專利名稱：一種可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的具有l(wèi)amp導(dǎo)向的bap31疫苗載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于DNA疫苗技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的具有LAMP導(dǎo)向的 BAP31疫苗載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一，因此，世界衛(wèi)生組織和各國政府衛(wèi)生部門都把攻克癌癥列為一項首要任務(wù)。在第18屆國際抗癌癥聯(lián)盟大會上，世界衛(wèi)生組織發(fā)表的一項研究報告表明，全球癌癥狀況將日益嚴(yán)重，今后20年新患者人數(shù)將由目前的每年1000萬增加到1500萬，因癌癥而死亡的人數(shù)也將由每年600萬增至1000萬。為應(yīng)對上述嚴(yán)峻形勢，報告呼吁各國制訂反癌癥的全國計劃和具體實施方案，并特別強調(diào)對癌癥預(yù)防、早期檢查和早期治療的重要意義。一直以來，特異性免疫治療是眾多研究人員力圖清除腫瘤微小殘留病的有效方法。DNA疫苗能在真核細(xì)胞中獲得持久的表達(dá)，抗原和MHC-I類分子結(jié)合后被呈遞到細(xì)胞表面，被⑶8+T細(xì)胞的受體識別而產(chǎn)生⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。BAP31即B細(xì)胞受體相關(guān)蛋白31，最初由Kim等人于1994年鑒定，由于其選擇性地與膜型IgD結(jié)合，故認(rèn)為它是B細(xì)胞受體相關(guān)蛋白家族的一個成員，命名為BAP31。成熟的BAP31分子量為^kDa,共有246個氨基酸殘基，在進(jìn)化中高度保守，人和小鼠在核酸水平和氨基酸水平上分別有91%和95%的同源性。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法，Manley等人系統(tǒng)研究了 BAP31在人體多種正常組織中的表達(dá)分布情況。研究結(jié)果顯示，BAP31在胸腺、小腦、腺垂體、甲狀腺、腎臟和卵巢組織中均有表達(dá)，但均局限于少數(shù)細(xì)胞，在骨骼肌中未見表達(dá)。胸腺組織中BAP31在淋巴細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)；小腦中主要表達(dá)于蒲肯野細(xì)胞的樹突上，軸突和胞核為陰性；腺垂體中的內(nèi)分泌細(xì)胞高表達(dá)BAP31 ；卵巢組織中顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中可見BAP31的表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞為陰性；BAP31在甲狀腺組織中主要表達(dá)于濾泡的立方上皮細(xì)胞；腎臟組織中近曲小管的立方上皮細(xì)胞中有BAP31分子的表達(dá)；而在腎上腺組織中，BAP31主要表達(dá)于皮層細(xì)胞。研究結(jié)果還顯示，BAP31在正常宮頸組織的立方上皮細(xì)胞、卵巢組織的顆粒細(xì)胞、 結(jié)腸組織和直腸組織的腺上皮細(xì)胞上有微弱表達(dá)；而在乳腺組織、食道組織、肝臟組織、肺組織中未見表達(dá)。BAP31在宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌和肺癌組織均見高水平表達(dá)，陽性率在58. 0% 87. 5%之間，陽性產(chǎn)物主要定位于胞漿。因此， BAP31是一個腫瘤相關(guān)抗原，可做為DNA疫苗研究的理想靶點。溶酶體是酸性的、富含多種蛋白水解酶的帶膜亞細(xì)胞器，也是外源性抗原加工途徑MHCII類分子器室(MIIC)的重要組成部分。