專利名稱：miR-29吸收序列、吸收載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及miR-29吸收載體的制備及應(yīng)用，尤其是miR-29相關(guān)疾病中的應(yīng)用，例如在細(xì)菌感染(尤其是胞內(nèi)菌感染)中的效應(yīng)、作用機(jī)制、實施方法和用途。
背景技術(shù)：
Mi croRNA (miRNA)是長約20 24nt、非編碼的微小RNA，它們通過抑制mRNA翻譯或者促進(jìn)mRNA降解對靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控(Bartel，D. P.，Cell. 2004,116 281-297)。MiRNA幾乎控制著每一個生物學(xué)過程，包括細(xì)胞的分化、發(fā)育、增殖和凋亡。此夕卜，miRNA表達(dá)水平失調(diào)與腫瘤等疾病也密切相關(guān)(Lu，J.等，Nature. 2005，435 :834-838 ；Li, Q. J.等，Cell. 2007，129 :147-161 ；Cheng, H. Y.等，Neuron. 2007,54 :813-829 ；Ch·ang,T. C.等，Mo I Cell. 2007,26 :745-752 ；He, L.等，Nature. 2005，435 :828-833 ；Care, A.等，Nat Med. 2007，13 :613-618)。在諸多已被廣泛報道的miRNA中，miR-29應(yīng)該算是一種明星分子，根據(jù)已有的50多個miR-29相關(guān)的報道中，其作用涉及了腫瘤、血液造血系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕病、糖尿病、皮膚病、病毒感染以及骨分化、肌肉分化和肌肉相關(guān)疾病等諸多人類重大疾病，這也從一個側(cè)面體現(xiàn)出這種miRNA在生理病理過程中發(fā)揮的
重要作用。此外，即便在腫瘤中，miR-29也體現(xiàn)出截然不同的功能，它既可作為癌基因，亦可被視為抑癌基因。同時，根據(jù)計算機(jī)預(yù)測結(jié)果，miR-29可以靶向免疫信號通路中的多個信號分子或者接頭蛋白而參與免疫反應(yīng)和免疫細(xì)胞分化和發(fā)育過程的調(diào)控。急性髓性白血病病人的外周血淋巴細(xì)胞中，miR-29表達(dá)下調(diào)(Garzon, R.等，Blood. 2009,114 5331-5341)，miR-29b的寡核苷酸模擬物已被證明可靶向凋亡、細(xì)胞周期和增殖等多條通路而可用于治療急性髓性白血病(Garzon,R.等，Blood. 2009，114 :6411-6418 ；Garzon,R.等，Blood. 2009，114 :5331-5341)。申請人之前的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染如李斯特菌、結(jié)核分支桿菌感染后，NK和T細(xì)胞被活化而其中的miR-29a表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步實驗證實，抑制細(xì)胞內(nèi)源性的miR-29a可促進(jìn)這些細(xì)胞產(chǎn)生更多的IFN-Y，而IFN-Y在機(jī)體抗胞內(nèi)菌過程中至關(guān)重要。MiRNA吸收載體或者miRNA誘餌載體，能夠通過吸收或扣押內(nèi)源性的目的miRNA而實現(xiàn)抑制miRNA的功能，miRNA吸收載體的抑制功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于化學(xué)合成的寡核苷酸抑制劑(Ebert, M. S.和 Sharp, P. A.，RNA. 2010，16 :2043-2050)。并且，相對于化學(xué)合成的寡核苷酸抑制劑，miRNA吸收載體在應(yīng)用時具有很多優(yōu)勢比如可以制備成病毒載體而在難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因高表達(dá)，甚至在體內(nèi)高表達(dá)該載體；可以用于制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系或者轉(zhuǎn)基因動物模型；可以通過更換細(xì)胞特異性的啟動子而使其在某些細(xì)胞中特異性表達(dá)；其次，由于它可以同時吸收同一家族的miNRA，故比只能吸收完全互補的某一種miRNA的寡核苷酸抑制劑更加強(qiáng)大，更能避免miRNA的功能冗余現(xiàn)象；miRNA吸收載體較化學(xué)修飾的miRNA抑制劑價格便宜、穩(wěn)定性高。IFN-Y是Thl細(xì)胞標(biāo)志性的細(xì)胞因子，在抗感染免疫，尤其是抗李斯特菌和抗結(jié)核桿菌相關(guān)的固有免疫和獲得性免疫中起著至關(guān)重要的作用(Schoenborn，J. R.和Wilson, C. B. , Adv Immunol. 2007,96 :41-101)。李斯特菌存在于日常食物中，對免疫缺陷或者免疫耐受的人來說是潛在的危險，因為李斯特菌能誘導(dǎo)敗血癥和腦膜炎，還能引起孕婦的膿毒性流產(chǎn)(Pamer，E.G.，Nat RevImmunol. 2004,4 :812-823)。李斯特菌感染早期的防御主要靠NK細(xì)胞分泌的IFN- Y以及隨之活化的巨噬細(xì)胞(Pamer, E. G.，Nat Rev Immunol. 2004,4 :812-823)。結(jié)核病已是全球最主要的公共衛(wèi)生問題之一，但有效預(yù)防和治療的手段尚待開發(fā)(Corbett,E. L.等,Arch Intern Med. 2003,163 :1009-1021)。結(jié)核分支桿菌的致死性主要與細(xì)菌的增殖、過度的炎癥和繼發(fā)的組織損傷相關(guān)(North，R. J.和Jung，Y. J.，Annu RevImmunol. 2004，22 :599-623 ；Dorhoi,A.等，J Exp Med. 2010，207 :777-792)，而宿主抗結(jié)核 菌的免疫反應(yīng)主要靠Thl細(xì)胞(Mogues, T.等，J Exp Med. 2001，193 :271-280)。因此，結(jié)核菌持續(xù)性感染的機(jī)制以及如何有效激活免疫系統(tǒng)以抵抗結(jié)核菌的研究，將有助于設(shè)計、應(yīng)用結(jié)核菌的防治策略。在多個動物模型以及人類疾病中已充分證實Thl細(xì)胞及其分泌的IFN-Y在抗結(jié)核分支桿菌感染過程中起主要作用(Redford, P. S.等，Eur J Immunol. 2010,40 2200-2210)。另一方面，IFN-Y也參與了某些免疫疾病的病理過程。因此，探討調(diào)控IFN-Y的機(jī)制，可以幫助我們了解怎樣更好地保護(hù)機(jī)體抗胞內(nèi)病原菌感染，以及限制過度炎癥反應(yīng)引起的組織損傷。本領(lǐng)域中迫切需要開發(fā)出有效治療或預(yù)防m(xù)iR-29相關(guān)疾病(尤其是感染或結(jié)核病等)的新藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一正是提供了一種miR-29吸收序列或載體，及其在有效抵抗細(xì)菌感染、預(yù)防和治療胞內(nèi)菌感染性疾病中的新用途。本發(fā)明的另一目的是提供這種新型miR-29新型載體的作用原理及在抗胞內(nèi)菌感染過程中的免疫學(xué)原理。本發(fā)明的又一目的是提供了這種新型吸收載體在抗細(xì)菌感染中的用途和實施策略，特別是應(yīng)用于胞內(nèi)菌感染導(dǎo)致的炎癥、Thl型反應(yīng)、結(jié)核等疾病的預(yù)防和治療。本發(fā)明提供的miR-29吸收載體可以促進(jìn)胞內(nèi)菌感染后IFN-Y的產(chǎn)生，減少肝臟、肺臟、脾臟等臟器中細(xì)菌的殘留量，提高機(jī)體的存活率。在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種miR-29吸收載體，其攜帶從5’至3’依次包含如下元件的表達(dá)盒(a) II型啟動子；(b)指示蛋白編碼序列；(c)miR-29吸收序列，所述吸收序列是4 10次重復(fù)的、與miR-29部分互補或完全互補的序列；(d)任選的增強(qiáng)子序列。在一優(yōu)選例中，miR-29吸收載體中的表達(dá)盒自5’至3’依次為UBC啟動子、eGFP指不蛋白及其在終止碼后插入的miR-29吸收序列。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述II型啟動子優(yōu)選UBC、CAG、PGK、CMV啟動子。在一個優(yōu)選例中，所述UBC啟動子優(yōu)選為Human Ubiquitin C序列(SEQ ID NO:18)或其同源序列。在另一個優(yōu)選例中,所述啟動子是細(xì)胞特異性啟動子或廣泛表達(dá)的啟動子。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述指示蛋白選自熒光蛋白、螢光素酶或者表達(dá)標(biāo)簽。在一個優(yōu)選例中，所述指示蛋白選自綠色熒光蛋白GFP、紅色熒光蛋白RFP、螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶、表達(dá)標(biāo)簽HA或Flag，優(yōu)選綠色熒光蛋白GFP，其激發(fā)波長為488nm,發(fā)射波長為509nm。在另一個優(yōu)選例中，所述指示蛋白為增強(qiáng)型綠色螢光蛋白eGFP。在另一個優(yōu)選例中，所述指示蛋白的分子量為8 60kD，優(yōu)選15 30kD。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述吸收序列與miR-29的互補比例為78 % 84%。在一個優(yōu)選例中，所述吸收序列與miR-29的9 12位堿基不互補。