專利名稱：無細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法及由其制備的無細(xì)胞真皮基質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及無細(xì)胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix, ADM)的制備方法及由其制備的無細(xì)胞真皮基質(zhì)。更詳細(xì)地，涉及以甘油、丙二醇及基本溶劑或溶液為基本成分，在其中添加蔗糖，從而制得冷凍保護(hù)劑，然后將該溶液浸透到去除了表皮及真皮內(nèi)細(xì)胞的皮膚中進(jìn)行冷凍干燥，從而制備無細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
皮膚是覆蓋整個(gè)人體表面的最大器官，其防止體液的流失，以及防止有害物質(zhì)和微生物侵入，抵御來自物理、化學(xué)方面的刺激等，執(zhí)行保護(hù)我們身體的功能。對(duì)于因嚴(yán)重的燒傷、外傷、上皮癌切除及皮膚疾病等皮膚嚴(yán)重受損的患者，應(yīng)起到阻止受損部位感染及體液損失的保護(hù)膜的作用，同時(shí)應(yīng)使患者的傷口部位不留下疤痕，防止在自然愈合過程中可能發(fā)生的嚴(yán)重收縮。用于使受損的皮膚組織再生的方法有以下三種移植患者自身皮膚的自體移植(autograft)、移植他人皮膚的同種異體移植(allograft)及移植動(dòng)物皮膚的異種移植(xenograft)。這些方法中自體移植最為理想，但燒傷部位范圍大的情況下，能夠確保組織的部位有限，在取皮部位還會(huì)留下新的傷口，因此存在困難。同種異體移植與其說起到永久移植的作用，不如說起到有助于傷口周圍區(qū)域的細(xì)胞移動(dòng)和愈合的作用。特別是在表皮層、真皮層直至皮下層受損的3度燒傷的情況下，必須進(jìn)行皮膚移植治療?，F(xiàn)在主要采用的皮膚移植治療方法為自體移植方法，由于在摘除了皮膚的健康部位產(chǎn)生新的外傷，因此增加了患者的痛苦，痊愈需要很長(zhǎng)時(shí)間，并且經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也大。此外，如嚴(yán)重的燒傷患者沒有足夠的身體健康部位的情況下，還存在無法采用自體移植方法或需要進(jìn)行多次移植手術(shù)的問題。人們?cè)噲D采用利用他人皮膚的同種異體移植或利用豬等其它動(dòng)物皮膚的異種移植等來解決上述問題，但這樣不僅會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，有時(shí)還會(huì)帶來其它副作用。因此，國內(nèi)外醫(yī)院實(shí)施的燒傷手術(shù)最普遍的情況為先將壞死的表皮層和真皮層去除，然后利用捐贈(zèng)者尸體的皮膚，去除表皮后，利用去除了真皮內(nèi)細(xì)胞的無細(xì)胞真皮進(jìn)行皮膚移植，以消除免疫排斥反應(yīng)。之后，培養(yǎng)的角質(zhì)細(xì)胞在其上完成完整的皮膚。這樣完成的皮膚含有基膜層，因此能夠像實(shí)際皮膚一樣起到保護(hù)我們身體的作用，防止外界有害物質(zhì)的進(jìn)入。美國專利第5，336, 616號(hào)中公開了一種移植用膠原蛋白基(collag en_based)組織的制備方法。但是按照上述專利中公開的方法制備的組織，冷凍保護(hù)劑的組分不能夠充分地浸透到膠原蛋白組織中，并且，吸收水分多的膠原蛋白組織，由于特性為低濃度的糖成分使得組織內(nèi)的水分不能夠充分排出，因此存在以下問題。在冷凍時(shí)，組織內(nèi)形成冰晶。這種冰晶在干燥過程中，使組織內(nèi)產(chǎn)生很多的孔，從而破壞膠原蛋白組織，并在移植后很快被分解，不能夠維持形態(tài)而被吸收