外源性抗原就是在MIIC中被蛋白酶水解成合適大小的肽段，然后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊組裝、并與MIIC的MHCII類分子結(jié)合，所形成的 MHCII/抗原肽復(fù)合物，最后表達(dá)在細(xì)胞膜上，并進(jìn)一步被CD4+T細(xì)胞的抗原識別受體(TCR)所識別，誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體膜蛋白成分介導(dǎo)著非常重要的功能，包括溶酶體內(nèi)腔的酸化，氨基酸、脂肪酸及碳水化合物的轉(zhuǎn)運等。溶酶體相關(guān)膜蛋白(LAMP)是溶酶體膜上主要的蛋白成分，包括LAMP-I (⑶107a) 和LAMP-2(⑶107b)，屬I型穿膜蛋白N端溶酶體內(nèi)腔部分(lumen)、疏水穿膜部分 (transmembrane)及C末端短胞漿尾(cytoplasmic! tail)，并且該保守的C末端短胞漿尾， 在LAMP分子生物合成后被靶向到溶酶體過程中起著非常重要的作用。LAMP分子胞漿尾具有靶向作用，可通過其穿膜-胞漿區(qū)定向地結(jié)合亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)-內(nèi)吞體/溶酶體，并翻轉(zhuǎn)進(jìn)入其中。將編碼目的抗原的基因插入LAMP分子編碼溶酶體內(nèi)腔部分和胞漿尾基因之間構(gòu)成嵌合體，由于LAMP分子的導(dǎo)向作用，可將LAMP融合蛋白中的目的抗原直接攜帶進(jìn)入MIIC， 從而可實現(xiàn)DNA疫苗所表達(dá)蛋白從內(nèi)源性抗原的MHC-I類加工途徑向外源性抗原的MHC-II 類加工途徑的轉(zhuǎn)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的具有LAMP導(dǎo)向的BAP31疫苗載體及其應(yīng)用，該疫苗載體能夠高效誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，可作為抗腫瘤的DNA疫苗應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的具有LAMP導(dǎo)向的BAP31疫苗載體，是將如SEQ. ID. NO. 1 SEQ. ID. NO. 3其中之一所示的核苷酸序列連接在LAMP插入到lumen結(jié)構(gòu)域和 transmembrane/cytoplasmic! tail所述的疫苗載體是P43-LAMP-hBAP31，是將SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列通過 XhoI I和EcoR I酶切位點插入到P43-LAMP載體當(dāng)中。所述的疫苗載體是P43-LAMP-hABAP31，是將SEQ. ID. N0. 2所示的核苷酸序列通過Β ο I和EcoR I酶切位點插入到P43-LAMP載體當(dāng)中。所述的疫苗載體是P43-LAMP-mABAP31，是將SEQ. ID. NO. 3所示的核苷酸序列通過Β ο I和EcoR I酶切位點插入到P43-LAMP載體當(dāng)中。所述的可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的具有LAMP導(dǎo)向的BAP31疫苗載體應(yīng)用于抗腫瘤DNA疫苗的制備。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明將腫瘤相關(guān)基因BAP31或優(yōu)勢表位所對應(yīng)的截短基因ΔΒΑΡ31插入到LAMP 序列的lumen結(jié)構(gòu)域和transmembrane/cytoplasmid tail之間(內(nèi)腔和穿膜/胞漿尾之間)，構(gòu)建包含BAP31的重組疫苗載體，在載體被表達(dá)之后形成融合蛋白，位于LAMP分子 lumen結(jié)構(gòu)域下游的BAP31被導(dǎo)向到溶酶體當(dāng)中，進(jìn)行MHCII/抗原肽復(fù)合物的加工、裝配， 實現(xiàn)DNA疫苗內(nèi)源性抗原MHCI加工/遞呈向MHCII加工/遞呈的轉(zhuǎn)化。