在另一個優(yōu)選例中，所述吸收序列同時與miR_29a、miR_29b、miR_29c部分互補。在另一個優(yōu)選例中，miR-29吸收序列的重復(fù)次數(shù)為4 10次，優(yōu)選7次。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述miR-29吸收序列選自下組如SEQ ID NO 3所示的序列；由SEQ ID NO :3所示序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸、且具有預(yù)防或治療miR-29過表達(dá)相關(guān)疾病和/或征狀的活性的序列；或它們的互補序列。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述吸收載體選自質(zhì)粒、曬菌體或病毒載體，優(yōu)選病毒載體，如慢病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在一個優(yōu)選例中，所述miRNA吸收載體是慢病毒載體，其特征在于，該慢病毒載體還包含慢病毒的包裝所必須的序列。在另一個優(yōu)選例中，所述miR-29吸收載體為帶有慢病毒結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因的慢病毒載體，其中miR-29吸收序列亞克隆至該慢病毒載體的多克隆位點。在本發(fā)明的第二方面中，提供了本發(fā)明miR-29吸收載體或miR-29吸收序列在制備用于預(yù)防或治療miR-29過表達(dá)相關(guān)疾病和/或癥狀中的用途。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述miR-29過表達(dá)相關(guān)疾病和/或癥狀選自腫瘤、血液造血系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕病、糖尿病、皮膚病、病毒感染以及骨分化、肌肉分化和肌肉相關(guān)疾病,優(yōu)選細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述的細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀為選自下組的疾病或征狀細(xì)菌感染后導(dǎo)致的敗血癥、腦膜炎、膿毒性流產(chǎn)；過度的炎癥和繼發(fā)的組織損傷；細(xì)菌的過度增殖導(dǎo)致的菌血癥、多器官功能衰竭；肺結(jié)核或者其它器官的結(jié)核征狀，優(yōu)選所述的細(xì)菌感染是由選自下組的一種或多種細(xì)菌引起的李斯特菌、結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌、布氏桿菌等胞內(nèi)寄生菌。在另一個優(yōu)選例中，所述的細(xì)菌為李斯特菌、結(jié)核分支桿菌。在另一個優(yōu)選例中，所述的器官為肺臟、肝臟和脾臟。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種藥物組合物，其包含(A)預(yù)防或治療有效量的miR-29吸收載體或其吸收序列；和(B)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在一個優(yōu)選例中，在給予本發(fā)明的藥物組合物之前、同時或之后，給予具有預(yù)防或治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)。在一個優(yōu)選例中，所述藥物組合物還包含任選的一種或多種預(yù)防或治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)。所述具有預(yù)防或治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀活性的其它活性物質(zhì)選自臨床常用抗生素(包括β -內(nèi)酰胺類(青霉素類和頭孢菌素類)、氨基糖甙類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)脂類、抗真菌抗生素、抗結(jié)核類抗生素)的一種或多種。在一個優(yōu)選例中，所述藥物組合物的制劑形式適于選自下組的給藥方法直接裸DNA注射法、脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法、復(fù)制缺陷病毒(腺病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒)攜帶目的DNA法。在另一個優(yōu)選例中，所述藥物組合物中miR-29吸收載體或其吸收序列占藥物組合物總重量的O. 001 99. 9wt %,優(yōu)選I 95wt %,更優(yōu)選5 90wt %,更優(yōu)選10 80wt%。在本發(fā)明的另一方面中，提供了一種預(yù)防或治療細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀的方法，所述方法包括給予需要預(yù)防或治療的對象有效量的miR-29吸收載體或其吸收序 列。在一個優(yōu)選例中，所述細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀為選自下組的一種或多種因細(xì)菌感染引起的疾病和/或征狀細(xì)菌感染后導(dǎo)致的敗血癥、腦膜炎、膿毒性流產(chǎn)；過度的炎癥和繼發(fā)的組織損傷；細(xì)菌的過度增殖導(dǎo)致的菌血癥、多器官功能衰竭；肺結(jié)核或者其它器官的結(jié)核征狀。在另一優(yōu)選例中，所述的炎癥因子為選自下組的一種或多種TNF_a，IL_1，IL_6，
I型干擾素，IFN- Y，iNOS，優(yōu)選 TNF- a，IL-6，iNOS。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)菌為李斯特菌、結(jié)核分支桿菌。在另一優(yōu)選例中，所述的器官為肺臟、肝臟和脾臟。本發(fā)明所提供的優(yōu)選的miR-29吸收載體，其核心部分?jǐn)y帶UBC啟動子，eGFP指示蛋白，以及7次重復(fù)的、與miR-29a部分互補的miR-29吸收序列。該載體能在細(xì)胞內(nèi)或者小鼠體內(nèi)有效地抑制內(nèi)源性的miR-29，其抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于商業(yè)化的寡核苷酸抑制劑，是一種高效的、具有良好應(yīng)用前景的miRNA抑制性載體。在本發(fā)明的一個實施方式中，miR-29吸收載體能有效抵抗細(xì)菌感染、預(yù)防和治療胞內(nèi)菌感染性疾病。在一個優(yōu)選例中，所述的細(xì)菌為李斯特菌和結(jié)核桿菌。在另一個優(yōu)選例中，所述的感染性疾病為敗血癥、腦膜炎、膿毒性流產(chǎn)；過度的炎癥和繼發(fā)的組織損傷；細(xì)菌的過度增殖導(dǎo)致的菌血癥、多器官功能衰竭；肺結(jié)核或者其它器官的結(jié)核征狀。在本發(fā)明的又一方面內(nèi)容中，提供這種新型miR-29吸收載體的作用原理及在抗胞內(nèi)菌感染過程中的免疫學(xué)原理。miR-29吸收載體可以通過促進(jìn)IFN-Y的產(chǎn)生從而增強(qiáng)機(jī)體抗細(xì)菌感染的能力。在本發(fā)明的又一方面內(nèi)容中提供了這種新型的miR-29吸收載體在抗細(xì)菌感染中的用途和實施策略，特別是應(yīng)用于胞內(nèi)菌感染導(dǎo)致的炎癥、Thl型反應(yīng)、結(jié)核等疾病的預(yù)防和治療。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I :李斯特菌(LM)和卡介苗(BCG)感染小鼠后各免疫細(xì)胞IFN-Y表達(dá)上調(diào)而miR-29a表達(dá)下調(diào)。圖1A、IB分別為LM注射小鼠腹腔0h、24h和48h后脾臟細(xì)胞和NK細(xì)胞中IFN- Y mRNA和miR_29a mRNA的表達(dá)水平。圖1C、ID分別為BCG皮下注射小鼠OcU 14d后脾臟細(xì)胞和T細(xì)胞中IFN-YmRNA和miR_29a mRNA的表達(dá)水平(“**”，P < O. 01)。圖2 miR-29吸收載體能上調(diào)EL4細(xì)胞和⑶4+T細(xì)胞的IFN- Y分泌量。圖2A為在T-bet基因轉(zhuǎn)染的EL4細(xì)胞中，miR-29吸收載體(pGS29)或其對照載體(Ctrl)轉(zhuǎn)染并用PMA/伊屋諾霉素(ionomycin)刺激24h、48h后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-Y的含量。圖2B為LV-29sp0nge(克隆了 miR-29吸收序列的慢病毒)或其對照慢病毒LV-Ctrl感染后的Thl細(xì)胞在CD3抗體再次刺激6h后IFN- Y的胞內(nèi)染色結(jié)果(“**，，，P < O. 01)。圖3 :野生型小鼠和miR-29吸收載體的轉(zhuǎn)基因小鼠(GS29小鼠)免疫細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)水平比較。圖3A和圖3B分別為Northern blot和qPCR檢測野生型小鼠和GS29小鼠的NK細(xì)胞、⑶4+T細(xì)胞、⑶8+T細(xì)胞中miR_29a的表達(dá)水平，內(nèi)參照均為U6mRNA ( “*，，，P < O. 05)。圖4 :野生型小鼠和GS29小鼠各免疫細(xì)胞經(jīng)刺激后IFN- Y分泌能力的比較。圖4A為各PMA/伊屋諾霉素，IL-12/IL-18，Poly (I C)刺激野生型或GS29小鼠的NK細(xì)胞6h后上清中IFN- Y的分泌量。圖4B為來源于野生型或GS29小鼠的⑶4+T細(xì)胞在ThN、Thl培養(yǎng)體系下培養(yǎng)3d后，上清中IFN-Y的分泌量。圖4C為來源于野生型或GS29小鼠的⑶8+T細(xì)胞活化3d后，上清中IFN- Y的分泌量(“**，，，P < O. 01)o圖5 :李斯特菌(LM)感染小鼠模型驗證miR-29吸收載體的功能。