專利名稱：Peg化白介素15的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化學(xué)修飾的聚乙二醇白介素15偶合物，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
白細胞介素15(IL_15)是Grabstein等人于1994年發(fā)現(xiàn)的一種約為12_14kD的 細胞因子，天然人白介素15成熟肽含有114個氨基酸，包括4個半胱氨酸殘基，Cys35與 Cys85、Cys42與Cys88連接，形成的兩對分子內(nèi)二硫鍵對于保持IL-15的空間構(gòu)象和生物
學(xué)活性起重要作用。與大多數(shù)細胞因子相似，IL-15可在機體正常的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，如促進T 細胞、B細胞、自然殺傷(NK)細胞的發(fā)育等，IL-15還可對免疫系統(tǒng)外的多種組織和細胞 發(fā)揮廣泛而多效的作用。體外研究顯示IL-15與IL-2由于共有的受體組分共有幾種生物 學(xué)活性，在T細胞上存在的IL-15受體包括一種特有的α鏈，IL-15Ra，但是與IL-2R共 有β鏈和Y鏈，結(jié)果，兩種受體都利用相同的Jak/STAT信號傳遞元件，不過，基于IL-2 和IL-15及其受體的復(fù)雜調(diào)控和不同表達，已經(jīng)報道了體內(nèi)功能的顯著差異(Kirman等， 1998 ；Waldmann and Tagaya, 1999 ；Waldmann 等，2001)。IL-15 和 IL-2 的抗腫瘤效應(yīng)應(yīng)受 到重視，比較IL-15與IL-2對肺腺癌轉(zhuǎn)移模型的療效時，它誘導(dǎo)的NK殺傷活性比IL-2誘 導(dǎo)的高3-4倍，此外，6倍劑量的IL-15才能引起肺血管滲漏等毒副作用的出現(xiàn)，在大鼠的結(jié) 腸癌模型中也發(fā)現(xiàn)，IL-15能顯著降低化療英氣的胃腸道毒性，增強藥物的最大耐受劑量。 朱法良等(朱法良，孫訥，田志剛，等.IL-15和rhIL-2誘生的LAK細胞特性比較.中國免 疫學(xué)雜志[J]. 2002，18 ) :252-258)在研究重組人白細胞介素15和重組人白介素2誘 導(dǎo)的粘附性自然殺傷細胞(LAK)時發(fā)現(xiàn)，IL-15誘生的LAK細胞殺傷K562細胞的能力強于 rhIL-2，同時，IL-15誘生的LAK細胞的⑶3TD56+細胞、⑶94+細胞百分率均要高于rhIL_2， 證明IL-15在體內(nèi)對NK細胞功能可能具有較強的調(diào)節(jié)作用。盡管，白介素15較白介素2有著更高的安全性及活性，作為蛋白類藥物，且由于其 分子量較小，體內(nèi)應(yīng)用后半衰期較短，因此臨床應(yīng)用時，為維持其在體內(nèi)的有效血漿濃度， 需要多次給藥，患者依從性較差。為解決白介素15體內(nèi)半衰期短的問題，中國專利CN200410067182. 0公開了一種 人白介素15與Fc的融合蛋白，通過將Fc片段與白介素15連接，形成融合蛋白，在體內(nèi)可 獲得更長的半衰期，但由于給藥時引入了外援蛋白或多肽片段，容易引起機體免疫反應(yīng)。其它治療蛋白的研究已經(jīng)表明，通過使蛋白質(zhì)與聚合物例如聚乙二醇(PEG)綴合， 通過治療蛋白和PEG兩者共價結(jié)合的連接部分可以顯著延長治療蛋白在血漿中的半衰期。對于聚乙二醇分子來說，可通過多種方法將其加到蛋白質(zhì)上?？偟膩碚f，聚乙二醇 分子是通過一個在蛋白質(zhì)分子上發(fā)現(xiàn)的反應(yīng)基團而聯(lián)到蛋白質(zhì)分子上。氨基，如賴氨酸殘 疾上的或N-末端上的氨基通常用于這類附著，例如，Royer (US4002531)認為可利用還原性 烷基化反應(yīng)將聚乙二醇分子附著到酶上。