專利名稱：2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制藥中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物的用途，尤其涉及在制藥領(lǐng)域的用途。
背景技術(shù)：
肝炎疾病是全世界各地包括中國(guó)影響最大的疾病之一，其病因大致可分為感染性慢性乙型(HBV)、丙型(HCV)和丁型(HDV)病毒性肝炎，血汲蟲病等；或非感染性先天性代謝缺陷(肝豆?fàn)詈俗冃?、血色病、?I-抗胰蛋白酶缺乏癥等)及化學(xué)代謝缺陷(慢性酒精性肝病、慢性藥物性肝病)及自身免疫性肝炎、原發(fā)性肝汁性肝硬化和原發(fā)性硬化性膽管炎等。其中，肝炎病毒感染是目前在全世界各地(主要為第三世界國(guó)家)覆蓋面積巨大和人口眾多的疾病，有數(shù)以十億人被感染。中國(guó)有十三億人口，也是肝炎病毒感染與肝炎的 高發(fā)區(qū)，超過百分之十的中國(guó)人口是被肝炎病毒感染過的，我國(guó)肝炎病人HBV標(biāo)記陽性的病人達(dá)到85% -90%，但是日本，歐洲與北美洲的肝炎病人背景主要是HCV。人群HBsAg陽性者，其患肝癌的相對(duì)危險(xiǎn)性為HBsAg陰性者的10-50倍。目前雖然已有乙肝疫苗，但還沒有丙肝疫苗，不能全面預(yù)防感染性肝炎的發(fā)生，加上我國(guó)很多人有酗酒和吸煙習(xí)慣，和其他環(huán)境與遺傳因素，肝炎又會(huì)發(fā)展成為肝硬化以至肝癌，因此肝癌發(fā)病率在中國(guó)也是非常高。肝炎和肝癌病人常年受病魔折磨，醫(yī)療費(fèi)用奇高，目前治療肝炎和肝癌的干擾素，白細(xì)胞介素和抗病毒藥物等都所費(fèi)不菲，而效果差強(qiáng)人意，其引發(fā)個(gè)人與社會(huì)的經(jīng)濟(jì)損失數(shù)以百千億計(jì)，因此有必要發(fā)展新的藥物與治療方法，以應(yīng)付廣大肝病病人燃眉之急。本申請(qǐng)發(fā)明人多年來對(duì)肝癌，肝炎，和肝硬化疾病作深入的研究，發(fā)現(xiàn)一個(gè)雜環(huán)嘌呤小分子化合物2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物其能夠抑制活性肝星狀細(xì)胞合成I型膠原質(zhì)，其可被開發(fā)成為一治療肝炎和肝纖維化的有效藥物。2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤,又名Programin或reversine,其結(jié)構(gòu)式如下
C^nh
該化合物的分子式為C21H27N7O,分子量為393。
H N H
O

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供雜環(huán)嘌呤小分子化合物2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物的新用途，即在制藥中的新用途。本發(fā)明涉及2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制備治療或預(yù)防感染性肝炎的藥中的用途。
涉及2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制備治療或預(yù)防非感染性肝炎的藥中的用途。涉及2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制備治療或預(yù)防肝損傷的藥中的用途。涉及2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制備治療或預(yù)防肝硬化的藥中的用途。
涉及2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制備治療或預(yù)防肝癌的藥中的用途。涉及2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制備治療或預(yù)防肝纖維化的藥中的用途。涉及2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制備保護(hù)或改善肝功能的藥中的用途。還涉及2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物與靶向分子或載體包括維生素A偶聯(lián)脂質(zhì)體聯(lián)合在制備治療或預(yù)防感染性肝炎、非感染性肝炎、肝損傷、肝硬化、肝癌、肝纖維化、保護(hù)或改善肝功能的藥中的用途。本發(fā)明的2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物可以制備成藥學(xué)常規(guī)藥物制劑如片劑、膠囊劑、注射劑、脂質(zhì)體等。也可以與靶向分子或載體包括維生素A偶聯(lián)脂質(zhì)體制備成藥學(xué)常規(guī)藥物制劑。除非特別指明，這里所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常所理解的含義相同。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于I、本發(fā)明對(duì)已知化合物2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物挖掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。