專利名稱：葉酸分子靶向磁性納米藥物載體及靶向基因藥物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種葉酸分子靶向磁性納米藥物載體及靶向基因藥物的制備方法。
背景技術(shù)：
葉酸(folic acid, FA)又稱蝶酰谷氨酸、維生素B11，是一種人體必需的維生素， 在細(xì)胞內(nèi)可還原為四氫葉酸，后者是一碳單位轉(zhuǎn)移酶的輔酶，參與一碳單位代謝和嘌呤、胸 腺嘧啶的合成，是細(xì)胞代謝、DNA合成及修復(fù)的基本組成成分。腫瘤細(xì)胞的快速生長需要充 足的葉酸以維持DNA的合成。動物細(xì)胞內(nèi)缺少合成葉酸的酶，細(xì)胞的生長和增殖依賴從外 界環(huán)境獲得葉酸。葉酸受體(folate receptor, FR)是細(xì)胞膜表面糖基化磷脂酰肌醇(GPI) 錨定的糖化多肽，包括三種異構(gòu)體α-FR、β-FR和γ-FR。β-FR是細(xì)胞膜相關(guān)蛋白，通過 GPI錨定在細(xì)胞膜上，二者具有約70%的同源性。α-FR和Y-FR缺少修飾GPI錨附著的羧 基末端信號肽，，組成上屬于分泌型蛋白。葉酸受體有三個顯著特點(diǎn)1. FR與游離葉酸的親 和力非常高，解離常數(shù)Kd<lnm0l/L;2.FR對葉酸分子通過化學(xué)鍵與其他大分子物質(zhì)連接形 成的復(fù)合物的親和力和胞吞效應(yīng)與游離葉酸相當(dāng)，具有良好的入胞轉(zhuǎn)運(yùn)潛能；3. FR對葉酸 及其衍生物的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)是特異的受體一配體結(jié)合，并能被游離葉酸競爭抑制。葉酸與受體 結(jié)合，通過內(nèi)化方式穿過細(xì)胞膜，是葉酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的主要途徑。已有研究發(fā)現(xiàn)葉酸受體在 卵巢癌、宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌、頭頸癌等多種上皮源性惡性腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)，已證實(shí) 喉癌和鼻咽癌高表達(dá)葉酸受體。而在正常組織細(xì)胞除脈絡(luò)叢、胎盤、肺、胸腺、腎低水平表達(dá) 外，均高度保守。葉酸受體表達(dá)分布的腫瘤特異性、高效的轉(zhuǎn)運(yùn)潛能和與葉酸的高親和力， 為葉酸分子靶向藥物載體的制備及抗腫瘤分子靶向治療提供了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種葉酸分子靶向磁性納米藥物載體及靶向基因藥物的制 備方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
一種葉酸分子靶向磁性納米藥物載體的制備方法，其包括以下步驟
1)醛基化海藻酸鈉(ASA)溶液的制備將海藻酸鈉(SA)溶于水中，加入強(qiáng)氧化劑，反應(yīng) 對-3他，加入乙醇終止反應(yīng)；其中，海藻酸鈉的質(zhì)量強(qiáng)氧化劑的質(zhì)量水的體積乙醇的體 積=Ig 0. 2-0. 3g :20-30ml :l_2ml ；
2)磁性納米粒子MNI^s溶液的制備將亞鐵鹽、鐵鹽溶于水中，調(diào)節(jié)pH至9-10，攪拌，直 至溶液顏色變?yōu)樯詈谏?，取上清液，備用；其中，F(xiàn)e2+的物質(zhì)的量 3+的物質(zhì)的量水的體 積=Imol 0.4-0. 6mol :80_120L ；
3)醛基化海藻酸鈉改性磁性納米粒子ASAMNPs的制備將步驟1)中的ASA溶液與步 驟2)中的磁性納米粒子MNPs溶液混合，80-90°C下反應(yīng)30-50min，取上清液，備用；
4)葉酸-氨基聚乙二醇FA-PEG-NH2的制備將葉酸(FA)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)混合于非質(zhì)子有機(jī)溶劑中，反應(yīng)4-8h，加入PEG2000(NH2) 2，反應(yīng) 8-10h，加水，過濾除去不溶物得FA-PEG-NH2溶液；其中，葉酸(FA)的質(zhì)量二環(huán)己基碳二亞 胺(DCC)的質(zhì)量N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的質(zhì)量非質(zhì)子有機(jī)溶劑的體積水的體積=Ig 1. 2-1. 5g :0. 3-0. 5g :40-60ml :180_240ml ；