Wright于1993年4月觀日公開的EP0539167， "Peg Imidates and Protein Derivates Thereof ”中認為帶有自由氨基酸的肽及有機復(fù)合物可被PEG的直接衍生物或有關(guān)的水溶性有機多聚體所修飾。Siaw在1990年2月27日公 開的美國專利號US4904584中涉及修飾蛋白質(zhì)中用于通過反應(yīng)性氨基基團附著聚乙二醇 分子的賴氨酸殘疾的數(shù)目。通常，這些偶聯(lián)物包括每個蛋白質(zhì)分子結(jié)合的PEG分子數(shù)從0到蛋白質(zhì)中氨基基 團數(shù)變化的偶聯(lián)物，對于已經(jīng)單獨修飾的蛋白質(zhì)分子，PEG單元可以結(jié)合在許多不同的胺位
；卜.ο歐洲專利申請EP593868描述了 PEG-IFN- α的制備，然而，PEG化反應(yīng)不是位點 特異性的，并因此獲得了 PEG-IFN- α偶聯(lián)物位置異構(gòu)體的混合物(也見Monkarsh等，ACS. Symp. kr. ,680:207-216，1997)。Kinstler等在歐洲專利申請EP675201中演示了用mPEG-丙醛對巨核細胞生長和 發(fā)育因子(MGDF)的N-末端殘基的選擇性修飾，這考慮到批次之間可重復(fù)性PEG化合物的 代謝動力學(xué)。Gilbert等在美國專利5711944中證明能產(chǎn)生具有最適合水平；活性IFN-α 的PEG化，在該例中需要費力的純化步驟來獲得最適偶聯(lián)物。在PCT/US2004/025864中公開了一種IU8和IU9的均一化制劑，在該申請中， IL-28和IL-29的PEG化是在其N-末端上的氨基進行PEG化，反應(yīng)在使其能利用蛋白質(zhì)的 賴氨酸殘基的ε氨基和N-末端的α氨基之間的pKa差異的ρΗ下進行，通過該選擇性衍 生作用，可控制諸如醛(如甲氧基聚乙二醇丙醛)等反應(yīng)性基團的水溶性聚合物與蛋白質(zhì)連 接，與聚合物的綴合主要發(fā)生在蛋白質(zhì)的N-末端上，而不顯著修飾其它反應(yīng)性基團，如賴 氨酸側(cè)鏈氨基。由于蛋白或多肽分子中存在多個氨基，因此得到的偶合物是多種交聯(lián)產(chǎn)物的混合 物，而且，不同分子大小及分子結(jié)構(gòu)的PEG對活性位點的修飾，在特異性、被修飾后的蛋白 空間結(jié)構(gòu)、產(chǎn)物穩(wěn)定性及產(chǎn)物活性等反面存在很大差別。白細胞介素15的PEG偶聯(lián)聚合物， 目前還沒有相關(guān)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種白細胞介素15與聚乙二醇的偶聯(lián)物，所述聚乙二醇白細胞介素 15偶聯(lián)物，較未PEG偶聯(lián)的白介素15相比，所得的PEG-IL-15具有可溶性、穩(wěn)定性提高、免 疫原性減弱，體外可保留天然白介素15約10%的活性，活性留存率較高，且其在體內(nèi)與天然 的白介素15比較，具有更長的體內(nèi)半衰期和平均達峰時間、過敏反應(yīng)更輕、用藥更為安全、 并具有更為長效的功能。天然IL-15含有6個賴氨酸殘基，其中LyS36、LyS41、LyS85與IL-15分子中半胱 氨酸殘基相鄰，在此處進行PEG偶聯(lián)時，修飾后將對其生物活性產(chǎn)生較大影響，在Lys上進 行修飾時，也不利于得到均一的PEG-IL-15偶聯(lián)產(chǎn)物。因此，具體地，本發(fā)明在于提供一種在IL-15的N末端進行PEG化的PEG-IL-15，所 述的PEG-IL-15具有如下通式
RO- (CH2CH2O) n- (CH2) pC0-NH- (AA) m-IL_15 式中，R為H或C1-C4烷基，優(yōu)選為甲基；
η為20到2000整數(shù)值，優(yōu)選為100-1000之間的整數(shù)值，更優(yōu)選為200-500之間的整 數(shù)，聚乙二醇的分子量在IkDiTlOOkDa之間，優(yōu)選為5-40kDa之間，更優(yōu)選為10_20kDa。
