專利名稱：一種組織工程化神經(jīng)組織及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程與再生醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種組織工程化神經(jīng)組織及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
組織工程是20世紀80年代末發(fā)展起來的一門新興交叉學(xué)科，近年來，隨著生命科學(xué)和材料科學(xué)的發(fā)展，科研人員相繼在骨骼、軟骨、皮膚等多種組織和器官體外再造研究方面取得突破性進展，其中，一些組織工程產(chǎn)品如軟骨、皮膚已實現(xiàn)商品化。盡管由于神經(jīng)系統(tǒng)本身的復(fù)雜性，再加上組織工程化神經(jīng)組織的研究起步較晚，目前在體外構(gòu)建的神經(jīng)組織還遠不能實現(xiàn)商品化；但是，隨著干細胞、神經(jīng)營養(yǎng)因子與生物材料研究領(lǐng)域的快速發(fā)展，體外構(gòu)建組織工程化神經(jīng)組織后的體內(nèi)移植已經(jīng)成為治療脊髓與周圍神經(jīng)損傷研究的重要手段，也可以作為體外模型進行神經(jīng)干細胞發(fā)育機理、神經(jīng)電生理、腦損傷等研究。James等人的研究發(fā)現(xiàn)，將混有雪旺氏細胞及成纖維細胞的膠原注入硅管中，移植修復(fù)坐骨神經(jīng)損傷，能夠促進其神經(jīng)再生[1]。Heather等人研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合神經(jīng)干細胞或者雪旺氏細胞的PLGA移植治療大鼠脊髓橫斷損傷能有效的促進軸突再生β]。Hillary等用 Matrigel為基質(zhì)，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞混合體外再造神經(jīng)組織，作為神經(jīng)生理學(xué)研究平臺D]。Michelle等將神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞以及Matrigel混合再造的三維神經(jīng)組織作為腦外傷研究模型，研究高速剪切力對其損傷的細胞機制M。生物材料是細胞附著的基本框架和代謝場所，其形態(tài)和功能直接影響所構(gòu)成組織的形態(tài)和功能。對于神經(jīng)組織體外三維再造而言，再造的三維微環(huán)境必須能夠支持神經(jīng)細胞的黏附、突起生長與功能性突觸的形成，并且能夠允許營養(yǎng)物的擴散，從而能夠長時間的培養(yǎng)與研究。目前，在神經(jīng)組織的體外三維再造研究中，所應(yīng)用的支架材料包括膠原、 Matrigel、瓊脂糖、三維文石生物基質(zhì)等。其中，利用三維文石生物基質(zhì)作為支架材料構(gòu)建的神經(jīng)組織中的神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞的能夠高效存活[5]；將神經(jīng)干細胞接種于膠原基質(zhì)并在旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器提供的微環(huán)境下進行長期培養(yǎng)，能夠形成在結(jié)構(gòu)和功能上一定程度類似于胚胎腦皮層的雙層結(jié)構(gòu)[6]；利用氣/液界面系統(tǒng)進行胚胎干細胞來源的神經(jīng)祖細胞的體外擴增和分化可以形成有機的三維神經(jīng)組織，該方法形成的組織在表型和結(jié)構(gòu)上與早期發(fā)育的胎兒腦具有相似性[7]。但是，根據(jù)以往研究報道，利用單純I型膠原體外再造的神經(jīng)組織由于缺少氧氣和營養(yǎng)致使神經(jīng)細胞難以長期生存，而單純Matrigel構(gòu)建的組織韌性差、易碎。將一定比例的Matrigel摻入I型膠原獲得的膠原/Matrigel支架除了具有膠原低免疫原性，良好的生物相容性等優(yōu)點之外，還可以改善膠原的物理特性，使其疏松多孔，能夠更好的作為組織工程支架材料，為細胞提供附著點，且便于細胞在三維孔徑中的生長延展，利于氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物等的運輸，且Matrigel中的一些組分如層連接蛋白、IV型膠原、巢蛋白等能夠為細胞生長提供營養(yǎng)作用。將液態(tài)I型膠原/Matrigel應(yīng)用于神經(jīng)組織工程，作為神經(jīng)干細胞的支架材料尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種組織工程化神經(jīng)組織的構(gòu)建方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種利用上述方法獲得的組織工程化神經(jīng)組織。一種組織工程化神經(jīng)組織的構(gòu)建方法，按照如下操作步驟進行(1)制備神經(jīng)干細胞懸液從已死亡的Wistar小鼠大腦皮層組織中分離得到神經(jīng)干細胞，傳代純化培養(yǎng)，然后用DMEM培養(yǎng)液重懸細胞制備細胞密度為1 X IO6 1 X IO8的神經(jīng)干細胞懸液；(2)膠原/Matrigel支架材料的制備將膠原與10 X DMEM混勻，并用NaOH調(diào)節(jié)其pH值至7. 