2、本發(fā)明的2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤能夠完全抑制活性肝星狀細(xì)胞合成I型膠原質(zhì)，同時(shí)肝星狀細(xì)胞仍保持健康，顯示其具有治療或預(yù)防感染性肝炎、非感染性肝炎、肝損傷、肝硬化、肝癌、肝纖維化、保護(hù)或改善肝功能的作用。3、本發(fā)明的2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤在體內(nèi)能實(shí)現(xiàn)直接抑制膠原質(zhì)的合成與表達(dá)，減慢肝纖維化的進(jìn)展，并且可以逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的肝纖維化甚至早期肝硬化，可以大幅度降低發(fā)病率和死亡率，預(yù)示著有很好的用藥前景。4、本發(fā)明化合物來源豐富，制備工藝簡(jiǎn)單。


圖I.正常肝至肝纖維化、再至肝硬化、直至肝衰竭導(dǎo)致死亡的過程圖。圖2. 2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤處理過的活化肝星狀細(xì)胞失去合成與表達(dá)膠原質(zhì)-I型的能力圖。圖2A&2B顯示活化肝星狀細(xì)胞合成I型膠原質(zhì)。圖2C&2D顯示2- (4_嗎啉苯胺)_6_環(huán)己基氨基嘌呤(處理3天后)抑制活化肝星狀細(xì)胞合成I型膠原質(zhì)。圖3. 2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤處理過的活化肝星狀細(xì)胞失去合成與表達(dá)MMP-2和MMP-3的能力圖。圖3A中顯示活化肝星狀細(xì)胞合成和表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (MMP-2)。圖3C中顯示活化肝星狀細(xì)胞合成和表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-3 (MMP-3)。圖3B中顯示2- (4-嗎啉苯胺)_6_環(huán)己基氨基嘌呤(處理3天后)抑制活化肝星狀細(xì)胞合成和表達(dá)MMP-2。圖3D中顯示2- (4-嗎啉苯胺)_6_環(huán)己基氨基嘌呤(處理3天后)抑制活化肝星狀細(xì)胞合成和表達(dá)MMP-3。圖4. 2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤處理過的活化肝星狀細(xì)胞失去合成與表達(dá) ΜΡ-2和 ΜΡ-3的能力。
圖4A中顯示活化肝星狀細(xì)胞合成和表達(dá)組織金屬蛋白酶抑制劑-2 (TIMP-2)。圖4C中顯示活化肝星狀細(xì)胞合成和表達(dá)組織金屬蛋白酶抑制劑-3 (TIMP-3)。圖4B中顯示2- (4-嗎啉苯胺)_6_環(huán)己基氨基嘌呤(處理三天后)抑制活化肝星狀細(xì)胞合成和表達(dá) ΜΡ-2。圖4D中顯示2- (4-嗎啉苯胺)_6_環(huán)己基氨基嘌呤(處理三天后)抑制活化肝星狀細(xì)胞合成和表達(dá) ΜΡ-3。圖5.2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤處理過的以四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)小鼠肝炎和肝纖維化。圖5a為使用生理鹽水處理15天以后的肝組織切片圖。圖5b為使用2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤處理15天后(50 μ g/公斤)的肝纖維組織切片圖。圖5c為使用2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤處理15天后(100 μ g/公斤)的肝纖維組織切片圖。圖5d為四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)肝炎和肝纖維化6周后，再使用生理鹽水處理15天以后的肝組織切片圖。圖5e為四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)肝炎和肝纖維化6周后，再使用2_(4_嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤處理15天后(50yg/公斤)的肝纖維組織切片圖。圖5f為四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)肝炎和肝纖維化6周后，再使用2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤處理15天后(IOOyg/公斤)的肝纖維組織切片圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一藥理試驗(yàn)一、2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的抑制作用大鼠肝星狀細(xì)胞分離用鏈霉蛋白酶和膠原酶通過原位灌流技術(shù)分離成年雄性Sprague-Dawley大鼠(500-600克)的肝臟。原始細(xì)胞懸液通過非連續(xù)性的逐級(jí)離心,其純化程度達(dá)到95%以上的同質(zhì)性。細(xì)胞用未密封的塑料組織容器懸浮培養(yǎng)于含20% FBS的DMEM(Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基)培養(yǎng)液，細(xì)胞密度為I. 5X 105cells/cm2。2天后，洗掉細(xì)胞碎片和未粘附的細(xì)胞，得到大鼠肝星狀細(xì)胞。