ρ為1-3的整數(shù)，優(yōu)選為2或3 ；
AA為N末端的L-氨基酸殘基，m為0-5之間的整數(shù)，優(yōu)選直接在N末端進行PEG偶聯(lián)， 即m為0。本發(fā)明中，所述與IL-15偶聯(lián)的聚乙二醇為醛基活化的單甲氧基聚乙二醇，醛基 活化的單甲氧基聚乙二醇分子，包括但不限于單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)、單甲氧 基聚乙二醇丁醛、單甲氧基聚乙二醇乙醛、單甲氧基聚乙二醇戊醛。優(yōu)選單甲氧基聚乙二醇 丙醛。聚乙二醇分子根據(jù)偶聯(lián)度不同，可以是分子量為IOKDa 40KDa的任一分子，其中優(yōu) 選分子量為20KD的聚乙二醇分子。聚乙二醇分子可以是直鏈型或分支型，可以是單鏈、雙 鏈或多鏈。優(yōu)選直鏈型單鏈聚乙二醇分子。白介素15可以是天然的、重組蛋白或同樣具有天然IL-15功能的基因突變產(chǎn)物， 當然，也包括通過組織培養(yǎng)、蛋白質(zhì)合成、細胞培養(yǎng)(天然、重組細胞活突變體)方法得到的產(chǎn)品。本發(fā)明中，聚乙二醇白介素15偶聯(lián)物、PEG-IL-15、PEG_rhIL_15之間，在定義上， 可互換使用，均是指PEG化的白介素15，重組的人白介素15 (rhIL-15)與天然的人白介素 15相比，在N末端多一個Met。聚乙二醇與IL-15的偶聯(lián)方式，可以是直接與IL-15的N末端氨基相連，也可以在 IL-15的N末端設(shè)計一連接肽，該連接肽為小于5個L-氨基酸的小分子肽，如在IL-15的N 末端設(shè)計3個甘氨酸，然后將PEG通過甘氨酸的NH2端與IL-15分子偶聯(lián)。本發(fā)明還提供了 IL-15聚乙二醇偶聯(lián)物的制備方法。所屬領(lǐng)域技術(shù)員根據(jù)常識可 以選擇聚乙二醇的結(jié)構(gòu)類型、分子量和反應(yīng)所需的用量。通過本申請所提供的制備方法，根 據(jù)修飾后蛋白分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，選擇修飾條件修飾酸堿度、反應(yīng)體系，蛋白和聚乙二醇 的摩爾比等。以本發(fā)明優(yōu)選的20KDa的mPEG定點N末端修飾白介素15為例，說明偶聯(lián)物的制
備方法。本領(lǐng)域熟知的，在硼氰化鈉存在條件下，帶醛基的PEG會和伯胺發(fā)生還原氨化反 應(yīng)。醛基和其他的親電活性基團不同，它只和胺基反應(yīng)。雖然醛基的反應(yīng)活性比NHS活 性低，但它具有反應(yīng)條件溫和，易于使PEG和蛋白質(zhì)或其它材料的表面連接。因此，在低的 PH下，mPEG-醛會對蛋白質(zhì)的N端進行選擇性反應(yīng)。該反應(yīng)條件在pH值4. 0 7. 0，10 IOOmmol/L鹽濃度的緩沖體系下，溫度在4 25°C，反應(yīng)時間為1 72小時，反應(yīng)摩爾比 PEG:蛋白在1 :2 1 :10。一般情況下，選擇低溫、低pH、反應(yīng)時間適宜條件下得到的N-末 端修飾產(chǎn)物均一性強，且反應(yīng)轉(zhuǎn)換率較高。本發(fā)明專利所述偶聯(lián)物的制備步驟將rhIL-15的磷酸鹽緩沖液與20KD的 mPEG-ALD在加入20mM硼氰化鈉條件下反應(yīng)，然后采用常規(guī)方法進行分離純化，過濾除 菌，獲得本發(fā)明的PEG-rhIL-15的偶聯(lián)物。所用磷酸鹽緩沖液優(yōu)選pH4. 0-6. 0，濃度為 50-IOOmmol/L，溫度優(yōu)選4_10°C，反應(yīng)時間優(yōu)選M 48小時，反應(yīng)摩爾比PEG:rhIL_15為 1 :2 1 :5，修飾率達到50%以上。修飾條件的選擇和修飾方法在實例中詳細說明。