進(jìn)而通過將重組疫苗載體免疫小鼠，能夠高效誘導(dǎo)抗腫瘤特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，能夠特異性殺傷高表達(dá)BAP31小鼠B16黑素瘤細(xì)胞，且在小鼠體內(nèi)具有很強的抑制腫瘤細(xì)胞生長的能力，顯示出作為抗腫瘤DNA疫苗進(jìn)行抗腫瘤應(yīng)用的廣闊前景。本發(fā)明構(gòu)建的具有LAMP導(dǎo)向的BAP31疫苗載體所誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生針對腫瘤相關(guān)抗原BAP31特異性的抗體，其抗體效價可達(dá)1 1，000，000;所誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答包括增強細(xì)胞因子(包括IFN-Y和IL-4)的分泌，提高免疫脾細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，能夠特異性殺傷高表達(dá)BAP31小鼠B16黑素瘤細(xì)胞；在對小鼠惡性黑色素瘤模型免疫之后，與對照相比，能夠顯著的降低其腫瘤體的體積，具有明顯的抗腫瘤效果，顯示出作為抗腫瘤DNA疫苗進(jìn)行抗腫瘤應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建的具有LAMP導(dǎo)向的BAP31疫苗載體具體將人BAP31全長基因、人BAP31截短基因和小鼠BAP31截短基因構(gòu)建成P43_LAMP_hBAP31疫苗載體、 P43-LAMP-hABAP31疫苗載體、P43-LAMP_mΔBAP31疫苗載體。所述載體在表達(dá)之后，位于 LAMP分子lumen結(jié)構(gòu)域下游的BAP31/ Δ ΒΑΡ31均可被LAMP導(dǎo)向到MIIC，而且在免疫之后均能引起特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。


圖1為LAMP導(dǎo)向的BAP31疫苗載體的雙酶切鑒定結(jié)果圖。圖2為對照疫苗載體的雙酶切鑒定結(jié)果圖。圖3為間接ELISA檢測Π1ΔΒΑΡ31 DNA疫苗免疫后血清中mΔ BAP31特異性抗體的效價的結(jié)果圖。圖4為間接ELISA檢測hABAP31DNA疫苗免疫后血清中h Δ BAP31特異性抗體的效價的結(jié)果圖。圖5為間接ELISA檢測hBAP31 DNA疫苗免疫后血清中hBAP31特異性抗體的效價的結(jié)果圖。圖6為ELISP0T檢測mΔBAP31 DNA疫苗免疫后脾細(xì)胞的m Δ BAP31抗原特異性細(xì)胞因子分泌的結(jié)果圖。圖7為ELISP0T檢測h Δ ΒΑΡ31 DNA疫苗免疫后脾細(xì)胞的h Δ ΒΑΡ31抗原特異性細(xì)胞因子分泌的結(jié)果圖。圖8為ELISP0T檢測hBAP31 DNA疫苗免疫后脾細(xì)胞的hBAP31抗原特異性細(xì)胞因子分泌的結(jié)果圖。圖9為Π1ΔΒΑΡ31 DNA疫苗免疫后免疫脾細(xì)胞特異性殺傷高表達(dá)BAP31小鼠B16 黑素瘤細(xì)胞的效/靶比的曲線圖。圖10為hABAP31 DNA疫苗免疫后免疫脾細(xì)胞特異性殺傷高表達(dá)BAP31小鼠B16 黑素瘤細(xì)胞的效/靶比的曲線圖。圖11為hBAP31 DNA疫苗免疫后免疫脾細(xì)胞特異性殺傷高表達(dá)BAP31小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的效/靶比的曲線圖。圖12為mABAP31 DNA疫苗免疫后小鼠黑素瘤模型的腫瘤重量對比圖。圖13為hABAP31 DNA疫苗免疫后小鼠黑素瘤模型的腫瘤重量對比圖。圖14為hBAP31 DNA疫苗免疫后小鼠黑素瘤模型的腫瘤重量對比圖。