2-7. 4，然后加入Matrigel， 充分混勻，此操作過程在冰上進行；(3)細胞與支架材料的復(fù)合及細胞-支架材料復(fù)合物的培養(yǎng)將步驟(1)制得的細胞懸液與步驟( 制得的膠原/Matrigel支架材料混合，其中膠原的終濃度為0. 4-lmg/mL，支架材料中Matrigel所占的體積分數(shù)為10% -80% ；然后將獲得的細胞-支架材料復(fù)合物加至培養(yǎng)板中，置于5% C02、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min， 待細胞-支架材料凝膠化后再加入含生長因子的DMEM-F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天，即得到組織工程化神經(jīng)組織。所述膠原為液態(tài)I型鼠尾膠原。DMEM-F12培養(yǎng)基中的生長因子為5 50ng/mL堿性成纖維生長因子和5 50ng/ mL表皮生長因子。一種利用上述的組織工程化神經(jīng)組織構(gòu)建方法獲得的組織工程化神經(jīng)組織。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明用鼠尾液態(tài)I型膠原，結(jié)合Matrigel基質(zhì)膠作為組織工程化神經(jīng)組織的支架，同現(xiàn)有的用于神經(jīng)組織的支架材料相比，該支架材料能夠有效的促進細胞在材料中的存活，其中，Matrigel基質(zhì)膠摻入I型膠原后，有效的增加了膠原表明的孔徑，更有利于氣體以及營養(yǎng)物質(zhì)的交換，且Matrigel基質(zhì)膠中的IV型膠原、層連接蛋白等對細胞的生長有營養(yǎng)支持的作用。本方法操作簡單、可實施性強，能夠較好的維持神經(jīng)干細胞的存活與增殖，促進神經(jīng)干細胞的分化，對推進組織工程化神經(jīng)組織發(fā)展具有重要意義。


圖1為神經(jīng)干細胞在相差顯微鏡下觀察結(jié)果；圖中，bar :Α = ΙΟΟμπι，B = 200μπι。
具體實施例方式通過以下實施例對本發(fā)明做詳細描述，但是以下實施例僅作為例證，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。實施例1組織工程化神經(jīng)組織的體外構(gòu)建本實施例中使用的細胞分離、培養(yǎng)及組織鑒定所需試劑(1)解剖液3g D-葡萄糖，7.5g 蔗糖，2.34g HEPES，8g NaCl，0.4g KC1,0. 24gNa2HPO4,4. 12g H20,0. 03g KH2PO4 加至 IL 超純水中，調(diào) pH 值為 7. 2-7.4,0. 22 μ m 濾膜過濾
除菌，4°C保存。(2) DMEM-F12培養(yǎng)基DMEM_F12干粉培養(yǎng)基一包溶解于IOOOmL超純水中，添加 1. 2g NaHCO3,調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 4，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾除菌，分裝并4°C保存。(3)濃縮培養(yǎng)基(10XH-DMEM) :DMEM_F12干粉培養(yǎng)基一包溶解于IOOmL超純水中，添加1.2g NaHCO3，調(diào)節(jié)pH值為7. 2-7. 4，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾除菌，分裝并4°C保存。(4)胰酶抑制劑lmg/mL胰酶抑制劑溶解于DMEM-F12溶中，0. 22 μ m濾膜過濾除菌，4°C保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。(5)賂(完全培養(yǎng)基以01^]\0712作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加N2、2% B27、20ng/mL EGF 禾口 20ng/mL bFGF，現(xiàn)用現(xiàn)配。(6)NSC分化培養(yǎng)基以DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加1 % N2,2% B27和5% FBS，現(xiàn)用現(xiàn)配。1、大鼠神經(jīng)干細胞的分離、純化與鑒定大鼠神經(jīng)干細胞來源于已死亡的Wistar大鼠。取Wistar大鼠大腦皮層，并剝?nèi)ツX膜，隨后將之轉(zhuǎn)移到60mm培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪成Imm3左右的組織塊，整個操作過程在冰盒上進行。然后將組織塊轉(zhuǎn)移到35mm培養(yǎng)皿中，加入適量0. 25%胰酶溶液消化約20min， 胰酶抑制劑終止消化，移入離心管中IOOOrpm離心5min，棄上清，將沉淀移入到完全培養(yǎng)基中，并用吸管輕輕吹打成細胞懸液，并通過200目的篩網(wǎng)過濾。收集到的細胞懸液通過血球計數(shù)板計數(shù)，以1-2X IO5個/mL的細胞密度接種于培養(yǎng)瓶中。5% CO2, 37°C孵箱恒溫培養(yǎng) 5-7d，待神經(jīng)干細胞分裂、增殖形成較大的細胞球后傳代。