專利名稱：利尿中藥在制備防治骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利尿中藥燈芯草、車前草、車前子、白茯苓的新用途，即在制備治療骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
加尼福尼亞大學(xué)骨質(zhì)研究表明，連續(xù)四周每天攝取食鹽量為6000毫克的婦女對(duì)鈣質(zhì)的吸收量會(huì)從原來(lái)正常的1500毫克減少了 42毫克左右——過(guò)量的Na鹽攝入會(huì)導(dǎo)致血液中鈣含量的降低，從而引發(fā)骨質(zhì)疏松癥。而上皮鈉通道蛋白(印ithelial sodium channel, ENaC)通道是調(diào)節(jié)體內(nèi)鈉鹽的膜蛋白，ENaC廣泛分布在人體細(xì)胞中，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的鈉離子平衡。上皮鈉通道蛋白通道是非電壓門控的阿米洛利敏感性異側(cè)離子通道。ENaC 由四個(gè)同源亞基α、β、Y、δ組成多聚體，多數(shù)的結(jié)構(gòu)為復(fù)合體。阿米洛利是一種上皮細(xì)胞鈉離子通道阻滯藥，一種作用于腎小管遠(yuǎn)端ENaC的保鉀利尿藥。阿米洛利及其衍生物都會(huì)抑制上皮細(xì)胞鈉離子通道。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)阿米洛利的衍生物Wienamil的小分子能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化和礦化。在我國(guó)中藥里面有很多具有清熱利尿作用(與阿米洛利和Wienamil的利尿作用相似)的藥材，但是這方面的藥材作為治療骨質(zhì)疏松癥的用途還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供利尿中藥在制備防治骨質(zhì)疏松癥疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
針對(duì)背景技術(shù)中阿米洛利的衍生物Wienamil的小分子能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化和礦化的啟示，我們從利尿中藥當(dāng)中找到了幾個(gè)和阿米洛利衍生物Wienamil有類似利尿作用的中藥來(lái)做實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)它們是否對(duì)成骨細(xì)胞有影響。本實(shí)驗(yàn)用乳鼠的頭蓋骨來(lái)做成骨細(xì)胞，將不同濃度的車前草、車前子、燈芯草、白茯苓培養(yǎng)成骨細(xì)胞。觀察不同濃度的車前草、車前子、燈芯草、白茯苓對(duì)成骨細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)這幾味中藥具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化的作用，能夠用于制備防治骨質(zhì)疏松癥的藥物。利尿中藥在制備促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和/或促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的藥物中的應(yīng)用，所述利尿中藥為車前草、車前子、燈芯草或白茯苓。利尿中藥在制備抑制OC基因表達(dá)、促進(jìn)Coll-Ia基因表達(dá)和/或促進(jìn)ALP基因表達(dá)的藥物中的應(yīng)用，所述利尿中藥為車前草、車前子或燈芯草。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明證實(shí)了利尿中藥對(duì)于成骨細(xì)胞增殖和分化都具有促進(jìn)作用，并能上調(diào)成骨功能指標(biāo)基因的表達(dá)，對(duì)防治骨質(zhì)疏松癥具有一定的治療作用，提供了利尿中藥的新用途，同時(shí)為骨質(zhì)疏松癥治療提供一種新的候選藥物。


圖1.不同濃度的含藥(車前草、燈芯草、白茯苓)血清刺激下成骨細(xì)胞增殖影響分析圖2.不同濃度含藥(車前子)血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖影響分析圖，其中N. S為生理鹽水； 圖3.不同濃度的含藥(車前草、燈芯草、白茯苓)血清刺激對(duì)成骨細(xì)胞AKP的影響分析
圖4.不同濃度含藥(車前子)血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖影響分析圖，其中N. S為生理鹽水； 圖5.不同濃度的含車前草血清和含燈芯草血清對(duì)成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)影響電泳
圖6.不同濃度的含藥(車前子)血清對(duì)成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)影響的電泳圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1利尿中藥對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響 1.利尿中藥提取液制備
取200g車前草、燈芯草、白茯苓干藥材煮兩次，第一次加入2L蒸餾水，浸泡5min后加熱沸騰30min，過(guò)濾，濾渣加入1. 2L蒸餾水煎煮，沸騰20min，煮完后再過(guò)濾，最終把兩次濾液合并，濃縮成200ml，4°C保存待用。取40g車前子加400ml蒸餾水，浸泡5min，加熱沸騰30min，過(guò)濾，留濾液與濾渣， 回收濾渣，加入400ml蒸餾水煎煮第二次，沸騰20min，過(guò)濾，留濾液。將兩次所得的濾液濃縮成400mL，4°C保存待用。2.含藥血清制備
分別用濃度為lmg/mL的車前草、燈芯草、白茯苓提取液、生理鹽水1日2次灌胃大鼠 (早上9 :00、傍晚17 :00)，每次灌量1 !111710(^。連續(xù)3.5 d。最后一次灌胃1小時(shí)后，動(dòng)物給予乙醚麻醉，心臟穿刺取血，將大鼠血以4000 rpm離心15min取血清，每組血清搖勻，_80°C 保存，用時(shí)過(guò)濾除菌，用無(wú)血清DMEM配成所需濃度的含藥血清培養(yǎng)基。3.成骨細(xì)胞培養(yǎng)
