專利名稱：板藍(lán)根總多糖及其組分和它們作為疫苗佐劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種板藍(lán)根總多糖及其組分和它們作為疫苗佐劑的用途。具體地，涉及從中藥材板藍(lán)根中提取的板藍(lán)根總多糖及其中性多糖組分和酸性多糖組分，以及它們作為疫苗佐劑或用于制備疫苗組合物的用途。本發(fā)明還涉及包含上述板藍(lán)根總多糖或多糖組分的疫苗佐劑和疫苗制劑。
背景技術(shù)：
板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)(Isatis indigotica)的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽之功效，常用于溫毒發(fā)斑，舌絳紫暗，喉痹，爛喉丹痧，丹毒和癰腫?，F(xiàn)代藥理研究表明板藍(lán)根能提高免疫功能和抗腫瘤作用。板藍(lán)根中主要化學(xué)成分有黃酮、木質(zhì)素、生物堿以及多糖等。近年來有以下文獻(xiàn)報道有關(guān)板藍(lán)根總多糖制備方法以及對動物免疫功能的影響。邱妍等(江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，2 :32-35)采取水煎醇沉法提取板藍(lán)根總多糖(糖含量為56% )，研究對雞外周血T淋巴細(xì)胞IL-4、IFN-y的mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明該多糖能提高淋巴細(xì)胞IL-4、IFN-Y的mRNA表達(dá)水平。邱妍等(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報2008， 31(1) :77-8)又將該多糖與雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)(NDV-IBV)弱毒苗一起免疫小鼠，能顯著提高新城疫HI抗體效價，促進(jìn)外周血T淋巴細(xì)胞增殖，提高⑶4+、⑶8+T淋巴細(xì)胞含量和⑶4+/⑶8+值?？紫榉宓?畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2004，35 0),468-47 用新城疫IV系疫苗免疫雛雞，在免疫前、后分別注射高、低劑量的板藍(lán)根總多糖(糖含量為82. 94%),結(jié)果表明能不同程度地提高抗體效價，且與給藥時間、劑量和免疫接種次數(shù)有一定關(guān)系。張紅英等(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，43 O) :173-176)測定不同濃度的板藍(lán)根總多糖對體外培養(yǎng)的豬脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明板藍(lán)根總多糖能顯著促進(jìn)豬脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，同時又能協(xié)同ConA或LPS誘導(dǎo)的豬脾臟淋巴細(xì)胞增殖，能顯著促進(jìn)由 ConA誘導(dǎo)的豬脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN- γ，抑制IL-2的分泌，顯著促進(jìn)NO的分泌。以板藍(lán)根總多糖作為免疫增強(qiáng)劑聯(lián)合豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗免疫仔豬，結(jié)果顯示該多糖能顯著提高仔豬的CD3+、CD8+淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)和特異性抗體滴度(張紅英等，中國免疫學(xué)雜志，2007,23 :134-137)。Chen L 等(Intervitrology，2005，48 :207-212)將板藍(lán)根水煎液作為佐劑，與手足口病病毒(FMDV)的DNA疫苗一起注射小鼠，能明顯增加FMDV的抗體反應(yīng)，促進(jìn)T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)小鼠對手足口病病毒攻擊的保護(hù)能力，作用效果優(yōu)于單獨注射FMDV DNA。陳亮等(中國專利，專利號ZL03145034. 2，授權(quán)日2006年5月17日)將板藍(lán)根水煎液作為佐劑，與口蹄疫病毒DNA、乙肝病毒核心抗原原核表達(dá)產(chǎn)物或口蹄疫滅活疫苗聯(lián)用，抗體產(chǎn)生量明顯增加。該佐劑能直接或間接激活活性細(xì)胞，增加抗原表面積，延長抗原在局部組織的存留時間。李寧(中國專禾丨』，公開號CN101703772A，
