專利名稱：激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)皮膚組織工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)作為人體真皮替代物的應(yīng)用，還涉及激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
大面積深度燒傷創(chuàng)面愈合后，常遺留瘢痕增生和攣縮畸形，嚴(yán)重影響外觀和功能，這與愈合創(chuàng)面缺乏真皮有關(guān)。如果在促進(jìn)創(chuàng)面愈合的同時，重建真皮結(jié)構(gòu)，將能有效減輕瘢痕的形成，進(jìn)而提高創(chuàng)面修復(fù)的質(zhì)量。
國內(nèi)外在真皮替代物方面開展了大量研究，各種人工合成真皮(如Integra和Dermagraft等)、去細(xì)胞同種異體真皮(如Alloderm等)等產(chǎn)品相繼問世并投入使用，取得了較好的臨床效果，但其價格昂貴，臨床應(yīng)用受到限制。由于豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)具有來源廣和費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此其受到重視并在臨床上得到初步應(yīng)用。
既往在制備豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)時，通常采用皮膚拉網(wǎng)機(jī)將其制成網(wǎng)狀，移植后創(chuàng)面基底滲液能夠透過真皮網(wǎng)眼營養(yǎng)淺層皮片，微血管可通過網(wǎng)眼再生，從而保證復(fù)合皮的成活。臨床上將網(wǎng)狀豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)與自體刃厚皮復(fù)合移植，用于修復(fù)小面積切痂創(chuàng)面、瘢痕切除創(chuàng)面以及各種原因所致的皮膚軟組織缺損，取得較滿意的療效。但由于網(wǎng)狀真皮的網(wǎng)眼較大，真皮基質(zhì)分布欠均勻，網(wǎng)眼部分的自體刃厚皮實質(zhì)上等同于單純自體皮移植，因此遠(yuǎn)期仍存在一定程度的創(chuàng)面收縮。此外，臨床上將網(wǎng)狀豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)+自體微粒皮+異體皮復(fù)合移植，試圖改善大面積深度燒傷創(chuàng)面愈合質(zhì)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在某些病例中異體皮成活不良。這是由于在異體皮與創(chuàng)面基底之間加入豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)后，真皮網(wǎng)嵴部分影響了淺層異體皮的營養(yǎng)供應(yīng)和血管再生。
因此，只有同時盡可能地縮小真皮網(wǎng)眼(孔徑)和縮窄網(wǎng)嵴(孔間距)，才能有效解決上述問題。但傳統(tǒng)的拉網(wǎng)機(jī)并不具備這一精細(xì)工藝，傳統(tǒng)的拉網(wǎng)機(jī)(以美國Zimmer公司皮膚拉網(wǎng)機(jī)為例)只能制備孔徑約為1.8mm×1.8mm，孔間距約為1.2mm的真皮基質(zhì)。
激光打孔是最早達(dá)到實用化的激光加工技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于金屬、皮革、玻璃、木材等材料的加工。激光打孔技術(shù)主要具有以下優(yōu)點(diǎn)①打孔速度快、效率高；②孔徑微小、可調(diào)；⑧適用于各類材料；④無工具損耗；⑤適合數(shù)量多、高密度的群孔加工。激光微孔孔徑可達(dá)到數(shù)十至數(shù)百微米不等，可容納蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分通過，便于真皮內(nèi)微血管的重建。
因此，將激光打孔技術(shù)引入豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)的加工，可望在真皮基質(zhì)上制作出均勻密布的微孔，以利于組織間液滲透和微血管再生，從而達(dá)到提高復(fù)合皮移植成活率和改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量的目的。但到目前為止，仍未開發(fā)出將激光打孔技術(shù)應(yīng)用于豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)加工領(lǐng)域以制備微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供一種激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)，其特征在于通過對豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)采用二氧化碳激光加工機(jī)打孔加工進(jìn)行制備。
本發(fā)明的另一個目標(biāo)是提供一種激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)，其特征在于孔徑為0.40±0.02mm，孔間距為0.8mm～1.0mm。