待原代培養(yǎng)5-7d，神經(jīng)干細胞克隆形成后，用吸管在培養(yǎng)瓶中輕輕吹打，使沉在瓶底沒有貼壁的神經(jīng)球浮起，然后將神經(jīng)球和培養(yǎng)液一并移入到50mL的無菌離心管中， 800rpm離心％iin，棄上清，加入適量0. 25%胰酶37°C消化約3min，胰酶抑制劑終止消化，然后用巴斯德吸管機械吹打成單個細胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，將收集到的液體血球計數(shù)板計數(shù)，IOOOrpm離心5min，棄上清，加入神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1-2X105 個/mL，并接種于培養(yǎng)瓶中。于5% CO2, 37°C孵箱恒溫培養(yǎng)。以后每隔3_4d傳代一次，方法同前。相差顯微鏡下的觀察結(jié)果表明，神經(jīng)干細胞存活良好，形成大小均一的細胞克隆(圖 1)；免疫熒光染色結(jié)果表明，分離培養(yǎng)的細胞內(nèi)表達神經(jīng)干細胞特異性的Nestin蛋白，具有良好的增殖能力和多向分化的潛能。2、細胞與支架材料的復(fù)合及復(fù)合物培養(yǎng)將神經(jīng)干細胞，加入液態(tài)I型鼠尾膠原、MatrigelUOXDMEM混勻，并用NaOH調(diào)節(jié)PH值，調(diào)整膠原濃度為0. 5mg/mL、Matrigel所占體積分數(shù)為60 %、神經(jīng)干細胞密度為 1 X IOVmL ；將細胞-支架材料的混合物加入48孔板，每孔注入復(fù)合物200 μ L。30min后， 待細胞-膠原復(fù)合物凝固，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。24h后更換培養(yǎng)液，此后每天更換培養(yǎng)液。實施例2體外構(gòu)建的組織工程化神經(jīng)組織的Live/Dead和免疫熒光檢測Live/Dead檢測實施例1中體外構(gòu)建的組織工程化神經(jīng)組織，在培養(yǎng)的第ld、3d、 7d，用Live/Dead試劑盒檢測組織工程化神經(jīng)組織內(nèi)細胞存活的影響。方法如下首先將 20 μ 1的2mM EthD-I禾口 5 μ 1的4mM Calcein AM力口入至Ij IOml PBS中制備染料溶液；棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次；加入ImL染料溶液，37°C染色60min ；棄染液，新鮮PBS再次清洗30min ； 隨機選取3-5個視野運用激光共聚焦檢測細胞存活情況。結(jié)果顯示，神經(jīng)干細胞以及分化細胞在膠原/Matrigel復(fù)合物中存活良好，在體外培養(yǎng)7天時，存活率仍然高達87%以上。免疫熒光檢測實施例1中體外構(gòu)建的組織工程化神經(jīng)組織，在體外培養(yǎng)14d后， 去除培養(yǎng)基，將細胞-材料復(fù)合體在預(yù)冷冷4%多聚甲醛中固定30min ；PBS漂洗5minX3 次；加入MAP2、GFAP或01igo2抗體37°C孵育濁；PBS漂洗5minX3次；加入二抗37°C孵育 30min ；PBS漂洗5minX3次；共聚焦熒光顯微鏡觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，神經(jīng)干細胞在膠原/Matrigel復(fù)合物中分化為GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞，MAP2陽性的神經(jīng)元以及01igo2陽性的少突膠質(zhì)細胞。參考文獻1. Olson HE, Rooney GE, Gross L, Nesbitt JJ, Galvin KE, Knight A, Chen B, Yaszemski MJ, Windebank AJ. Neural stem cell—and Schwann cell-loaded biodegradable polymer scaffolds support axonal regeneration in the transected spinal cord. Tissue Eng Part A. 2009Jul ； 15 (7) :1797-805.2.Phillips JB, Bunting SC, Hall SM, Brown RA. Neural tissue engineering a self-organizing collagen guidance conduit. Tissue Eng. 2005Sep-0ct；11(9-10) 1611-7.3. Irons HR, Cullen DK, Shapiro NP, Lambert NA, Lee RH, Laplaca MC. Three-dimensional neural constructs -.a novel platform for neurophysiological investigation. J Neural Eng. 2008S??；5 (3) :333-41. Epub 2008Aug 28.4. LaPlaca MC, Cullen DK, McLoughlin JJ, Cargill RS 2nd. High rate shear strain of three-dimensional neural cell cultures -.a new in vitro traumatic brain injury model. J Biomech. 