取新生SD大鼠75%酒精浸泡15min處死，沿耳朵兩側(cè)，將皮膚翻開(kāi)，小心剪出頭蓋骨， 置于PBS的培養(yǎng)皿中，并刮除結(jié)締組織及骨膜，直至骨頭發(fā)白。剪碎加入消化液(膠原酶 PBS=20 mg 10 ml)消化，經(jīng)過(guò)兩次37 °C水浴30 min、1500rpm離心7min后棄上清，再37°C 水浴lh，1500 rpm離心7 min，棄上清，即可加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含10%體積胎牛血清的DMEM) 置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后換液，以除去未貼壁血細(xì)胞，此后每3 d換液一次，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)采用0. 25%胰酶消化傳代，以1. OX IO5ceIVmL接種于培養(yǎng)皿中。P2代細(xì)胞開(kāi)始用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM液中添加1X10_2 mol/L β -甘油磷酸鈉、 1X10_8 mol/L地塞米松、50 mg/L維生素C)培養(yǎng)，使頭蓋骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。取P3-P5 代細(xì)胞用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。4.細(xì)胞增殖功能測(cè)定(CCK-8)
步驟3所得細(xì)胞以IXlO4 cell/mL接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)(棄周圍一圈，改加PBS，防止水分丟失)每孔100 yL，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)M h。細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基， 分別加入對(duì)照組培養(yǎng)基(含5%、10%,20%和30%空白血清培養(yǎng)基，按體積百分濃度計(jì)算，下同)100 μ L和含藥血清培養(yǎng)基(含5%、10%,20%和30%車前草血清培養(yǎng)基；含5%、10%,20%和30%燈芯草血清培養(yǎng)基；含5%、10%,20%和30%白茯苓血清培養(yǎng)基)100 μ L，每組平行做6 孔，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d后，用CCK-8試劑盒檢測(cè)，加入10 μ L的CCK-8，37°C 孵育60 min后(車前子組培養(yǎng)池)，在酶標(biāo)儀470 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定各管成骨細(xì)胞吸光度 (OD)值。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。 表1不同濃度含利尿中藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響(CCK-8) 1小時(shí)
組別0% (DMEM)5%血清濃度10%血清濃度20%血清濃度30%血清濃度對(duì)照組0. 372 ±0. 0050. 375±0. 0260. 420±0. 0650. 398 ±0. 0350. 347±0. 012車前草0. 459 ±0. 008**0. 483±0. 0260. 456±0. 0180. 350±0. 016燈芯草0. 533 ±0. 038**0. 410±0. 0180. 437 ±0. 0420. 343 ±0. 026白茯苓0. 496 ±0. 030**0. 470±0. 0600. 418±0. 0550. 339 ±0. 078
注與同濃度對(duì)照組比*ρ<0· 05，**Ρ<0· 01。
表2不同濃度車前子含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響(CCK-8) 2小時(shí)
組別5%血清濃度10%血清濃度20%血清濃度30%血清濃度對(duì)照組0. 923±0. 0580. 854±0. 0390. 824±0. 0420. 797 ±0. 098車前子組0. 918±0. 0590. 950 ±0. 048**1. 000±0. 036**1. 054 ±0. 078**
注與同濃度對(duì)照組比*ρ<0· 05，**Ρ<0· 01。加入藥物干預(yù)培養(yǎng)后，成骨細(xì)胞增殖呈雙向趨勢(shì)，基本在含藥血清濃度為5 10% 時(shí)數(shù)值最高，然后隨著濃度上升，OD值降低。T檢測(cè)結(jié)果顯示，表3中三種清熱利尿藥均都只有含藥血清濃度為5%有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ<0. 01)，且有較明顯的增加作用。雖然三種藥含藥血清10%、20%濃度時(shí)都有促進(jìn)作用，但均無(wú)顯著性差異；含藥血清濃度為30%對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響。而從表2和圖2可以看出，在含車前子血清濃度為10%、20%時(shí)增殖最為明顯。5.細(xì)胞分化功能測(cè)定(AKP)
細(xì)胞接種、分組給藥方法同4，給藥并置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，按堿性磷酸酶(AKP)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)方法，在酶標(biāo)儀520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、表4 ；同時(shí)計(jì)算各管成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶水平，結(jié)果見(jiàn)圖3、 圖4。 表3車前草、燈芯草、白茯苓含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響(AKP)