本發(fā)明的第三個目標(biāo)是提供一種激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，其特征在于采用激光對豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行打孔加工。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中采用二氧化碳激光加工機(jī)對豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行打孔加工(優(yōu)選孔徑為0.40±0.02mm，孔間距0.8mm～1.0mm)，再將激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)置入0.5％Triton X-100溶液內(nèi)浸泡并持續(xù)震蕩6個小時，去除微孔周圍變性組織，并使用磷酸鹽緩沖溶液對其進(jìn)行充分浸泡和洗滌，袋裝密封。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，對所制備的激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)使用60Co照射進(jìn)行消毒，并在4℃保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明的第四個目標(biāo)是提供一種激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)在構(gòu)建組織工程復(fù)合皮以及人體真皮替代物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的其它目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)，將通過下面的具體實施方式
和說明變得顯而易見。
具體實施例方式
制備激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)首先，制備豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)?？梢圆捎萌魏我阎闹苽湄i去細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法，優(yōu)選采用專利號為ZL 200410069394.2中所公開的方法，這里將該專利作為參考文獻(xiàn)加以整體引用。將無菌豬皮在三蒸水配置的高滲鹽水中浸泡獲得的真皮基質(zhì)，置于使用三蒸水配置的0.5Mol/L氫氧化鈉溶液中用水浴震蕩器常溫下持續(xù)震蕩24小時，再用超聲波清洗機(jī)對真皮基質(zhì)用三蒸水分次震蕩洗滌至少3遍，每次至少震蕩洗滌10分鐘，然后用磷酸平衡鹽溶液漂洗5遍，置于95％的乙醇內(nèi)浸泡30分鐘，再用磷酸平衡鹽溶液漂洗3遍后，-80℃下冷凍干燥4小時，分裝消毒，低溫保存?zhèn)溆谩?br> 然后，采用二氧化碳激光加工機(jī)對豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行打孔加工。孔徑0.40～0.02mm。根據(jù)孔間距不同，制備出四種規(guī)格的激光微孔去細(xì)胞真皮基質(zhì)(0.8mm、1.0mm、1.2mm和1.5mm)。再將激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)置入0.5％TritonX-100溶液內(nèi)浸泡并持續(xù)震蕩6小時，去除微孔周邊變性組織，磷酸鹽緩沖溶液充分浸泡洗滌，袋裝密封，使用60Co照射進(jìn)行消毒，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 動物模型及分組取健康SD大鼠144只，雌雄不限，體重為250±15g。3％的戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔麻醉，背部去毛，切除背部約3cm×3cm全層皮膚至深筋膜。大鼠隨機(jī)分為6組(n＝24)。微孔組I孔間距為0.8mm的激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)+自體刃厚皮移植；微孔組II孔間距為1.0mm的真皮基質(zhì)+自體刃厚皮移植；微孔組III孔間距為1.2mm的真皮基質(zhì)+自體刃厚皮移植；微孔組IV孔間距為1.5mm的真皮基質(zhì)+自體刃厚皮移植；網(wǎng)狀組網(wǎng)狀豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)(采用皮膚拉網(wǎng)機(jī)按1∶1.5比例拉網(wǎng)而成)+自體刃厚皮移植；對照組單純自體刃厚皮移植。創(chuàng)面移植后用凡士林紗布及無菌敷料覆蓋，打包固定。實驗鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)。分別在術(shù)后2周、4周和6周觀察創(chuàng)面愈合率，計算收縮率，同時取移植物組織進(jìn)行組織學(xué)觀察。
實驗結(jié)果(1)創(chuàng)面大體觀察 移植術(shù)后2周，微孔組I、II、III和網(wǎng)狀組創(chuàng)面移植的<p>表四