5 ) FA-PEG-ASAMNPs的制備將步驟3 )中的得到的ASAMNPs與步驟4)中得到的 FA-PEG-NH2溶液在0. 3-0. 6mol/L的硼酸鈉溶液中混合，再加入硼氫化鈉，室溫下反應(yīng) 8-10h，得到產(chǎn)物，其中，ASAMNPs質(zhì)量=FA-PEG-NH2溶液中的FA-PEG-NH2質(zhì)量硼酸鈉溶液 體積硼氫化鈉質(zhì)量=Ig :0. 5-lg :30-50ml :0. 3-0. 5g。步驟1)中所述的強(qiáng)氧化劑為NaI04。步驟1)中，反應(yīng)溫度為4-8 °C。所述的亞鐵鹽為FeSO4 · 4H20。所述的鐵鹽為FeCl3 · 6H20。步驟2)中，調(diào)節(jié)pH是通過加入25% (w/w) NH3 · H2O來調(diào)節(jié)的。步驟3)中，ASA溶液與MNPs溶液體積比為1 1_2。步驟4)中，所述的非質(zhì)子化有機(jī)溶劑為乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、六甲基 磷酰三胺、苯、乙醚、四氯化碳中的一種。步驟5)中，所得產(chǎn)物在蒸餾水中透析3-5天，干燥。上述制備方法中，步驟1)的反應(yīng)方程式示意如式子(I )
權(quán)利要求
1.一種葉酸分子靶向磁性納米藥物載體的制備方法，其特征在于其包括以下步驟1)醛基化海藻酸鈉(ASA)溶液的制備將海藻酸鈉(SA)溶于水中，加入強(qiáng)氧化劑，反應(yīng) 對-3他，加入乙醇終止反應(yīng)；其中，海藻酸鈉的質(zhì)量強(qiáng)氧化劑的質(zhì)量水的體積乙醇的體 積=Ig 0. 2-0. 3g :20-30ml :l_2ml ；2)磁性納米粒子MNI^s溶液的制備將亞鐵鹽、鐵鹽溶于水中，調(diào)節(jié)pH至9-10，攪拌，直 至溶液顏色變?yōu)樯詈谏?，取上清液，備用；其中，F(xiàn)e2+的物質(zhì)的量 3+的物質(zhì)的量水的體 積=Imol 0.4-0. 6mol :80_120L ；3)醛基化海藻酸鈉改性磁性納米粒子ASAMNPs的制備將步驟1)中的ASA溶液與步 驟2)中的磁性納米粒子MNPs溶液混合，80-90°C下反應(yīng)30-50min，取上清液，備用；4)葉酸-氨基聚乙二醇FA-PEG-NH2的制備將葉酸(FA)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)混合于非質(zhì)子有機(jī)溶劑中，反應(yīng)4-8h，加入PEG2ticitl (NH2) 2，反應(yīng) 8-10h，加水，過濾除去不溶物得FA-PEG-NH2溶液；其中，葉酸(FA)的質(zhì)量二環(huán)己基碳二亞 胺(DCC)的質(zhì)量N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的質(zhì)量非質(zhì)子有機(jī)溶劑的體積水的體積=Ig 1. 2-1. 5g :0. 3-0. 5g :40-60ml :180_240ml ；5 ) FA-PEG-ASAMNPs的制備將步驟3 )中的得到的ASAMNPs與步驟4)中得到的 FA-PEG-NH2溶液在0. 3-0. 6mol/L的硼酸鈉溶液中混合，再加入硼氫化鈉，室溫下反應(yīng) 8-10h，得到產(chǎn)物，其中，ASAMNPs質(zhì)量=FA-PEG-NH2溶液中的FA-PEG-NH2質(zhì)量硼酸鈉溶液 體積硼氫化鈉質(zhì)量=Ig :0. 5-lg :30-50ml :0. 3-0. 5g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸分子靶向磁性納米藥物載體的制備方法，其特征在 于步驟1)中所述的強(qiáng)氧化劑為NaI04。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸分子靶向磁性納米藥物載體的制備方法，其特征在 于步驟1)中，反應(yīng)溫度為4-8°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸分子靶向磁性納米藥物載體的制備方法，其特征在 于所述的亞鐵鹽為FeSO4 · 4H20。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸分子靶向磁性納米藥物載體的制備方法，其特征在 于所述的鐵鹽為FeCl3 · 6H20o
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸分子靶向磁性納米藥物載體的制備方法，其特征在 于步驟2)中，調(diào)節(jié)pH是通過加入25% (w/w) NH3 · H2O來調(diào)節(jié)的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸分子靶向磁性納米藥物載體的制備方法，其特征在 于步驟3)中，ASA溶液與MNPs溶液體積比為1 :1_2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸分子靶向磁性納米藥物載體的制備方法，其特征在 于步驟4)中，所述的非質(zhì)子化有機(jī)溶劑為乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、六甲基磷酰 三胺、苯、乙醚、四氯化碳中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸分子靶向磁性納米藥物載體的制備方法，其特征在 于步驟5)中，所得產(chǎn)物在蒸餾水中透析3-5天，干燥。