本發(fā)明偶聯(lián)物的純化方法為IL_15與聚乙二醇聚合物經(jīng)反應(yīng)后的的樣品，用 5XDDW透析后上Q Sepharose F.F.，經(jīng)10 mM乙酸-乙酸鈉(pH5. 5)，平衡液平衡后，用IM Nacl的鹽離子逆度洗脫，穿透和洗脫樣品分別用電泳、RP-HPLC檢測純度。含聚乙二醇偶聯(lián)物組份再經(jīng)SuperdeX75分子篩，1OmM PB，(pH7. 4)條件下分離除去高分子聚合物。結(jié)構(gòu)和 質(zhì)量分析方法包括質(zhì)譜、質(zhì)量肽圖、RP-HPLC，Gel-HPLC和SDS-PAGE。本發(fā)明的一個實施例中，公開了不同分子量大小的mPEG-ALD修飾rhIL_15后的體 外活性保留率。在本發(fā)明的再一實施例中，公開了 mPEG-ALD-rhIL-15與rhIL-15的體內(nèi)藥代動力 學(xué)研究，rhIL-15的聚乙二醇偶聯(lián)物在體內(nèi)具有更長的半衰期和更長的平均達峰時間。本發(fā)明的再一實施例中，還公開了 rhIL-15與rhIL_15的PEG偶聯(lián)物對豚鼠的過 敏性試驗研究，研究發(fā)現(xiàn)，rhIL-15的聚乙二醇偶聯(lián)物具有較低的過敏反應(yīng)。本發(fā)明的還一實施例中，公開了聚乙二醇白介素15偶聯(lián)物對荷瘤小鼠的免疫自 然殺傷細胞(NK細胞)的影響，聚乙二醇白介素15偶聯(lián)物可以顯著延長荷瘤小鼠NK細胞活 性的持續(xù)周期，在給藥結(jié)束后一周內(nèi)，NK細胞的活性仍然保持著與給藥結(jié)束時的水平。對于治療用途，技術(shù)人員可容易地確定合適的劑量、給藥頻率和給藥途徑。做出這 些決定的因素包括，但不限于，所施用的蛋白質(zhì)的特性，所需治療的病癥，潛在的病人應(yīng)變 性，病人的年齡、體重以及個體反應(yīng)等。本發(fā)明的化合物也可用作傳遞載體增強所附著的治 療劑的血漿循環(huán)半衰期或指導(dǎo)向體內(nèi)特異性靶的傳遞。本發(fā)明PEG- IL-15，結(jié)合適合的藥用載體或賦形劑，以用于治療各種病癥，在這些 藥物組合物中所用的特定載體可以采取各種形式，其取決于所希望的給藥類型。適當?shù)慕o 藥途徑包括，但不限于，腸道(例如，口服)、局部、栓劑、吸入、以及非胃腸道，優(yōu)選為非胃腸 道給藥，如皮下、肌肉、或靜脈注射。在制備口服液體劑型(例如，混懸劑、酊劑、膠體或溶液)的組合物時，可以采用典 型的藥物介質(zhì)，如水、乙二醇、丙三醇、油、乙醇、增味劑、防腐劑、著色劑等。類似地，當制備 口服固體劑型(如片劑、膠囊劑等)時，可采用諸如淀粉、糖類、稀釋劑、成粒劑、潤滑劑、粘合 劑、崩解劑等。用于非胃腸道給藥的藥物組成可以制備成包括有效成分和適當載體的注射劑型。 為了非胃腸道給藥，載體通常包括無菌注射水，也可包括一些其它可用的助溶劑或防腐劑 組分，此外也可制備注射型混懸劑，在這種情況下，將采用合適的液體載體、懸浮劑等。用于 非胃腸道給藥的載體在本技術(shù)領(lǐng)域是熟知的并且包括，水、鹽溶液、林格氏液、和/或葡萄 糖，該載體可以包含少量的賦形劑以便保持藥劑的穩(wěn)定性和等滲性，這些溶液可以按照通 常的方法制備。為了局部給藥，本發(fā)明的PEG-IL-15可用溫和的含水基質(zhì)進行配制，如軟膏或乳 膏，適用軟膏基質(zhì)的如凡士林、羊毛脂、以及油包水乳劑如Eucerin ，其可獲自Beiersdorf (Cincinnati, Ohio) ； 7令霜(USP) ；Purpose Cream ,可獲自 Johnson & Johnson (New Brunswick, New Jersey)等。本發(fā)明的PEG-IL-15 —般以單位劑量的形式給藥，本發(fā)明的化合物通常以每日、 每周、以及每月劑量給藥，從約0. 01 μ g/kg體重至約50mg/kg體重，優(yōu)選為從約0. 1 μ g/ kg體重至約25mg/kg體重，更優(yōu)選為從約1 μ g/kg體重至約5mg/kg體重。