圖5A為LM感染野生型小鼠或GS29小鼠指定天數(shù)后的存活率(ffilcoxon test, P < O. 05)。圖5B為LM 感染野生型小鼠或GS29小鼠2d后脾臟、肝臟中的細(xì)菌負(fù)荷量；圖5C為LM感染野生型小鼠或GS29小鼠24h、48h后外周血血清中的IFN- Y水平；圖為LM感染野生型小鼠或GS29小鼠24h后，脾臟NK細(xì)胞的IFN-Y胞內(nèi)染色結(jié)果(“**，，，P < 0.01)。圖6 LM感染野生型小鼠和GS29小鼠后腹腔巨噬細(xì)胞炎性基因的表達(dá)水平比較。圖6A，B, C依次為LM感染野生型小鼠和GS29小鼠后腹腔巨噬細(xì)胞24h、48h后，TNF-α，IL-6和iNOS mRNA水平的qPCR檢測結(jié)果，β -actin作為內(nèi)參照(“#”，P < 0. 01)。圖7 :卡介苗(BCG)感染小鼠模型驗證miR-29吸收載體的功能。圖7A為BCG腹腔感染野生型小鼠或GS29小鼠30d后PH)再次免疫后腳背腫脹程度的比較；圖7B為BCG腹腔感染野生型小鼠或GS29小鼠30d后，分離脾臟中的⑶4+T和⑶8+T細(xì)胞用⑶3抗體再次刺激6h后，IFN- Y的胞內(nèi)染色結(jié)果。圖7C為BCG腹腔感染野生型小鼠或GS29小鼠30d后用PBS或PH)再次免疫后腳掌切片顯示的炎癥細(xì)胞浸潤情況。圖7D為BCG靜脈感染野生型小鼠或GS29小鼠30d后，肺臟中BCG的菌落計數(shù)結(jié)果(ffilcoxon test, P < 0· 05)，(“**，，，P < O. 01)。圖8 :結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染小鼠模型驗證miR-29吸收載體的功能。圖8A為H37Rv感染野生型小鼠或GS29轉(zhuǎn)基因小鼠30d，分離其肺臟中⑶4+T和⑶8+T細(xì)胞后，IFN- Y的胞內(nèi)染色結(jié)果。圖8B為H37Rv感染野生型小鼠或GS29轉(zhuǎn)基因小鼠指定天數(shù)后，小鼠的存活率(Wilcoxon test, P < O. 05)。圖8C為H37Rv感染野生型小鼠或GS29轉(zhuǎn)基因小鼠21d后，肺臟中H37Rv的菌落計數(shù)結(jié)果(“#”，P < O. 01)。圖9 :pGS29載體的設(shè)計與制備。圖9A為miR_29a，b，c的同源性比較以及miR-29吸收(miR-29sponge)序列設(shè)計；圖9B為pGS29載體設(shè)計圖，UBC為啟動子，GFP primer和GS-29primer為鑒定引物，Tthlll I為線性化酶切位點；圖9C為pGS29載體和其對照載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后RT-PCR鑒定GFP和GS-29序列的表達(dá)情況。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，成功構(gòu)建了能在體外顯著抑制miR-29功能的新型miRNA吸收載體。發(fā)明人還將miR-29的吸收序列亞克隆至第三代慢病毒載體，包裝成慢病毒，感染難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞(如T細(xì)胞)后成功高表達(dá)miR-29吸收序列。并且，發(fā)明人還通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將miR-29的吸收載體線性化后插入小鼠基因組中，成功實現(xiàn)體內(nèi)敲減miR-29的功能。通過大量的體外實驗和動物模型實驗，本發(fā)明人證實了 miR-29吸收載體在細(xì)菌感染性疾病中，能有效地增強(qiáng)機(jī)體抵抗細(xì)菌感染能力，通過促進(jìn)IFN-Y的產(chǎn)生，增強(qiáng)肝臟、肺臟、脾臟等臟器中細(xì)菌的清除率，提高機(jī)體的生存率。由此，進(jìn)一步證實了 miR-29吸收載體對miR-29相關(guān)疾病的治療效果。在此基礎(chǔ)上本發(fā)明人完成了本項發(fā)明。
具體而言，針對干擾素進(jìn)行的應(yīng)用研究是分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點，將干擾素的核苷酸和蛋白質(zhì)應(yīng)用于免疫相關(guān)疾病的預(yù)防和治療是人工干預(yù)細(xì)菌性感染的有效技術(shù)，因此無論是在功能基因組研究，還是感染相關(guān)的基因治療方面均具有廣闊地應(yīng)用前景。發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)miR-29吸收載體可以促進(jìn)II型干擾素IFN- Y的產(chǎn)生。在李斯特菌感染模型中，觀察到miR-29吸收載體能顯著上調(diào)血清中IFN-Y的水平，減少肝臟、脾臟中李斯特菌的殘留量，并明顯地延長小鼠的存活時間，提示miR-29吸收載體可能具有治療李斯特菌感染相關(guān)疾病的應(yīng)用前景。在卡介苗BCG感染模型中，我們發(fā)現(xiàn)miR-29吸收載體能增強(qiáng)小鼠的Thl型反應(yīng)，表現(xiàn)為再次用PH)免疫的小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的遲發(fā)型過敏反應(yīng)，脾臟T細(xì)胞中產(chǎn)生較多的IFN-Y且肺臟中殘留的BCG也較少，提示miR-29吸收載體能促進(jìn)機(jī)體清除結(jié)核分支桿菌。在野生型的結(jié)核分支桿菌H37Rv感染模型中，miR-29吸收載體能減少肺臟中H37Rv的殘留量，延長小鼠的生存期，結(jié)合BCG的實驗結(jié)果，說明miR-29吸收載體在抗結(jié)核治療中有潛在的應(yīng)用價值。綜合以上動物模型實驗，我們已表明miR-29吸收載體能可以應(yīng)用于胞內(nèi)菌感染相關(guān)疾病的預(yù)防和治療，尤其對李斯特菌感染和結(jié)核桿菌感染具有明顯的應(yīng)用價值。本發(fā)明針對miR-29吸收載體，對各種細(xì)胞模型和免疫細(xì)胞在胞內(nèi)菌感染條件下的IFN-Y的產(chǎn)生進(jìn)行了研究，并且驗證了 miR-29吸收載體能促進(jìn)IFN-Y，抵抗胞內(nèi)菌感染。實驗證明I)胞內(nèi)菌如李斯特菌和卡介苗BCG感染后，miR-29a和IFN-Y的表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系，miR-29a可能調(diào)控IFN- Y的產(chǎn)生；2)miR_29吸收載體能上調(diào)T_bet轉(zhuǎn)染的EL4細(xì)胞中IFN- Y的分泌量，高表達(dá)miR-29吸收序列的Thl中IFN- Y +的細(xì)胞比例較高；3)miR-29吸收載體促進(jìn)NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生較多的IFN-Y ;4)miR-29吸收序列能上調(diào)IFN- Y的表達(dá)從而促進(jìn)機(jī)體對李斯特菌的清除能力，增強(qiáng)機(jī)體抗李斯特菌的感染能力；5)miR-29吸收載體能促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)較高水平的TNF-a、IL-6和iNOS mRNA，產(chǎn)生較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)；6)miR-29吸收序列在體內(nèi)高表達(dá)后能增強(qiáng)機(jī)體的遲發(fā)型過敏反應(yīng)，并促進(jìn)清除結(jié)合分支桿菌；7)miR-29吸收序列在體內(nèi)高表達(dá)后能有效地促進(jìn)結(jié)核分支桿菌H37Rv的清除能力，對肺結(jié)核這種人類重大疾病可能有治療作用。
本發(fā)明針對miR-29吸收載體或miR-29吸收序列，用以抵抗胞內(nèi)菌感染所致的相關(guān)疾病如敗血癥、腦膜炎、結(jié)核等。這些發(fā)明證實miR-29吸收載體或者miR-29吸收序列可望成為治療和預(yù)防細(xì)菌性感染尤其是胞內(nèi)菌感染的有效手段。miR-29吸收序列、miR-29吸收載體如本文所用，術(shù)語“miR-29吸收序列”包括所有與已知的miR_29a部分互補或完全互補的、四 十次重復(fù)(優(yōu)選七次重復(fù))的人工合成序列，可被稱為miR-29sponge序列或者miR-29deCOy序列，這些序列的共有特征是能吸收內(nèi)源性的miR-29而減少其與真正靶基因的結(jié)合機(jī)會，從而抑制miR-29的功能，即miR-29吸收序列的功能類似于競爭性抑制劑。miR-29的序列可從microRNA. org網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫獲得，miR-29吸收序列根據(jù)miR_29a成熟體的序列設(shè)計并需實驗優(yōu)化。本發(fā)明所涉及的miR-29吸收序列可以全部人工合成，也可以通過部分合成在PCR擴(kuò)增后獲得。