公開日2010年5月12日)制備復(fù)方板藍(lán)根口服液，其中板藍(lán)根總多糖0. 5-20kg，黃芪多糖含量為50%的黃芪多糖原料
4藥0. 5-20kg，淫羊藿多糖含量為50 %的淫羊藿多糖原料藥0. 5-10kg，巴戟天提取物 0. 5-10kg,山梨酸鉀50g，余量的注射用水。該口服液對于禽類由于疾病或飼養(yǎng)條件造成的免疫力低下具有良好療效，同時可增強(qiáng)疫苗免疫效果。也有文獻(xiàn)報道了板藍(lán)根總多糖的制備方法。陳浩然等(中國藥房，2009，2(K21) :1642-1644)將板藍(lán)根藥材以8倍、6倍量水提取2次，水提取液減壓濃縮，加入乙醇至終濃度為70%，得到沉淀為板藍(lán)根粗多糖部位。板藍(lán)根總多糖水溶解后，加乙醇分級沉淀，得到50%和70%醇沉多糖部分，70%醇沉多糖經(jīng) SephadexGlOO排阻色譜分離，得到板藍(lán)根純化多糖A。板藍(lán)根總多糖A的相對分子質(zhì)量為 11700,多糖A水解后有2個斑點，分別為阿拉伯糖和半乳糖。張體祥等(河南工程學(xué)院學(xué)報，2009，21(3) :13_17)采用水煮醇沉方法制備板藍(lán)根粗多糖，再將粗多糖加水溶脹、煮沸和離心，取上層清液滴加一定量的三氯乙酸， 劇烈攪拌，離心除去沉淀，經(jīng)透析、醇沉、洗滌、干燥，即得脫蛋白多糖。利用葡聚糖凝膠 (SephadexG-IOO)柱層析法進(jìn)行多糖的分離，得到一種分子量均一的ISP2多糖，其相對分子量為2. MX 105。I SP2是由鼠李糖、果糖、葡萄糖、半乳糖四種單糖組成的雜多糖，它們的質(zhì)量比為1 4 58. 2 3. 1。張體祥等(時珍國藥，2009，20 (8) :1992-1994)采用以下路線制備精制多糖板藍(lán)根一粉碎一稱量一乙醚脫脂一熱水浸提一離心取上清液一殘渣重復(fù)浸提兩次一合并上清液一減壓濃縮一透析一測含糖量一乙醇沉淀一有機(jī)溶劑洗滌一真空干燥一板藍(lán)根粗多糖。 粗多糖溶液一SehadexG-IOO柱層析一洗脫液濃縮一乙醇沉淀一冷凍干燥一精制板藍(lán)根總多糖。該多糖得率25. 63%，多糖含量76. 42%。魯建江等(廣東藥學(xué)，2001,11 ) :16-18)將板藍(lán)根洗凈，晾干，精密稱取100g， 置索氏提取器中，依次用石油醚(60-90°C)、乙醚和80%乙醇回流提取4h。殘渣揮干溶劑后，再繼續(xù)以水回流提取4h，減壓濃縮至一半體積，加入0. 1 %活性炭，脫色，濾過，濾液加入95 %乙醇使溶液含醇80 %，靜置過夜，濾過，殘渣用乙醚、無水乙醇反復(fù)洗滌，得板藍(lán)根總多糖。測得板藍(lán)根中多糖含量0.8099%。然而，現(xiàn)有的板藍(lán)根總多糖的制備方法比較煩瑣，成本較高，并且對其中的活性多糖成分可能有所破壞(特別是煎煮和回流步驟)。此外，板藍(lán)根總多糖的收率也往往并不理
術(shù)g
；ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動和深入的研究，得到了一種板藍(lán)根總多糖和多糖組分。并且本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，所述板藍(lán)根總多糖和多糖組分能夠作為良好的疫苗佐劑。由此提供了下述發(fā)明本發(fā)明的一個方面涉及一種具有如下特征的板藍(lán)根多糖組分(即中性多糖組分)(1)其包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，并且摩爾比 Rha Ara Xyl Man Glc Gal = 1. 00 2. 35 2. 38 9. 27 27. 47 13. 03 ；(2)以葡萄糖計算，含糖量為98. 13% ；(3)分子量為 2000-10000。