對于75kg的平 均體重，劑量可以在每日1Oyg和1mg之間，更優(yōu)選為20yg到之間。對經(jīng)修飾的 PEG-IL-15，其給藥周期可延長，例如，每周、或每兩周給藥方案。例如，每人每周劑量可以是 IOyg至約500 μ g，在某些具體的實施例中，每人每周劑量可以是約50 μ g至約250 μ g，在某些其它的實施例中，每人每周劑量可以是約100至約200μ g。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所明了 的，根據(jù)本發(fā)明的藥物組成的特定量取決于若干因素，包括但不限于所希望的生物活性、患 者的狀態(tài)、以及對藥物的耐受性等。


圖Ia為rhIL-15的誘導(dǎo)表達情況電泳圖，圖Ib為rhIL_15的樣品和標準品 Western Blot雜交圖，從圖中可以看出在大約13kDa的位置出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶， Western Blot試驗表明該目的條帶出現(xiàn)明顯的印跡反應(yīng)，說明白介素15獲得了正確高效 表達。圖2為rhIL-15樣品純化前、后的電泳情況圖，純化后的重組rhIL_15經(jīng) Tricine-SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果在大約13kDa的位置出現(xiàn)一條帶。附圖3 不同分子量PEG修飾的IFN-SA的SDS-PAGE電泳圖。其中M為marker，1 為 mPEG10K-rhIL15, 2 為 mPEG20K_rhIL15, 3 為 mPEG40K_rhIL15o
實施例本發(fā)明通過下述實施例進一步闡明，但任何實施例或其組合不應(yīng)當理解為對本發(fā) 明的范圍或?qū)嵤┓绞降南拗啤１景l(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定，結(jié)合本說明書和本領(lǐng) 域一般常識，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以清楚地明白權(quán)利要求書所限定的范圍。在不偏離本 發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行任何修改或改 變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例1 制備rhIL-15
試驗材料DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶均為 GIBCO公司產(chǎn)品；大腸桿菌宿主菌DH5a，BL21 (DE3)菌株(購自Invotrogen公司)；pVB220 載體(購自Novagen公司)
1引物的設(shè)計與合成根據(jù)報道的hILl-15的基因序列設(shè)計一對引物，上游引物 Pl 5，-C ctcgagTTCATGAACTGGGTGAATGTAATAAG-3，，包括起始密碼子 ATG，外設(shè)Xho I 酶切位點；下游引物P2: 5，-CGGATCCttaTTAAGAAGTGTTGATGAAGATTTG-3，，將終止密碼子變 成原核系統(tǒng)高頻使用的強終止子I酶切位點，引物由北京三博遠志生物技 術(shù)有限公司合成。2富含rhIL-15mRNA單個核細胞的制備及總RNA提取，采用常規(guī)密度梯度離心方 法分離正常人外周血白細胞，培養(yǎng)與含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液 中，加入細菌脂多糖5 μ g/ml和干擾素-Y 500u/ml，培養(yǎng)4h，棄去懸浮細胞，收獲帖壁的單 個核細胞，經(jīng)異硫氰酸胍法提取細胞總RNA，采用甲醛變形瓊脂糖凝膠水平電泳鑒定RNA。