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題因此，本發(fā)明的技術(shù)課題為提供一種新的無細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，該方法與現(xiàn)有的方法相比，能夠有效地提高組織的穩(wěn)定性，使生物學(xué)性質(zhì)的變化最小化。解決技術(shù)問題的技術(shù)手段為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供無細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其包括下列步驟i)去除同種異體皮膚的表皮；ii)去除真皮內(nèi)細(xì)胞；iii)將甘油、丙二醇及基本溶劑或溶液進(jìn)行混合；iv)在上述溶液中溶解蔗糖，使蔗糖的最終濃度達(dá)到2(Γ40重量％，從而制得冷凍 保護(hù)劑；V)將上述去除了表皮及真皮內(nèi)細(xì)胞的皮膚用上述冷凍保護(hù)劑浸透；vi)將上述浸透了冷凍保護(hù)劑的皮膚進(jìn)行冷凍干燥。本發(fā)明還提供由上述處理方法制備的無細(xì)胞真皮基質(zhì)。下面，詳細(xì)說明本發(fā)明。在本發(fā)明中，對(duì)同種異體皮膚去除表皮后再去除真皮內(nèi)細(xì)胞，以消除免疫排斥反應(yīng)。去除表皮及真皮內(nèi)細(xì)胞可采用本領(lǐng)域公知的多種方法實(shí)施，對(duì)此沒有特別的限制。去除表皮時(shí)，可使用例如胰蛋白酶(trypsin)、膠原酶(collagenase)或分散酶(dispase)等酶或NaCl溶液進(jìn)行處理。去除真皮內(nèi)細(xì)胞時(shí)，可使用例如曲拉通XlOO (Triton X100)、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80或十二燒基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate, SDS)等進(jìn)行處理。本發(fā)明的冷凍保護(hù)劑使用甘油、丙二醇(propylene glycol)及基本溶劑或溶液作為基本成分。本發(fā)明的基本溶劑或溶液指的是制備冷凍保護(hù)劑時(shí)的基本(base)溶劑或溶液，可以使用蒸餾水、生理鹽水、處理動(dòng)物細(xì)胞時(shí)使用的緩沖液或動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明的上述緩沖液只要是本領(lǐng)域?qū)?dòng)物細(xì)胞處理時(shí)所使用的緩沖液即可，沒有特別的限制。本發(fā)明可使用的緩沖液例如有磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、HBSS (Hank，s 平衡鹽溶液(Hank，s balanced salt solution))、TBS (Tris 緩沖鹽溶液(Tris buffered saline))、TAPS (N_三(輕甲基)甲基-3-氨基丙橫酸(N-Tris(hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid))緩沖液、N-二輕乙基甘氨酸(N, N-雙(2-輕乙基)甘氨酸(N, N-Bis (2-hydroxyethyl) glycine))緩沖液、HEPES(4- (2_ 輕乙基)_1_ 哌嗪乙燒橫酸(4- (2-hydroxyethyl)-l-piper azineethanesulfonicacid))緩沖液、TES (N-三(輕甲基)甲基_2_氨基乙燒磺酸(N-Tris (hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid))緩沖液、PIPES (哌嗪-N, N’-雙(2-乙橫酸(piperazine-N, -bis (2-ethanesulfonic acid))緩沖液、甲次砷酸鹽(cacodylate)緩沖液、MES (2- (N-嗎啉代)乙橫酸(2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid))緩沖液等，但不限于此。