專利名稱：一種組織工程化淋巴結(jié)模型及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程與再生醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種組織工程化淋巴結(jié)模型及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
淋巴系統(tǒng)對(duì)人體的重要性日趨顯現(xiàn)，淋巴組織生物學(xué)研究發(fā)展的需要推動(dòng)了構(gòu)建適合模型的研究。組織工程淋巴器官(淋巴結(jié)、脾臟、淋巴管和淋巴細(xì)胞)不僅可以作為體外研究模型，還具有移植治療疾病或損傷引起的淋巴缺陷的潛在應(yīng)用價(jià)值。Chistoph Giese 等(Chistoph Giese 等，Artifical Organs, 2006, 30,803)在體外通過(guò)生物反應(yīng)器培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)狀突細(xì)胞取得成功，Sachiko Suematsu等(Sachiko Suematsu 等，Nuture Biotechnology, 2004，22，1539)將接種了胸腺基質(zhì)細(xì)胞(TEL-2-LT α )的“海綿樣”膠原支架移植到小鼠體內(nèi)，能夠產(chǎn)生“淋巴組織樣類器官”，其結(jié)構(gòu)類似于次級(jí)淋巴器官并能夠在宿主中產(chǎn)生抗體。然而，目前為止，未見(jiàn)基于膠原-Mstrigel支架材料構(gòu)建的組織工程化淋巴結(jié)模型的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種組織工程化淋巴結(jié)模型，該模型包含添加了淋巴細(xì)胞刺激物的淋巴組織分離的淋巴細(xì)胞以及膠原-Matirgel支架材料。本發(fā)明的目的還在于提供一種組織工程化淋巴結(jié)模型的構(gòu)建方法。一種組織工程化淋巴結(jié)模型，該模型包含淋巴組織中分離獲得的淋巴細(xì)胞以及膠原-Matrigel 支架。所述淋巴細(xì)胞來(lái)源于胸腺組織、脾臟組織或外周血；所述膠原為I型鼠尾膠原；所述膠原-Matirgel支架中膠原與Matirgel的質(zhì)量比為(0. 1-9) 1?！N組織工程化淋巴結(jié)模型的構(gòu)建方法，按照如下操作步驟進(jìn)行(1)制備淋巴細(xì)胞懸液用2XRMPI 1640培養(yǎng)液重懸淋巴細(xì)胞制備細(xì)胞密度為5X IO4 5Χ IO7AiL的淋巴細(xì)胞懸液；(2)制備原代小鼠成纖維細(xì)胞懸液用2 X H-DMEM培養(yǎng)液重懸小鼠成纖維細(xì)胞制備細(xì)胞密度為5 X IO4 5 X 107/mL的 MEF細(xì)胞懸液；(3)細(xì)胞與支架材料的復(fù)合及細(xì)胞-支架復(fù)合物的培養(yǎng)將步驟⑴制得的細(xì)胞懸液和步驟(2)制得的細(xì)胞懸液按細(xì)胞數(shù)量比為 (5-1) 1混合，然后在細(xì)胞混合懸液中加入濃度為0. 5-4. 0mg/mL的膠原與Matrigel，其中膠原與Matrigel的質(zhì)量比為(0. 1-9) 1，混勻后，用0. IM的NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值至 7. 2-7. 4 ；(4)靜態(tài)拉伸模具制備
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將細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔注入Iml的質(zhì)量濃度為2%的無(wú)菌瓊脂，瓊脂凝固后，均勻插入4根長(zhǎng)Icm的無(wú)菌玻璃毛吸管，紫外燈照射30min ；(5)將步驟C3)獲得的細(xì)胞-支架復(fù)合物加至步驟(4)制得的靜態(tài)拉伸模具中，置于5%C02、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，待細(xì)胞-支架復(fù)合物凝膠化后再加入含有10%胎牛血清和淋巴細(xì)胞刺激物的RMPI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)3-14天，即得到組織工程化淋巴結(jié)模型。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述一種組織工程化淋巴結(jié)模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(4)所用淋巴細(xì)胞刺激物為刀豆蛋白A，其濃度為10-40 μ g/ml，或者植物凝激素A，其濃度為 10-40 μ g/ml。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用I型鼠尾膠原和Matrigel基質(zhì)膠作為組織工程化淋巴結(jié)模型的支架，該支架體系在施加靜態(tài)拉伸力后能夠更好地模擬體內(nèi)環(huán)境，支持淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞因子的分泌以及表面標(biāo)志的表達(dá)，對(duì)未來(lái)應(yīng)用組織工程淋巴結(jié)模型進(jìn)行生物材料免疫毒性評(píng)價(jià)及免疫藥物篩選等具有重要意義。本發(fā)明的構(gòu)建方法操作工藝簡(jiǎn)單、實(shí)施條件溫和。