如本文所用，術(shù)語“miR-29吸收載體”指的是所有能在細(xì)胞內(nèi)或者體內(nèi)有效地表達(dá)miR-29吸收序列從而抑制內(nèi)源性miR-29功能的載體，其作用一般優(yōu)于商業(yè)化的化學(xué)合成的寡核苷酸序列?！癿iR-29吸收載體”中的啟動子選擇至關(guān)重要，因為它直接決定了 miR-29吸收序列的表達(dá)量、表達(dá)特異性或者表達(dá)時間，進(jìn)而對內(nèi)源性miR-29進(jìn)行時空和效率上進(jìn)行調(diào)控。某些啟動子在體內(nèi)還會被某些反饋機(jī)制修飾而沉默掉，而不利于miR-29吸收序列的長期穩(wěn)定表達(dá)。所以啟動子的優(yōu)化是miR-29吸收載體制備過程中關(guān)鍵的一環(huán)?？梢赃m合適用于本發(fā)明核心序列的啟動子可以是任一種II型啟動子，可以是組成型啟動子或誘導(dǎo)性啟動子，既可以要求細(xì)胞特異性也可以是廣泛表達(dá)的啟動子。較佳地，該啟動子是組成型的強(qiáng)啟動子，且制備轉(zhuǎn)基因動物模型時不會被體內(nèi)的反饋機(jī)制沉默而失活，如UBC、CAG等啟動子是較佳的選擇。啟動子的強(qiáng)弱直接決定了目的miRNA吸收序列的表達(dá)量，進(jìn)一步影響了敲減內(nèi)源性miRNA的效率。當(dāng)然，可以根據(jù)需要，選擇誘導(dǎo)性啟動子或者細(xì)胞特異性啟動子。較佳地，UBC啟動子是較符合在細(xì)胞或者小鼠體內(nèi)穩(wěn)定、高效并廣泛表達(dá)miR-29吸收序列的強(qiáng)啟動子，這是我們比較多種II型啟動子的實驗效果后得出的結(jié)論。然而，需要指出的是，我們列出的UBC啟動子序列是人泛素C(human ubiquitin C, SEQ ID NO :14)啟動子的部分序列，可采用更長或者更短的序列，也可以改變部分堿基獲得相似或者更適合的啟動子序列?？稍诒景l(fā)明的啟動子之后加入指示蛋白編碼序列，以便于檢測。適用于本發(fā)明的指示蛋白可以是任一種熒光蛋白、螢光素酶或者表達(dá)標(biāo)簽。較佳地，該指示蛋白分子量不要太大(范圍為15kD 30kD為佳)，因為插入片段過長，會影響轉(zhuǎn)錄的效率，同時該指示蛋白必須方便檢測，最好能用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或共聚焦纖維鏡清晰地觀察現(xiàn)象。另外，還可miRNA吸收載體中加入其它調(diào)控元件(如增強(qiáng)子、操縱子或定位序列)，以使得本發(fā)明的載體可更為有效的表達(dá)吸收序列。例如在miRNA吸收載體核心部分的miRNA吸收序列之后接上一段增強(qiáng)子序列，以使得miRNA吸收序列能在胞內(nèi)或者體內(nèi)更強(qiáng)地表達(dá)。優(yōu)選的增強(qiáng)子可為SV-40增強(qiáng)子。
_7] 慢病毒載體的構(gòu)建和慢病毒的包裝、滴度測定、感染可采用本領(lǐng)域中常用的介導(dǎo)基因表達(dá)的載體，例如慢病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒載體或質(zhì)粒、噬菌體等非病毒載體，使得所述吸收序列在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。
可采用本領(lǐng)域中已知的方法來構(gòu)建本發(fā)明的載體。例如,可參考王培堂等人翻譯的《分子克隆實驗指南》(第三版，科學(xué)出版社，2002)中所記載的方法、或采用市售試劑盒根據(jù)廠商的說明書進(jìn)行操作。例如，慢病毒是目前介導(dǎo)目的基因高表達(dá)的最有效的方式，幾乎可以感染所有哺乳動物細(xì)胞，包括非分裂細(xì)胞和大多數(shù)的模式生物。慢病毒載體可以作為普通載體通過一般的基因轉(zhuǎn)染方式在常規(guī)細(xì)胞系內(nèi)實現(xiàn)低度到中度地表達(dá)目的基因。然而，通過將慢病毒載體包裝成慢病毒，可以實現(xiàn)在難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中高效地轉(zhuǎn)移基因，尤其是在原代細(xì)胞、干細(xì)胞和分化細(xì)胞中特別凸顯其優(yōu)勢。表達(dá)載體與感染后的細(xì)胞基因組整合，從而長期穩(wěn)定地表達(dá)靶基因。 慢病毒表達(dá)系統(tǒng)主要有三個成分組成慢病毒表達(dá)載體(穿梭載體)，慢病毒包裝載體(骨架載體和被膜載體)，以及慢病毒包裝細(xì)胞系(如293T細(xì)胞、293FT細(xì)胞或293TN 細(xì)胞)。本發(fā)明中所采用的慢病毒載體由貓免疫缺陷病毒改造而來(SBI公司的新型pCDF載體，貨號為⑶111B-1)，其3’LTR的U3區(qū)域缺失，故自體失活。一旦慢病毒整合到基因組后，其5’LTR的啟動子失活，阻止了病毒顆粒的復(fù)制成分的形成。慢病毒載體在包裝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，CMV/FIV 5’ LTR驅(qū)動病毒骨架成分蛋白和必要的功能蛋白轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)(如Psi，RRE和cPPT)，當(dāng)病毒的被膜蛋白在293T細(xì)胞中共表達(dá)時，P⑶F轉(zhuǎn)錄本被有效地包裝入假病毒顆粒中。分離這些病毒顆粒后，P⑶F的表達(dá)盒以RNA的形式可以被有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)入哺乳動物靶細(xì)胞中。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，表達(dá)盒被逆轉(zhuǎn)錄并整合入細(xì)胞的基因組中。本發(fā)明的P⑶F慢病毒載體含有EFla啟動子介導(dǎo)的eGFP基因,便于病毒感染細(xì)胞的篩選。關(guān)于該病毒成分的具體信息和操作見SBI公司的試劑說明書(P⑶Fl-MCS2-EFl-copGFP，貨號⑶111B-1)。目前的慢病毒載體主要指第二代和第三代慢病毒載體，其主要區(qū)別為是否具有單獨啟動子的5’ LTR0對于人免疫缺陷病毒為基礎(chǔ)的慢病毒載體，其第二代慢病毒載體為三質(zhì)粒系統(tǒng)，其第三代慢病毒載體為四質(zhì)粒系統(tǒng)。本發(fā)明所用的慢病毒載體以貓免疫缺陷病毒為基礎(chǔ)，是三質(zhì)粒系統(tǒng)的第三代慢病毒載體。無論是哪種免疫缺陷病毒為基礎(chǔ)的慢病毒載體，均最大限度地考慮了其安全性，即3’ LTR的U3區(qū)缺失及5’ LTR上游的CMV啟動子分別保證其自體失活和復(fù)制缺陷。本發(fā)明將miR-29吸收載體的GFP基因及其下游的miR-29吸收序列克隆至P⑶F的多克隆位點處，經(jīng)測序驗證后的穿梭載體連同骨架載體、被膜載體共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，超速離心收集病毒顆粒。溶解病毒顆粒后倍比稀釋在293T細(xì)胞中根據(jù)GFP細(xì)胞的比例測定病毒滴度。已知滴度的病毒顆粒按照MOI約10 I的濃度感染靶細(xì)胞(10個病毒I個細(xì)胞)，感染效率達(dá)40% 60%。成功實現(xiàn)在原代的難轉(zhuǎn)染細(xì)胞中高表達(dá)miRNA吸收序列，并可對高表達(dá)細(xì)胞篩選后與其余對照細(xì)胞進(jìn)行對比，探討該miRNA吸收序列的功能。已知滴度的病毒顆粒按照MOI約I : I 100 1，優(yōu)選10 I的濃度感染靶細(xì)胞(10個病毒I個細(xì)胞)，感染效率達(dá)40% 60 %。成功實現(xiàn)在原代的難轉(zhuǎn)染細(xì)胞中高表達(dá)miRNA吸收序列，并可對高表達(dá)細(xì)胞篩選后與其余對照細(xì)胞進(jìn)行對比，探討該miRNA吸收序列的功能。本發(fā)明優(yōu)選第三代慢病毒載體，并帶上獨立啟動子介導(dǎo)的熒光蛋白，插入目的miRNA吸收序列后而抑制miRNA功能，進(jìn)行隨后的功能探索。
應(yīng)理解，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在閱讀了本發(fā)明的說明書以及具體的實施例之后，可根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體或系統(tǒng)或者采用本領(lǐng)域中的常識和常規(guī)技術(shù)手段對該表達(dá)載體或系統(tǒng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑?，例如采用各種指示蛋白或啟動子、加入其它調(diào)控序列(如增強(qiáng)子和定位序列)等。載體、宿主及轉(zhuǎn)基因動物本發(fā)明還涉及包含miR-29的吸收載體，以及用該載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及通過轉(zhuǎn)基因獲得高表達(dá)miR-29吸收序列的轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明中，術(shù)語“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、動物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒或其它載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件?！け绢I(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含miR-29吸收序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄。吸收載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。本發(fā)明中優(yōu)選使用pUBC-eGFP載體、pCDF慢病毒載體及其相關(guān)的慢病毒系統(tǒng)。此外，吸收載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；動物細(xì)胞等。在本發(fā)明中，優(yōu)選采用大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞、小鼠淋巴細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。本發(fā)明中術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動物”、或“轉(zhuǎn)化動物”可互換使用，均指通過常規(guī)轉(zhuǎn)基因的方法獲得的轉(zhuǎn)入本發(fā)明miR29吸收載體并穩(wěn)定高表達(dá)miR-29吸收序列的細(xì)胞、器官、組織或個體。