具體實施例方式本發(fā)明將腫瘤相關(guān)基因BAP31或優(yōu)勢表位所對應(yīng)的截短基因ΔΒΑΡ31插入到LAMP 序列之后，構(gòu)建包含BAP31的重組疫苗載體，該載體被表達(dá)后顯示出特異性的免疫誘導(dǎo)效果，具有抗腫瘤的特性。下面結(jié)合BAP31的重組疫苗載體的構(gòu)建、DNA疫苗的免疫及其免疫效果和抗腫瘤效果的檢測對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。以下詳細(xì)介紹克隆人BAP31或ΔΒΑΡ31(截短基因)疫苗載體的構(gòu)建過程1、人ΒΑΡ31全長及截短基因的克隆消化收集5 X IO6個Hela細(xì)胞，加入Iml Trizol溶液，室溫孵育5min，以提取總 RNA0然后加入0. 2ml氯仿，劇烈震蕩15s，室溫孵育3min ；4°C, < 12000Xg，離心15s，將上層水樣層取出，加入0. 5ml異丙醇，混勻，室溫孵育lOmin。4°C，12000 X g，離心15s，棄上清。75%乙醇洗滌沉淀，4°C，7500 Xg離心15s，棄盡上清，開蓋置室溫5 IOmin JnDEPC 水溶解，取少量樣品稀釋后，紫外分光光度計測定RNA濃度。以總RNA為模板，Oligo dT為引物，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。其中，上游引物為atgagtctgc agtggactg ；下游弓丨物為:ttactcttcc ttcttgtcca t ；PCR擴增人BAP31基因全長74Ibp，收集并純化PCR擴增產(chǎn)物之后AT克隆入 PMD-18T載體中并測序，將克隆入的BAP31基因測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的人BAP31序列比對，序列一致。以測序正確的包含人BAP31全長基因的pMD-18T-BAP31為模板，設(shè)計擴增引物，擴增人BAP31基因463-741bp (其對應(yīng)的氨基酸為15fea_M6aa)的截短基因h Δ BAP31，所設(shè)計的引物為上游弓 I物為:gaccagctca agaagggagc ；下游弓丨物為:ttactcttcc ttcttgtcca t ；PCR擴增長度為279bp的人BAP31基因的截短基因h Δ BAP31，收集并純化PCR擴增產(chǎn)物之后AT克隆入pMD-18T載體中并測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的人ΒΑΡ31序列比對，對應(yīng)的序列一致。2、小鼠ΒΑΡ31截短基因(ι ΔΒΑΡ31)的克隆消化收集5 X IO6個小鼠黑色素瘤Β16細(xì)胞，Trizo法提取總RNA，以總RNA 為模板，Oligo dT為引物，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，克隆小鼠BAP31基因 463-738bp(155aa-245aa)的截短基因ι ΔΒΑΡ31，所設(shè)計的引物為上游弓 I物為:gatcagctaa agaagggagc ；下游弓丨物為ttactcctcc ttcttgactg ；PCR擴增長度為276bp的小鼠BAP31截短基因πιΔΒΑΡ31，收集并純化PCR擴增產(chǎn)物之后AT克隆入pMD-18T載體中并測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的小鼠ΒΑΡ31序列比對，對應(yīng)的序列一致。3、疫苗載體的構(gòu)建3. ILAMP導(dǎo)向的ΒΑΡ31疫苗載體的構(gòu)建以測序正確的PMD-18T載體為模板，設(shè)計特異性引物，在ΒΑΡ31基因(包括人全長 hBAP31基因、人463-741bp截短hABAP31基因、小鼠463_738bp截短ι ΔΒΑΡ31基因)上下游分別加入》ιο I和EcoR I限制性內(nèi)切酶位點(下劃線所標(biāo)注)，所設(shè)計的引物為人全長hBAP31基因上游弓丨物為:ttctcRaRat gagtctgcag tggactg ；