圖1為培養(yǎng)3d后的組織工程淋巴結(jié)模型宏觀觀察圖。圖2為培養(yǎng)7d后的組織工程淋巴結(jié)模型宏觀觀察圖。
具體實(shí)施例方式通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述，但是以下實(shí)施例僅僅是作為例證，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。以下實(shí)施例中未詳細(xì)說(shuō)明的部分請(qǐng)參閱Robert Lanza, Robert Langer and Joseph Vacanti 編寫的〈〈Principles of Tissue Engineering〉〉第三版禾口 Anthony Atala, Robert P. Lanza 編寫的《Methods of tissue engineering》(2006)。以下實(shí)施例組織工程化淋巴結(jié)模型構(gòu)建方法中使用的細(xì)胞分離、培養(yǎng)及組織鑒定所需試劑(I)RMPI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基RMPI 1640 干粉培養(yǎng)基一袋，2. 2g NaHCO3, 2. 383g HEPES, 10萬(wàn)單位青霉素，10萬(wàn)單位鏈霉素，溶解于1000ml超純水中，調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 4， 經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存。使用時(shí)添加10%胎牛血清(FBS)和淋巴細(xì)胞刺激物，用于淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)模型的培養(yǎng)。(2)H-DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基H-DMEM 干粉培養(yǎng)基一袋，3. 7g NaHCO3, 2. 383g HEPES, 10萬(wàn)單位青霉素，10萬(wàn)單位鏈霉素，溶解于1000ml超純水中，調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 4，經(jīng) 0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存。使用時(shí)添加10%胎牛血清(FBS)，用于原代小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)的培養(yǎng)。(3)濃縮培養(yǎng)基 QXRMPI 1640) =RMPI 1640 干粉培養(yǎng)基一袋，2. 2gNaHC03，2. 383g HEPES, 10萬(wàn)單位青霉素，10萬(wàn)單位鏈霉素，溶解于500ml超純水中，調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 4， 經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存。(4)PBS:稱取 8g NaCl,0. 2g KCl，3.491g Na2HPO4 ‘ 12H20,0. 2g KH2PO4,溶解于 1000ml超純水中，調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 4，121 °C高壓蒸汽滅菌20min，4°C保存。實(shí)施例1以人外周血單核細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化淋巴結(jié)模型
(1)采用密度梯度離心法分離人外周血單核細(xì)胞取肝素抗凝血用Hanks液稀釋一倍，將其輕鋪在Ficoll分離液(比重為1. 077g/ mL)上，然后2000rpm，水平離心30min。單個(gè)核細(xì)胞懸于分離液上層，呈白色膜狀。用吸管小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層，加入Hanks液后洗滌3遍。加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培