本發(fā)明可使用的上述動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基可以使用本領(lǐng)域公知的任意的培養(yǎng)基。本發(fā)明可使用的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基例如有MEM (最小必需培養(yǎng)基(Minimum EssentialMedia))、DMEM (達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco，s Modified Eagle Media))、RPMI1640、MDM(伊思考夫改良杜爾貝可培養(yǎng)基(Iscove，s Modified Dulbecco’s Media))、特定角化細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(不含BPE (牛腦垂體提取液))(Defined Keratinocyte-SFM(without BPE (Bovine Pituitary Extract)))、角化細(xì)胞培養(yǎng)基(Keratinocyte-SFM (含ΒΡΕ))、敲除 D-MEM (Knock-Out D-MEM)、AmnioMAX-II 完全培養(yǎng)基(AmnioMAX-II CompleteMedium)及 AmnioMAX-ClOO 完全培養(yǎng)基(AmnioMAX-ClOO Complete Medium)等，但不限于此。本發(fā)明的甘油、丙二醇及基本溶劑或溶液以重量計(jì)，優(yōu)選以O(shè). 5^2 :0. 5^2 6^10的混合比來使用，更優(yōu)選為O. 8^1. 5 :0. 8^1. 5 :7 9，最優(yōu)選為I :1 :8。在本發(fā)明的甘油及丙二醇的混合比在小于O. 5的情況下，會(huì)有冷凍時(shí)因凍傷引起的問題，在大于2的情況下，會(huì)在冷凍干燥后誘發(fā)組織的變性。本發(fā)明的冷凍保護(hù)劑是在上述混合基本成分的溶液中，溶解鹿糖(sucrose),使其最終濃度達(dá)到2(Γ40重量％，從而制得。利用慢速冷凍法進(jìn)行冷凍的情況下，細(xì)胞及組織內(nèi)會(huì)發(fā)生水分損失，因此，細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶會(huì)對(duì)細(xì)胞和組織造成物理性破壞。此外，因冷凍干燥時(shí)水分的蒸發(fā)，會(huì)引起組織的凝縮，因冰晶而引起組織破壞，會(huì)削弱構(gòu)成組織的大部分的膠原蛋白纖維的結(jié)合力，或使其斷開，這種情況下，在冷凍干燥時(shí)會(huì)加速組織的破壞。這樣制得的無細(xì)胞真皮基質(zhì)，因拉伸強(qiáng)度變?nèi)?，在移植到使用無細(xì)胞真皮基質(zhì)多的燒傷患者的關(guān)節(jié)部位時(shí)，術(shù)后難以期待好的恢復(fù)效果。因此，冷凍保護(hù)劑首先要解決的問題是最大限度地抑制細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。因此，本發(fā)明將具有膜透過性的甘油、高濃度的蔗糖，以及具有非透過性的丙二醇用作冷凍保存溶液的主要物質(zhì)，其能夠抵御因冰晶引起的物理性破壞，從而對(duì)組織起到保護(hù)及穩(wěn)定化的作用。此外，本發(fā)明使用的丙二醇，與其它的醇類相比，幾乎無毒性，是也可以用在食品添加劑和化妝品中的物質(zhì)，具有抑制細(xì)菌和霉菌增殖的抗菌作用。因此，在冷凍干燥后，可以使組織不受污染，起到保護(hù)作用。如上所述，本發(fā)明的無細(xì)胞真皮基質(zhì)能夠提高組織的穩(wěn)定性，采用蔗糖、甘油、丙二醇，以及基本溶劑或溶液的理想混合比，能夠使真皮組織的穩(wěn)定性得到更大的提高。本發(fā)明的冷凍保護(hù)劑中的蔗糖含量不足20重量％時(shí)，冷凍時(shí)會(huì)因冰晶的影響，使組織的穩(wěn)定性等變得微弱，蔗糖含量超過40重量％時(shí)，會(huì)因濃度高的糖成分使冷凍干燥后組織中生成糖結(jié)晶，這會(huì)給組織的安全性帶來影響。