下游弓I物為:ttgaattctt actcttcctt cttgtccat ；人463-74Ibp 截短 h Δ ΒΑΡ31 基因上游弓 I物為:ttctcgagga ccagctcaag aagggagc ；下游弓I物為:ttgaattctt actcttcctt cttgtccat ；小鼠463_738bp 截短 m Δ ΒΑΡ31 基因上游弓 I物為:ttctcgagga tcagctaaag aagggagc ；下游弓I物為:ttgaattctt actcctcctt cttgactg ；PCR擴增相應(yīng)片段，經(jīng)Β ο I和EcoR I雙酶切后克隆入P43-LAMP載體中，構(gòu)建重組BAP31疫苗載體。P43-LAMP載體中LAMP元件為表達(dá)Lamp分子的全長基因，而BAP31基因通過LAMP 序列的 lumen 結(jié)構(gòu)域禾口 transmembrane/cytoplasmid tail 之間的 Xho I 禾口 EcoR I 多克隆位點插入，在載體表達(dá)之后形成融合蛋白，這樣目標(biāo)基因BAP31所表達(dá)的蛋白就可被LAMP 導(dǎo)向至MIIC，以加強其抗原遞呈；P43-LAMP載體具體由美國霍普金斯大學(xué)August教授惠贈。對構(gòu)建的重組載體用Bio I和EcoR I雙酶切后，10g/L瓊脂糖電泳鑒定，鑒定結(jié)果如圖ι所示，其中，泳道1為Marker、泳道2為P43_LAMP/hBAP31載體酶切結(jié)果、泳道3為 P43-LAMP/hABAP31載體酶切結(jié)果、泳道4為P43_LAMP/mΔBAP31載體酶切結(jié)果，可以看到泳道2、3、4中均出現(xiàn)了目標(biāo)條帶，說明ΒΑΡ31或ΔΒΑΡ31插入到正確的位置；而且將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的相應(yīng)序列比對，所對應(yīng)的序列一致。將插入SEQ. ID. NO. 1、SEQ. ID. NO. 2、SEQ. ID. NO. 3 所示的 hBAP31、 h Δ BAP31、m Δ ΒΑΡ31基因所構(gòu)建的疫苗載體分別命名為P43_LAMP_hBAP31疫苗載體、 P43-LAMP-h Δ ΒΑΡ31 疫苗載體、P43-LAMP_m Δ ΒΑΡ31 疫苗載體。3. 2不含LAMP的對照疫苗載體的構(gòu)建以測序正確的PMD-18T載體為模板，設(shè)計特異性引物，在BAP31基因(包括人全長 hBAP31基因、人463-741bp截短hABAP31基因、小鼠463_738bp截短ι ΔΒΑΡ31基因)上下游分別加入Nhe I和Kpn I限制性內(nèi)切酶位點(下劃線標(biāo)注)，所設(shè)計的引物為人全長hBAP31基因上游弓丨物為:ttRctaRcat gagtctgcag tggactg ；下游弓I物為:ttRRtacctt actcttcctt cttgtccat ；人463_741bp 截短 hABAP31 基因上游弓 I物為:ttgctagcga ccagctcaag aagggagc ；下游弓I物為:ttRRtacctt actcttcctt cttgtccat ；小鼠463_738bp 截短 m Δ ΒΑΡ31 基因上游弓 I物為:ttgctagcga tcagctaaag aagggagc ；下游弓I物為:ttRRtacctt actcctcctt cttgactg ；PCR擴增相應(yīng)片段，經(jīng)Nhe I和Kpn I雙酶切后克隆入P43載體中，構(gòu)建不含LAMP 的對照疫苗載體。將構(gòu)建的對照疫苗載體用Nhe I和Kpn I雙酶切后，10g/L瓊脂糖電泳鑒定插入片段，檢測結(jié)果如圖2所示，其中，泳道1為Marker、泳道2為P43_hBAP31載體酶切結(jié)果、泳道3為P43-h Δ ΒΑΡ31載體酶切結(jié)果、泳道4為P43_m Δ ΒΑΡ31載體酶切結(jié)果，可以看到泳道 2、3、4中均出現(xiàn)了目標(biāo)條帶，說明ΒΑΡ31或ΔΒΑΡ31插入到正確的位置；而且將測序結(jié)果與 NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的相應(yīng)序列比對，所對應(yīng)的序列一致。以上所構(gòu)建的P43-LAMP-hBAP31疫苗載體、P43_LAMP_h Δ ΒΑΡ31疫苗載體、 P43-LAMP-mABAP31疫苗載體作為疫苗載體進(jìn)行免疫后，均可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答并對小鼠黑色素瘤有顯著治療效果。