10.一種靶向基因藥物的制備方法，其特征在于其包括以下步驟1)醛基化海藻酸鈉(ASA)溶液的制備將海藻酸鈉溶于水中，加入強(qiáng)氧化劑NaIO4,反 應(yīng)對-3他，加入乙醇終止反應(yīng)；其中，海藻酸鈉的質(zhì)量強(qiáng)氧化劑的質(zhì)量水的體積乙醇的 體積=Ig 0. 2-0. 3g :20-30ml Hml，反應(yīng)溫度為 4-8°C ；2)磁性納米粒子MM^s溶液的制備將亞鐵鹽、鐵鹽溶于水中，調(diào)節(jié)pH至9-10，攪拌，直 至溶液顏色變?yōu)樯詈谏?，取上清液，備用；其中，F(xiàn)e2+的物質(zhì)的量 3+的物質(zhì)的量水的體 積=Imol 0.4-0. 6mol :80_120L ；3)醛基化海藻酸鈉改性磁性納米粒子ASAMNPs的制備將步驟1)中的ASA溶液與步 驟2)中的磁性納米粒子MNPs溶液混合，80-90°C下反應(yīng)30-50min，取上清液，備用；4)葉酸-氨基聚乙二醇FA-PEG-NH2的制備將葉酸(FA)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)混合于非質(zhì)子有機(jī)溶劑中，反應(yīng)4-8h，加入PEG2ticitl (NH2) 2，反應(yīng) 8-10h，加水，過濾除去不溶物得FA-PEG-NH2溶液；其中，葉酸(FA)的質(zhì)量二環(huán)己基碳二亞 胺(DCC)的質(zhì)量N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的質(zhì)量非質(zhì)子有機(jī)溶劑的體積水的體積=Ig 1. 2-1. 5g :0. 3-0. 5g :40-60ml :180_240ml ；5)MMP-9-AS0DN的合成根據(jù)人MMP_9基因cDNA序列，選擇含起始密碼子及上 游的6個堿基及后續(xù)的11個堿基，共20個堿基作為靶序列的反義寡核苷酸(AS0DN)， MMP-9 反義序列如下5，-TGCCAGAGGCTCATGGTGAG-3，(SEQ ID NO. 1)，無義序列為 5’-CGTCCCTATACGACC-3，(SEQ ID NO. 2),上述寡核苷酸堿基均采用硫代修飾，5’氨基(NH2) 修飾；6)FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN 磁性納米復(fù)合物的制備取 ASAMNPs、FA-PEG-NH2、 硫代及氨基修飾的MMP-9-AS0DN，攪拌均勻，于4_8 °C下避光反應(yīng)M-36小時，加入 一定量的硼氫化鈉溶液，使體系中硼氫化鈉的濃度為0. 5-0. 7mol. Γ1，體系繼續(xù)反 應(yīng)3-6小時后，充分離心沉淀，沉淀物用0. 01mol/L的PBS溶液重新分散均勻，制備成 FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN 的磁性納米復(fù)合物；步驟6)中，ASAMNPs溶液體積=FA-PEG-NH2溶液體積硫代及氨基修飾的MMP-9-AS0DN 溶液體積=1 0. 25-0. 35 0. 15-0. 25，硫代及氨基修飾的 MMP-9-AS0DN溶液中，MMP-9-AS0DN 的濃度為 95-105 μ mol. Γ1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種葉酸分子靶向磁性納米藥物載體的制備方法，其包括以下步驟1)醛基化海藻酸鈉(ASA)溶液的制備將海藻酸鈉(SA)溶于水中，加入強(qiáng)氧化劑，反應(yīng)24-36h，加入乙醇終止反應(yīng)；2)磁性納米粒子MNPs溶液的制備將亞鐵鹽、鐵鹽溶于水中，調(diào)節(jié)pH至9-10，攪拌，直至溶液顏色變?yōu)樯詈谏?，取上清液，備用?)醛基化海藻酸鈉改性磁性納米粒子ASAMNPs的制備將步驟1)中的ASA溶液與步驟2)中的磁性納米粒子MNPs溶液混合，80-90℃下反應(yīng)30-50min，取上清液，備用；4)葉酸-氨基聚乙二醇FA-PEG-NH2的制備；5)FA-PEG-ASAMNPs的制備。本發(fā)明制作的載體FA-PEG-ASAMNPs對腫瘤細(xì)胞具有很好的主動響應(yīng)性能，由于載體上連接磁性粒子，其又具備較好的磁響應(yīng)性能。
文檔編號A61P35/00GK102145177SQ201110092468
公開日2011年8月10日 申請日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者劉潔, 劉濤, 張宏征, 張濤, 許熠銘, 謝民強(qiáng), 馬棟 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)