本發(fā)明的冷凍保護(hù)劑在混合有上述基本成分的溶液中優(yōu)選以最終濃度為30重量％來溶解蔗糖，從而制得。本發(fā)明中，在去除了表皮及真皮內(nèi)細(xì)胞的皮膚中浸透冷凍保護(hù)劑可以使用本領(lǐng)域公知的多種方法，優(yōu)選在低溫反應(yīng)器中，使冷凍保護(hù)劑浸透皮膚。糖成分作為微生物的營(yíng)養(yǎng)供給源，在加工皮膚時(shí)，會(huì)成為污染的基礎(chǔ)，因此優(yōu)選在低溫下使冷凍保護(hù)劑進(jìn)行反應(yīng)。此夕卜，冷凍保護(hù)劑在常溫下的反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致作為原材料的膠原蛋白組織的變性，因此，在低溫下浸透冷凍保護(hù)劑要比在常溫下浸透更為優(yōu)選。浸透所需的時(shí)間根據(jù)皮膚組織的大小等而有所不同，例如在4°C的低溫反應(yīng)器中，可以浸透約6 24小時(shí)。優(yōu)選地，本發(fā)明中浸透了冷凍保護(hù)劑的皮膚可以使用溫度可調(diào)節(jié)的冷凍干燥器進(jìn)行冷凍。冷凍時(shí)使用溫度可調(diào)節(jié)的冷凍干燥器能夠以期望的速度冷凍皮膚。本發(fā)明中使用溫度可調(diào)節(jié)的冷凍干燥器來冷凍皮膚的速度優(yōu)選為-0. TC /min至-5°c /min，最優(yōu)選為-TC /min。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明的處理方法制備的移植用無細(xì)胞真皮基質(zhì)，組織穩(wěn)定性高，能夠維持 細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)結(jié)構(gòu)及基底膜(basement membrane)不會(huì)受到損傷，并且生物學(xué)性質(zhì)的變化少，因此能夠提高無細(xì)胞真皮基質(zhì)的移植率,縮短治療時(shí)間。


圖I為示出對(duì)使用了不同濃度蔗糖的冷凍保存液進(jìn)行冷凍干燥處理的無細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行再水化后，進(jìn)行H&E染色后，用光學(xué)顯微鏡分別放大100倍后拍攝的照片。(A 5%鹿糖；B :10%鹿糖；C :15%鹿糖；D :20%鹿糖；E :25%鹿糖；F :30%鹿糖)圖2示出對(duì)使用了不同濃度蔗糖的冷凍保存液進(jìn)行冷凍干燥處理的無細(xì)胞真皮基質(zhì)，用電子顯微鏡分別放大150倍及1，000倍后拍攝的照片。(A 0%蔗糖，150倍；B 0%蔗糖，1000 倍；C :10% 蔗糖，150 倍；D :10% 蔗糖，1000 倍；E :30% 蔗糖，150 倍；F :30% 蔗糖，1000 倍)圖3為對(duì)實(shí)施例、比較例I及比較例2的無細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行H&M染色后，用光學(xué)顯微鏡放大100倍后所拍攝的照片。(A :實(shí)施例；B :比較例I ;C :比較例2)圖4為示出對(duì)使用蔗糖最終濃度為30重量％的冷凍保護(hù)劑進(jìn)行處理的冷凍保存無細(xì)胞真皮基質(zhì)和比較例I及比較例2的無細(xì)胞真皮基質(zhì)根據(jù)膠原蛋白水解酶的分解性進(jìn) 行測(cè)定的結(jié)果的圖表。(陽性對(duì)照(Positive controI):將膠原蛋白粉末用膠原蛋白水解酶進(jìn)行處理；陰性對(duì)照(Negative control):不進(jìn)行膠原蛋白水解酶處理)