轉(zhuǎn)基因小鼠是研究miRNA體內(nèi)功能的有效策略，且本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因小鼠實現(xiàn)了內(nèi)源性miRNA的功能抑制，更接近于在生理濃度下研究目的miRNA的功能，實驗結(jié)果明顯優(yōu)于miRNA體內(nèi)高表達(dá)的模型。制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠可為例如提供miR-29吸收載體；用該miR-29吸收載體顯微注射小鼠受精卵，并將其分別移植到假孕母鼠輸卵管；待所述母鼠生產(chǎn)小鼠后，檢驗并獲得轉(zhuǎn)基因陽性小鼠；任選使所述轉(zhuǎn)基因陽性小鼠與其它小鼠配對以產(chǎn)生后代。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述的組合物含有有效量的本發(fā)明的miR-29吸收載體或miR-29吸收序列，以及藥學(xué)上可接受的載體。在較佳的實施方案中，所述藥物組合物可用于治療與現(xiàn)有技術(shù)中已知可治療或預(yù)防細(xì)菌感染性疾病，例如細(xì)菌感染后導(dǎo)致的敗血癥、腦膜炎、膿毒性流產(chǎn)；過度的炎癥和繼發(fā)的組織損傷；細(xì)菌的過度增殖導(dǎo)致的菌血癥、多器官功能衰竭；肺結(jié)核或者其它器官的結(jié)核征狀。如本文所用，術(shù)語“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”。如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學(xué)》 (Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解齊ij、潤滑劑、助流齊 、泡騰齊 、潤濕劑或乳化劑、矯味劑、PH緩沖物質(zhì)等。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。本發(fā)明的組合物中miR-29吸收載體或miR-29吸收序列有效成分占組合物總重量的O. 001 99. 9wt% ;優(yōu)選為組合物總重量的I 95wt%，較優(yōu)選為5 90wt%，更優(yōu)選10 80wt%。余量為藥學(xué)上可接受的載體以及其它添加劑等物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“單位劑型”是指為了服用方便，將本發(fā)明的組合物制備成單次服用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，所述組合物為單位劑型或多劑型，且其中miR-29吸收載體或miR-29吸收序列的含量為O. 01 2000mg/劑，優(yōu)選O. I 1500mg/劑，更優(yōu)選I IOOOmg/劑。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選例中，每天施用I 6劑本發(fā)明的組合物，優(yōu)選施用I 3劑；最優(yōu)選的，每天服用的劑量為I齊U。應(yīng)理解,所用miR-29吸收載體或miR-29吸收序列的有效劑量可隨待施用或治療的對象的嚴(yán)重程度而變化。具體情況根據(jù)對象的個體情況(例如對象體重、年齡、身體狀況、所需達(dá)到的效果)來決定，這在熟練醫(yī)師可以判斷的范圍內(nèi)。本發(fā)明的組合物，可以為固態(tài)(如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或液態(tài)(如口服液)或其它合適的形狀。給藥途徑可采用(1)直接裸DNA注射法；(2)將miR-29吸收載體或miR-29吸收序列與轉(zhuǎn)鐵蛋白/多聚L-賴氨酸復(fù)合物連接，以增強(qiáng)其生物效應(yīng)；(3)miR-29吸收載體或miR-29吸收序列與帶正電荷的脂類形成復(fù)合物，以克服磷酸骨架負(fù)電荷所致的穿越細(xì)胞膜的困難；(4)用脂質(zhì)體包裹miR-29吸收載體或miR-29吸收序列后介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，既有利于大分子的順利進(jìn)入又免受細(xì)胞外各種酶的水解作用；
(5)miR-29吸收載體或miR-29吸收序列與膽固醇結(jié)合使其胞漿保持時間增加10倍；(6)用免疫脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運miR-29吸收載體或miR-29吸收序列可使其特異性轉(zhuǎn)運至靶組織和靶細(xì)胞；(7)將miR-29吸收載體或miR-29吸收序列體外轉(zhuǎn)染給轉(zhuǎn)載細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)也可較好地將miR-29吸收載體或miR-29吸收序列相關(guān)藥物載入靶細(xì)胞內(nèi)；(8)電打孔(electroporation),即借助于電流將miR-29吸收載體或miR-29吸收序列導(dǎo)入祀細(xì)胞。此外，本發(fā)明的組合物中還可含有用于改善和治療細(xì)菌感染性疾病的其它活性物質(zhì)，所述的其它活性物質(zhì)選自下組臨床常用抗生素(包括β_內(nèi)酰胺類(青霉素類和頭孢菌素類)、氨基糖甙類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)脂類、抗真菌抗生素、抗結(jié)核類抗生素)的一種或多種。本發(fā)明的miR-29吸收載體或miR-29吸收序列相互間可以聯(lián)合應(yīng)用，還可以與其它藥物和治療手段聯(lián)合，用于細(xì)菌感染性疾病尤其是胞內(nèi)菌感染的預(yù)防和治療。本發(fā)明的優(yōu)點I、本發(fā)明揭示了一種新型的miR-29吸收載體及其應(yīng)用，尤其是在抗細(xì)菌感染(優(yōu)選抗胞內(nèi)菌感染)中的作用，miR-29吸收序列在小鼠體內(nèi)高表達(dá)后能促進(jìn)機(jī)體對李斯特菌和結(jié)核分支桿菌的清除率，增強(qiáng)機(jī)體的抗感染能力并延長這些胞內(nèi)菌感染小鼠的存活時間。 2、本發(fā)明闡明了 miR-29吸收載體抗胞內(nèi)菌感染的機(jī)制，即miR-29吸收載體通過抑制內(nèi)源性miR-29的功能，上調(diào)IFN- Y的表達(dá)，增強(qiáng)IFN- Y介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用，從而對胞內(nèi)菌感染后機(jī)體起保護(hù)作用。3、本發(fā)明舉例說明了 miR-29吸收載體或類似的miRNA吸收載體的應(yīng)用方法，即可通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)基因技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)或者體內(nèi)高表達(dá)相應(yīng)miRNA吸收序列，達(dá)到抑制內(nèi)源性目的miRNA的功能。4、本發(fā)明還提供了一種能有效抑制細(xì)菌感染，尤其是某些胞內(nèi)菌感染的新型基因藥物，即miR-29吸收載體。該基因藥物可能對李斯特菌或者結(jié)核菌感染病人有治療作用，既能保護(hù)病人免受這些胞內(nèi)菌感染，又能增強(qiáng)病人對這些胞內(nèi)菌的清除能力。實施例下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件(如王培堂等人翻譯的《分子克隆實驗指南》第三版，科學(xué)出版社，2002 ;基本細(xì)胞操作均參照王培堂等人翻譯的《細(xì)胞培養(yǎng)實驗指南》第一版，科學(xué)出版社，2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例I :李斯特菌(LM)和卡介苗(BCG)感染小鼠后免疫細(xì)胞內(nèi)IFN-Y表汰上調(diào)而miR_29a表達(dá)下調(diào)LM和BCG的培養(yǎng)、計數(shù)和感染李斯特菌毒力株(LM，ATCC 19111的單核增生性李斯特菌，由上海復(fù)祥生物科技有限公司代購)，在含5 μ g/mL紅霉素的BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌處于對數(shù)生長期時，對培養(yǎng)基中的細(xì)菌原液進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋后，涂于含有紅霉素的BHI瓊脂板，在37°C培養(yǎng)過夜后，通過克隆計數(shù)計算原液中的集落形成單位數(shù)(CFU)。每只小鼠腹腔注射5 X IO4CFU的LM，感染指定時間后，分離小鼠脾臟細(xì)胞及其中的NK細(xì)胞(用DX5的磁珠標(biāo)記后進(jìn)行磁珠分選)。
結(jié)核分支桿菌BCG (丹麥823D2株)購自北京生物制品研究所，在米德爾7H9培養(yǎng)基(Difco，Detroit, Ml)中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌處于對數(shù)生長期時，對培養(yǎng)基中的細(xì)菌原液進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋后，涂于含有10%過氧化氫酶葡萄糖酸(DifC0，Detr0it，MI)和O. 05%Tween 80 (上海生工生物工程有限公司)的米德爾7H9瓊脂板。BCG感染時，將5X IO6CFU的BCG溶于PBS后皮下注射到小鼠中。感染指定天數(shù)后，分離小鼠脾臟細(xì)胞及其中的T淋巴細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分別用抗CD4、抗CD8的磁珠標(biāo)記后進(jìn)行磁珠分選)。IFN- Y和miR_29a的定量檢測脾臟細(xì)胞和免疫細(xì)胞的總RNA用TRIzoI (購自Invitrogen公司，貨號為15596-018)或者miRNeasy Mini Kit (購自Qiagen公司，貨號為217004)，具體提取步驟參見相關(guān)試劑盒的說明書。qPCR分析用LightCycler儀器以及SYBR RT-PCR試劑盒。