本發(fā)明的另一個方面涉及具有如下特征的板藍(lán)根多糖組分(即酸性多糖組分)(1)其包含阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖，并且摩爾比為 Rha Ara Man Glc Gal = 1. 00 40. 06 0. 61 22. 24 18. 04 ；(2)以葡萄糖計算，含糖量為92. 11% ；(3)以半乳糖醛酸計算，糖醛酸含量為6. 41 % ；(4)分子量為 3000-70000。本發(fā)明的再一方面涉及一種板藍(lán)根總多糖，其包含(1)上述的板藍(lán)根中性多糖組分；和(2)上述的板藍(lán)根酸性多糖組分。根據(jù)本發(fā)明任一項所述的板藍(lán)根總多糖，其特征在于(1)以葡萄糖計算，含糖量為58. 93% ；(2)以半乳糖醛酸計算，糖醛酸含量為13.36%。根據(jù)本發(fā)明任一項所述的板藍(lán)根總多糖，其具有附圖1或者附圖2所示的特征。根據(jù)本發(fā)明任一項所述的板藍(lán)根總多糖，其通過如下步驟制得1)用水在0°C _60°C下浸提板藍(lán)根，得到水提液；優(yōu)選地，在30°C _60°C或25°C _55°C下浸提板藍(lán)根；更優(yōu)選地，為40°C _55°C;進(jìn)一步優(yōu)選地，為 45°C -55°C ；特別優(yōu)選地，為 50°C _55°C，例如 50°C、51°C、52°C、53°C、54°C、或 55 °C。不拘束于理論的限制，提取溫度不同決定著多糖組成不同。低于60°C，一般不影響化學(xué)穩(wěn)定性，但得率較低；高于60°C，得率會升高，但可能影響總多糖的組成和多糖結(jié)構(gòu)。 在50°C-55°C范圍內(nèi)，制備的多糖和多糖組分的活性保留和產(chǎn)品收率之間得到了良好的平衡。浸提的時間并不特別限定，優(yōu)選的是1-48小時，更優(yōu)選的是2-12小時，進(jìn)一步優(yōu)選的是2-8小時，例如2、3、4、5、6、7、或8小時。2)將步驟1)中的水提液經(jīng)乙醇醇沉、上清液透析和冷凍干燥，得到板藍(lán)根總多糖。根據(jù)本發(fā)明任一項所述的板藍(lán)根總多糖，其特征在于如下的(1)-(12)項中的任意一項或多項(1)步驟1)中，將浸提后得到的殘渣按照相同條件進(jìn)行一次或多次浸提，合并水提液；(2)步驟1)中所用水為蒸餾水或去離子水；(3)步驟1)中水的用量為板藍(lán)根的5-15倍量(L/Kg)；(4)步驟1)中所用板藍(lán)根為粉碎的板藍(lán)根；(5)步驟1)中所用板藍(lán)根為經(jīng)過有機(jī)溶劑(例如石油醚、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正己烷、環(huán)己烷、正丁醇、乙醇或甲醇)浸提過的板藍(lán)根殘渣(例如用75%乙醇浸提，可以是浸提&小時)；有機(jī)溶劑萃取的部分可以用于其它用途(例如分離其它的活性小分子成分)，提高了原料板藍(lán)根的利用率，對多糖或多糖組分的提取并不影響。(6)步驟1)中，浸提期間進(jìn)行攪拌；
(7)步驟1)中，將得到的水提液進(jìn)行減壓濃縮，得到濃縮的水提液；(8)步驟2~)中，乙醇醇沉的條件是醇沉后乙醇的終濃度為60-80% ；優(yōu)選地，醇沉的時間大于12小時；(9)步驟幻中，將乙醇醇沉后離心得到的沉淀再進(jìn)行一次或多次乙醇醇沉，合并上清液；(10)步驟2)中，透析所用的透析袋的截留分子量大于1000 ；該分子量范圍的透析袋能夠有效地截留多糖和寡糖；(11)步驟2)中，透析進(jìn)行一次或多次；(12)步驟幻中，在冷凍干燥之前，將得到的透析液在50°C _55°C下進(jìn)行濃縮(例如減壓濃縮)。本發(fā)明還涉及根據(jù)上述制備方法制得的板藍(lán)根總多糖。在具體的實施方案中，該板藍(lán)根總多糖具有前述任一項的板藍(lán)根總多糖的特征。根據(jù)本發(fā)明任一項所述的板藍(lán)根中性多糖組分，其通過如下步驟制得將本發(fā)明任一項的板藍(lán)根總多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，得到水洗脫部分。本發(fā)明還涉及根據(jù)上述制備方法制得的板藍(lán)根中性多糖組分。在具體的實施方案中，該板藍(lán)根中性多糖組分具有前述任一項的板藍(lán)根中性多糖組分的特征。根據(jù)本發(fā)明任一項所述的板藍(lán)根多糖組分，其通過如下步驟制得將本發(fā)明任一項的板藍(lán)根總多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，得到0. 25NaHC03洗脫部分。本發(fā)明還涉及根據(jù)上述制備方法制得的板藍(lán)根酸性多糖組分。在具體的實施方案中，該板藍(lán)根酸性多糖組分具有前述任一項的板藍(lán)根酸性多糖組分的特征。 本發(fā)明的再一方面涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明中任一項所述的板藍(lán)根多糖組分或板藍(lán)根總多糖；可選地，還包含藥學(xué)上可接受的輔料。