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。但這些實(shí)施例僅是為了例示本發(fā)明，并不能限制本發(fā)明的范圍。由于捐贈(zèng)者(尸體)的人體皮膚組織的應(yīng)用受到限制，因此使用了接近人體皮膚的豬皮，根據(jù)下述實(shí)施例及比較例的方法分別制備了 10份。實(shí)施例使用豬皮按照下述步驟制備無細(xì)胞真皮基質(zhì)。( I)用生理鹽水洗凈豬皮。(2)將豬皮分別切成5X IOcm2的大小。(3)在IM的NaCl (Sigma，美國)溶液中分別加入豬皮。(4)準(zhǔn)備 38°C的反應(yīng)器(P-039，KoaTech)。(5)將置于IM的NaCl (Sigma，美國)溶液中的豬皮在38°C的反應(yīng)器(P-039，KoaTech)中進(jìn)行約6至24小時(shí)的攪拌反應(yīng)。(6)利用醫(yī)用鑷子去除表皮。(7)用磷酸緩沖液清洗去除了表皮的真皮。(8)將清洗后的真皮放入0. 5%的SDS中，在常溫下攪拌反應(yīng)I小時(shí)，從而去除真皮內(nèi)細(xì)胞。(9)用磷酸緩沖液清洗去除了細(xì)胞的真皮。(10)將甘油(Sigma，美國)、丙二醇(Sigma，美國)及磷酸緩沖液(GIBC0，美國)以I 1 8的重量比進(jìn)行混合。(11)在(10)的溶液中溶解蔗糖(Sigma，美國)，使蔗糖最終濃度達(dá)到30%，從而制得冷凍保護(hù)劑。(12)準(zhǔn)備 4°C的低溫反應(yīng)器(P-039，KoaTech)。
(13)在4°C的低溫反應(yīng)器中放入(9)的豬皮，然后浸透冷凍保護(hù)劑12小時(shí)。(14)將浸透好的豬皮放入高密度聚乙烯合成紙袋(Tyvek bag,高麗新材料,韓國)中。(15)準(zhǔn)備冷凍干燥器(Genesis 25XL，VirTis，美國)。(16)將(14)的高密度聚乙烯合成紙袋放入冷凍干燥器中，以_1°C /min的速度冷凍至_70°C，放入真空5torr的冷凍干燥器中干燥24小時(shí)，從而制得冷凍干燥的無細(xì)胞真皮基質(zhì)。(17)冷凍干燥結(jié)束后,放入氧化乙烯氣滅菌器(HS_4313E0,hanxin medical公司，韓國)進(jìn)行滅菌。 (18)將滅菌的無細(xì)胞真皮基質(zhì)放入鋁袋中進(jìn)行密封，在常溫下保存直至實(shí)驗(yàn)前。比較例I使用豬皮按照美國專利第5，336，616號(hào)的實(shí)施例I公開的方法，使用在HBSS中包含7. 5%的葡聚糖(MWT70，000),6%蔗糖、7. 5%聚乙烯吡咯烷酮(MWT40，000)、I. 25%棉子糖及 ImM 乙二胺四乙酸二鈉(disodium ethylenediamine tetraacetic acid)的溶液，按照與公開的方法相同的方法準(zhǔn)備無細(xì)胞真皮基質(zhì)。比較例2使用豬皮按照下述步驟準(zhǔn)備冷凍干燥皮膚。( I)用生理鹽水洗凈豬皮。(2)將豬皮分別切成5X IOcm2的大小。(3)在IM的NaCl (Sigma，美國)溶液中分別加入豬皮。(4)準(zhǔn)備 38°C的反應(yīng)器(P-039，KoaTech)。(5)將置于IM的NaCl (Sigma，美國)溶液中的豬皮在38°C的反應(yīng)器中進(jìn)行攪拌，反應(yīng)約6至24小時(shí)。(6)利用醫(yī)用鑷子去除表皮。(7)用磷酸緩沖液清洗去除了表皮的真皮。(8)將清洗后的真皮放入O. 1%的SDS中，在常溫下攪拌反應(yīng)I小時(shí)，從而去除真皮內(nèi)細(xì)胞。(9)用磷酸緩沖液(pH7. 2，GIBC0，美國)清洗去除了細(xì)胞的真皮。(10)將甘油(Sigma，美國)及磷酸緩沖液以I :9的重量比進(jìn)行混合，從而制得冷凍保存溶液。(11)準(zhǔn)備 4°C 的低溫反應(yīng)器(P-039，KoaTech )。(12)在4°C的低溫反應(yīng)器中放入(9)的豬皮，然后浸透冷凍保護(hù)劑12小時(shí)。(13)將浸透好的豬皮放入高密度聚乙烯合成紙袋(Tyvek bag,高麗新材料,韓國)中(14)準(zhǔn)備冷凍干燥器(Genesis 25XL，VirTis，美國)。