定量PCR的結(jié)果顯示，在LM感染后小鼠脾臟細(xì)胞和NK細(xì)胞中IFN-Y mRNA上調(diào)而miR-29a下調(diào)(圖1A、B);類似地，在BCG感染后的小鼠脾臟細(xì)胞和T細(xì)胞中IFN-Y mRNA上調(diào)而miR-29a下調(diào)(圖1C、D)。該結(jié)果提示胞內(nèi)菌如LM和BCG感染后，miR_29a和IFN-Y的表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系，miR-29a可能調(diào)控IFN-Y的產(chǎn)生。實施例2 miR-29吸收載體h調(diào)EL4和Thl細(xì)朐中IFN- Y的產(chǎn)牛A. miR-29吸收載體的制備miR-29吸收載體(pGS29)是一種能吸收內(nèi)源性miR_29a，b，c的新型miRNA抑制齊U，其核心部分從5’至3’端依次為UBC啟動子、綠色熒光蛋白eGFP以及在eGFP終止碼下游插入的miR-29吸收序列，其中所述的miR-29吸收序列特征是7次重復(fù)的、與miR_29a部分互補的人工合成序列。miR-29吸收載體制備具體如下(所用的限制性內(nèi)切酶、Taq酶和pMD19_T載體均購自Takara公司)
miR-29吸收載體插入片段合成以及擴(kuò)增含有7個重復(fù)的miR-29 sponge插入片段(圖9A-B)用以下兩個化學(xué)合成的片段經(jīng)過PCR反應(yīng)后獲得片段I (SEQ ID NO : I):5，-TAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTA-3’ ；片段2 (SEQ ID NO :2):5，-TAGCACCAAGAAAATCGGTTATAGCACCAAGAAAATCGGTTATAGCACCAAGAAAATCGGTTATAGCACCAAGAAAATCGGTTATAGCA-3，所得miR_29sponge插入片段共147bp,其序列(SEQ ID NO 3)如下TAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTATAACCGATTTTCTTGGTGCTA反應(yīng)體系為加入2μ I的100 μ M的片段I和片段2，以及PCR反應(yīng)所需的premixEx Taq(Takara, cat no.D332A)。反應(yīng)條件如下98°C 10s，55°C 30s，72°C 15s，5個循環(huán)后再用72°C延伸lOmin。膠回收PCR產(chǎn)物克隆插入pMD19-T載體成為pMD19T-miR-29sponge載體(TA克隆法，即PCR產(chǎn)物末端帶A，而pMD19-T載體帶有T的粘端，連接PCR產(chǎn)物和pMD19_T片段即可)。
DIRES2-EGFP載體改造pIRES 2-EGFP 購自 Clontech 公司。I. PUBC-IRES2-EGFP 的制各 首先將其CMV啟動子換成UBC啟動子(human ubiquitin-C promoter),用以下引物在 ΗΕΚ293Τ 細(xì)胞 cDNA 中用高保真酶 PrimerSTAR(Takara，cat no. DR010S)擴(kuò)增 UBC 啟動子上游引物(SEQID NO 4)5， -TAGTTATTAATGTCTAACAAAAAAGCC-3，下游引物(SEQID NO : 5)5， -GAAGATCTGGCCTCCGCGCCGGGTT-3，劃下劃線處為酶切位點和保護(hù)堿基；反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，其中5XPrimerSTAR緩沖液5 μ 1，dNTP混合物 2μ1;模板 cDNA O. 2 μ g, PrimerSTAR HS DNA 聚合酶 O. 25 μ 1，上下游引物各 O. 5 μ 1，ddH20 補齊至 25 μ I。反應(yīng)參數(shù)為98°C10s，56°C 10s，72°C 75s，40 個循環(huán)后 72°C延伸 lOmin。上、下游引物分別引入PShB I和Bgl II酶切位點。膠回收以上PCR產(chǎn)物、用pShB I和Bgl II雙酶切之并連入經(jīng)過同樣雙酶切的PIRES2-EGFP載體中。至此，該載體改造為pUBC-IRES2-EGFP。2. PUBC-EGFP-IRES2-EGFP 的制各用高保真酶PrimerSTAR(Takara，cat no. DR010S)擴(kuò)增 pIRES2_EGFP 中的 GFP 片段上游引物(SEQID NO 6)5， -CGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3，下游引物(SEQID NO 7)5’ CGGGATCCCATGGACGAGCTGTACAAGCC-3’劃下劃線處為酶切位點和保護(hù)堿基。反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，其中5 XPrimerSTAR緩沖液5 μ 1，dNTP混合物 2μ1;模板 cDNA 0. 2 μ g, PrimerSTAR HS DNA 聚合酶 O. 25 μ 1，上下游引物各 O. 5 μ 1，ddH20 補齊至 25 μ I。反應(yīng)參數(shù)為98°C10s，55°C 10s，72°C 45s，40 個循環(huán)后 72°C延伸 lOmin。上、下游引物分別引入EcoR I和BamH I酶切位點。膠回收以上PCR產(chǎn)物、用EcoR I和BamH I雙酶切之并連入經(jīng)過同樣雙酶切的PUBC-IRES2-EGFP載體中。至此，該載體改造為pUBC-EGFP-IRES2-EGFP。擴(kuò)增miR-29 SOonge七重復(fù)片段.及GS29載體的構(gòu)建用高保真酶PrimerSTAR (Takara, cat no. DR010S)、以以下引物在pMD19-miR-29sponge 載體中擴(kuò)增 miR-29 sponge 七重復(fù)片段上游引物(SEQID NO 8)5’ -CGGGATCCATGACTTGCATGCCTGCAGGTCGACG-3’下游引物(SEQID NO 9)5， -AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCC-3，劃下劃線處為酶切位點和保護(hù)堿基。 反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，其中5 XPrimerSTAR緩沖液5 μ 1，dNTP混合物 2μ1;模板 cDNA 0. 2 μ g, PrimerSTAR HS DNA 聚合酶 O. 25 μ 1，上下游引物各 O. 5 μ 1，ddH20 補齊至 25 μ I。反應(yīng)參數(shù)為98°C10s，58°C 10s，72°C 30s，40 個循環(huán)后 72°C延伸 lOmin。上、下游引物分別引入BamH I和Not I酶切點位。膠回收以上PCR產(chǎn)物、用BamH I和Not I雙酶切之并連入經(jīng)過同樣雙酶切的PUBC-EGFP-IRES2-EGFP載體中(此時已將EGFP-IRES2切除，并留出粘端以連接miR-29 sponge重復(fù)序列)。至此pGS29載體改造完畢，其特征為UBC啟動子后帶有GFP表達(dá)序列，并在GFP基因的3’ UTR區(qū)帶有7個miR-29 sponge的重復(fù)片段。將pGS29載體或其對照載體pUBC_IRES2_EGFP轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞，24h后用GFP和GS-29引物，qRT-PCR檢測GFP基因和miR-29 sponge序列的表達(dá)情況說明pGS29載體構(gòu)建成功(圖9C)，其中鑒定引物分別為GFP primer 上游引物(SEQ ID NO 10)5’ -GTGACCACCCTGACCTACGG-3’下游引物(SEQID NO 11)5’ -CTGCTTGTCGGCCATGATAT-3’GS-29primer 上游引物(SEQ ID NO 12)5，-GAGCAAAGACCCCAACGAGAAG-3，GS-29primer 下游引物(SEQ ID NO 13)5，-TCTACAAATGTGGTATGGCTGAT-3，。B. miR-29吸收載體的慢病毒包裝將miR-29吸收序列連同上游的eGFP序列插入到由貓免疫缺陷病毒改造而來的慢病毒P⑶F載體中(購自SBI公司，貨號為⑶111B-1)，即可獲得含miR-29吸收序列的慢病毒載體，按照相應(yīng)的操作說明書，在293T細(xì)胞中可包裝出能在原代細(xì)胞或大部分組織中介導(dǎo)miR-29吸收序列高表達(dá)的慢病毒顆粒。具體而言