本發(fā)明的再一方面涉及一種疫苗佐劑，其包含本發(fā)明中任一項所述的板藍(lán)根多糖組分或板藍(lán)根總多糖；具體地，所述疫苗佐劑為減毒疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗的佐劑。本發(fā)明的再一方面涉及一種疫苗制劑或疫苗組合物，其包含本發(fā)明的板藍(lán)根總多糖或板藍(lán)根多糖組分。根據(jù)本發(fā)明任一項所述的疫苗制劑或疫苗組合物，其為減毒疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、 DNA疫苗或多肽疫苗；具體地，為Hmi流感疫苗。本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明中任一項所述的板藍(lán)根多糖組分或者板藍(lán)根總多糖作為疫苗佐劑的用途；或者在制備疫苗制劑、疫苗組合物、或抗體中的用途。根據(jù)本發(fā)明任一項的用途，其中，所述疫苗制劑為減毒疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗；所述疫苗佐劑為減毒疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗的佐劑。本發(fā)明的再一方面涉及一種制備抗體的方法，包括使用有效量的本發(fā)明的板藍(lán)根多糖組分和/或板藍(lán)根總多糖的步驟；具體地，所述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。本發(fā)明的再一方面涉及一種免疫方法或者接種方法，包括給予哺乳動物有效量的疫苗制劑或疫苗組合物的步驟。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述哺乳動物是人。具體地， 所述疫苗制劑或疫苗組合物是減毒疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗；更具體地，為HlNl流感疫苗。用量須由主診醫(yī)師在可靠的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)作出決定。在本發(fā)明中，如果沒有特殊說明，術(shù)語“板藍(lán)根多糖組分”是指板藍(lán)根中性多糖組分和/或酸性多糖組分。術(shù)語“有效量”是指可在哺乳動物中實現(xiàn)免疫效果的疫苗制劑或者疫苗組合物的劑量。發(fā)明的有益效果本發(fā)明的板藍(lán)根總多糖及其中性多糖組分和酸性多糖組分均可以用作減毒疫苗、 蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗的佐劑。本發(fā)明的板藍(lán)根總多糖或多糖組分能夠作為良好的疫苗佐劑。并且本發(fā)明的板藍(lán)根總多糖和多糖組分的制備過程簡單，成本較低，并且收率較高，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1 板藍(lán)根總多糖A的DEAE-纖維素柱層析洗脫曲線(苯酚-硫酸法檢測多糖組分，490nm波長)。圖2 板藍(lán)根總多糖A的DEAE-纖維素柱層析洗脫曲線QSOnm波長下測定吸光度)。圖3 =OVA配伍BLG-A第1次免疫小鼠血清抗體滴度。mean士SD ；η = 5。圖4 :0VA配伍BLG-A第2次免疫小鼠血清抗體滴度。mean士 SD ;n = 5。圖5 :0VA配伍BLG-A第3次免疫小鼠血清抗體滴度。mean士 SD ;n = 5。圖6 =OVA配伍BLG-A (50 55°C )第1次免疫小鼠血清抗體滴度。mean SD ；η = 5。(BLG-A =Img/ 鼠；OVAO. 06mg/ 鼠)。圖7 =OVA配伍BLG-A (50 55°C )第2次免疫小鼠血清抗體滴度。mean SD ；η = 5。(BLG-A =Img/ 鼠；OVAO. 06mg/ 鼠)。圖8 :0VA配伍BLG-Al，BLG-A2第1次免疫小鼠血清抗體滴度。mean士SD ;n = 5。