(15)將(13)的高密度聚乙烯合成紙袋放入冷凍干燥器中，以_1°C /min的速度冷凍至_70°C，放入真空5torr的冷凍干燥器中干燥24小時(shí)，從而制得冷凍干燥的無細(xì)胞真皮基質(zhì)。(16)冷凍干燥結(jié)束后，放入氧化乙烯氣滅菌器(HS-4313E0，Hanshin Medical公司，韓國)中進(jìn)行滅菌。(17)將滅菌的冷凍干燥無細(xì)胞真皮基質(zhì)放入鋁袋中進(jìn)行密封，在常溫下保存直至實(shí)驗(yàn)前。實(shí)驗(yàn)例I組織學(xué)鑒定按照下述方法，進(jìn)行H&E染色。(I)將石蠟塊切成4 μ m厚，然后對(duì)其進(jìn)行干燥，制成石蠟切片。(2)為了脫蠟過程，在二甲苯中反應(yīng)3次，每次5分鐘；在100%乙醇中反應(yīng)3次，每次2分鐘；在90%的乙醇中反應(yīng)I次，I分鐘；在80%乙醇中反應(yīng)I次，I分鐘；在70%乙醇中反應(yīng)I次，I分鐘；之后用流動(dòng)的水清洗10分鐘。
在蘇木精(hematoxylin)染色液中反應(yīng)10分鐘,然后用流動(dòng)的水清洗3分鐘,在伊紅(eosin)染色液中反應(yīng)10分鐘，然后用流動(dòng)的水清洗，直至沒有伊紅染色液流出。在70%乙醇中反應(yīng)10次，每次I秒；在80%乙醇中反應(yīng)10次，每次I秒；在90%乙醇中反應(yīng)10次，每次I秒；在100%乙醇中反應(yīng)2次，每次I分鐘；在二甲苯中反應(yīng)3次，每次3分鐘；然后用封固(mounting)溶液進(jìn)行封固。使用掃描電子顯微鏡進(jìn)行拍攝，實(shí)施如下。(I)將試樣在 2. 5% 的戍二醒(glutaraldehyde)溶液(固定液，fixativesolution)中進(jìn)行2小時(shí)預(yù)固定，然后使用0. IM的磷酸緩沖液清洗后，用1%的OsO4溶液進(jìn)行后固定。(2)此后，按照乙醇濃度增加的順序進(jìn)行脫水/取代，在_190°C的液氮內(nèi)進(jìn)行冷凍切斷，使試樣的截面露出，然后利用臨界點(diǎn)干燥器(HCP-2)使試樣完全干燥。(3)使露出的試樣的截面朝上并附著在鋁支架(Stub)(試樣固定臺(tái))上，在金屬離子涂布裝置(E-1030離子濺射(Ion sputter))中用Pt-Pd實(shí)施約IOnm厚的金屬涂布。(4)用掃描電子顯微鏡(Hitachi S-4700，日本)進(jìn)行觀察及拍攝。制備蔗糖最終濃度為5%、10%、15%、20%、25%及30%的冷凍保存液后，使用其按照實(shí)施例的方法制備了冷凍干燥的無細(xì)胞真皮基質(zhì)。將制備的無細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行再水化后，按照上述方法進(jìn)行H&E染色,用光學(xué)顯微鏡(Olympus BX51,H&E染色(staining))拍攝后，顯示于圖I中。在蔗糖濃度不足20%的情況下，在冷凍干燥后觀察時(shí)，組織的基質(zhì)與濃度成比例地呈現(xiàn)出組織基質(zhì)破壞的現(xiàn)象，在20%、25%及30%的情況下，組織的基質(zhì)沒有與濃度成比例地被破壞，可以觀察到維持與原形接近的形態(tài)。此外，按照上述方法，將使用不含蔗糖的冷凍保存液處理所制得的無細(xì)胞真皮基質(zhì)及使用上述制得的含有10%、30%蔗糖的冷凍保存液進(jìn)行處理的無細(xì)胞真皮基質(zhì)用掃描電子顯微鏡拍攝后顯示于圖2中。在使用不含蔗糖的冷凍保存液和含10%蔗糖的冷凍保存液進(jìn)行處理的無細(xì)胞真皮基質(zhì)，能夠觀察到在冷凍干燥后產(chǎn)生破壞，但是使用含30%蔗糖的冷凍保存液進(jìn)行處理的無細(xì)胞真皮基質(zhì)，能夠觀察到在冷凍干燥后，也能很好地維持組織基質(zhì)的形態(tài)，組織基質(zhì)沒有被破壞。由上述結(jié)果可知，含有20%以上蔗糖的情況下，在冷凍干燥過程中產(chǎn)生的組織破壞確實(shí)很少。將按照上述方法對(duì)實(shí)施例，以及比較例I和比較例2的無細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行H&E染色后，用光學(xué)顯微鏡(Olympus BX51，H&E染色)拍攝后，顯示于圖3中。