大鼠肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)用含有20%的胎牛血清(FBS)和青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100ug/ml)的DMEM培養(yǎng)液在37°C，5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)得到的大鼠肝星狀細(xì)胞，培養(yǎng)液每4天更換一次。2- (4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的抑制作用經(jīng)過大約十天的培養(yǎng)后，大鼠肝星狀細(xì)胞變得活躍，加入5-10 μ M的2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤，之后換成DMEM(Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基)+20% FBS培養(yǎng)24小時(shí)，微陣列收獲細(xì)胞，處理后24-48小時(shí)內(nèi)用免疫熒光和RT-PCR的方法進(jìn)行分析。在免疫熒光分析實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞用200ul的細(xì)胞裂解物(50mM NaCl, 20mM Tris (三羥甲基氨基甲烷)，pH 7. 6，1%諾乃洗滌劑(Nonidet P-40)，Ix蛋白酶抑制劑混合物)裂解I小時(shí)。之后4°C，16，000離心力，離心IOmin去除細(xì)胞裂解產(chǎn)物.用蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒測(cè)量天然蛋白質(zhì)的濃度。取總蛋白量25 μ g的蛋白裂解液以及彩色分子量marker作為標(biāo)記物，膠原蛋白-I，MMP-2和TIMP的單克隆抗體(Santa Cruz Lab)來檢測(cè)，用兔β -肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(I 1000稀釋)或者β-微管蛋白(I 1000稀釋)孵育印跡。然后用抗大鼠或抗兔的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示
1、2-(4_嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤處理的活化肝星狀細(xì)胞失去合成與表達(dá)膠原質(zhì)-I型的能力(如圖2所示)，圖2A&2B顯示活化肝星狀細(xì)胞合成I型膠原質(zhì)。圖2C&2D顯示2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤抑制活化肝星狀細(xì)胞合成I型膠原質(zhì)。2,2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤處理過的活化肝星狀細(xì)胞失去合成與表達(dá)MMP-2和MMP-3的能力(如圖3所示)，圖3A&3C顯示活化肝星狀細(xì)胞合成和表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP_2)和MMP-3。圖3B&3D顯示2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤抑制活化肝星狀細(xì)胞合成和表達(dá)MMP-2和MMP-3。3、2-(4_嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤處理過的活化肝星狀細(xì)胞失去合成與表達(dá) ΜΡ-2和 ΜΡ-3的能力(如圖4所示)。圖4A&4C顯示活化肝星狀細(xì)胞合成和表達(dá)組織金屬蛋白酶抑制劑-20 ΜΡ-2)和 ΜΡ-3。圖4B&4D顯示2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤抑制活化肝星狀細(xì)胞合成和表達(dá) ΜΡ-2和 ΜΡ-3。二、2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤對(duì)小鼠體內(nèi)肝炎和肝纖維化的影響取ICR小鼠24只分4組，每組6只，第一組只給四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)肝炎和肝纖維化；第二組給予四氯化碳誘導(dǎo)肝炎和肝纖維化，加上低量2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤(Sigma公司)(50微克/公斤)i. p.注射4次；第三組給予四氯化碳誘導(dǎo)肝炎和肝纖維化，加上高量2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤(100微克/公斤)i. p.注射4次；第四組給予四氯化碳誘導(dǎo)肝炎和肝纖維化，加上高量2- (4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤(100微克/公斤)i. p.注射8次。處死小鼠，切割肝組織樣品，用4%的多聚甲醛固定24小時(shí)，之后用石蠟浸泡。切組織成為5微米厚度的切片。用免疫組化，免疫熒光法和Western blot分析法確定組織中膠原蛋白肝的蛋白量，同時(shí)利用RT-PCR法確定其mRNA水平，以纖維指數(shù)(fitoolndex)檢驗(yàn)肝纖維化程度。