以下以P43-LAMP-mABAP31疫苗載體為例詳細(xì)介紹該疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的能力，并分別給出3種疫苗載體對小鼠黑色素瘤的治療效果。4、LAMP分子導(dǎo)向的小鼠Δ ΒΑΡ31疫苗載體能夠誘導(dǎo)小鼠Δ ΒΑΡ31特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答4. 1免疫方案將小鼠分為實驗組(P43-LAMP_mABAP31)禾Π對照組 (P43-m Δ ΒΑΡ31、PBS)，DNA 疫苗載體(P43-LAMP_m Δ ΒΑΡ31、P43_m Δ ΒΑΡ31)以 50 μ g/ 只的劑量尾根部皮下免疫8周齡雌性C57BL/6小鼠，每次間隔4周，共免疫3次。初次免疫前采集正常小鼠血清，第3次免疫后1周經(jīng)尾靜脈取血，分離免疫血清，-20°C保存。4. 2.免疫小鼠血清中m Δ ΒΑΡ31特異性抗體的檢測采用間接ELISA法檢測ΒΑΡ31特異性抗體效價，具體操作為將重組表達(dá)的Π1ΔΒΑΡ31蛋白包被ELISA板，4°C過夜。次日洗板并加入系列稀釋 (1 100、1 200、1 500、1 1, OOOU 10，000、1 100，000、1 1,000,000)的質(zhì)粒DNA免疫過的小鼠免疫血清(一抗)，100 μ L/孔，37°C孵育Ih ；洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG (二抗)，100 μ L/孔，37°C孵育Ih后洗板，ABTS顯色10 30min。然后將 ELISA板置于酶標(biāo)儀測定波長410nm處各孔OD值，陽性孔的最大稀釋度即為免疫小鼠血清中的抗體效價。特異性抗體效價的檢測結(jié)果如圖3所示，在第3次免疫后，P43-LAMP_m Δ ΒΑΡ31組、 Ρ43-πιΔΒΑΡ31組的免疫血清當(dāng)中包含特異性針對ΔΒΑΡ31蛋白的抗體，其抗體效價高低為 P43-LAMP-mABAP31 組> Ρ43_πιΔΒΑΡ31 組> PBS 組，而 P43-LAMP_m Δ ΒΑΡ31 組抗體效價可達(dá) 1 1，000，000。用相同的免疫方案和抗體檢測方法，疫苗載體P43-LAMP_h Δ ΒΑΡ31、 P43-LAMP-hBAP31免疫后的特異性抗體效價的檢測結(jié)果如圖4、圖5所示，均能檢測出相應(yīng)的抗體，而且高于相應(yīng)的對照組。4. 3ELISP0T法檢測細(xì)胞免疫應(yīng)答在第三次免疫后2周分別取各組免疫小鼠2只，分離脾細(xì)胞進(jìn)行ELISP0T檢測用IFN- γ或IL-4捕獲抗體以5 μ g/mL包被96孔PVDF濾膜板，4°C過夜。次日用不含血清RPMI 1640洗滌2遍，然后用10% FCS的RPMI1640封閉，200 μ L/孔，室溫濁；分離小鼠脾細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1. 0 X IO7個/mL，100 μ L/孔，加入板內(nèi)；加入重組表達(dá)的小鼠ΔΒΑΡ31蛋白(1 μ g/mL)，100 μ L/孔，三個復(fù)孔，同時設(shè)ConA(終濃度為5mg/L)陽性對照和完全培養(yǎng)基陰性對照，37°C、5% CO2孵育Mh。洗板，拍干后，每孔加入1 μ g/mL生物素化IFN- γ或IL-4檢測抗體100 μ L，室溫孵育池；洗板拍干后，加入HRP-鏈霉親和素 100 μ L/孔，室溫孵育Ih ；加入AEC (BD公司)底物顯色，室溫避光靜置15 45min，待斑點形成后，自來水沖洗，終止顯色過程，晾干，ELISP0T自動讀板儀計數(shù)。