2005May ；38 (5) :1093-105.5. Peretz H, Talpalar AE, Vago R, Baranes D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Eng. 2007Mar ； 13(3) :461-72.6. Ma W, Tavakoli Τ, Chen S, Marie D， Liu JL, 0' Shaughnessy TJ, Barker JL. Reconstruction of functional cortical-like tissues from neural stem and progenitor cells.Tissue Eng Part A.2008 Oct ；14(10) :1673-86.7.Preynat-Seauve 0, Suter DM, Tirefort D, Turchi L, Virolle T, Chneiweiss H,Foti M,Lobrinus JA,Stoppini L,Feki A,Dubois-Dauphin M,Krause KH. Development of human nervous tissue upon differentiation of embryonic stem cells in three-dimensional culture. Stem Cells. 2009Mar ；27 (3) :509-20. 7.
權(quán)利要求
1.一種組織工程化神經(jīng)組織的構(gòu)建方法，其特征在于，按照如下操作步驟進行(1)制備神經(jīng)干細胞懸液從已死亡的WiStar小鼠大腦皮層組織中分離得到神經(jīng)干細胞，傳代純化培養(yǎng)，然后用 DMEM培養(yǎng)液重懸細胞制備細胞密度為1 X IO6 1 X IO8的神經(jīng)干細胞懸液；(2)膠原/Matrigel支架材料的制備將膠原與10 X DMEM混勻，并用NaOH調(diào)節(jié)其pH值至7. 2-7. 4，然后加入Matrigel，充分混勻，此操作過程在冰上進行；(3)細胞與支架材料的復(fù)合及細胞-支架材料復(fù)合物的培養(yǎng)將步驟(1)制得的細胞懸液與步驟( 制得的膠原/Matrigel支架材料混合，其中膠原的終濃度為0. 4-lmg/mL，支架材料中Matrigel所占的體積分數(shù)為10% -80% ；然后將獲得的細胞-支架材料復(fù)合物加至培養(yǎng)板中，置于5% C02、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，待細胞-支架材料凝膠化后再加入含生長因子的DMEM-F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天，即得到組織工程化神經(jīng)組織。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種組織工程化神經(jīng)組織的構(gòu)建方法，其特征在于，所述膠原為液態(tài)I型鼠尾膠原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種組織工程化神經(jīng)組織的構(gòu)建方法，其特征在于，DMEM-F12 培養(yǎng)基中的生長因子為5 50ng/mL堿性成纖維生長因子和5 50ng/mL表皮生長因子。
4.一種利用權(quán)利要求1-3任一所述的組織工程化神經(jīng)組織構(gòu)建方法獲得的組織工程化神經(jīng)組織。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于組織工程與再生醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的一種組織工程化神經(jīng)組織及其構(gòu)建方法。該組織工程化神經(jīng)組織以傳代、純化培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞作為種子細胞，以液態(tài)I型膠原和Matrigel基質(zhì)作為支架材料，種子細胞與支架材料體外復(fù)合后進行培養(yǎng)。本發(fā)明采用的支架體系能夠有效地維持神經(jīng)干細胞的存活與增殖，促進神經(jīng)干細胞的分化，形成由分化成熟神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞構(gòu)成的工程化神經(jīng)組織。本發(fā)明對于未來臨床利用組織工程化神經(jīng)組織移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有重要意義，同時也可以作為神經(jīng)發(fā)育、腦外傷以及神經(jīng)電生理研究的體外模型。
文檔編號A61L27/38GK102228718SQ20111017255
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月24日
發(fā)明者張志立, 李藍蘭, 林秋霞, 王妍, 王常勇, 陳威震, 韓堯 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所