l_5mg/mL ；步驟3)所述交聯(lián)劑的溶液中交聯(lián)劑濃度為l-5mg/mL;步驟4)所述熒光素酶的PBS緩沖液中熒光素酶濃度為2-10mg/mL ；步驟2)-4)中所述吸附的時間為30-60min ；所述模板粒子為碳酸鈣粒子。
6.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述生物自發(fā)光微膠囊作為光敏藥物載體的應(yīng)用。
7.一種光敏藥物微膠囊，由囊芯、包覆所述囊芯的陽離子聚電解質(zhì)層以及包覆所述聚電解質(zhì)層的囊壁組成；其中，所述囊芯為熒光素和光敏藥物組成，所述囊壁由交聯(lián)劑和熒光素酶交替層層組裝構(gòu)成，所述交聯(lián)劑為含有兩個醛基并能保護(hù)所述熒光素酶活性的化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的光敏藥物微膠囊，其特征在于所述熒光素為螢火蟲熒光素， 所述熒光素酶為螢火蟲熒光素酶；所述熒光素為海螢熒光素，所述熒光素酶為海螢熒光素酶；所述熒光素為細(xì)菌熒光素，所述熒光素酶為細(xì)菌熒光素酶；所述交聯(lián)劑選用氧化度為60-70%的海藻酸鈉；所述陽離子聚電解質(zhì)層由聚乙烯亞胺組成，其中所述聚乙烯亞胺的重均分子量優(yōu)選 50000-100000 ；所述光敏藥物為激發(fā)波長在550 580nm的水溶性藥物。
9.一種制備權(quán)利要求7或8所述光敏藥物微膠囊的方法，包括下述步驟1)制備含熒光素和光敏藥物的模板粒子；2)將所述含熒光素和光敏藥物的模板粒子置于陽離子聚電解質(zhì)的PBS緩沖溶液中進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后離心分離并清洗，得到表面包覆陽離子聚電解質(zhì)層的含熒光素和光敏藥物的模板粒子；3)將步驟2)得到的模板粒子置于交聯(lián)劑的溶液進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后離心分離并清洗，得到表面吸附交聯(lián)劑層的模板粒子；所述交聯(lián)劑為含有兩個醛基并能保護(hù)所述熒光素酶活性的化合物；4)將步驟3)得到的模板粒子置于熒光素酶的PBS緩沖液中進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后離心分離并清洗，得到表面吸附熒光素酶層的模板粒子；5)以所述步驟幻和4)作為一次組裝處理，重復(fù)所述組裝處理直至得到目標(biāo)層數(shù)；6)溶解步驟幻得到的微膠囊中的模板粒子，得到所述光敏藥物微膠囊。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于步驟幻和步驟4)中所述PBS緩沖溶液為0. 2M、pH 6. 0的PBS緩沖溶液；步驟2)所述陽離子聚電解質(zhì)的PBS緩沖溶液中陽離子聚電解質(zhì)濃度為l-5mg/mL;步驟3)所述交聯(lián)劑的溶液中交聯(lián)劑濃度為l_5mg/mL ；步驟4)所述熒光素酶的PBS緩沖液中熒光素酶濃度為2-10mg/mL ；步驟2)-4)中所述吸附的時間為30-60min ；所述模板粒子為碳酸鈣粒子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有自發(fā)光性質(zhì)的微膠囊及其制備方法。本發(fā)明所提供的生物自發(fā)光微膠囊，由囊芯、包覆所述囊芯的陽離子聚電解質(zhì)層以及包覆所述聚電解質(zhì)層的囊壁組成；其中，所述囊芯為熒光素，所述囊壁由交聯(lián)劑和熒光素酶交替層層組裝構(gòu)成，所述交聯(lián)劑為含有兩個醛基并能保護(hù)所述熒光素酶活性的化合物。本發(fā)明賦予藥物載體自發(fā)光特性，解決載體在裝載光敏劑過程中若沒有外加光源時無法被有效激活的缺陷，為光動力治療提供新的更有效的途徑。
文檔編號A61P35/00GK102379860SQ201110310299
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日
發(fā)明者李峻柏, 趙潔 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所