PLV-GS29慢病毒載體的構(gòu)建用EcoR I和Not I雙酶切pGS29載體，膠回收分子量較小的片段(含有GFP基因及7個miR-29 sponge重復(fù)序列)，連入經(jīng)過同樣酶切的pCDFl-MCS2-EFl_copGFP慢病毒載體(該慢病毒載體購自SBI公司，cat no.⑶111B-1)，經(jīng)測序驗證pLV_GS29載體構(gòu)建成功。慢病毒包裝、濃縮和原代T細(xì)胞感染簡述之，轉(zhuǎn)染前一天在IOcm培養(yǎng)皿中鋪3 X IO6個的293T細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后用8ml37°C預(yù)熱培養(yǎng)基換液。將10 μ g包裝載體混合物(pFIV-34N pVSV_G摩爾比為I : 1，購自SBI公司，貨號為LV100A-1)及4 μ g帶有目的基因的穿梭載體(LV-Ctrl或LV-29sp0nge，前者為P⑶Fl載體，購自SBI公司，貨號為⑶11IB-I ;后者為在P⑶Fl載體的多克隆插入位點中(BamH I和Not I)插入了七次重復(fù)的miR-29吸收序列)加入到Iml OMEM中，混合均勻，加入線性25kDa PEI 50 μ I充分混勻后室溫靜置15min (具體步驟可參見PolyscienceIncorporation 的 Linear PEI 說明書，#23966-2)。將質(zhì)粒和PEI的混合溶液均勻地加入到293T細(xì)胞，8h后換液，加入IOml新鮮DMEM培養(yǎng)基。再48 72小時后先低速離心3000rpm 5min去除細(xì)胞碎片，O. 45 μ m濾器過濾后25，000rpm，2h，4°C超速速離心收獲病毒沉淀，用100 μ I無血清培養(yǎng)基重懸沉淀，重懸過程為每隔15min，4°C晃動離心管一次，2h左右徹底溶解病毒沉淀。分裝病毒于_80°C保存，并取一小部分測定滴度。(慢病毒詳細(xì)包裝說明見System Biosciences公司的“LentivectorExpression Systems Guide to Packaging and Transduction of Target Cells，，)。
C. EL4和T細(xì)胞中miR-29吸收序列的高表達(dá)EL4細(xì)胞轉(zhuǎn)染用核轉(zhuǎn)試劑盒用Kit-L(購自Lonza公司)，程序為Amaxa, C-009。按照試劑盒說明書，將T-bet表達(dá)載體和miR-29吸收載體pGS29 (或其對照載體Ctrl，即PUBC-IRES2-EGFP)共轉(zhuǎn)入EL4細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后12h換液加PMA/伊屋諾霉素(25ng/ml PMA和500ng/ml伊屋諾霉素)刺激24h或48h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA檢測IFN- Y的分泌量。分離小鼠脾臟中⑶4+T細(xì)胞，按病毒顆粒數(shù)與靶細(xì)胞數(shù)10 I (Μ0Ι = 10 I)比例加入靶細(xì)胞培養(yǎng)皿中并加入polybrene，使其終濃度為6μ g/ml，12h后更換培養(yǎng)基去除polybrene及游離的病毒顆粒，再在Thl培養(yǎng)體系中培養(yǎng)60h后取靶細(xì)胞用PMA/伊屋諾霉素再次刺激6h，分選出GFP+的細(xì)胞后再用胞內(nèi)染色FACS檢測IFN- Y +的細(xì)胞比例。ELISA和FACS結(jié)果顯示，miR-29吸收載體能上調(diào)T-bet轉(zhuǎn)染的EL4細(xì)胞中IFN-Y的分泌量(圖2A);類似地高表達(dá)miR-29吸收序列的Thl中IFN-Y +的細(xì)胞比例較高(圖2B)。該結(jié)果提示miR-29能抑制IFN- Y的產(chǎn)生，miR-29吸收載體能抑制內(nèi)源性miR-29的功能，從而上調(diào)IFN-Y的表達(dá)。實施例3 miR-29吸收載體的轉(zhuǎn)基因小鼠(GS29小鼠)的NK細(xì)胞和T細(xì)胞中miR_29a表達(dá)下調(diào)GS29小鼠的構(gòu)建內(nèi)切酶Tthlll I線性化miR-29吸收載體pGS29并回收DNA后，委托上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司進(jìn)行胚胎顯微注射，簡述之轉(zhuǎn)基因小鼠是通過外源基因的受精卵雄原核注射獲得，供體受精卵取自C57BL/6J(早)與CBA( ^ )的雜交一代。在此次轉(zhuǎn)基因小鼠制備過程中，我們共獲得385枚注射卵，這些卵分別移植到15只假孕母鼠的輸卵管中，其中14只母鼠懷孕，移植成功率為93. 33%，小鼠出生總數(shù)119只，經(jīng)基因組DNA的PCR檢測，其中5小鼠為陽性，陽性率為4. 20%。這些轉(zhuǎn)基因陽性小鼠被稱作Founder，即首建鼠。首建鼠與野生型C57BL/6J配對后產(chǎn)出Fl代。剪尾后提基因組PCR檢測其miR-29吸收序列確定其是否為成功插入外源基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。
GS29小鼠NK細(xì)胞和T細(xì)胞中miR_29a的檢測分離野生型小鼠和GS29小鼠脾臟中的NK細(xì)胞、⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞，提取這些細(xì)胞的 RNA, Northern Blot 和 qPCR(參考Livak, KJ.等，Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and the 2_Δ Δ Ct method.Methods. 2001 ；25 =402-408])檢測其中的miR_29a，并用U6作為內(nèi)參照。比較GS29小鼠和野生型小鼠NK細(xì)胞和T細(xì)胞中miR-29a mRNA表達(dá)水平，得到以下結(jié)果GS29小鼠的NK細(xì)胞、⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞中的miR-29amRNA表達(dá)較低(圖3A、B)。該結(jié)果提示miR-29吸收序列在體內(nèi)高表達(dá)后除了吸收內(nèi)源性miR-29外，還可能會通過某些機(jī)制下調(diào)內(nèi)源性miR-29的表達(dá)。實施例4 GS29小鼠的NK細(xì)朐和T細(xì)朐活化后產(chǎn)牛較多的IFN- YNK細(xì)胞的活化 野生型小鼠或GS29小鼠的脾臟細(xì)胞用DX5的磁珠抗體標(biāo)記后磁珠分選NK細(xì)胞，相同數(shù)目的細(xì)胞鋪板后用PMA/伊屋諾霉素(購自Sigma公司，終濃度為25ng/ml PMA,500ng/ml 伊屋諾霉素)、IL-12/IL-18 (購自 Biolegend 公司，終濃度均為 10ng/ml)、TLR3配體Poly (I C)(購自Sigma公司，終濃度為10 μ g/ml)刺激6小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測上清中的IFN-Y的分泌量。CD4+T細(xì)胞的活化用Dako MoFIoTM XDP分選CD44lQCD62LhiCD4+的初始T細(xì)胞(細(xì)胞純度達(dá)到97%以上)，用于誘導(dǎo)培養(yǎng)各種輔助⑶4+T細(xì)胞。抗⑶Sdyg/ml、購自Biolegend公司)、抗⑶28 (2 μ g/ml購自Biolegend公司)或者抗原(0VA蛋白或肽由上海生工生物工程有限公司合成)沖擊后的DC與流式分選出的T細(xì)胞共孵育，并在不同的極化條件下培養(yǎng)(ThN細(xì)胞極化條件不加任何細(xì)胞因子和阻斷性抗體；Thl細(xì)胞極化條件10 μ g/ml抗IL-4抗體，10ng/ml IL-12和50U/ml IL-2)。誘導(dǎo)3天后，離心去除誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用包被好的抗CD3抗體再次刺激這些細(xì)胞24小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測上清中的IFN- Y的分泌量。CD8+T細(xì)胞的活化CDS+T細(xì)胞抗CD8的磁珠標(biāo)記后進(jìn)行磁珠分選，流式細(xì)胞儀檢測相應(yīng)的表面標(biāo)志表明其純度達(dá)90%以上?？耿? (I μ g/ml)、抗⑶28 (2 μ g/ml)活化這些⑶8+T 3天后，離心去除誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用包被好的抗⑶3抗體再次刺激這些細(xì)胞24小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測上清中的IFN-Y的分泌量。通過比較野生型小鼠和GS29小鼠NK細(xì)胞或T細(xì)胞活化IFN-Y的分泌量，得出GS29小鼠的NK細(xì)胞和T細(xì)胞活化后產(chǎn)生較多的IFN- Y (圖4)。這些結(jié)果提示miR-29吸收序列在體內(nèi)高表達(dá)后,可能通過上調(diào)IFN-Y的表達(dá)而促進(jìn)胞內(nèi)菌的清除能力，增強(qiáng)機(jī)體抗胞內(nèi)菌的感染能力。
_9] 實施例5 =GS29小鼠具有較強(qiáng)的抗李斯特菌感染的能力李斯特菌的感染和臟器中細(xì)菌計數(shù)李斯特菌毒力株(LM，ATCC 19111的單核增生性李斯特菌，由上海復(fù)祥生物科技有限公司代購)，在含5 μ g/mL紅霉素的BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌處于對數(shù)生長期時，對培養(yǎng)基中的細(xì)菌原液進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋后，涂于含有紅霉素的BHI瓊脂板，在37°C培養(yǎng)過夜后，通過克隆計數(shù)計算原液中的集落形成單位數(shù)(CFU)。每只小鼠腹腔注射5X IO4CFU的LM，感染指定天數(shù)后，計數(shù)小鼠死亡率，計算生存曲線。取感染3天后小鼠脾臟在5ml