圖9 :0VA配伍BLG-Al，BLG-A2第2次免疫小鼠血清抗體滴度。mean士SD ;n = 5。圖10 =OVA配伍BLG-Al，BLG-A2第3次免疫后小鼠血清抗體滴度。mean士 SD ；η = 5。圖11 =HlNl病毒配伍BLG-A1初次免疫小鼠血清抗體滴度。HlNl :3yg/鼠， BLG-Al Img/ 鼠.mean + SD ；η = 5。圖12 :Hmi病毒配伍BLG-A2初次免疫小鼠血清抗體滴度。Hmidyg/鼠， BLG-A2 0. Img/ 鼠.mean士SD ；η = 5。圖13 =BLG-Al與Hmi減毒疫苗免疫小鼠抗體滴度(Al :10mg/ml, lmg/鼠)。圖14 :BLG-A2與Hmi減毒疫苗免疫小鼠抗體滴度(A2 10mg/ml，lmg/鼠)。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實施例1 板藍(lán)根總多糖BLG-A樣品1的制備中藥材板藍(lán)根lkg，粉碎，室溫下加入IOL 75%乙醇浸泡M小時，過濾，離心 (3000r/min X IOmin)，殘渣同樣條件再浸提一次，合并濾液，40 V -45 °C減壓回收浸膏。經(jīng)過 75%乙醇浸提后的板藍(lán)根殘渣50°C烘干后，加入15L蒸餾水，在室溫下浸提M小時，期間不時攪拌；然后過濾，濾液離心IOmin(轉(zhuǎn)速3000r/min)，浸提后的板藍(lán)根殘渣在同樣條件下進(jìn)行二次提取。合并二次提取的水提液，50°C _55°C減壓濃縮至1000ml，然后加入3倍體積(3000ml)95%的乙醇進(jìn)行48-72小時的醇沉。醇沉溶液離心(3000r/minX IOmin)，沉淀部分加入IOOOml水?dāng)嚢枞芙?，離心，沉淀再同樣操作二次。合并溶解的上清液，裝入透析袋 (截留分子量> 1000)，自來水透析48小時后換蒸餾水再透析對小時。該透析液50°C-55°C 減壓濃縮至200ml左右，裝入小瓶進(jìn)行冷凍干燥，獲得淡黃色粉末，即板藍(lán)根總多糖BLG-A 樣品1(得率為0.417% )0實施例2 板藍(lán)根總多糖BLG-A樣品2的制備中藥材板藍(lán)根1kg，粉碎后加入15L蒸餾水，在50°C _55°C溫度下浸提4小時，期間不時攪拌；然后過濾，濾液離心IOmin(轉(zhuǎn)速3000r/min)，浸提后的板藍(lán)根殘渣在同樣條件下進(jìn)行二次提取。合并二次提取的水提液，50°C _55°C減壓濃縮至1000ml，然后加入3倍體積(3000ml)95%的乙醇進(jìn)行48-72小時的醇沉。醇沉溶液離心(3000r/minX IOmin)，沉淀部分加入IOOOml水?dāng)嚢枞芙?，離心，沉淀再同樣操作二次。合并溶解的上清液，裝入透析袋(截留分子量> 1000)，自來水透析48小時后換蒸餾水再透析M小時。該透析液在 500C _55°C減壓濃縮至200ml左右，裝入小瓶進(jìn)行冷凍干燥，獲得淡黃色粉末，即板藍(lán)根總多糖BLG-A樣品2 (得率為0. 438% ) ο與樣品1的制備相比，樣品2的制備方法與之相同，只是樣品1的制備使用的原料是經(jīng)過75%乙醇浸提后的板藍(lán)根殘渣，目的是獲得浸膏用于其它用途，而本發(fā)明人在后面的實驗中發(fā)現(xiàn)，這并不影響制得的板藍(lán)根總多糖的產(chǎn)品組成和效果。實施例3 板藍(lán)根中性多糖組分(BLG-Al)和酸性多糖組分(BLG-A2)的制備取實施例2制備的板藍(lán)根總多糖lg，加入蒸餾水50ml溶解，溶解液上樣DEAE-纖維素柱(cD8cmX35cm)，分別采用水、0. 25mol/LNaHCO3、0. 5mol/L NaHCO3 和 0. Imol/LNaOH 進(jìn)行連續(xù)洗脫，采用硫酸-苯酚法檢測多糖流分(圖1)，相應(yīng)獲得多糖組分BLG-Al (H2O)、 BLG-A2(0. 25mol/L NaHCO3)、BLG_A3(0. 5mol/L NaHCO3)禾PBLG-A4(0. lmol/L NaOH)，同時測定洗脫液在^Onm處的吸光度，洗脫曲線見圖2。實施例4 板藍(lán)根總多糖、中性多糖組分和酸性多糖組分的理化性質(zhì)測定實驗樣品所用板藍(lán)根總多糖為實施例2制備，中性多糖組分和酸性多糖組分為實施例3制備。1.板藍(lán)根總多糖、中性多糖組分和酸性多糖組分的含糖量(以葡萄糖計)的測定1)實驗方法采用硫酸-苯酚法測定糖含量。2)實驗結(jié)果板藍(lán)根總多糖BLG-A為淡黃色粉末，含糖量為58. 93% (以葡萄糖計算)。中性多糖組分BLG-Al為白色粉末，含糖量為98. 13% (以葡萄糖計算)。
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酸性多糖組分BLG-A2為淺黃色粉末，含糖量為92. 11% (以葡萄糖計算)。2.板藍(lán)根總多糖、酸性多糖組分的糖醛酸含量(以半乳糖醛酸計)的測定1)實驗方法采用間羥聯(lián)苯法測定糖醛酸含量。2)實驗結(jié)果板藍(lán)根總多糖BLG-A的糖醛酸含量為13. 36% (以半乳糖醛酸計算)。酸性多糖組分BLG-A2的糖醛酸含量為6. 41% (以半乳糖醛酸計算)。3.板藍(lán)根中性多糖組分和酸性多糖組分的單糖比例的測定1)實驗方法采用衍生化、氣相色譜分析獲得單糖比例。