結(jié)果如圖5所示，2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤能抑制膠原質(zhì)表達(dá)和肝纖維化。在小鼠體內(nèi)證實(shí)2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤在50-100微克/公斤能有效抑制膠原質(zhì)的表達(dá)和肝纖維化。實(shí)施例二攜帶2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤的維生素A偶聯(lián)脂質(zhì)體的制備在凍干的陽性脂質(zhì)體(O,O ' -ditetradecanoyl-N-(a -trimethylammonioacetyl) diethanolamine chloride (0, - 二肉豆載釀 _N_( α -三甲酷按乙釀)二乙醇胺氯)(DC-6-14)、膽固醇和 dioleoylphosphatidyle-Thanolamine ( 二油酸憐脂酸乙醇胺)，分子比例為4 3 3)中加入雙蒸水，使(DC-16-4)的濃度為ImM，使用之前振蕩。將200nmol的維生素A溶于DMSO中，在25°C條件下與IOOnmol的上述制備好的陽性脂質(zhì)體懸液混合于I. 5ml管中，并振蕩得到維生素A脂質(zhì)體。將2- (4-嗎啉苯胺)_6_環(huán)己基氨基嘌呤加入上述維生素A脂質(zhì)體中，2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤與DC-16-4的比例為I : 11. 5(mol/mol) ,2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤與維生素A脂質(zhì)體的比例為I : l(wt/wt)。自由維生素A和未被吸收的2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤將用一個(gè)微分系統(tǒng)從脂質(zhì)體的配制劑中分離出來。脂質(zhì)體懸液加入至過濾器，1，500離心力在25°C條件下離心三次，每次五分鐘。得到攜帶2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤的維生素A偶聯(lián)脂質(zhì)體。2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤維生素A/脂質(zhì)體制劑成分配比如表I所示。
表I :2-(4-嗎啉苯胺)-6_環(huán)己基氨基嘌呤維生素A/脂質(zhì)體制劑成分配比
權(quán)利要求
1.2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制備治療或預(yù)防感染性肝炎的藥中的用途。
2.2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制備治療或預(yù)防非感染性肝炎的藥中的用途。
3.2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制備治療或預(yù)防肝損傷的藥中的用途。
4.2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制備治療或預(yù)防肝硬化的藥中的用途。
5.2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制備治療或預(yù)防肝癌的藥中的用途。
6.2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制備治療或預(yù)防肝纖維化的藥中的用途。
7.2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物在制備保護(hù)或改善肝功能的藥中的用途。
8.2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物與靶向分子或載體包括維生素A偶聯(lián)脂質(zhì)體聯(lián)合在制備治療或預(yù)防感染性肝炎、非感染性肝炎、肝損傷、肝硬化、肝癌、肝纖維化、保護(hù)或改善肝功能的藥中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種2-(4-嗎啉苯胺)-6-環(huán)己基氨基嘌呤及其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物的新用途。該化合物可抑制活化肝星狀細(xì)胞合成與表膠原蛋白和其他外間質(zhì)蛋白包括MMPs和TIMPs的合成與表達(dá)，對(duì)肝纖維化有抑制作用，在體內(nèi)能抑制膠原質(zhì)的合成與表達(dá)，有效逆轉(zhuǎn)與治療肝炎和肝纖維化，與靶向分子或載體包括維生素A偶聯(lián)脂質(zhì)體，單獨(dú)或聯(lián)合使用，在制備治療或預(yù)防感染性肝炎、非感染性肝炎、肝損傷、肝硬化、肝癌、肝纖維化、保護(hù)或改善肝功能的藥中的用途。
文檔編號(hào)A61K31/5377GK102805747SQ201110146859
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2011年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月1日
發(fā)明者李嘉豪, 陳若翰, 侯志波, 潘全威 申請(qǐng)人:漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司