養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)。(2)原代小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)的分離與培養(yǎng) 取已死亡孕小鼠的胚胎組織，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，加PBS清洗。倒掉PBS，加入適量胰酶溶液消化，反復(fù)吹打振蕩后，靜置片刻，將上清轉(zhuǎn)入血清中終止消化。重復(fù)上述步驟，直至組織塊消化完全。收集所有消化上清，200目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾后，移入離心管中IOOOrpm離心 5min。收集細(xì)胞。(3)用2 X RPMI 1640重懸人外周血單核細(xì)胞，細(xì)胞密度為lX106/mL ；用2 X RPMI 1640重懸原代小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)，細(xì)胞密度為5X 105/mL。(4) I型液態(tài)鼠尾膠原的制備取已死亡大鼠的尾根部，置于75%的酒精中浸泡30min ；無(wú)菌條件下取出尾腱；剪碎，浸入0. 的醋酸中；置于4°C冰箱；并用磁力攪拌機(jī)間斷進(jìn)行攪拌。4 后，4°C離心， 收集上清即得膠原溶液。制備的膠原溶液濃度為2. Omg/ml。(5)靜態(tài)拉伸模具的制備將12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔注入Iml的濃度為2 %的無(wú)菌瓊脂，瓊脂凝固后，均勻插入4根長(zhǎng)約Icm的無(wú)菌玻璃毛吸管，紫外燈照射30min，獲得靜態(tài)拉伸模具。(6)細(xì)胞與支架材料的復(fù)合及細(xì)胞-支架復(fù)合物的培養(yǎng)將步驟⑴制得的細(xì)胞懸液和步驟(2)制得的細(xì)胞懸液按細(xì)胞數(shù)量為2 1混合。 然后在細(xì)胞混合懸液中加入濃度為2. Omg/mL的膠原與Matrigel，其中膠原-Matrigel的比例為2 1，混勻后，用0. IM的NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值至7. 2-7. 4。(7)然后將步驟( 獲得的細(xì)胞-支架復(fù)合物加至由細(xì)胞培養(yǎng)板制得的靜態(tài)拉伸模具中，置于5% C02、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，待細(xì)胞-支架復(fù)合物凝膠化后再加入含有10%胎牛血清和淋巴細(xì)胞刺激物的RMPI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)3天(如圖Ia所示)，即得到組織工程化淋巴結(jié)模型。實(shí)施例2以小鼠骨髓單核細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化淋巴結(jié)模型(1)采用密度梯度離心法分離小鼠骨髓單核細(xì)胞取已死亡小鼠股骨，將股骨放入無(wú)菌的冷PBS中；用ImL注射器沖出小鼠股骨中的細(xì)胞，直到股骨腔呈白色；充分混勻細(xì)胞，使用200目的濾網(wǎng)過(guò)濾，收集過(guò)濾液于IOmL離心管中，1500rpm。離心5min ；棄上清，加入8mLNH4Cl_Tris溶液，將細(xì)胞懸起，溶解紅細(xì)胞約 6min，1500rpm,離心5min。棄上清，在離心管中加入5mL無(wú)菌冷PBS，重懸細(xì)胞；將上述細(xì)胞懸液輕輕加到5mL Ficoll-paqul(1.086g/mL)，1500rpm，離心30min ；小心取出離心管，溶液分為三層從上往下依次是透明的PBS層、單核細(xì)胞層、RBS層；用口徑較大的細(xì)吸管吸出單個(gè)核細(xì)胞到50mL的離心管中，加入30mLPBS混勻清洗細(xì)胞，1500rpm,離心5min。1 OmLPBS, 1500rpm，離心5min再洗滌1次；重懸細(xì)胞，接種于含有10% FBS的RMPI1640培養(yǎng)液中，常規(guī)培養(yǎng)。(2)原代小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)的分離與培養(yǎng)
取已死亡孕小鼠的胚胎組織，剪成Imm3左右的組織塊，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，再加 PBS清洗。倒掉PBS，加入適量胰酶溶液消化，反復(fù)吹打振蕩后，靜置片刻，將上清轉(zhuǎn)入血清中終止消化。重復(fù)上述步驟，直至組織塊消化完全。收集所有消化上清，200目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾后，移入離心管中IOOOrpm離心5min。收集細(xì)胞。(3)用2 X RPMI 1640重懸小鼠骨髓單核細(xì)胞，細(xì)胞密度為5 X 106/mL ；用2 X RPMI 1640重懸原代小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)，細(xì)胞密度為5X 106/mL。(4) I型液態(tài)鼠尾膠原的制備取已死亡大鼠的尾根部，置于75%的酒精中浸泡30min ；無(wú)菌條件下取出尾腱；剪碎，浸入0. 的醋酸中；置于4°C冰箱；并用磁力攪拌機(jī)間斷進(jìn)行攪拌。4 后，4°C離心， 收集上清即得膠原溶液。