與比較例I和比較例2相比，可知在冷凍干燥時(shí)產(chǎn)生的冰晶帶來的組織破壞方面，實(shí)施例的無細(xì)胞真皮基質(zhì)因冷凍保存液的優(yōu)異性，其組織穩(wěn)定性顯著優(yōu)于比較例I和比較例2的無細(xì)胞真皮基質(zhì)。實(shí)驗(yàn)例2測(cè)定根據(jù)膠原蛋白水解酶的分解性為了觀察實(shí)施例與比較例的無細(xì)胞真皮基質(zhì)的穩(wěn)定性，按照下述步驟測(cè)定了膠原蛋白水解酶的分解性。(I)將25mg的試樣添加到5mM的TES緩沖液中，并混勻，所述5mM的TES緩沖液中混合有 5ml 的 O. 36mM 的氯化I丐(calcium chloride)。(2)將O. Iml的O. lmg/ml的膠原蛋白分解酶(collagenase)添加到(I)的試樣中混勻，在37°C下反應(yīng)I天。(3)用4. OmM的L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)稀釋(serial dilution)后,用卻三酮顯色 劑(ninhydrin color reagent)進(jìn)行處理,在570nm下測(cè)定了吸光度(VERSA max,MolecularDevice,美國)并繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線。(4)將(2)的試樣用茚三酮顯色劑處理，在570nm下測(cè)定了吸光度。(5)利用(3)的L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出了各個(gè)試樣所釋放的L-亮氨酸的量。上面計(jì)算得到的L-亮氨酸的釋放量如圖4所示。由圖4可以看出，實(shí)施例的無細(xì)胞真皮基質(zhì)與比較例I和比較例2的無細(xì)胞真皮基質(zhì)相比組織穩(wěn)定性高，并且通過膠原蛋白分解酶的分解速度顯著降低。從通過顯微鏡拍攝照片的組織學(xué)分析或根據(jù)膠原蛋白分解酶的分解性測(cè)定結(jié)果可知，根據(jù)本發(fā)明的處理方法與現(xiàn)有的方法相比，具有高的組織穩(wěn)定性。因此，根據(jù)本發(fā)明方法制備的無細(xì)胞真皮基質(zhì)能夠維持細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)結(jié)構(gòu)且基底膜(basement membrane)不會(huì)受到損傷,而且生物學(xué)性質(zhì)的變化少，因此能夠提高無細(xì)胞真皮基質(zhì)的移植率，縮短治療時(shí)間。
權(quán)利要求
1.無細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其包括下列步驟 i)去除同種異體皮膚的表皮； ii)去除真皮內(nèi)細(xì)胞； iii)將甘油、丙二醇及基本溶劑或溶液進(jìn)行混合； iv)在上述溶液中溶解蔗糖，使蔗糖的最終濃度達(dá)到2(Γ40重量％，從而制得冷凍保護(hù)劑； V)將上述去除了表皮及真皮內(nèi)細(xì)胞的皮膚用上述冷凍保護(hù)劑浸透； vi)將上述浸透了冷凍保護(hù)劑的皮膚進(jìn)行冷凍干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于，以重量計(jì)，甘油、丙二醇及基本溶劑或溶液的混合比為O. 5^2 :0. 5^2 :6 10。