檢測結(jié)果如圖6所示，在DNA質(zhì)粒免疫之后，免疫脾細(xì)胞分泌IFN- γ和IL_4的水平為P43-LAMP-mABAP31 組> Ρ43_πιΔΒΑΡ31 組> PBS 組。P43-LAMP_mΔ ΒΑΡ31 組脾細(xì)胞分泌IFN- γ和IL-4的頻率分別為323/1 X IO6個細(xì)胞和119/1 X IO6個細(xì)胞，遠(yuǎn)高于對照組 (P < 0. 01)，且P43-LAMP-mABAP31組遠(yuǎn)高于Ρ43_πιΔΒΑΡ31組；這表明所構(gòu)建的DNA疫苗載體所表達(dá)的LAMP分子，能夠增強抗原特異性細(xì)胞因子的分泌。用相同的免疫方案和ELISP0T檢測，疫苗載體P43-LAMP_hABAP31、 P43-LAMP-hBAP31免疫后的檢測結(jié)果分別如圖7、圖8所示，表現(xiàn)出相近的效果，均能夠增強抗原特異性細(xì)胞因子的分泌。4. 4、乳酸脫氫酶(LDH)釋放法進(jìn)行細(xì)胞毒活性檢測采用Cyt0I10x 96試劑盒對DNA疫苗載體免疫后的C57BL/6小鼠T細(xì)胞的CTL功能進(jìn)行檢測無菌條件下分離免疫后C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，計數(shù)后用含10% FCS的RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞濃度為1. OX IO7AiL備用。將高水平表達(dá)BAP31分子的小鼠黑素瘤細(xì)胞B16作為靶細(xì)胞，調(diào)整靶細(xì)胞濃度lX106/mL。設(shè)置效應(yīng)細(xì)胞(免疫鼠脾細(xì)胞)和靶細(xì)胞(小鼠黑素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞)的比例分別為50 1、25 1、和12.5 1，每個效靶比設(shè)置3復(fù)孔，同時設(shè)置效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔、靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔、靶細(xì)胞最大釋放孔、培養(yǎng)液背景對照和體積校正對照，37°C ,5% CO2孵箱培養(yǎng)4h。加入SubstrateMix顯色系統(tǒng)， 檢測LDH的釋放，490nm波長測定吸光度(A)值。殺傷率(％ )=(試驗孔A值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔A值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔A值)/ (靶細(xì)胞最大釋放孔A值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔 A 值)X100%。細(xì)胞毒活性檢測結(jié)果如圖9所示，在效靶比為50 1時，P43-LAMP_mABAP31組可誘導(dǎo)良好的CTL殺傷活性，64%的B16細(xì)胞被殺傷，而P43-m Δ ΒΑΡ31組殺傷率僅為40% ； 這表明經(jīng)過LAMP分子導(dǎo)向之后，目標(biāo)蛋白能夠被有效的遞呈，在小鼠被免疫之后，脾細(xì)胞中特異性CTL的細(xì)胞毒活性顯著提高，能夠特異性殺傷高表達(dá)BAP31小鼠B16黑素瘤細(xì)胞。用相同的免疫方案和細(xì)胞毒活性檢測方法，疫苗載體P43-LAMP_h Δ ΒΑΡ31、 P43-LAMP-hBAP31免疫后的CTL功能檢測結(jié)果分別如圖10、圖11所示，表現(xiàn)出相近的效果， 在被免疫之后，脾細(xì)胞的細(xì)胞毒活性顯著提高，能夠特異性殺傷高表達(dá)BAP31的B16黑素瘤細(xì)胞。4. 5、重組BAP31疫苗載體作為DNA疫苗的體內(nèi)抗腫瘤效果以小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞系B16接種C57BL/6小鼠背部皮下，接種腫瘤細(xì)胞系后1天，將p43-LAMP-mABAP31載體和對照載體(p43_mΔ BAP31)分別免疫(以50 μ g/ 只的劑量行尾根部皮下免疫)，并設(shè)立PBS對照組，每間隔1周加強免疫1次，共免疫5 次。末次免疫后兩周，取出小鼠體內(nèi)的腫瘤稱重，具體結(jié)果如圖12所示，可以明顯看出免疫P43-LAMP-m Δ ΒΑΡ31和P43_m Δ ΒΑΡ31載體的實驗組腫瘤重量分別為2. 02 士 0. 23g和 3. 98士0. 37g，均比對照組(15. 62士2. 61g)低，而P43-LAMP_mΔBAP31組效果更顯著，這表明重組ΒΑΡ31疫苗載體可以作為抗腫瘤的DNA疫苗。用相同的免疫方案和腫瘤重量檢測方法，疫苗載體P43-LAMP_h Δ ΒΑΡ31、 P43-LAMP-hBAP31免疫后的腫瘤重量檢測結(jié)果分別如圖13、圖14所示，表現(xiàn)出相近的效果， 這表明P43-LAMP-h Δ ΒΑΡ31、P43_LAMP_hBAP31疫苗載體均可以作為抗腫瘤的DNA疫苗。