O.05%的Triton X-100中研磨、裂解，然后進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋后，涂于含有紅霉素的BHI瓊脂板，在37°C培養(yǎng)過夜后，通過克隆計數(shù)計算脾臟和肝臟中LM的CFU。取感染24小時、48小時后小鼠摘取眼球取血檢測外周血上清中IFN-Y的蛋白水平。分離感染24小時后小鼠脾臟NK細(xì)胞，細(xì)胞因子胞內(nèi)染色(所用試劑盒購自BD公司)測IFN-Y +細(xì)胞比例。李斯特菌感染野生型小鼠和GS29小鼠后IFN- Y產(chǎn)生能力的比較GS29小鼠在李斯特菌感染后，存活率明顯高于野生型小鼠(圖5A)，感染3天的小鼠中，GS29小鼠肝臟和脾臟中的李斯特菌菌落數(shù)量明顯少于野生型小鼠(圖5B)。感染I天、2天的小鼠中，GS29小鼠外周血中IFN-Y蛋白水平較高(圖5C)。感染I天后，GS29小鼠NK細(xì)胞IFN- Y +細(xì)胞比例較高(圖OT)。以上結(jié)果說明，GS29小鼠具有較強(qiáng)的抗李斯特菌感染的能力，提示miR-29吸收序 列能上調(diào)IFN- Y的表達(dá)而促進(jìn)李斯特菌的清除能力，增強(qiáng)機(jī)體抗李斯特菌的感染能力。實施例6:李斯特菌感染后GS29小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)較高水平的炎性基因mRNA李斯特菌的感染方式同實施例5，野生型小鼠或GS29小鼠感染李斯特菌24小時或者48小時后，沖出其腹腔巨噬細(xì)胞，鋪在培養(yǎng)皿中貼壁I小時后，PBS洗去未貼壁細(xì)胞，Trizol 裂解已貼壁細(xì)胞,提取其總 RNA,定量 PCR( [Livak, KJ.等，Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and the 2_Δ Δ Ct method.Methods. 2001 ；25 :402-408)檢測 TNF-a ,IL-6 和 iNOS mRNA 水平。qPCR 結(jié)果顯示 GS29小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)較高水平的TNF-a、IL-6和iNOS mRNA,即產(chǎn)生較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，這與GS29小鼠有較強(qiáng)的抗李斯特菌能力密切相關(guān)。實施例7 :卡介苗BCG感染后GS29小鼠產(chǎn)牛較強(qiáng)的Thl反應(yīng)BCG感染和DTH模型結(jié)核分支桿菌BCG (丹麥823D2株)購自北京生物制品研究所，在米德爾7H9培養(yǎng)基(Difco，Detroit，MI)中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)菌處于對數(shù)生長期時，對培養(yǎng)基中的細(xì)菌原液進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋后，涂于含有10%過氧化氫酶葡萄糖酸(DifC0，Detr0it，MI)和0. 05%Tween 80 (上海生工生物工程有限公司)的米德爾7H9瓊脂板。BCG感染時，將5X IO6CFU的BCG溶于PBS后尾靜脈或者皮下注射到小鼠中。為了研究抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，在小鼠感染BCG 28天后用純化的蛋白衍生物PB)測試其DTH反應(yīng)(遲發(fā)型超敏反應(yīng))。簡述之，BCG腹腔注射感染小鼠28天后，在右足墊注射10 μ g (溶于50 μ I PBS中)，而左足墊注射50μ1 PBS作為對照。24小時后，用游標(biāo)卡尺測量左右腳足墊厚度，足墊的腫脹程度用以下公式計算腫脹程度(Swelling)=右足墊的厚度-左足墊的厚度
BCG感染后臟器菌落計數(shù)BCG感染28天后，小鼠肺臟在0.05%的Tween 80中研磨、裂解，然后進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋后，涂于米德爾7H9瓊脂板，在37°C培養(yǎng)3周后，通過克隆計數(shù)計算肺臟中BCG的 CFU。BCG感染并用PH)再次刺激后，GS29小鼠與野生型小鼠足墊腫脹程度如圖7A所示，GS29小鼠的腫脹程度明顯高于野生型小鼠。此時取脾臟的T細(xì)胞胞內(nèi)染色結(jié)果顯示GS29小鼠中⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞中IFN-Y+比例較高(圖7B)。足墊的切片結(jié)果也顯示GS29小鼠具有較多的炎癥細(xì)胞浸潤(圖7C)。對于BCG靜脈注射感染后，GS29小鼠肺臟中BCG菌落殘留量較少(圖7D)。這些結(jié)果說明GS29小鼠在BCG感染后產(chǎn)生較強(qiáng)的Thl反應(yīng)，且對BCG有較強(qiáng)的細(xì)菌清除能力。該結(jié)果表明，miR-29吸收序列在體內(nèi)高表達(dá)后能增強(qiáng)機(jī)體的遲發(fā)型過敏反應(yīng)，并促進(jìn)機(jī)體清除結(jié)合分支桿菌。實施例8 =GS29小鼠具有較強(qiáng)的抗結(jié)核分支桿菌H37Rv感染的能力H37Rv的培養(yǎng)、計數(shù)和感染結(jié)核分支桿菌毒力株H37Rv購自ATCC (#27294)，均在米德爾7H9培養(yǎng)基(Difco，Detroit, MD中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)菌處于對數(shù)生長期時，對培養(yǎng)基中的細(xì)菌原液進(jìn)行10倍梯度 倍比稀釋后，涂于含有10%過氧化氫酶葡萄糖酸(Difco, Detroit, Ml)和O. 05% Tween80 (上海生工生物工程有限公司)的米德爾7H9瓊脂板。H37Rv感染時，將5X IO5CFU的H37Rv溶于PBS后尾靜脈注射到小鼠中。感染指定天數(shù)后，小鼠肺臟在O. 05%的Tween 80中研磨、裂解，然后進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋后，涂于米德爾7H9瓊脂板，在37°C培養(yǎng)3周后，通過克隆計數(shù)計算肺臟中H37Rv的CFU。H37Rv感染兩周后，GS29小鼠肺臟CD4+T細(xì)胞IFN-Y +比例較高，而CD8+T細(xì)胞IFN-Y+比例與野生型小鼠相當(dāng)(圖8A)。H37Rv感染指定天數(shù)后，GS29小鼠的存活率較高(圖8B)。H37Rv感染3周后，GS29小鼠肺臟中H37Rv的細(xì)菌殘留量較小(圖8C)。以上結(jié)果表明，miR-29吸收序列在體內(nèi)高表達(dá)后能有效地促進(jìn)結(jié)核分支桿菌H37Rv的清除能力，對肺結(jié)核這種人類重大疾病可能有治療作用。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種miR-29吸收載體，其攜帶從5’至3’依次包含如下元件的表達(dá)盒 (a)II型啟動子； (b)指示蛋白編碼序列；以及 (c)miR-29吸收序列，所述吸收序列是4 10次重復(fù)的、與miR-29部分互補或完全互補的序列； (d)任選的增強(qiáng)子序列。
2.如權(quán)利要求I所述的miR-29吸收載體，其特征在于，所述II型啟動子優(yōu)選UBC、CAG、PGK、CMV 啟動子。
3.如權(quán)利要求I所述的miR-29吸收載體，其特征在于，所述指示蛋白選自熒光蛋白、螢光素酶或者表達(dá)標(biāo)簽。
4.如權(quán)利要求I所述的miR-29吸收載體，其特征在于，所述吸收序列與miR-29的互補比例為78% 84%。
5.如權(quán)利要求I所述的miRNA吸收載體，其特征在于，所述miR-29吸收序列選自下組如SEQ ID NO :3所示的序列；由SEQ ID NO :3所示序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸、且具有預(yù)防或治療miR-29過表達(dá)相關(guān)疾病和/或征狀的活性的序列；或它們的互補序列。
6.如權(quán)利要求I所述的miR-29吸收載體，其特征在于，所述吸收載體選自質(zhì)粒、噬菌體或病毒載體，優(yōu)選病毒載體，如慢病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的miR-29吸收載體或miR-29吸收序列在制備用于預(yù)防或治療miR-29過表達(dá)相關(guān)疾病和/或癥狀中的用途。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述miR-29過表達(dá)相關(guān)疾病和/或癥狀選自腫瘤、血液造血系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕病、糖尿病、皮膚病、病毒感染以及骨分化、肌肉分化和肌肉相關(guān)疾病，優(yōu)選細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的細(xì)菌感染相關(guān)疾病和/或征狀為選自下組的疾病或征狀細(xì)菌感染后導(dǎo)致的敗血癥、腦膜炎、膿毒性流產(chǎn)；過度的炎癥和繼發(fā)的組織損傷；細(xì)菌的過度增殖導(dǎo)致的菌血癥、多器官功能衰竭；肺結(jié)核或者其它器官的結(jié)核征狀。
10.一種藥物組合物，其包含(A)預(yù)防或治療有效量的miR-29吸收載體或其吸收序列；和(B)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種miR-29吸收序列、吸收載體及其用途。本發(fā)明的miR-29吸收載體攜帶從5’至3’依次包含如下元件的表達(dá)盒(a)II型啟動子；(b)指示蛋白編碼序列；(c)miR-29吸收序列，所述吸收序列是4～10次重復(fù)的、與miR-29部分互補或完全互補的序列；(d)任選的增強(qiáng)子序列。本發(fā)明還提供了所述吸收載體的應(yīng)用及包含該載體的藥物組合物。本發(fā)明的miR-29吸收載體可用于預(yù)防和治療胞內(nèi)菌感染導(dǎo)致的炎癥、Th1型反應(yīng)、結(jié)核等疾病。
文檔編號A61K48/00GK102839187SQ20111017389
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月24日
發(fā)明者曹雪濤, 馬烽, 李楠, 徐勝 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)