3 RT-PCR反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取細胞總RNA 5-10 μ g作為模板，加入DTTlOmmol、 M-MLV200u、4 χ dNTP (每種)0. 5mmo 1、下游引物 250pmo 1，總反應(yīng)體積 20 μ 1、37 °C 作用 lh，95°C IOmin 滅活 M-MLV ;PCR 反應(yīng)在 RT 反應(yīng)物 20μ 1 中，加入 MgCl22mmol、4 χ dNTP 0. lmmol、上游引物 150pmol、95°C、5min，加入 TaqDNA 聚合酶 2u。PCR 反應(yīng)條件-MV Imin, 580C lmin、72°C lmin，循環(huán)；35 次，72°C延長 7min。擴增得到 rhIL-15 cDNA 序列。4 rhIL-15重組表達載體構(gòu)建將RT-PCR擴增后的rhIL_15cDNA用損ol和及a HI雙酶切后，經(jīng)低熔點瓊脂糖電泳純化回收片段，再在T4DNA連接酶的作用下與同樣酶切的 PKW2載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5 α大腸桿菌，在含氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。5將rhIL-15表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌BL21 (DE3)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，將陽 性的克隆菌株接種于2ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，30°C活化后，1:100接種，擴增至 OD600=O. 4-0. 6時，于37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，5000r/min離心5min收集菌體，超聲波破碎菌體， 收集包涵體，然后通過變性-復(fù)性-層析的方法純化rhIL-15，最后獲得95%以上純度的 rhIL-15。純化的rhIL-15經(jīng)氨基酸分析，其N端的10個氨基酸序列結(jié)果表明，樣品中除部 分N端多出1個甲硫氨酸外(轉(zhuǎn)錄時的起始密碼子)，氨基酸序列與天然的人rhIL-15相同， 純化后的rhIL-15的比活為2X 107U/mg.
實例2、重組集成干擾素變異體聚乙二醇化偶聯(lián)物(mPEG2(1-rhIL-15)的修飾條件 rhIL-15溶液(為rhIL-15，濃度為10 mg/mL，緩沖為100 mM PB，pH7. 0)由北京凱因科 技股份有限公司制備，mPEG-ALD-20KD (純度>95%，相對分子質(zhì)量為20 X IO3)購自北京凱正 生物工程發(fā)展有限公司，氰基硼氫化鈉(OKBrNa)溶液購自Sigma公司，SDS-PAGE相關(guān)試 劑及溶液和各種分析純均為上海生工產(chǎn)品。恒溫磁力攪拌儀(江蘇中大儀器廠)、電泳儀、Q Sepharose F. F.、Superdex75 分子篩、AKTA explore 層析系統(tǒng)、SDS-PAGE 電泳系統(tǒng)均為 Pharmacia公司產(chǎn)品。1、反應(yīng)pH值對修飾產(chǎn)物的影響
rhIL-15 溶液分別用 100 mmol/L PB (pH4. 0、pH5. 0 和 pH5. 5)緩沖液配成 2 mg/ mL，各取一份加入1 mol/L CH3BNNa母液至終濃度為20 mmol/L。按摩爾比1 :4 (rhIL-15:mPEG-ALD-20KD)稱取mPEG-ALD-20KD 加入 rhIL-15 反應(yīng)溶液中，4°C條件下 1 OOr/ min攪拌反應(yīng)對h。分別取樣進行SDS-PAGE電泳，確定mPEG20-rhIL-15的修飾率。實驗結(jié)果表明pH值在4. 0,5. 0,5. 5的條件下，mPEG20-rhIL_15所占比例分別為 18%，31%，40%。說明pH4. 0的修飾率最低，pH5. 5的條件下修飾率最高。2、rhIL-15與PEG的修飾比例對修飾產(chǎn)物的影響