權(quán)利要求
1.一種可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的具有LAMP導(dǎo)向的BAP31疫苗載體，其特征在于，是將如SEQ. ID. NO. 1 SEQ. ID. NO. 3其中之一所示的核苷酸序列插入到LAMP序列的lumen結(jié)構(gòu)域和 transmembrane/cytoplasmic! tail
2.如權(quán)利要求1所述的可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的具有LAMP導(dǎo)向的BAP31疫苗載體，其特征在于，所述的疫苗載體是P43-LAMP-hBAP31，是將SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列通過Β ο I 和EcoR I酶切位點插入到P43-LAMP載體當(dāng)中。
3.如權(quán)利要求1所述的可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的具有LAMP導(dǎo)向的BAP31疫苗載體，其特征在于，所述的疫苗載體是P43-LAMP-h Δ ΒΑΡ31，是將SEQ. ID. NO. 2所示的核苷酸序列通過)(ho I和EcoR I酶切位點插入到P43-LAMP載體當(dāng)中。
4.如權(quán)利要求1所述的可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的具有LAMP導(dǎo)向的BAP31疫苗載體，其特征在于，所述的疫苗載體是P43-LAMP-mABAP31，是將SEQ. ID. NO. 3所示的核苷酸序列通過)(ho I和EcoR I酶切位點插入到P43-LAMP載體當(dāng)中。
5.權(quán)利要求1所述的可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的具有LAMP導(dǎo)向的BAP31疫苗載體應(yīng)用于抗腫瘤DNA疫苗的制備。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的具有LAMP導(dǎo)向的BAP31疫苗載體及其應(yīng)用，將腫瘤相關(guān)基因BAP31或優(yōu)勢表位所對應(yīng)的截短基因ΔBAP31插入到LAMP序列的lumen結(jié)構(gòu)域和transmembrane/cytoplasmid tail之間，構(gòu)建包含BAP31的重組疫苗載體。在載體被表達(dá)之后形成融合蛋白，可使位于LAMP分子內(nèi)腔和穿膜/胞漿尾之間的BAP31被導(dǎo)向到溶酶體當(dāng)中，進(jìn)行MHCII/抗原肽復(fù)合物的加工、裝配，進(jìn)而通過將重組疫苗載體免疫小鼠，能夠高效誘導(dǎo)抗腫瘤特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，能夠特異性殺傷高表達(dá)BAP31小鼠B16黑素瘤細(xì)胞。
文檔編號A61K39/00GK102210875SQ201110147000
公開日2011年10月12日 申請日期2011年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月2日
發(fā)明者孫元杰, 宋朝君, 李海濤, 楊琨, 金伯泉, 魏玉英 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)