實施例3處方見表五表五

制備方法同實施例2該實施例制備的滌綸薄膜吸附亞甲藍(lán)組合物的含量經(jīng)檢測為168.2ug/片，無菌、熱原檢測合格，微粒檢測符合2005年二部藥典附錄ixC規(guī)定，符合注射用要求。
該實施例制備的亞甲藍(lán)的病原體滅活驗證效果詳見下表六表六

實施例4處方見表七表七

<p>表2術(shù)后各組創(chuàng)面收縮率比較(％，x±s)

注與對照組比較*P＜0.05與網(wǎng)狀組比較#P＜0.05(2)組織學(xué)觀察 各微孔組和網(wǎng)狀組術(shù)后2周復(fù)合皮組織學(xué)可見炎性細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞生長及毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)；術(shù)后4周復(fù)合皮表皮層分化良好，真皮內(nèi)可見少許炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管垂直于創(chuàng)面生長；術(shù)后6周表皮和真皮結(jié)構(gòu)基本正常，真皮層內(nèi)可見到膠原纖維排列規(guī)整，毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)豐富，未見皮膚附件；免疫組化抗層粘連蛋白(Laminin)染色各組層粘連蛋白，均在基底膜區(qū)及真皮血管束周圍呈陽性反應(yīng)，染色較深，連續(xù)性好。術(shù)后6周，對照組表皮層分層接近正常，但真皮內(nèi)膠原纖維排列較紊亂，成纖維細(xì)胞多；免疫組化染色層粘連蛋白在基底膜區(qū)及真皮血管束周圍也呈陽性反應(yīng)，但染色較淡，連續(xù)性較差。
以上實驗結(jié)果表明微孔孔間距越小，移植物成活率越大；當(dāng)孔間距為0.8mm和1.0mm時，兩組術(shù)后6周的移植物成活率及創(chuàng)面收縮率均明顯優(yōu)于網(wǎng)狀豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)組和單純自體刃厚皮移植組；當(dāng)孔間距為1.2mm或1.5mm時，兩組移植物成活率低于網(wǎng)狀豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)組和單純自體刃厚皮移植組。結(jié)果證實，孔間距為0.8mm或1.0mm的激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)與自體刃厚皮復(fù)合移植可明顯提高創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量；其中后者與前者相比，孔間距更大，單位面積內(nèi)微孔更少、真皮基質(zhì)組織量更多，而移植物成活率及創(chuàng)面收縮率無明顯差異。
通過上述描述，本發(fā)明的以下優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的①激光微孔孔徑微小、一致，分布均勻，存活后可縮小創(chuàng)面收縮率。
②真皮基質(zhì)易于血管化，可提高創(chuàng)面愈合率；⑧制備工藝簡單，價格低廉。
需要注意的是，本發(fā)明所討論的這些優(yōu)選實施方案及其變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說根據(jù)這里所公開的內(nèi)容是很顯而易見的和有啟示的，其中顯然需要理解的是，上面描述的內(nèi)容只是為了舉例說明本發(fā)明而不是對其進(jìn)行限制。
權(quán)利要求
1.一種激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)，其特征在于通過對豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)采用二氧化碳激光加工機(jī)進(jìn)行打孔加工進(jìn)行制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)，其中所述的豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)是通過包括以下步驟的方法進(jìn)行制備的1)將無菌豬皮在三蒸水配置的高滲鹽水中浸泡獲得的真皮基質(zhì)，置于使用三蒸水配置的0.5Mol/L氫氧化鈉溶液中用水浴震蕩器常溫下持續(xù)震蕩24小時；2)再用超聲波清洗機(jī)對真皮基質(zhì)用三蒸水分次震蕩洗滌至少3遍，每次至少震蕩洗滌10分鐘；3)然后用磷酸平衡鹽溶液漂洗5遍，置于95％的乙醇內(nèi)浸泡30分鐘，再用磷酸平衡鹽溶液漂洗3遍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)，其特征在于其孔徑為0.40±0.02mm，孔間距為0.8mm～1.0mm。
4.一種制備激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法，其包括使用激光對豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行打孔加工。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)是通過包括以下步驟的方法進(jìn)行制備的1)將無菌豬皮在三蒸水配置的高滲鹽水中浸泡獲得的真皮基質(zhì)，置于使用三蒸水配置的0.5Mol/L氫氧化鈉溶液中用水浴震蕩器常溫下持續(xù)震蕩24小時；2)再用超聲波清洗機(jī)對真皮基質(zhì)用三蒸水分次震蕩洗滌至少3遍，每次至少震蕩洗滌10分鐘；3)然后用磷酸平衡鹽溶液漂洗5遍，置于95％的乙醇內(nèi)浸泡30分鐘，再用磷酸平衡鹽溶液漂洗3遍。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于包括以下步驟A)采用二氧化碳激光加工機(jī)對豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行打孔加工；B)將激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)置入0.5％ Triton X-100溶液內(nèi)浸泡并持續(xù)震蕩6個小時，去除微孔周圍變性組織，并使用磷酸鹽緩沖溶液對其進(jìn)行充分浸泡和洗滌。
7.根據(jù)權(quán)利要求4～6中任意一項所述的方法，其特征在于對所制備的激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)使用60Co照射進(jìn)行消毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求4～7中任意一項所述的方法，其特征在于步驟A)中采用二氧化碳激光加工機(jī)對豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行打孔加工的孔徑為0.40±0.02mm，孔間距為0.8mm～1.0mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)與自體刃厚皮的結(jié)合在制備人體真皮替代物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)與培養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)合在構(gòu)建組織工程復(fù)合皮中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用二氧化碳激光加工機(jī)制備激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)的方法，其包括(A)采用二氧化碳激光加工機(jī)對豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行打孔加工，孔徑為0.40±0.02mm，孔間距0.8mm～1.0mm；(B)將激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)置入0.5％Triton X－100溶液內(nèi)浸泡并持續(xù)震蕩6個小時，去除微孔周圍變性組織，并使用磷酸鹽緩沖溶液對其進(jìn)行充分浸泡和洗滌，袋裝密封。本發(fā)明公開了一種通過上述方法所制備的激光微孔豬去細(xì)胞真皮基質(zhì)，其適合制備人體真皮替代物和構(gòu)建組織工程復(fù)合皮。
文檔編號A61L27/38GK1861203SQ20061009008
公開日2006年11月15日 申請日期2006年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月26日
發(fā)明者柴家科, 梁黎明, 楊紅明, 馮瑞, 孫強(qiáng), 尹會男, 侯玉茹 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院