組別0% (DMEM)5%血清濃度10%血清濃度20%血清濃度30%血清濃度對(duì)照組13.082±0. 64616. 514±0. 64620. 619±1. 00828. 186±3. 30237. 745±1. 701車前草14. 645±1. 52316. 911±1. 595*20. 833 ±2. 999*29. 075 ±1. 933**燈芯草14. 583 ±0. 463*16. 268 ±0. 694**21.293±0. 281*24. 632±0. 159**白茯苓16. 881±0. 21221. 415±0. 93332. 353±3. 78233. 119±3. 927
注與同濃度對(duì)照組比*ρ<0· 05，**Ρ<0· 01。
表4車前子含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響(AKP)
5%血清濃度10%血清濃度20%血清濃度30%血清濃度對(duì)照組6. 603±0. 2056. 607±0. 2857. 399±0. 2027. 156±0. 070車前子6. 906 ±0. 150**7. 392±0. 287**8. 972 ±0. 592**8. 748 ±0. 468**
注與同濃度對(duì)照組比*ρ<0· 05，**Ρ<0· 01。 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與同濃度對(duì)照組比，車前草含藥血清濃度為10%、20%、30%,燈芯草度含藥血清為5%、10%、20%、30%時(shí)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)堿性磷酸酶活性有抑制作用；而白茯苓含藥血清4種濃度對(duì)堿性磷酸酶活性無(wú)影響。加入車前草、燈芯草、白茯苓含藥血清干預(yù)培養(yǎng)后，成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性隨著濃度的增加而升高。但是與同濃度對(duì)照組相比，數(shù)據(jù)都呈現(xiàn)變小趨勢(shì)(見(jiàn)表3)。從表3和圖3得到，車前草、燈芯草對(duì)堿性磷酸酶活性有抑制作用。而從表4和圖4可以看出，車前子對(duì)堿性磷酸酶活性有促進(jìn)作用。6、RT-PCR測(cè)定成骨相關(guān)基因的mRNA表達(dá)
采用RT-PCR方法測(cè)定藥物作用后成骨功能指標(biāo)基因Coll_Ia、0C、ALP、0N表達(dá)
量的變化。成骨細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合時(shí)，分別給予對(duì)照組培養(yǎng)基(含5%、10%空白血清培養(yǎng)基)和含藥血清培養(yǎng)基(分別為含車前子血清、車前草血清、燈芯草血清、白茯苓血清濃度為5%、10%的培養(yǎng)基)，并置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，1Trizol提取總RNA，按 PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄直接合成 DNA。RT-PCR 產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定標(biāo)本的灰度值，與內(nèi)參照β-actin灰度值比較，相對(duì)定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。從圖5可以看出，2. 5%、5%、10%濃度的含車前草血清和含燈芯草血清對(duì)ColI-Ia基因有較明顯促表達(dá)作用；濃度為10%的含燈芯草血清抑制OC基因表達(dá)，其他濃度對(duì)OC基因表達(dá)無(wú)影響。濃度為2. 5%的含車前草血清和含燈芯草血清較明顯促進(jìn)ALP基因表達(dá)。 t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，濃度為10%的含燈芯草血清抑制OC基因表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)；而濃度為2. 5%的含燈芯草血清較明顯促進(jìn)ALP基因表達(dá)(ALP/β -actin)，也有顯著性差異 (P<0. 05)。圖6顯示，濃度為5%的車前子含藥血清能明顯上調(diào)OC、ALP、Osteopontin的表達(dá)水平(與β-actin灰度值比較進(jìn)行相對(duì)定量)，與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.01 ； P<0. 05 ；P<0. 01)，濃度為10%的含車前子血清亦能促進(jìn)ALP基因的表達(dá)，與空白對(duì)照組相比有極顯著的差異(P<0. 01)。
權(quán)利要求
1.利尿中藥在制備治療骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用，所述利尿中藥為車前草、車前子、燈芯草或白茯苓。
2.利尿中藥在制備促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和/或促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的藥物中的應(yīng)用，所述利尿中藥為車前草、車前子、燈芯草或白茯苓。
3.利尿中藥在制備抑制OC基因表達(dá)、促進(jìn)Coll-Ia基因表達(dá)、促進(jìn)ALP基因表達(dá)和/ 或促進(jìn)Osteopontin基因表達(dá)的藥物中的應(yīng)用，所述利尿中藥為車前草、車前子或燈芯草。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了利尿中藥在制備治療骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用，屬于傳統(tǒng)中藥的新用途。本發(fā)明采用利尿中藥車前草、車前子、燈芯草和白茯苓分別培養(yǎng)成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)于成骨細(xì)胞增殖和分化都具有促進(jìn)作用，并能上調(diào)成骨功能指標(biāo)基因的表達(dá)，對(duì)防治骨質(zhì)疏松癥具有一定的治療作用，提供了利尿中藥的新用途，同時(shí)為骨質(zhì)疏松癥治療提供一種新的候選藥物。
文檔編號(hào)A61P19/10GK102228573SQ20111017419
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者盧麗, 李青南, 楊國(guó)柱, 陸幸妍, 陳珺 申請(qǐng)人:廣東藥學(xué)院