制備的膠原溶液濃度為3. 5mg/ml。(5)靜態(tài)拉伸模具的制備將12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔注入Iml的濃度為2 %的無(wú)菌瓊脂，瓊脂凝固后，均勻插入4根長(zhǎng)約Icm的無(wú)菌玻璃毛吸管，紫外燈照射30min，獲得靜態(tài)拉伸模具。(6)細(xì)胞與支架材料的復(fù)合及細(xì)胞-支架復(fù)合物的培養(yǎng)將步驟⑴制得的細(xì)胞懸液和步驟(2)制得的細(xì)胞懸液按細(xì)胞數(shù)量為1 1混合。 然后在細(xì)胞混合懸液中加入濃度為3. 5mg/mL的膠原與Matrigel，其中膠原-Matrigel的比例為1:2，混勻后，用0. IM的NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值至7. 2-7. 4。(7)然后將步驟( 獲得的細(xì)胞-支架復(fù)合物加至由細(xì)胞培養(yǎng)板制得的靜態(tài)拉伸模具中，置于5% C02、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，待細(xì)胞-支架復(fù)合物凝膠化后再加入含有10%胎牛血清和淋巴細(xì)胞刺激物的RMPI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)10天，即得到組織工程化淋巴結(jié)模型。實(shí)施例3以小鼠脾淋巴細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化淋巴結(jié)模型(1)采用密度梯度離心法分離小鼠脾淋巴細(xì)胞取已死亡小鼠的脾臟組織，置于盛有無(wú)菌的冷PBS中，然后將脾臟剪碎，使用 200目的濾網(wǎng)過(guò)濾，收集過(guò)濾液于IOmL離心管中，1500rpm。離心5min ；棄上清，加入 8mLNH4Cl-Tris溶液，將細(xì)胞懸起，溶解紅細(xì)胞約8min，1500rpm,離心5min。棄上清，在離心管中加入5mL無(wú)菌冷PBS，重懸細(xì)胞；將上述細(xì)胞懸液輕輕加到5mL Ficoll (1. 086g/mL)， 2000rpm，離心15min ；小心取出離心管，溶液分為三層從上往下依次是透明的PBS層、單核細(xì)胞層、RBS層；用口徑較大的細(xì)吸管吸出淋巴細(xì)胞到IOmL的離心管中，加入5mLPBS混勻清洗細(xì)胞2次，1500rpm,離心5min。重懸細(xì)胞，接種于含有10% FBS的RMPI1640培養(yǎng)液中， 常規(guī)培養(yǎng)。(2)原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的分離與培養(yǎng)取已死亡孕小鼠的胚胎組織，剪成Imm3左右的組織塊，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，再加 PBS清洗。倒掉PBS，加入適量胰酶溶液消化，反復(fù)吹打振蕩后，靜置片刻，將上清轉(zhuǎn)入血清中終止消化。重復(fù)上述步驟，直至組織塊消化完全。收集所有消化上清，200目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾后，移入離心管中IOOOrpm離心5min。收集細(xì)胞。(3)用2 X RPMI 1640重懸小鼠骨髓單核細(xì)胞，細(xì)胞密度為5 X 106/mL ；用2 X RPMI 1640重懸原代小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)，細(xì)胞密度為1 X 106/mL。(4) I型液態(tài)鼠尾膠原的制備
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取已死亡大鼠的尾根部，置于75%的酒精中浸泡30min ；無(wú)菌條件下取出尾腱；剪碎，浸入0. 的醋酸中；置于4°C冰箱；并用磁力攪拌機(jī)間斷進(jìn)行攪拌。4 后，4°C離心， 收集上清即得膠原溶液。制備的膠原溶液濃度為3. Omg/ml。(5)靜態(tài)拉伸模具的制備將12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔注入Iml的濃度為2 %的無(wú)菌瓊脂，瓊脂凝固后，均勻插入4根長(zhǎng)約Icm的無(wú)菌玻璃毛吸管，紫外燈照射30min，獲得靜態(tài)拉伸模具。(6)細(xì)胞與支架材料的復(fù)合及細(xì)胞-支架復(fù)合物的培養(yǎng)將步驟⑴制得的細(xì)胞懸液和步驟(2)制得的細(xì)胞懸液按細(xì)胞數(shù)量為5 1混合。 然后在細(xì)胞混合懸液中加入濃度為3. Omg/mL的膠原與Matrigel，其中膠原-Matrigel的比例為4 1，混勻后，用0. IM的NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值至7. 2-7. 4。(7)然后將步驟( 獲得的細(xì)胞-支架復(fù)合物加至由細(xì)胞培養(yǎng)板制得的靜態(tài)拉伸模具中，置于5% C02、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，待細(xì)胞-支架復(fù)合物凝膠化后再加入含有10%胎牛血清和淋巴細(xì)胞刺激物的RMPI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天(如圖Ib所示)，即得到組織工程化淋巴結(jié)模型。