2)實驗結(jié)果中性多糖組分BLG-Al主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及少量鼠李糖、阿拉伯糖和木糖組成，摩爾比為 Rha Ara Xyl Man Glc Gal = LOO 2. 35 2.38 9.2727.47 13.03。酸性多糖組分BLG-A2主要由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖以及少量鼠李糖和甘露糖組成，摩爾比為 Rha Ara Man Glc Gal = LOO 40.06 0. 61 22.24 18.04。4.板藍(lán)根中性多糖組分和酸性多糖組分的分子量測定1)實驗方法儀器:HPLC,Waters 公司；色譜柱:TSKsw4000 ；流動相0. lMNa2S04 ；流速0. 6ml/ min ；檢測器示差。2)實驗結(jié)果中性多糖組分BLG-Al的分子量為2000-10000。酸性多糖組分BLG-A2的分子量為3000-70000。實施例5 板藍(lán)根總多糖樣品1的佐劑活性測定1.實驗?zāi)康膶嵤├?制備的板藍(lán)根總多糖BLG-A作為佐劑，以卵清蛋白(OVA)為抗原，二者聯(lián)用肌肉注射小鼠，測定產(chǎn)生的抗體滴度。2.實驗方法實驗動物Balb/C，6-8周，5只/組，雌性。藥物濃度由上述實施例1制備的板藍(lán)根總多糖BLG-A :20mg/ml ；OVA :1. 2mg/ml ； 鋁佐劑2mg/ml ；對照溶劑生理鹽水給藥劑量:0VA-60μ g/50 μ 1/ 鼠；鋁佐劑-100 μ g/50 μ 1/ 鼠；BLG-A :lmg/50 μ 1/ 鼠；分組⑴P 組:PBS+0VA ； (2)鋁佐劑組鋁佐劑 +OVA ； (3) BLG-A 組:BLG_A+0VA ； (4)溶劑對照組生理鹽水。注射前等體積混合，100 μ 1/鼠，右后肢肌肉注射。免疫方案動物按照免疫分組首次免疫注射后3周，尾靜脈取血，測定血清中抗體滴度。首次免疫注射后第3周檢測抗體滴度，第4周加強(qiáng)免疫，二次免疫注射后2周，尾靜
10脈取血，測定血清中抗體滴度，視滴度情況，測定后2周進(jìn)行第3次免疫。ELISA測定血清中抗體滴度。ELISA法所用試劑配制抗原包被液50mmol/L碳酸鹽緩沖液pH9. 6。稱取無水Na2CO3L 696g，NaHCO3 2. 856g加水溶解到IOOOml，調(diào)節(jié)pH至9. 6。洗滌液(10X PBST，ρΗ7· 4)稱取 NaCl 80g，KCl 2g，Na2HP0429g, KH2PO4 2g， Tween-20 10ml，雙蒸水至1000ml，調(diào)節(jié)pH7. 4，10倍稀釋使用。封閉液1%BSA，用 50mmol/L PBS ρΗ7· 4 溶解。底物液(TMB-H2O2)使用時將底物液A和B等體積混合，加入30 % H2O2，終濃度 0. 5%。底物液A(TMB)，稱取TMB 200mg，無水乙醇100ml，加雙蒸水至1000ml。底物液B(0. lmol/L 檸檬酸-0. 2mol/L Na2HPO4 緩沖液)，Na2HP0424. 8g，檸檬酸 19. 33g，加雙蒸水至 1000ml，調(diào)節(jié) ρΗ5· 0-5. 4。2 N H2SO4OVA溶解于抗原包被液，濃度為4 μ g/ml，包被96孔板(Costa) 100 μ 1/孔，4°C過夜。PBST洗3遍，BSA-PBS 37°C封閉lh。PBST洗3遍后加入以PBST稀釋的小鼠血清樣品，100μ 1/孔，37°C孵溫 lh。PBST 洗 3 遍，加入 HRP-羊抗小鼠 IgG(l 1000，PBST) 37°C 孵溫1，PBST洗6遍，加入100 μ 1底物液顯色后，加入50 μ 1 2 N H2SO4終止反應(yīng)測定Α45。。3.實驗結(jié)果實驗結(jié)果表明經(jīng)過第一、二次免疫所有測試組抗體滴度均比較低(圖3和圖4)，而經(jīng)過第三免疫后BLG-A注射組動物血清具有較高的抗體滴度(圖幻，說明BLG-A能顯著促進(jìn)抗體產(chǎn)生，佐劑效果優(yōu)于鋁佐劑(圖3、圖4和圖5分別為1，2，3次免疫后ELISA檢測小鼠血清抗OVA抗體滴度，平均值士SD ;n = 5)。實施例6 板藍(lán)根總多糖樣品2的佐劑活性測定具體步驟與實施例5相同，除了所用樣品為實施例2制備的板藍(lán)根總多糖樣品2。 結(jié)果如圖6、圖7所示。結(jié)果顯示，板藍(lán)根總多糖樣品2能夠有效地促進(jìn)抗體的生成。實施例7 板藍(lán)根中性多糖組分和酸性多糖組分的抗體滴度測定11.實驗?zāi)康姆謩e將實施例3中制備板藍(lán)根中性多糖組分BLG-Al和酸性多糖BLG-A2作為佐齊U，以卵清蛋白(OVA)為抗原，二者聯(lián)用肌肉注射小鼠，測定產(chǎn)生的抗體滴度。2.實驗方法具體實驗步驟參照實施例5。藥物濃度BLG-Al:10mg/ml ；BLG-A2 :10mg/ml ；OVA :1. 2mg/ml ；鋁佐劑:2mg/ml ；