rhIL-15 溶液用 100 mmol/LPB pH5. 5 緩沖液配成 2 mg/mL，補入 1 mol/L OKBNNa 母 液至終濃度為 20 mmol/L。按 rhIL-15 與 mPEG-ALD_20KD 摩爾比為 A (1:2)、B (1:3)、C (1:4)、D (1:5)、E (1:6)分別稱取 mPEG-ALD-20KD 加入 rhIL-15 反應(yīng)溶液中，4°C條件下 100 r/min攪拌反應(yīng)M hr，分別取樣進行SDS-PAGE電泳，確定PEG20_rhIL_15的修飾率。實驗結(jié)果表明在rhIL-15 與 mPEG-ALD_20KD 摩爾比為 A( 1 2)、B(1 3)、C( 1 4)、 D (1:5)、E (1:6)時，PEG1-IL-15 所占比例分別為 18%, 27%, 39%,40%,41%。當 PEG 修飾物 的摩爾比達到1 :4后，不能進一步提高修飾率，反應(yīng)會造成PEG修飾的多聚體增加。3、反應(yīng)溫度和時間對修飾產(chǎn)物的影響
rhIL-15 溶液用 100 mmol/L PB pH5. 5 緩沖液配成 2 mg/mL，補入 1 mol/L OKBNNa 至 終濃度為 20 mmol/L。取 rhIL-15 與 mPEG-ALD_20KD 質(zhì)量比 1 4，分別在 4°C反應(yīng) 48hr，25°C 反應(yīng)Mhr不同時間點，分別取樣進行SDS-PAGE電泳，確定mPEG2(1-rhIL-15的修飾率。實驗 結(jié)果表明4°C條件下通過延長反應(yīng)時間，同樣達到反應(yīng)25°C反應(yīng)的修飾率。但4°C條件修 飾更利于rhIL-15的活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。4、rhIL-15濃度對修飾產(chǎn)物的影響
rhIL-15 溶液用 100 mmol/L PB pH5. 5 緩沖液配成為 1.0 mg/mL, 2. 0 mg/mL, 3. 0 mg/mL，4. 0 mg/mL，共4份，按rhIL-15 與mPEGALD-20KD質(zhì)量比 1:4 的比例加入mPEG-ALD-20KD， 4°C，100 r/min攪拌反應(yīng)Mhr，分別取樣進行SDS-PAGE電泳分析，確定mPEG20-rhIL_15的
修飾率。實驗結(jié)果表明，rhIL-15濃度在 1.0 mg/mL, 2. 0 mg/mL, 3. 0 mg/mL, 4. 0 mg/ mL時，PEG20-rhIL-15所占比例分別為28%，40%, 45%，48%。但隨著蛋白濃度提高時， PEG20-rhIL-15的修飾有所增加，達到3. 0 4. 0 mg/mL時為合適濃度。實施例3 mPEG-rhIL-15 純化
反應(yīng)混合液先對50mM Tris-HCl緩沖液(pH 6. 5)透析，再將樣品上樣于同樣緩沖液平 衡好的Q Sepharose FF陽離子交換柱。用O-IM氯化鈉梯度洗脫吸附蛋白。PEG-干擾素進 一步經(jīng)Superdex 75純化，流動相為含0. 15M氯化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 6.5)。 收集洗脫活性組分，SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，PEG-白介素已被純化至電泳單一條帶。用10kDa、40kDa偶合rhIL-15的工藝同上，純化所得PEG白介素的電泳為單一條 帶，見附圖3。實例4、不同分子量聚乙二醇修飾的rhIL-15體外生物活性測定