權(quán)利要求
1.一種組織工程化淋巴結(jié)模型，其特征在于，該模型包含淋巴組織中分離獲得的淋巴細(xì)胞以及膠原-Matrigel支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種組織工程化淋巴結(jié)模型，其特征在于，所述淋巴細(xì)胞來(lái)源于胸腺組織、脾臟組織或外周血；所述膠原為I型鼠尾膠原；所述膠原-Matirgel支架中膠原與Matirgel的質(zhì)量比為(0. 1-9) 1。
3.—種組織工程化淋巴結(jié)模型的構(gòu)建方法，其特征在于，按照如下操作步驟進(jìn)行(1)制備淋巴細(xì)胞懸液用2XRMPI 1640培養(yǎng)液重懸淋巴細(xì)胞制備細(xì)胞密度為5X IO4 5XlO7AiL的淋巴細(xì)胞懸液；(2)制備原代小鼠成纖維細(xì)胞懸液用2 X H-DMEM培養(yǎng)液重懸小鼠成纖維細(xì)胞制備細(xì)胞密度為5 X IO4 5X 107/mL的MEF 細(xì)胞懸液；(3)細(xì)胞與支架材料的復(fù)合及細(xì)胞-支架復(fù)合物的培養(yǎng)將步驟(1)制得的細(xì)胞懸液和步驟( 制得的細(xì)胞懸液按細(xì)胞數(shù)量比為(5-1) 1 混合，然后在細(xì)胞混合懸液中加入濃度為0. 5-4. Omg/mL的膠原與Matrigel，其中膠原與 Matrigel的質(zhì)量比為(0.1-9) 1，混勻后，用0. IM的NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值至7. 2-7. 4 ；(4)靜態(tài)拉伸模具制備將細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔注入Iml的質(zhì)量濃度為2%的無(wú)菌瓊脂，瓊脂凝固后，均勻插入4 根長(zhǎng)Icm的無(wú)菌玻璃毛吸管，紫外燈照射30min ；(5)將步驟C3)獲得的細(xì)胞-支架復(fù)合物加至步驟(4)制得的靜態(tài)拉伸模具中，置于 5% C02、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，待細(xì)胞-支架復(fù)合物凝膠化后再加入含有10%胎牛血清和淋巴細(xì)胞刺激物的RMPI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)3-14天，即得到組織工程化淋巴結(jié)模型。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種組織工程化淋巴結(jié)模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(4) 所用淋巴細(xì)胞刺激物為刀豆蛋白A，其濃度為10-40 μ g/ml，或者植物凝激素A，其濃度為 10-40μ g/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了屬于組織工程與再生醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的一種組織工程化淋巴結(jié)模型及其構(gòu)建方法。這種組織工程化淋巴結(jié)模型包含淋巴組織中分離獲得淋巴細(xì)胞以及膠原-Matrigel支架。本發(fā)明組織工程化淋巴結(jié)模型構(gòu)建方法首先制備淋巴細(xì)胞懸液和原代小鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞懸液，然后將混合細(xì)胞懸液與膠原-Matrigel支架材料復(fù)合后在施加靜態(tài)拉伸的模具中培養(yǎng)，獲得組織工程化淋巴結(jié)模型。本發(fā)明支架體系在施加靜態(tài)拉伸后能夠更好地模擬體內(nèi)環(huán)境，支持淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞因子的分泌以及表面標(biāo)志的表達(dá)，對(duì)未來(lái)應(yīng)用組織工程化淋巴結(jié)模型進(jìn)行生物材料免疫毒性評(píng)價(jià)及免疫藥物篩選等具有重要意義。本發(fā)明的構(gòu)建方法操作工藝簡(jiǎn)單、實(shí)施條件溫和。
文檔編號(hào)A61L27/38GK102228719SQ201110172898
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月24日
發(fā)明者周瑾, 杜芝燕, 林秋霞, 段翠密, 王妍, 王常勇, 郝彤 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所