對照溶劑生理鹽水。給藥劑量:0VA-60μ g/50 μ 1/ 鼠；鋁佐劑-100 μ g/50 μ 1/ 鼠;BLG-Al :0. 5mg/50 μ 1/ 鼠；BLG-A2 :0. 5mg/50 μ 1/ 鼠;分組(I)P組:PBS+0VA ； (2)鋁佐劑組鋁佐劑 +OVA ； (3) BLG-Al 組:BLG_A1+0VA ； (4)BLG-A2 組BLG-A2+0VA ；
注射前等體積混合，100 μ 1/鼠，右后肢肌肉注射。3.實驗結(jié)果板藍(lán)根總多糖BLG-A經(jīng)DEAE-纖維素柱層析分離，得到中性多糖組分BLG-Al和酸性多糖組分BLG-A2，按照免疫方案進(jìn)行進(jìn)一步的佐劑活性功能測定，經(jīng)第一、二次免疫后檢測，Al和Α2組分具有較高的免疫佐劑活性(圖8和圖9)。第三次免疫后抗體的滴度沒有明顯提高(圖2C)(圖8、圖9和圖10分別為第1，2，3次免疫后ELISA檢測小鼠血清抗OVA 抗體滴度，平均值士 SD ;n = 5)。實施例8 板藍(lán)根中件多糖組分和酸件多糖組分的抗體滴度測定2分別將實施例3制備的中性多糖組分BLG-Al和酸性多糖BLG-A2作為佐劑，與 HlNl流感疫苗(Hmi流感病毒裂解液，30μ g/ml)混和免疫小鼠，2周后同樣采用ELASI方法測定抗體滴度。實驗分為生理鹽水組、Hmi疫苗組和Hmi+BLG-Al組，結(jié)果說明Hmi病毒裂解液為免疫抗原，BLG-Al和BLG-A2作為佐劑初次免疫即可產(chǎn)生較高滴度的抗體(圖 11，圖⑵。實施例9 板藍(lán)根中件多糖組分和酸件多糖組分的抗體滴度測定3所用樣品將實施例1制備的板藍(lán)根總多糖樣品1，按照實施例3中的方法，分別制得板藍(lán)根中性多糖組分和酸性多糖組分。實驗步驟參照實施例8。結(jié)果如圖13、14所示。結(jié)果顯示，由板藍(lán)根總多糖樣品1制得的板藍(lán)根中性多糖組分和酸性多糖組分能夠有效地促進(jìn)抗體的生成。盡管本發(fā)明的具體實施方式
已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
權(quán)利要求
1.具有如下特征的板藍(lán)根多糖組分(1)其包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，并且摩爾比 Rha Ara Xyl Man Glc Gal = 1. 00 2. 35 2. 38 9. 27 27. 47 13. 03 ；(2)以葡萄糖計算，含糖量為98.13% ；(3)分子量為2000-10000。
2.具有如下特征的板藍(lán)根多糖組分(1)其包含阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖，并且摩爾比為 Rha Ara Man Glc Gal = 1. 00 40. 06 0. 61 22. 24 18. 04 ；(2)以葡萄糖計算，含糖量為92.11% ；(3)以半乳糖醛酸計算，糖醛酸含量為6.41% ；(4)分子量為3000-70000。
3.—種板藍(lán)根總多糖，其包含(1)權(quán)利要求1所述的板藍(lán)根多糖組分；和(2)權(quán)利要求2所述的板藍(lán)根多糖組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的板藍(lán)根總多糖，其特征在于(1)以葡萄糖計算，含糖量為58.93% ；(2)以半乳糖醛酸計算，糖醛酸含量為13.36%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的板藍(lán)根總多糖，其具有附圖1或者附圖2所示的特征。