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述基本溶劑或溶液選自蒸餾水、生理鹽水(normal saline)、磷酸緩沖液(PBS)、HBSS (Hank’ s平衡鹽溶液(Hank，s balanced salt solution))、TBS (Tris 緩沖鹽溶液(Tris bufferedsaline))、TAPS (N_ 三(輕甲基)甲基-3-氨基丙橫酸(N_Tris (hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid))緩沖液、N- 二輕乙基甘氨酸(N, N-雙(2-輕乙基)甘氨酸(N, N-Bis (2-hydroxyethyl) glycine))緩沖液、HEPES (4_ (2_ 輕乙基)_1_ 哌嗪乙燒橫酸(4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid))緩沖液、TES(N-三(輕甲基)甲基-2-氨基乙燒橫酸(N-Tris(hydroxymethyl )methyl-2_aminoethanesulfonic acid))緩沖液、PIPES (哌嗪-N, N’-雙(2-乙橫酸(piperazine-N, N ' -bis(2-ethanesulfonic acid))緩沖液、甲次砷酸鹽(cacodylate)緩沖液、MES (2~ (N-嗎啉代)乙橫酸(2- (N-morpholino) ethanes ulfonic acid))緩沖液、MEM (最小必需培養(yǎng)基(Minimum Essential Media))、DMEM(達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s ModifiedEagle Media))、RPMI1640、MDM (伊思考夫改良杜爾貝可培養(yǎng)基(Iscove，s ModifiedDulbecco’s Media))、特定角化細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(不含BPE (牛腦垂體提取液))(DefinedKeratinocyte-SFM (without BPE (Bovine Pituitary Extract)))、角化細(xì)胞培養(yǎng)基(Keratinocyte-SFM (含 ΒΡΕ))、敲除 D-MEM (Knock-Out D-MEM)、AmnioMAX-II 完全培養(yǎng)基(AmnioMAX-11 Complete Medium)及 AmnioMAX-ClOO 完全培養(yǎng)基(AmnioMAX-ClOOCompleteMedium)中的一種以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于，蔗糖的最終濃度為30重量％。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于，將分離的皮膚用冷凍保護(hù)劑浸透的步驟，是在4°C的低溫反應(yīng)器中，浸透6 24小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于，將浸透了冷凍保護(hù)劑的皮膚，以-1°C /min的速度進(jìn)行冷凍。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的方法制備的無細(xì)胞真皮基質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及無細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法及由其制備的無細(xì)胞真皮基質(zhì)。更詳細(xì)地，涉及以甘油、丙二醇及基本溶劑或溶液為基本成分，在其中添加蔗糖，從而制得冷凍保護(hù)劑，然后將該溶液浸透到去除了表皮及真皮內(nèi)細(xì)胞的皮膚中進(jìn)行冷凍干燥，從而制備無細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法。
文檔編號(hào)A61L27/60GK102869392SQ201080064799
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者田旭, 崔源益, 洪晙杓, 柳眩丞 申請(qǐng)人:Cg生物技術(shù)有限公司