采用rhIL-15依賴細胞株(CTLL-2 )/MTT法測定rhIL-15及其PEG偶聯(lián)的rhIL-15的生 物學(xué)活性。以人血清白蛋白為標準蛋白，用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量，測定比活性(IU/mg)。 用測定培養(yǎng)液稀釋至1000IU/mL，在96孔細胞培養(yǎng)板中，做4倍梯度系列稀釋，共8個稀釋 度，每個稀釋度做 2 孔。分別將 mPEG1Q-rhIL-15，mPEG2Q-rhIL-15 和 mPEG4(1-rhIL-15 用測定 培養(yǎng)液稀釋成0. 1 μ g/mL,用測定培養(yǎng)液稀釋成將rhIL-15稀釋為1. Ong/mL,記錄預(yù)稀釋倍 數(shù)。在96孔細胞培養(yǎng)板中，再做4倍梯度系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2孔。mPEG10-rhIL-15 體外抗活性保留了 rhIL-15 約 12. 61% 的活性，mPEG2(1-rhIL-15 保 留了 9. 25%, mPEG40-rhIL-15 保留了 3. 61%。
權(quán)利要求
1.聚乙二醇通過氨基酸或寡肽的連接子與人白介素-15連接形成的偶合物。
2.權(quán)利要求1所述的偶合物，所述偶合物具有式I所示的連接形式 RO- (CH2CH2O) n- (CH2) pC0-NH- (AA) m_IL15其中，R為H或C1-C4烷基； η為20到2000的整數(shù)值； P為1-3的整數(shù)；AA為N末端的L-氨基酸殘基； m為0-5之間的整數(shù)。
3.權(quán)利要求2所述的偶合物，所述偶合物具有式I所示的連接形式 RO- (CH2CH2O) n- (CH2) pC0-NH- (AA) m_IL15其中，R為甲基； η為100到1000的整數(shù)值； P為2或3 ；AA為N末端的L-氨基酸殘基； m為0。
4.權(quán)利要求1-3任意一項權(quán)利要求所述的偶合物，其中所述偶合物具有均一的分子量。
5.一種制備權(quán)利要求1至4中任意一權(quán)利要求所述偶聯(lián)物的方法，其特征在于包括如 下步驟(1)偶合反應(yīng)中，白介素15與醛基化單甲氧基聚乙二醇的摩爾比為1 2 1 10 ；(2)偶合反應(yīng)體系為磷酸鹽緩沖液pH4.0-8. 0，離子強度為lO-lOOmmol/L;(3)柱色譜層析法分離反應(yīng)所得的聚乙二醇白介素15偶合物。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述醛基化單甲氧基聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇丙 醛或單甲氧基聚乙二醇丁醛。
7.權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述的醛基化單甲氧基聚乙二醇的分子量為 10-50kDa。
8.一種藥用組合物，其特征在于，該組合物包括權(quán)利要求1至4中任意一權(quán)利要求所述 偶聯(lián)物作為活性組分，和藥物學(xué)上可接受的載體、賦形劑或輔料。
9.權(quán)利要求1至4中任意一權(quán)利要求所述偶合物在制備具有抗腫瘤藥物中的用途。
10.權(quán)利要求8所述組合物在制備具有抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種PEG白介素15偶聯(lián)物，即PEG化白介素15，所述PEG與白介素15通過或不通過小肽連接子連接于N末端氨基上，得到均一的PEG白介素15偶聯(lián)物，在體內(nèi)可以至少保留原有白介素15的活性，并具有更長的半衰期和平均達峰時間。
文檔編號A61K47/48GK102145178SQ20111009564
公開日2011年8月10日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者侯建華, 張春麗, 楊璐 申請人:北京凱因生物技術(shù)有限公司, 北京凱因科技股份有限公司