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項所述的板藍(lán)根總多糖，其通過如下步驟制得1)用水在50°C_55°C下浸提板藍(lán)根，得到水提液；2)將步驟1)中的水提液經(jīng)乙醇醇沉、上清液透析和冷凍干燥，得到板藍(lán)根總多糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的板藍(lán)根總多糖，其特征在于如下的(1)-(1 項中的任意一項或多項(1)步驟1)中，將浸提后得到的殘渣按照相同條件進(jìn)行一次或多次浸提，合并水提液；(2)步驟1)中所用水為蒸餾水或去離子水；(3)步驟1)中水的用量為板藍(lán)根的5-15倍量(L/Kg)；(4)步驟1)中所用板藍(lán)根為粉碎的板藍(lán)根；(5)步驟1)中所用板藍(lán)根為經(jīng)過有機(jī)溶劑(例如石油醚、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正己烷、環(huán)己烷、正丁醇、乙醇或甲醇)萃取過的板藍(lán)根殘渣；(6)步驟1)中，浸提期間進(jìn)行攪拌；(7)步驟1)中，將得到的水提液進(jìn)行減壓濃縮，得到濃縮的水提液；(8)步驟幻中，乙醇醇沉的條件是醇沉后乙醇的終濃度為60-80%;優(yōu)選地，醇沉的時間大于12小時；(9)步驟幻中，將乙醇醇沉后離心得到的沉淀再進(jìn)行一次或多次乙醇醇沉，合并上清液；(10)步驟幻中，透析所用的透析袋的截留分子量大于1000；(11)步驟幻中，透析進(jìn)行一次或多次；(12)步驟幻中，在冷凍干燥之前，將得到的透析液在50°C-55°C下進(jìn)行濃縮。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的板藍(lán)根多糖組分，其通過如下步驟制得將權(quán)利要求6或7得到的板藍(lán)根總多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，得到水洗脫部分。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的板藍(lán)根多糖組分，其通過如下步驟制得將權(quán)利要求6或7得到的板藍(lán)根總多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，得到0. 25 NaHCO3洗脫部分。
10.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至9中任一項所述的板藍(lán)根多糖組分或板藍(lán)根總多糖；可選地，還包含藥學(xué)上可接受的輔料。
11.一種疫苗佐劑，其包含權(quán)利要求1至9中任一項所述的板藍(lán)根多糖組分和/或板藍(lán)根總多糖；具體地，所述疫苗佐劑為減毒疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗的佐劑。
12.—種疫苗制劑或疫苗組合物，其包含權(quán)利要求1至9中任一項所述的板藍(lán)根多糖組分和/或板藍(lán)根總多糖；具體地，所述疫苗制劑或疫苗組合物為減毒疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、DNA 疫苗或多肽疫苗；更具體地，為Hmi流感疫苗。
13.權(quán)利要求1至9中任一項所述的板藍(lán)根多糖組分或者板藍(lán)根總多糖作為疫苗佐劑的用途；或者在制備疫苗制劑、疫苗組合物、或抗體中的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其中，所述疫苗制劑為減毒疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗；所述疫苗佐劑為減毒疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗的佐劑。
15.一種制備抗體的方法，包括使用有效量的權(quán)利要求1至9中任一項所述的板藍(lán)根多糖組分和/或板藍(lán)根總多糖的步驟；具體地，所述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種板藍(lán)根總多糖及其組分和它們作為疫苗佐劑的用途。具體地，涉及從中藥材板藍(lán)根中提取的板藍(lán)根總多糖及其中性多糖組分和酸性多糖組分，以及它們作為疫苗佐劑或用于制備疫苗組合物的用途。本發(fā)明還涉及包含上述板藍(lán)根總多糖或多糖組分的疫苗佐劑和疫苗制劑。本發(fā)明的板藍(lán)根總多糖及其中性多糖組分和酸性多糖組分均可以用作減毒疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗的佐劑。
文檔編號A61K39/39GK102462842SQ20111016872
公開日2012年5月23日 申請日期2011年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者刁玉林, 單俊杰, 姜威, 朱婷, 武軍華, 王晨宇, 王玉霞, 賈培媛, 趙修南 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所